Microbiologi_a_Pruebas_Bioquimicas

Vista previa del material en texto

10
/3
/2
00
8 1
T
P
N
º
5
P
ru
eb
as
 B
ioq
uí
m
ic
as
T
.P
. N
º 
5 q
10/3/2008
2
l ió d t i d d t bl difiEspecie bacteriana:colección de cepas que comparten propiedades estables y difieren 
significativamente de otros grupos de cepas.
Especie bacteriana:
Asociación DNA-DNA (>70%)
Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)
IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO
Ensayos que ponen de manifiesto características metabólicas 
de los microorganismos.
Pruebas bioquímicas:
10/3/2008
3
Catalasa
Oxidasa
Hidrólisis de almidón
MotilidadMotilidad
Sensibilidad a antibióticos
IMViC
Agar Hierro-Dos azúcares de Kligler
API 20E
Pruebas bioquímicas para la 
identificación de 
enterobacteriasAPI 20E enterobacterias
10
/3
/2
00
8 4
P
ru
eb
a 
de
 la
 O
xi
da
sa
(c
ito
cr
om
o 
C
 o
xi
da
sa
)
V
ib
ri
o
A
er
om
on
as
A
er
om
on
as
P
se
ud
om
on
as
E
sc
he
ri
ch
ia
 c
ol
i
10/3/2008
5
Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)
Se utiliza un donor de 
electrones artificial (tetrametilelectrones artificial (tetrametil-
p-fenilenediamina).
Reacción + Reacción
Vibrio
Aeromonas
Enterobacterias
Reacción + Reacción -
Pseudomonas
10/3/2008
6
Prueba de la Catalasa
ó i i ó Compuesto producido en pequeñas cantidadesPeróxido de hidrógeno Compuesto producido en pequeñas cantidades 
durante la respiración aeróbica. Su producción 
está mediada por flavoproteínas.
Radical hidroxilo Radical libre altamente reactivo. Agente 
oxidante capaz de atacar cualquier molécula 
orgánica presente en la célula.
10/3/2008
7
Prueba de la Catalasa
Enzimas que actúan sobre CatalasaEnzimas que actúan sobre 
los derivados tóxicos del 
oxígeno:
Catalasa
Peroxidasa
Enzimas que destruyen el peróxido de 
hidrógeno.
Superóxido dismutasa Enzima que destruye el anión 
superóxido ( ).p ( )
10/3/2008
8
Prueba de la Catalasa
+-
BacillusReacción +
Staphylococcus
EnterobacteriasEnsayo:
Se toman bacterias de un cultivo 
sólido y se esparcen con ansa sobre
Aerobios estrictos o 
facultativos
Clostridium
S
Reacción -
sólido y se esparcen con ansa sobre 
una gota de peróxido de hidrógeno 
30%.
Streptococcus
Lactobacillus
Anaerobios estrictos o 
microaerófilos
10/3/2008
9
Hidrólisis de almidón
α-amilasa: Enzima que hidroliza los enlaces α(1-4) α amilasa: q ( )
de polímeros de glucosa.
+-
Agregado de B ill
Reacción +
(Halo transparente)
Agregado de 
Lugol
Bacillus
Agar - almidón
10/3/2008
10
Motilidad
Se detecta la presencia de flagelo bacteriano.
Se cultivan las bacterias por punción en 
placas de agar blando.
Se observa migración como un halo desdeSe observa migración como un halo desde 
el punto de siembra.
StaphylococcusPseudomonas
Bacterias móviles Bacterias no móviles
Bacillus
Enterobacter
Vibrio
10/3/2008
11
Sensibilidad a antibióticos
Mecan ism os de acción
Inhibición de la síntesis de la pared(Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,
Cefalosporinas, Vancomicina, etc.) 
Inhibición de la síntesis de proteínas(Streptomicina, Gentamicina, 
Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)
Inhibición de la sínteis de ácidos nucléicos(Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)
Disrupción de la membrana (Polimixina B)
Antagonistas metabólicos(Sulfonamida, Trimetoprima)
10/3/2008
12
Sensibilidad a antibióticos
Anális is de 
MIC (concentración inhibitoria mínima)
Anális is de 
sens ibilidad a 
an tibió ticos
MLC (concentración letal mínima)
Anális is de d ifus ión en agar
(sistema de discos)
10/3/2008
13
Sensibilidad a antibióticos
Se crecen cultivos en medio líquido.
Metodo logía de trabajo :
Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.
Se depositan discos con diferentes antibióticos.
Se mide el diametro del halo de inhibición.
10/3/2008
14
Pruebas bioqu im icas para la Pruebas bioqu im icas para la 
iden tificación de En te robacte rias
Cocobacilos Gram negativos
Aerobios facultativos (Catalasa positivos)
Fermentadores de Glucosa
Oxidasa negativosOxidasa negativos
1) IMViC
a) Prueba del Indol)
b) Rojo Metilo
c) Voges Proskauer
d) Prueba del citrato
2) Agar Hierro Dos Azúcares de Kligler
10/3/2008
15
IMV iC1)
a) Prueba del Indol
Indol: Subproducto de la degradación del aminoácido Triptofano 
por la enzima triptofanasa.
)
por la enzima triptofanasa.
Cultivar la bacteria en caldo de peptonas 
Reacción +
Formación de una fase
Reacción –
Formación de una fase
(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.
Agregar al cultivo cinco gotas de reactivo 
de Kovacs (dimetilaminobenzaldehído).
Formación de una fase 
orgánica roja
Formación de una fase 
orgánica amarilla
El reactivo de Kovacs reacciona con el 
indol dando un producto de color rojo.
E. coliSalmonella
ProteusEnterobacter
Klebsiella
10/3/2008
16
Fermentacion:
Tipos de FermentaciónTipos de Fermentación
1) Láctica
2)Alcohólica
3) Propiónica
4) Butilenglicólica
5) Ácido Mixta
6)Aceto-Butírica
10
/3
/2
00
8
17
F
t
ió
B
til
li
ól
i
F
er
m
en
ta
ci
ón
 B
ut
il
en
gl
ic
ól
ic
a
E
nt
er
ob
ac
te
r
Se
rr
at
ia
Se
rr
at
ia
E
rw
in
ia
B
ac
ill
us
10
/3
/2
00
8
18
Á
F
er
m
en
ta
ci
ón
Á
ci
do
 
