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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA Evaluación del proceso de maduración de la Uvilla (Physalis peruviana) mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa para determinar el tiempo adecuado de cosecha. Proyecto de Investigación (Graduación), Modalidad: Trabajo Estructurado de Manera Independiente (TEMI) presentado como requisito previo a la obtención del Título de Ingeniero Bioquímico, otorgado por la Universidad Técnica de Ambato, a través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería En Alimentos. Autor: Jaime Vinicio Herrera Villarroel Tutora: Ing. Mg. Cecilia Carpio Ambato – Ecuador 2014 APROBACIÓN DE LA TUTORA Ing. Mg. Cecilia Carpio Siendo la Tutora del Trabajo de Investigación bajo el tema: “Evaluación del proceso de maduración de la uvilla (Physalis peruviana) mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa para determinar el tiempo adecuado de cosecha.”, realizado por el egresado Jaime Vinicio Herrera Villarroel; tengo a bien afirmar que el estudio es idóneo y reúne los requisitos de un trabajo de investigación de Ingeniería Bioquímica; y el señor egresado posee los méritos académicos suficientes para ser sometido a la evaluación del Jurado Examinador que sea designado por el H. Consejo Directivo de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Ambato, Agosto del 2014. …………………………………… Ing. Mg. Cecilia Carpio TUTORA AUTORÍA El presente trabajo de investigación: “Evaluación del proceso de maduración de la uvilla (Physalis peruviana) mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa para determinar el tiempo adecuado de cosecha.”, es absolutamente original, auténtico y personal, en tal virtud, el contenido y efectos académicos que se desprendan del mismo son de exclusiva responsabilidad del autor. Ambato, Agosto del 2014. …………………………………… Jaime Vinicio Herrera Villarroel CI: 180434196-2 APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE GRADO UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA Los miembros del Tribunal de Grado aprueban el presente Trabajo de Graduación de acuerdo a las disposiciones emitidas por la Universidad Técnica de Ambato. Ambato, Agosto del 2014. Para constancia firman: …………………………………… Ing. Mg Gladys Navas Miño. PRESIDENTE DEL TRIBUNAL …………………………………… ………………………………… Químico Lander Pérez Ing. Mg. Manolo Córdova MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL DEDICATORIA Primero a Dios Por otorgarme muchas bendiciones a lo largo de mi carrera. A mis Padres Jaime y María por su apoyo incondicional hacia el cumplimiento de mis objetivos, eterno cariño, ejes fundamentales en mi vida. A mi Hermana Diana por ser uno de mi motivación para seguir adelante. A la memoria de mi Segundo Padre Lino Herrera quien me enseño afrontar con valor y esfuerzo los momentos difíciles de la vida. A todos los familiares y amigos que hicieron posible alcanzar mis metas. Vinicio AGRADECIMIENTO El más sincero agradecimiento hacia mis Padres Jaime y María, mi Hermana Diana por su incondicional apoyo y palabras de aliento Mis agradecimientos a la Universidad Técnica de Ambato Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos, Carrera de Ingeniería Bioquímica por los conocimientos adquiridos. Al Ing. Mg. Cecilia Carpio. Por su confianza y paciencia depositada en mí desde el primer momento de la realización de mi trabajo de investigación. A la Asociación Artesanal Tierra Productiva del cantón Quero, por brindarme la oportunidad de realizar mí trabajo de investigación. A los familiares, amigos y personas que colaboraron en este mi proyecto de graduación. ÍNDICE CAPÍTULO I...................................................................................................10 EL PROBLEMA...............................................................................................12 1 .1 Tema de Investigación:.....................................................................................12 1 .2 Planteamiento de Problema:............................................................................12 1.2.1 Contextualización....................................................................................12 1.2.2 Análisis Crítico........................................................................................15 1.2.3 Prognosis...............................................................................................16 1.2.4 Formulación Del Problema........................................................................16 1.2.5 Preguntas Directrices...............................................................................17 1.2.6 Delimitación Del Problema........................................................................17 1 .3 Justificación...................................................................................................18 1 .4 Objetivos.......................................................................................................19 1.4.1 Objetivo General.....................................................................................19 1.4.2 Objetivos Específicos...............................................................................19 CAPÍTULO II..................................................................................................20 MARCO TEÓRICO..........................................................................................20 2 .1 Antecedentes Investigativos.............................................................................20 2 .2 Fundamento Filosófico....................................................................................23 2 .3 Fundamento Legal..........................................................................................24 2 .4 Categorías Fundamentales..............................................................................34 2.4.1 Gráficos de inclusión interrelacionados.......................................................34 2 .5 Hipótesis.......................................................................................................35 2.5.1 Hipótesis nula (Ho):.................................................................................35 2.5.2 Hipótesis Alternativa (H1)..........................................................................35 2 .6 Señalamiento De Variables De La Hipótesis.......................................................35 2.6.1 Variable independiente:............................................................................35 2.6.2 Variable dependiente:..............................................................................35 CAPÍTULO