ESPECTROFOTOMETRIA

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ESPECTROFOTOMETRIA
ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA
Dado que la reflexión de la luz es de un interés mínimo en 
espectrofotometría, se tiene que lo relevante es la 
absorbancia y transmitancia de la luz.
El color que vemos en una muestra de solución se debe a la
absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de luz 
visible y transmitancia del resto longitudes de onda. Si una 
muestra absorbe todas las longitudes de onda en la región 
visible del espectro, aparecerá negro; si no absorbe 
ninguno de ellos, aparecerá blanco o incoloro. Vemos los 
distintos colores cuando las longitudes de onda radiante de 
la energía golpean nuestros ojos.
Definimos transmitancia como la relación de la cantidad 
de luz transmitida a la cantidad de luz que cayó 
inicialmente en la superficie.
Fig.1 TRANSMITANCIA EN UNA MUESTRA
La ecuación de la transmitancia se define como sigue:
Transmitancia (T) = P / P0
Donde:
 T = Transmitancia.
 P = Intensidad de la luz transmitida.
 P0 = Intensidad de la luz incidente.
La absorbancia se define como el logaritmo negativo de la
transmitancia, y se observa que la absorbancia y la 
transmitancia tienen una relación inversa, como se muestra
a continuación:
Absorbancia(A) = -log (T) = -log ( P ⁄ P0 )
Esto permite que diferentes espectrofotómetros con 
diferentes fuentes de luz produzcan lecturas de absorción 
independientes de la potencia de la fuente de luz.
A continuación, supongamos que hay dos tubos de ensayo, 
ambos contienen la misma solución en la misma 
concentración. La única diferencia es que uno de los tubos 
de ensayo es más delgado que el otro, las imágenes se 
muestran a continuación:
Fig. 2 LONGITUDES DE TRAYECTORIAS DIFERENTES POR
DISTINTAS MUESTRAS
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Hacemos pasar luz de la misma intensidad (P0) en ambos 
contenedores. En el primer caso la luz tiene que viajar sólo 
en una corta distancia, mientras que en el segundo caso 
tiene que pasar a través de una longitud mucho más larga 
de la muestra. Podríamos deducir que en el segundo caso 
más cantidad de la luz será absorbida, ya que la longitud de
la trayectoria es mucho más larga. En otras palabras, la 
absorbancia aumenta a medida que la longitud de la 
trayectoria aumenta.
Las dos observaciones descritas anteriormente (las que se 
refieren a la relación entre la absorbancia y la 
concentración y la absorbancia y la longitud de la 
trayectoria) constituyen la Ley de Beer-Lambert, que se 
muestra a continuación:
A = ε * ι * c
Donde:
 A es un número adimensional.
 ι la constante de proporcionalidad, se denomina 
coeficiente de extinción molar o absortividad molar, 
tiene unidades de litro/mol*cm.
 c tienen las unidades habituales de longitud (cm) y 
concentración (mol/litro).
El coeficiente de extinción (ε) es una constante para una 
sustancia dada, siempre que la temperatura y la longitud 
de onda son constantes. En la práctica, el coeficiente de 
extinción medido también depende de las características del
instrumento utilizado. Por esta razón, normalmente no se 
utilizan valores predeterminados del coeficiente de 
extinción para análisis cuantitativo. Para transiciones 
electrónicas, la diferencia de energía entre los estados 
fundamentales y excitados, es relativamente grande. Por 
tanto, a temperatura ambiente, es muy probable que todas 
las moléculas estén en estado electrónico fundamental. La 
absorción y vuelta al estado fundamental, son procesos 
rápidos por lo que el equilibrio se alcanza muy 
rápidamente.
Es importante notar que ε es una función de la longitud de 
onda y por lo tanto la Ley de Beer-Lambert es verdadera 
sólo para la luz de una sola longitud de onda o luz 
monocromática.
La medida cuantitativa de la absorción de la luz en función 
de la longitud de onda puede establecer tanto la identidad 
como la concentración de una sustancia en solución.
MEDICIONES DE TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA.
 Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen 
por comparación entre la muestra problema y un estándar 
arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un 
porcentaje de transmitancia de 100%, esta es llamada 
referencia de 100%., o una absorbancia de cero.
SELECCIÓN DE LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO. 
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente,
a la longitud de onda en la cual la absorbancia del analito 
(sustancia a analizar) es máxima, y recibe la denominación 
de Lambda máximo (λmax). Para seleccionar el λmax., se 
hace un espectro de absorción o curva espectral, y que 
consiste en una gráfica de la absorbancia de una solución 
de la sustancia absorbente de concentración adecuada, 
medida a distintas longitudes de onda y en ella se 
determina el λmax. (Fig.3).
Fig. 3. CURVA ESPECTRAL
Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de 
longitudes de onda donde se espera que absorba la 
sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, 
las mediciones se realizan en la zona visible del espectro 
electromagnético (380 a 800nm). En el caso de sustancias 
no coloreadas, las mediciones se realizan en la región 
ultravioleta del espectro electromagnético (200 a 380nm).
CURVA DE CALIBRACIÓN 
Uno de los métodos más utilizados para determinar la 
concentración de una muestra problema, es el método de la
curva de calibración. Esta curva de calibración es una 
gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco 
soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con 
la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda 
máxima (λ max) (Fig. 4).
Fig. 4. CURVA DE CALIBRACION
Una vez obtenida la gráfica se determina la función 
matemática que presenta dicha recta a través del 
tratamiento estadístico de regresión de los mínimos 
cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la 
concentración de un analito. La siguiente ecuación 
matemática corresponde a dicha función: 
A = m*c + n
 A : Absorbancia.
 n : Intercepto de la recta 
 m : Pendiente de la recta y que corresponde al 
producto entre absortividad a de la muestra y el 
espesor b de la cubeta.
Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se 
interpola su valor en la gráfica o se reemplaza en la 
ecuación, para obtener el valor de concentración del 
analito. La concentración de la solución problema debe 
estar comprendida en el rango de concentración que 
comprende la curva de calibración. Si la concentración de la
solución problema es menor que la concentración del 
estándar más diluido, debe usarse el método de adición 
estándar, que consiste en adicionar un volumen 
determinado de un estándar concentrado a la solución 
problema, antes de realizar la lectura y que permite que 
esta lectura este dentro de las obtenidas para la curva de 
calibración. En el caso contrario, si la concentración del 
analito es mayor que la concentración del estándar más 
concentrado la solución problema deberá ser diluida.
Fig. 5. INTERPOLACION GRAFICA
Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la 
longitud de onda de máxima absorbancia (λmax.), para 
obtener una recta con la máxima pendiente y así tener 
mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones. La 
medición de la absorbancia de la solución problema debe 
hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la 
curva de calibración.