M
ix
ta
E
sc
he
ri
ch
ia
, S
al
m
on
el
la
, 
P
ro
te
us
, e
tc
.
10/3/2008
19
IMV iC1)
b) Rojo de Metilo
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar 
f ió á id i
)
fermentación ácido-mixta.
Rojo de Metilo: Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3
Se inocula medio RM-VP Reacción +ReacciónSe inocula medio RM VP
Incubación 48h a 37ºC
Se agregan 3 gotas de Rojo de 
Reacción +
(Rojo)
Reacción –
(Amarillo)
Metilo 0,1%.
E. coliEnterobacter E. coli
Klebsiella
10/3/2008
20
IMV iC1)
c) Voges Proskauer
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de producir 
il il bi l ( í ) i d l f ió b il li óli d l
)
acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la frementación butilenglicólica de la 
glucosa.
Se inocula medio RM-VP
Reacción +Reacción–
Incubación 48h a 37ºC
Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit 
( f l i l j l i l
Reacción +Reacción 
(α-naftol, vira al rojo al reaccionar con la 
acetoína) y 0,2 ml de KOH 40%.
E. coli Enterobacter
Klebsiella
10/3/2008
21
IMV iC1)
d) Prueba del Citrato
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizar 
citrato como única fuente de carbono
)
citrato como única fuente de carbono.
Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul de 
b ti l i di d d H)bromotimol como indicador de pH). 
Incubación 48h a 37ºC
Reacción +Reacción –
Sin cambio (medio de 
color verde).
Crecimiento y viraje al 
azul (la eliminación del 
citrato alcaliniza el 
medio).
E. coli
Shigella
Salmonella
Enterobacterg
Klebsiella
10/3/2008
22
IMV iC1)
I M V C
)
I M V C
++ _
+
Escherichia coli _
Proteus mirabilis + _ _
+
_
_
++
Salmonella
Enterobacter
_
Kl b i ll
+ _
Klebsiella
__
+ +
10/3/2008
23
2) Agar Hierro-Dos azúcares de Kligler) g g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para 
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.
d A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendoPeptona de carne
Lactosa y Glucosa
(10:1)
A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendo 
una alcalinización del medio.
La fermentación de estos sustratos produce compuestos 
ácidos.
Tiosulfato de sodio.
Citrato de hierro y amonio. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de 
hidrógeno, el cual reacciona con la sal de hierro 
produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .
Rojo fenol Vira al amarillo en medio ácido.
10/3/2008
24
2) Agar Hierro-Dos azúcares de Kligler) g g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para 
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.
Se inocula el medio por 
punción y estría en 
superficiesuperficie.
Incubación 24h a 37ºC
10/3/2008
25
2) Agar Hierro-Dos azúcaresde Kligler) g g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para 
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.
10/3/2008
26
API 20E
Sistema para la identificación rápida de enterobacterias.p p
Dispositivo plástico con tubos que contienen medios deshidratados.
Se inocula cada minitubo con una suspensión del microorganismo a analizar y se 
incuba 24 hs a 37ºC en una atmósfera húmeda.
Al cada resultado se le asigna un código que da como resultado un número de 7 
cifras que se compara con tablas o bases de datos para la identificación de la q p p
especie..
10
/3
/2
00
8
27
A
P
I 2
0E