III..................................................................................................36 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN..........................................................36 3 .1 Enfoque........................................................................................................36 3 .2 Modalidad básica de la investigación.................................................................36 3 .3 Nivel O Tipo De Investigación...........................................................................37 3.3.1 Exploratorio............................................................................................37 4 3.3.2 Descriptivo.............................................................................................37 3 .4 Población Y Muestra.......................................................................................37 3.4.1 Población...............................................................................................37 3.4.2 Muestra.................................................................................................373 .5 Operacionalización De Variables......................................................................38 3.5.1 Operacionalización de la variable independiente: Parámetros óptimos de maduración... …...................................................................................................................... ...38 3.5.2 Operacionalización de la variable dependiente: Cuantificación de almidón, azúcares e invertasa........................................................................................39 3 .6 Recolección de Información.............................................................................40 3.6.1 Preparación de las muestras para análisis..................................................40 3.6.2 Cuantificación de Almidón.........................................................................41 3.6.3 Preparación de la curva estándar de glucosa con DNS.................................41 3.6.4 Cuantificación de Glucosa........................................................................44 3.6.4 Curva de Calibración para Glucosa con Reactivo MR...................................46 3.6.5 Cuantificación de Sacarosa.......................................................................46 3.6.6 Cuantificación de Azúcares Reductores......................................................48 3.6.7 Determinación de la Actividad Enzimática de la Invertasa..............................49 3 .7 Procesamiento y Análisis.................................................................................50 CAPÍTULO IV.................................................................................................51 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS............................................51 4 .1 Cuantificación de Almidón................................................................................52 4 .2 Cuantificación de Glucosa...............................................................................54 4 .3 Cuantificación de Sacarosa..............................................................................55 4 .4 Cuantificación de Azúcares Reductores.............................................................56 4 .5 Determinación De La Actividad Enzimática De La Invertasa..................................57 4 .6 Verificación de hipótesis..................................................................................61 CAPÍTULO V..................................................................................................62 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.......................................................62 5 .1 Conclusiones.................................................................................................62 5 .2 Recomendaciones..........................................................................................64 CAPÍTULO VI.................................................................................................65 PROPUESTA..................................................................................................65 5 6 .1 Datos informativos..........................................................................................65 6 .2 Antecedentes de la propuesta..........................................................................66 6 .3 Justificación...................................................................................................67 6 .4 Objetivos.......................................................................................................67 6.4.1 Objetivo General.....................................................................................67 6.4.2 Objetivos específicos...............................................................................68 6 .5 Análisis de factibilidad.....................................................................................68 6 .6 Fundamentación............................................................................................68 6 .7 Metodología..................................................................................................69 6.7.1 Siembra por tutoreo.................................................................................70 6.7.2 Análisis de Glucosa.................................................................................70 6.7.3 Análisis de °Brix......................................................................................71 6 .8 Administración de la propuesta.........................................................................72 6 .9 Previsión de la evaluación...............................................................................73 7 Bibliografía..................................................................................................74 ANEXO A.......................................................................................................78 RESPUESTAS EXPERIMENTALES...................................................................78 Tabla A1. Pesos de uvillas verdes, pintonas y maduras con y sin tutoreo................79 Tabla A2. Lecturas de ° Brix, ph, humedad, de uvillas verdes, pintonas y maduras con y sin tutoreo....................................................................................................79 Tabla A3. Datos de absorbancia de la curva estándar de glucosa para lectura de almidón..........................................................................................................80 Gráfico A1. Curva estándar de Glucosa, para la cuantificación de Almidón y Azúcares Reductores.....................................................................................................80 Tabla A4. Lecturas de absorbancia a 540 nm para la cuantificación de almidón en muestra de uvilla con y sin tutoreo para los tres estados de madurez......................81 Tabla A5. Contenido de almidón obtenido de uvillas con y sin tutoreo en base seca. .81 Gráfico A2. Cantidad de almidón en uvillas con y sin tutoreo..................................82 Tabla A6. Pesos de los componentes de la solución stock de glucosa.....................83 Tabla A7. Lecturas de absorbancia de glucosa para los tres estados de madurez de la uvilla, cultivada con y sin tutoreo........................................................................83 Tabla A8. Datos para la curva estándar de glucosa...............................................84 Tabla A9. Datos de absorbancia de la curva de calibración en base a pesos de glucosa…………………………………………………………………………………………… …………………………………….84 Gráfico A3. Curva de calibración de Glucosa en base a pesos...............................85 6 Tabla A10. Contenido en gr de glucosa por 100 gr de uvilla seca obtenida de uvillas con y sin tutoreo en base seca..........................................................................85 Gráfico A4. Contenido de glucosa en uvillas con diferentes grados de madurez, cultivadas con y sin tutoreo...............................................................................86 Tabla A11. Lecturas de absorbancia de sacarosa a 500 nm para los tres estados de madurez de la uvilla con y sin tutoreo.................................................................87 Tabla A12. Contenido en gr sacarosa y glucosa por 100 gr de uvillas secas con y sin tutoreo...........................................................................................................87 Tabla A13. Contenido en gr sacarosa y glucosa por 100 gr de uvillas secas con y sin tutoreo...........................................................................................................88 Gráfico A5. Cantidad de sacarosa en uvillas con y sin tutoreo................................88 Tabla A14. Lecturas de absorbancia de azúcares reductores a 540 nm para muestras de uvilla con tres estados de madurez cultivadas con y sin tutoreo.........................89 Tabla A15. Cantidad en gr de azúcares reductores por 100 gr de uvilla secaobtenida en uvillas con y sin tutoreo................................................................................89 Gráfico A6. Cantidad de azúcares reductores en uvillas con distinto grado de madurez, cultivados con y sin tutoreo...............................................................................90 Tabla A16. Lecturas de absorbancia a(540 nm) de azúcares reductores generados durante la determinación de actividad de la invertasa para muestras de uvilla, con tres estados de madurez cultivada sin tutoreo............................................................91 Tabla A17. Lecturas de absorbancia a(540 nm) de azúcares reductores generados durante la determinación de actividad de la invertasa para muestras de uvilla, con tres estados de madurez cultivada con tutoreo..........................................................92 Tabla A18. Contenido de azúcares reductores producidos durante la hidrólisis de sacarosa producida por la invertasa para muestras de uvillas sin tutoreo con tres estados de madurez expresados en mg/ml de azúcares reductores para uvilla sin tutoreo...........................................................................................................93 Gráfico A7. Cinética de formación de producto de la enzima de Uvilla Sin Tutoreo....93 Tabla A19. Contenido de azúcares reductores producidos durante la hidrólisis de sacarosa producida por la invertasa para muestras de uvillas sin tutoreo con tres estados de madurez expresados en mg/ml de azúcares reductores para uvilla con tutoreo...........................................................................................................94 Gráfico A8. Cinética de formación de producto de la enzima de Uvilla Con Tutoreo...94 ANEXO B.......................................................................................................95 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS...............................................................................95 Tabla B1. Análisis de varianza del contenido de almidón en muestras de uvilla con diferentes estados de madurez la uvilla, cultivadas con y sin tutoreo.......................96 Tabla B2. TUKEY Prueba de comparación múltiple para el estado de madurez........96 Tabla B3. Prueba de comparación múltiple para la aplicación de tutoreo.................96 7 Tabla B4. Prueba de comparación múltiple para el interacción de estado de madurez y aplicación de tutoreo........................................................................................97 Gráfico B1. Interacción de estado de madurez y aplicación de tutoreo en el contenido de almidón.....................................................................................................97 Tabla B6. Análisis de varianza del contenido de glucosa realizada con muestras de uvilla cultivada con y sin tutoro a los diferentes estados de madurez.......................98 Tabla B7. Prueba de comparación múltiple del contenido de glucosa para el estado de madurez.........................................................................................................98 Tabla B8. Prueba de comparación múltiple para análisis de glucosa con y sin tutoreo ………...........................................................................................................98 Tabla B9. Prueba de comparación múltiple para la interacción del estado de madurez y aplicación de tutoreo........................................................................................99 Gráfico B2. Interacción de estado de madurez y aplicación de tutoreo para el contenido de glucosa.......................................................................................99 Tabla B10. Análisis de varianza de la actividad enzimática realizada con extractos obtenidos de muestras de uvilla con diferentes estados de madurez para fruta cultivada con y sin tutoreo..............................................................................100 Tabla B11. Pruebas de comparación múltiple de la actividad invertásica para aplicación de tutoreo.....................................................................................................100 Tabla B12 Prueba de comparación múltiple de actividad invertásica para el estado de madurez.......................................................................................................100 Tabla B13. Prueba de comparación múltiple para el tiempo actividad de la enzima. 101 Tabla B14 Prueba de comparación múltiple para interacción de aplicación de tutoreo y estado de madurez........................................................................................101 Tabla B15 Prueba de comparación múltiple para interacción la aplicación de tutoreo y tiempo de la actividad enzimática.....................................................................101 Tabla B16 Prueba de comparación múltiple para interacción del estado de madurez y tiempo de la actividad de enzima.....................................................................102 Tabla B17. Prueba de comparación múltiple para la interacción de aplicación de tutoreo, estado de madurez y tiempo de actividad de la enzima...........................103 Gráfico B3. Interacción del estado madurez y aplicación de tutoreo de la enzima. . .104 Gráfico B4. Interacción del tutoreo y tiempo de actividad de la enzima..................104 Gráfico B5. Interacción del estado madurez y tiempo de actividad de la enzima.....105 ANEXO C.....................................................................................................106 FOTOGRAFÍAS............................................................................................106 Imagen C1. Cuadro de color en la maduración de la uvilla (Physalis peruviana).....107 Fotografía C1: Uvillas (Physalis peruviana) verde sin tutoreo)..............................108 Fotografía C2: Uvillas (Physalis peruviana) verde con tutoreo..............................108 8 Fotografía C3: Uvillas (Physalis peruviana) pintona sin tutoreo.............................108 Fotografía C4: Uvillas (Physalis peruviana) pintona con tutoreo...........................109 Fotografía C5: Uvillas (Physalis peruviana) madura sin tutoreo............................109 Fotografía C6: Uvillas (Physalis peruviana) madura con tutoreo...........................109 Fotografía C7: Prevaricación de muestra de uvillas............................................110 Fotografía C7: Muestra de uvillas para análisis de azúcares y almidón sin tutoreo. .110 Fotografía C8: Muestra de uvillas para análisis de azúcares y almidón con tutoreo. 110 Fotografía C9: Centrifuga con muestra de uvillas para análisis de almidón y azúcares……………………………. ……………………………………………………………………………………………….111 Fotografía C10: Liberación de etanol de muestras para análisis de azúcares.........111 Fotografía C11: Preparación para análisis de glucosa.........................................111 Fotografía C12: Muestras para análisis de glucosa.............................................112 9 “EVALUACIÓN DEL PROCESO DE MADURACIÓN DE LA UVILLA (Physalis Peruviana) MEDIANTE LA CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES, ALMIDÓN E INVERTASA PARA DETERMINAR EL TIEMPO ADECUADO DE COSECHA” Herrera, Vinicio y Carpio, Cecilia UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO. FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS e-mail: rokrss@gmail.com AMBATO – ECUADOR RESUMEN El presente trabajo de investigación, se orientó a seguir el proceso de maduración de la uvilla (Physalis peruviana) con tutoreo y sin tutoreo, mediante la cuantificación de almidón, azúcares y la cinética de hidrólisis de la sacarosa catalizada por la invertasa Se evidenció que el contenido promedio de almidón y azúcares así como la actividad de la invertasa fue mayor en las muestras de uvilla cultivadas con tutoreo durante los tres estados de madurez estudiados. Así, el contenido promedio de almidón en la uvillaverde sin tutoreo fue de 6,480,58 gr almidón/100 gr de uvilla seca, mientras que en uvillas verdes con tutoreo fue de 9,630,30 gr almidón/100 gr de uvilla seca y descendió en los dos casos a medida que avanzó el proceso de maduración hasta 2,700,55 gr almidón/100 gr de uvilla seca, en uvillas cultivadas con tutoreo y 2,820,62 gr almidón/100 gr de uvilla seca en uvillas que crecieron sin tutoreo. El contenido de glucosa presente en uvillas maduras sin tutoreo fue de 3,3770,08 gr glucosa/100 gr de uvilla seca, y para uvillas maduras con tutoreo fue de 3,6740,02gr glucosa/100 gr de uvilla seca, y la actividad de la invertasa determinada a través del contenido de azúcares reductores producidos por la acción hidrolítica de la enzima sobre sacarosa fue más alta en el extracto obtenido a partir de uvillas maduras: 0,620,03 mg/ml para uvillas cultivadas sin tutoreo y 0,860,02 mg/ml en uvillas maduras con tutoreo. Consecuentemente, la aplicación del tutoreo brinda mejores resultados en el cultivo de la uvilla debido a que proporciona un soporte a la planta, mejor aireación en el fruto y la oportunidad de aprovechar de una mejor manera la luz 10 solar, como se constata en los niveles más altos de almidón, glucosa, e invertasa obtenidos en este tratamiento que constituye el mejor tratamiento. Palabras clave: uvilla, Physalis peruviana, tutoreo, almidón, invertasa. 11 CAPÍTULO I 1. EL PROBLEMA 1.1 Tema de investigación: Evaluación del proceso de maduración de la Uvilla (Physalis peruviana) mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa para determinar el tiempo adecuado de cosecha 1.2 Planteamiento de problema: 1.2.1 Contextualización 1.2.1.1 Contextualización macro La uvilla es una fruta de origen americano, que pertenece al grupo de frutas semi-ácidas, es una baya carnosa formada por carpelos soldados entre sí, es redonda, amarilla, dulce y pequeña con una cáscara protectora, derivada de una planta herbácea silvestre (Flores et al., 2009). El diámetro del fruto varía de 0.8 a 2.0 cm. A este fruto se le conoce con diferentes nombres en varias regiones y países como: uvilla en Ecuador, topo-topo en Venezuela, cereza del Perú en Perú, uchuva en Colombia y cereza del cabo en Sudáfrica (La coctelera, 2013). La uvilla es rica en vitaminas A y C, además contiene Calcio y Fósforo; contribuye a la purificación de la sangre, elimina la albúmina de los riñones, reconstruye y fortifica el nervio óptico, y es muy eficaz en el tratamiento de afecciones de la garganta, también se le atribuye propiedades calcificadoras, es recomendada en dietas para el control de la diabetes; sus propiedades diuréticas ayudan en el tratamiento de los problemas de próstata y el zumo de uvilla madura sirve para curar cataratas aplicando unas gotas diariamente (Rotger, 2013). 12 1.2.1.2 Contextualización meso Gracias a las condiciones geográficas y climáticas de los andes ecuatorianos podemos aprovechar sus ventajas naturales para el cultivo de uvilla ya que proporcionan las condiciones favorables para su óptimo desarrollo. La uvilla forma parte de la ecología del Ecuador y se encuentra en diferentes provincias como Cotopaxi, Tungurahua, Imbabura, Carchi, Pichincha, etc. (Ecofinsa, 2011). Las condiciones favorables del clima y suelo del Ecuador, permiten la producción agrícola de calidad para el mercado nacional e internacional. La constante demanda de nuevos productos en el mercado mundial, ha impulsado la diversificación de la producción y exportación en el Ecuador, esto debido a la promoción de cultivos no tradicionales, entre los cuales está la uvilla (Brito, 2002). A partir de los años 80, la uvilla empieza a tener valor económico, debido a características como: aroma, sabor dulce y bondades nutricionales y medicinales conocidas en la actualidad como nutraceúticas. Esto ha permitido que la demanda se incremente así como su producción, y se la encuentre en la mayoría de mercados y supermercados del país (Brito, 2002). A nivel de país, desde hace una década la fruta ha cobrado interés en el mercado nacional e internacional, incentivándose su cultivo en la serranía norte, provincias de Tungurahua, y Pichincha principalmente, extendiéndose su producción a las provincias de Azuay y Loja (MAGAP, 2013). 1.2.1.3 Contextualización micro En Tungurahua, el cantón Quero impulsa el cultivo de la uvilla, particularmente, la Asociación Artesanal “Tierra Productiva”. Al momento, su fuerte es la producción y comercialización de uvilla, pero también aspiran a producir 13 derivados con esta fruta, y para ello planifican estrategias en busca de entidades que apoyen su iniciativa para conseguir la maquinaria necesaria para la producción. Los agricultores y productores de uvilla del cantón Quero pertenecientes a la Asociación Tierra Productiva emprendieron en un proyecto de mejoramiento agroindustrial de la uvilla, mediante el uso de abono orgánico y manejo tecnológico adecuado para incrementar su producción, evitando el empleo de fungicidas químicos con el claro objetivo de mejorar el nivel de vida de los socios y disminuir la contaminación ambiental. El organismo artesanal posee una microempresa con los equipos necesarios para producir helados, mermelada de uvilla. Actualmente elaboran helados con esta fruta y otras que se producen en el cantón los cuales son comercializados en Tungurahua. Además han llevado sus productos (helados y mermeladas) a diferentes ferias productivas desarrolladas en la provincia y el país. Adicionalmente, se plantean ampliar la oferta de productos elaborados a través de la producción de uvillas deshidratadas, pulpa y productos de la fermentación acética con el apoyo de la FCIAL a través de nuevos proyectos de investigación y de vinculación con la comunidad, tomando en consideración que las uvillas cuentan con vitaminas reconocidas que sirven para contrarrestar enfermedades. 14 Limitada disponibilidad en el mercado de uvilla cosechada con el grado de madurez adecuado para un mejor aprovechamiento del fruto Insatisfacción en los consumidores por inadecuada madurez en la uvilla Desperdicio de frutos de la uvilla contribuyen a una actividad agrícola poco rentable. Escasos estudios sobre parámetros de madurez de la uvilla Inexistencia de los parámetros postcosecha de la Uvilla mediante cuantificación de azúcares, almidón e invertasa Reducido empleo del fruto de la uvilla en productos comercialesApreciación empírica (subjetiva) de la madurez de la Uvilla en base a atributos físicos 1.2.2 Análisis crítico 1.2.2.1 Árbol de problemas EFECTOS PROBLEMA CAUSAS Figura 1. Árbol de problemas Elaborado por: Vinicio Herrera, 2014. 15 1.2.2.2 Relación causa – efecto. Causa Apreciación empírica (subjetiva) de la madurez de la Uvilla en base a atributos físicos Efecto Desperdicio de frutos de la uvilla (Physalis peruviana) contribuyen a una actividad agrícola poco rentable. 1.2.3 Prognosis La presente investigación pretende estudiar el proceso de maduración de la uvilla, mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa a fin de establecer una correlación con los parámetros tradicionalmente utilizados por los agricultores para la cosecha, los cuales se basan principalmente en la coloración del capuchón. En base a los datos obtenidos se espera establecer el tiempo de cosecha apropiado para que la uvilla tenga los atributos más adecuados para la elaboración de productos derivados como mermeladas, helados, vino, los cuales representarían una fuente económica de ingreso a la Asociación Artesanal “Tierra Productiva”, incentivando así una mejor producción y comercialización de uvilla con la ayuda de estrategias que apoyenel mejoramiento de la producción. 1.2.4 Formulación del problema ¿La evaluación de los procesos de maduración de la uvilla mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa ayudará a correlacionar mejor los parámetros físicos (color del capuchón) que se manejan para cosechar la fruta de modo que la misma tenga el grado de maduración adecuado en base al tiempo de cosecha? 16 1.2.5 Preguntas directrices ¿Si no se establece un rango adecuado para el tiempo de cosecha de la uvilla que sucederá con este producto una vez cosechado? ¿Cuál es la variación físico-química que experimenta la uvilla durante el proceso de maduración? ¿Qué beneficios obtendrá el agricultor y productores de los derivados de uvilla con el estudio del proceso de maduración? 1.2.6 Delimitación del problema Delimitación del contenido Área: Investigación Sub-área: Postcosecha de la uvilla Sector: Fisiología vegetal Sub-sector: Conservación del fruto Delimitación espacial La investigación se llevará a cabo con uvillas del cantón Quero de la Asociación Tierra Productiva y en los laboratorios de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos de la Universidad Técnica de Ambato. Delimitación temporal La investigación se realizará en el tiempo comprendido entre el mes de Julio del 2013 al mes de Mayo del 2014 17 1.3 Justificación La Maduración de la fruta es un fenómeno complejo, con varios cambios bioquímicos y fisiológicos que tienen lugar en un corto período de tiempo, estos cambios afectan el sabor, color y textura de las frutas, atributos que contribuyen a hacer de estos órganos de plantas aptos para el consumo. El aumento de la actividad metabólica de la fruta está relacionado con cambios en la expresión génica de varias enzimas importantes, que están por lo general bajo el control de las hormonas vegetales. La cosecha de la fruta en un punto adecuado de madurez es fundamental para la preservación y comercialización en buen estado, debido a que el grado de madurez condiciona el almacenamiento y la calidad final, por lo cual se pretende determinar el grado de maduración en la uvilla en base a estos factores físico-químicos como la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa y encontrar una correlación con los parámetros tradicionales manejados por los agricultores. Mediante el establecimiento del grado de maduración correcto de la uvilla se pretende incrementar el tiempo de vida útil postcosecha lo cual posibilitaría la exportación de este producto a otros países expandiendo los beneficios de este fruto. A la vez se espera incentivar en el pequeño agricultor y empresarios una mejor capacidad de apreciación del grado madurez lo que facilitaría un manejo cosecha y postcosecha satisfactorio junto con la posibilidad de mejorar el rendimiento en la elaboración de diferentes productos. 18 1.4 Objetivos 1.4.1 Objetivo general Evaluar el proceso de maduración de la Uvilla (Physalis peruviana) mediante la cuantificación de azúcares, almidón e invertasa para determinar el tiempo adecuado de cosecha. 1.4.2 Objetivos específicos Determinar los niveles de azúcares, almidón e invertasa en tres fases del proceso de maduración de la uvilla. Correlacionar las variaciones en el contenido de azúcares, almidón e invertasa que experimenta la uvilla durante el proceso de maduración con los parámetros físicos tradicionalmente utilizados para definir el tiempo de cosecha (color del capuchón y del fruto). Comparar el efecto del tutoreo en el desarrollo del fruto y en el tiempo de maduración de la Uvilla. 19 CAPÍTULO II 2 MARCO TEÓRICO 2.1 Antecedentes Investigativos Pilamala (2010), de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos de la Universidad Técnica de Ambato señala que la uvilla ecuatoriana está siendo introducida paulatinamente en el mercado internacional, principalmente por su sabor y características medicinales y nutritivas que la hacen muy atractiva para su mercadeo y comercialización. Además por su alto contenido en pectina, la uvilla es especialmente apropiada para mermeladas, salsas y gelatinas. Su gusto ácido en salsas combina bien con carnes, mariscos, vegetales y otros frutos y, secadas al sol se consumen como pasas. Altamirano (2010), del Colegio de Agricultura, Alimentos y Nutrición de la Universidad San Francisco de Quito menciona en sus estudios que la planta de uvilla es un arbusto muy denso, por lo cual plantaciones comerciales se deben sostener mediante tutores y amarres debido a que cuando están en producción alcanzan excesivo peso, ocasionando volcamientos y ruptura de ramas; este problema se agrava en zonas de vientos fuertes o en terrenos con elevada pendiente; el tutoreo mejora también la disposición de las ramas y tallos factor que facilita las labores agrícolas como podas, deshierbas, controles fitosanitarios, riego y cosechas. Zapata et al.,(2002) de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria señalan que existen varios sistemas de tutorado y amarre para el cultivo, que dependen de la región y del material genético que se emplea en la siembra. El sistema más utilizado permite la formación de la planta en “V”, que facilita la disponibilidad de la luz y favorece la aireación del cultivo, lo cual 20 permite reducir el ambiente favorable para el desarrollo de enfermedades; igualmente facilita algunas labores de cosecha, podas y controles fitosanitarios. El tutorado se debe instalar inmediatamente después del trasplante para mantener la arquitectura esperada; el objetivo del tutoreo es facilitar la entrada de la luz y favorecer la aireación del cultivo, esto mejora la calidad de la fruta. Álvarez et al. (2012), del Área agropecuaria y de recursos naturales renovables de la Universidad de Loja resalta que la uvilla es una fruta que debe cosecharse madura desde la planta, porque no puede madurarse después de la cosecha. Por lo tanto, esta actividad se debe realizar en forma manual, cortando los pedúnculos con tijeras o arrancándolos con prolijidad de modo que no se maltarte el fruto. El estado fisiológico ideal es cuando el capuchón presenta una coloración amarilla, muy atractiva a la vista y provocativa al paladar. Uvillas con capuchones de color café y con manchas por la excesiva humedad no se deben cosechar. La cosecha es escalonada, es decir todas las semanas hay frutos para recolectar. Debe evitarse cosechar cuando llueve o los frutos estén mojados o con mucho rocío, éstos deben estar completamente secos (sin humedad). Se depositan en cajas de cartón, bandejas plásticas con capacidad de no más de cinco kilos, demasiado peso puede reventar la fruta o arrugar los capuchones, que es el envase natural y netamente orgánico con que debería presentarse la fruta al consumidor. FONTAGRO (2008) menciona que la uvilla se recolecta cuando el color del cáliz comienza a presentar coloración amarilla y el fruto es amarillo naranja. La cosecha se lleva a cabo directamente con la mano, pero últimamente se usa tijeras. Las uvillas de exportación se cosechan cuando el color del capuchón comienza a amarillarse pero para venta local el color del cáliz puede ser más amarillo. En este estudio se evaluaron el color, firmeza, pH, grados brix, acidez titulable (como ácido cítrico) e intensidad respiratoria. 21 Agronet(Colombia) sugiere que se deben utilizar al menos dos métodos para determinar el grado de madurez. Los indicadores de madurez son parámetros que se emplean para determinar el grado de desarrollo de las frutas y por lo tanto se utilizan como criterios para determinar el momento preciso para iniciar la recolección. Figura 2. Métodos para la determinación de los índices de madurez TOAPANTA (2012) señala que lacosecha se inicia cuando los frutos toman una coloración anaranjada y el capuchón que encierra la fruta se torna de color amarillo. Según Brisco (2006), la uvilla se clasifica según su maduración en grados que van del “0” al “6” El tiempo de vida útil de una uvilla cosechada en grado 5 de madurez, es más largo que el de una uvilla con grado 6. 22 Figura 3. Etapas de maduración de la uvilla Fuente: TOAPANTA (2012) González M. afirma que el incide de madurez, Es una relación entre acidez (gr/mL) y porcentaje de sólidos solubles disueltos dicho de otra forma, acidez/Grados Brix. Los °brix es un parámetro muy usado para evaluar la madurez de los frutos, pues a medida que el fruto madura, la acidez baja, entre tanto que el porcentaje de azúcares (sólidos solubles) aumenta; Y a su vez el Color es un manifiesto de cambios que experimenta las frutas durante la maduración y es este el criterio más usado por los consumidores para decidir si la fruta está o no madura. 2.2 Fundamento filosófico La presente investigación pretende complementar el conocimiento tradicional sobre el tiempo de cosecha de la uvilla con el análisis de propiedades físico-químicas en busca de determinar el tiempo adecuado de maduración para la cosecha, a fin de mejorar la preservación de la uvilla y evitar desperdicios en sus frutos. Esta investigación se fundamenta, en el paradigma positivista el cual afirma que el único conocimiento auténtico es el conocimiento científico basado en métodos científicos. 23 De acuerdo con Dobles et al. (1998), el paradigma positivista postula que el sujeto descubre el conocimiento porque tiene acceso a la realidad mediante los sentidos, la razón y los instrumentos utilizados, también resaltan que el conocimiento válido es el científico, y existe una realidad accesible al sujeto mediante la experiencia. El positivismo supone la existencia independiente de la realidad con respecto al ser humano que la conoce (Barrantes, 2000). 2.3 Fundamento legal NORMA INEN 2485:2009 Norma Técnica Ecuatoriana Voluntaria FRUTAS FRESCAS. UVILLA. REQUISITOS. NTE INEN 2 485:2009 2009-03 OBJETO 1.1 Esta norma establece los requisitos que debe cumplir la uvilla destinada para consumo en estado fresco acondicionada y/o envasada para su comercialización dentro del territorio ecuatoriano. ALCANCE 2.1 Esta norma se aplica a la uvilla Physalis peruviana (L.), de la familia Solanaceae. DEFINICIONES 3.1 Para los efectos de esta norma, se adoptan las definiciones contempladas en la NTE INEN 1751y las que a continuación se detallan: 3.1.1 Uvilla Physalis peruviana (L.), de la familia Solanaceae. La fruta es redonda - ovoide, del tamaño de una uva grande, con piel lisa, cerácea, brillante y de color amarillo – dorado – naranja; o verde según la variedad. Su carne es jugosa con semillas amarillas pequeñas y suaves que pueden comerse. Cuando la flor cae el cáliz se expande, formando una especie de 24 capuchón o vejiga muy fina que recubre a la fruta. Cuando la fruta está madura, es dulce con un ligero sabor ácido. Figura 4. Estado maduro de la uvilla (Physalis peruviana) 3.1.2 Capuchón o cáliz acrescente. Es el conjunto de hojas o sépalos unidas en sus bordes que encierran al fruto y lo protegen de agentes externos 3.1.3 Fruta fuera de norma. Es aquella fruta que no cumple con los requisitos establecidos en esta norma. CLASIFICACIÓN 4.1 Independiente del calibre, la clasificación de la uvilla admite tres grados que se definen a continuación: 4.1.1 Grado extra. Las uvillas de este grado deben cumplir los requisitos generales definidos en el numeral 6.1. Su forma y color deben ser característicos de la variedad. No deben tener defectos que demeriten la calidad del fruto. El capuchón debe estar libre de hongos, se acepta manchas superficiales ocasionadas por la humedad y/o hongos hasta un 5 % del área total. 25 4.1.2 Grado I. Las uvillas de este grado deben cumplir con los requisitos generales definidos en 6.1 y poseer el color y las formas características, se aceptan los siguientes defectos, siempre que éstos no afecten a la pulpa. - defectos leves de la forma; - defectos leves en la coloración; - defectos leves de la piel. El capuchón debe estar libre de hongos, se acepta manchas superficiales ocasionadas por la humedad y/o hongos hasta un 10 % del área total. 4.1.3 Grado II. Este grado comprende las uvillas que no pueden clasificarse en los grados anteriores, pero satisfacen los requisitos mínimos especificados en 6.1. Podrán permitirse, sin embargo, los siguientes defectos, siempre y cuando las uvillas conserven sus características esenciales en lo que respecta a su calidad, estado de conservación, aspecto general y presentación: - defectos de la forma; - defectos de la coloración; - defectos de la piel; - pequeñas grietas cicatrizadas que no representen más del 5% de la superficie total del fruto. En ningún caso los defectos deberán afectar a la pulpa del fruto. El capuchón debe estar libre de hongos, puede presentar manchas superficiales ocasionadas por la humedad y/o hongos hasta un 20 % del área total. 4.2 Calibre. El calibre se determina por el diámetro en mm de la sección ecuatorial de la fruta y la masa expresada en g, la correlación entre calibre, diámetro y masa es la siguiente: 26 Tabla 1. Calibres de la uvilla Calibre Diámetro ecuatorial, mm (ver 8.1.2) Masa promedio, g (ver 8.1.3) Grande >22 >3,0 >2,8 Mediana 18 – 22 3,0 – 2,0 2,8 – 1,8 Pequeña < 18 < 2,0 < 1,8 4.3 Tolerancias. Se admiten tolerancias de calidad y calibre en cada unidad de empaque para los productos que no cumplan los requisitos del grado indicado. 4.3.1 Tolerancias de calidad 4.3.1.1 Grado extra. Se admite hasta el 5 % en número o en masa de las uvillas con capuchón o sin él, que no correspondan a los requisitos de este grado. 4.3.1.2 Grado I. Se admite hasta el 10 % en número o en masa de las uvillas con capuchón o sin él, que no correspondan a los requisitos de este grado. 4.3.1.3 Grado II. El 10%, en número o en masa de las uvillas con capuchón o sin él, que no satisfagan los requisitos de este grado, ni los requisitos mínimos, con excepción de los productos afectados por magulladuras graves, descomposición o cualquier otro tipo de deterioro que no sean aptos para el consumo. En este grado podrá aceptarse como máximo un 20%, en número o en masa, de los productos con grietas pequeñas que no abarque una superficie superior al 5%. 4.3.2 Tolerancias de calibre. Para todos los grados se acepta hasta el 10% en número o en masa de frutos, que corresponda al calibre inmediatamente inferior o superior, al señalado en el empaque. 27 DISPOSICIONES GENERALES 5.1 Los frutos destinados a la comercialización, deben cumplir con los grados y calibres considerados anteriormente, deben estar bien formados, pulpa carnosa y de color típico. El producto no debe tener heridas, pudriciones y daños causados por insectos. 5.2 El proveedor debe garantizar que la muestra inspeccionada cumpla con el grado y calibre declarado en el rótulo o etiqueta del envase o embalaje. REQUISITOS 6.1 Requisitos generales 6.1.1 Todos los grados de uvilla deben estar sujetos a los requisitos y tolerancias permitidas en esta norma. Además, deben tener las siguientes características físicas: Enteras, con o sin capuchón; Sanas, y exentas de podredumbre o deterioro que hagan que no sean aptas para el consumo; Limpias y exentas de cualquier materia extraña visible; Exentas de plagas que afecten al aspecto general del producto; Exentas de humedad externa anormal, salvo la condensación consiguiente a su remoción de una cámara frigorífica; Exentas de cualquier olor y/o saborextraños; Ser de consistencia firme; Tener un aspecto fresco; Tener una piel suave y brillante. Si el capuchón está presente, el pedúnculo no debe superar los 25 mm de longitud. 6.1.2 La madurez de las uvillas puede evaluarse visualmente según su coloración externa, que varía de verde a naranja a medida que madura el fruto. 28 Su condición puede confirmarse determinando el contenido total de sólidos solubles. La variación en la coloración del capuchón no indica la madurez del fruto. 6.1.2.1 La escala de color de la uvilla para determinar su madurez es la que se indica a continuación: TABLA 2. Requisitos físico químicos de las uvillas de acuerdo con su estado de madurez Madurez de consumo Min Max Método de ensayo Acidez titulable % (acido cítrico) - 2,50 NTE INEN 381 Sólidos solubles totales, °Brix 10,0 . NTE INEN 380 6.1.3 Los residuos de plaguicidas no deben exceder los límites máximos establecidos en el Codex Alimentarius 6.2 Requisitos complementarios 6.2.1 Las uvillas deben recolectarse con pedúnculo, cuando alcancen su madurez de consumo. 6.2.2 El desarrollo y condición de las uvillas deben ser tales que les permitan: a) Soportar el transporte y la manipulación, y b) Llegar en estado satisfactorio al lugar de destino. 6.2.3 Para su comercialización se debe tener en cuenta que el fruto no es climatérico. 6.2.4 El producto puede comercializarse con o sin capuchón 6.2.5 Condiciones de almacenamiento 29 6.2.5.1 Para evitar daños al fruto no debe exponerse al sol. 6.2.5.2 Las áreas de transporte y almacenamiento deben mantenerse frescas y ventiladas 6.2.6 La comercialización de este producto debe sujetarse con lo dispuesto en la Ley 2007-76 del Sistema Ecuatoriano de la Calidad. INSPECCIÓN 7.1 Muestreo. El muestreo de las uvillas se realizará de acuerdo con la NTE INEN 1 750. 7.2 Aceptación y rechazo. Si la muestra inspeccionada no cumple con uno o más de los requisitos establecidos en esta norma, se considera rechazada. En caso de discrepancia, se repetirán los ensayos sobre la muestra reservada para tal fin. Cualquier resultado no satisfactorio, en este segundo caso, será motivo para considerar el lote como fuera de norma, y se debe rechazar el lote quedando su comercialización sujeta al acuerdo de las partes interesadas. MÉTODO DE ENSAYO 8.1 Determinación del calibre 8.1.1 Diámetro ecuatorial. Medir el diámetro de la sección ecuatorial del fruto con un calibrador y el resultado expresar en milímetros (mm). 8.1.2 Masa. La masa de las uvillas determinar mediante el uso de una balanza con sensibilidad de gramos. EMBALAJE 9.1 El contenido de cada unidad de empaque debe ser homogéneo y estar compuesto únicamente por frutos de la misma variedad, grado, color y calibre. 30 La parte visible del contenido del empaque debe ser representativa del conjunto. 9.2 Los empaques deben estar limpios y compuestos por materiales que no causen alteraciones al producto, así por ejemplo en cajas de madera, cartón corrugado o de otro material adecuado que reúna las condiciones de higiene, limpieza, ventilación y resistencia a la humedad, manipulación y transporte, de modo que garantice una adecuada conservación del producto. 9.3 Las características del embalaje de madera se encuentran establecidas en la NTE INEN 1 735. ROTULADO 10.1 Los envases deben llevar etiquetas o impresiones con caracteres legibles e indelebles redactados en español (sin perjuicio de que además se expresen en otro idioma) y colocadas en tal forma que no desaparezcan bajo condiciones normales de almacenamiento y transporte, debiendo contener la información mínima siguiente: a) Identificación del productor, empacador y/o distribuidor (marca comercial, nombre, dirección o código). b) Nombre del producto: UVILLA. c) País de origen y región productora. d) Características comerciales: grado, calibre, contenido neto expresado en unidades del Sistema Internacional. e) Fecha de empaque. f) Impresión con la simbología que indique el manejo adecuado del producto, ver NTE INEN 2 058. 10.2 Si se usan impresiones litográficas, éstas no deben estar en contacto con el producto. 31 APÉNDICE Z Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 380 Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 381 Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1 735 Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1 750 Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1 751 Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 2 058 CODEX ALIMENTARIO CAC/MRL 1-2001 Conservas vegetales. Determinación de sólidos solubles. Método refractométrico. Conservas vegetales. Determinación de la acidez titulable. Método potenciométrico de referencia. Embalajes de madera para frutas y hortalizas. Requisitos Hortalizas y frutas frescas. Muestreo. Frutas frescas. Definiciones y clasificación. Embalajes. Símbolos gráficos para la manipulación de mercancías. Lista de Límites Máximos para Residuos de Plaguicidas 2007-76 Ley del Sistema de la Calidad Registro Oficial No. 26 de 2007-02-22 “Marco Legal para Agricultura Orgánica. El Reglamento de la Normativa de la Producción Orgánica en el Ecuador” EL MINISTRO DE AGRICULTURA Y GANADERÍA Considerando: Que, el Ecuador es un país agrícola que sustenta gran parte de su economía en las actividades agropecuarias de la cual depende alrededor del 40% de su población. 32 CAPÍTULO I OBJETIVOS Y FINES Art. 1.- Objetivos.- El presente reglamento tiene los siguientes objetivos: a) Establecer las normas y procedimientos para la producción, elaboración, empaque, etiquetado, almacenamiento, transporte, comercialización, la exportación e importación de los productos orgánicos. b) Asegurar todas las fases, desde la producción hasta llegar al consumidor final. Art. 21.- De la cosecha y postcosecha.- Estas operaciones deben realizarse bajo condiciones adecuadas que permitan preservar la integridad orgánica y la calidad de los productos. CONSTITUCIÓN DE LA REPUBLICA DEL ECUADOR 2008 Capítulo segundo biodiversidad y recursos naturales Sección quinta suelo Art. 410.- El Estado brindará a los agricultores y a las comunidades rurales apoyo para la conservación y restauración de los suelos, así como para el desarrollo de prácticas agrícolas que los protejan y promuevan la soberanía alimentaria. 33 CATEGORIZACIÓN DE VARIABLES SUPERORDINACIÓN SUBORDINACIÓN 2.4 Categorías fundamentales 2.4.1 Gráficos de inclusión interrelacionados V.I. V.D Elaborado por: Vinicio Herrera 2014 34 Mayor aprovechamiento del producto. Empleo de métodos físico-químicos Mejor apreciación del punto de maduración. Muestreo en la plantación de la Asociación Artesanal Tierra Productiva. Evaluación del proceso de maduración de la uvilla. Cuantificación de Almidón, Azúcar e invertasas. 2.5 Hipótesis 2.5.1 Hipótesis nula (Ho): Los estados de maduración de la uvilla no se pueden evaluar mediante la cuantificación del contenido de almidón, azúcares e invertasa. 2.5.2 Hipótesis alternativa (H1) Los estados de maduración de la uvilla se pueden evaluar mediante la cuantificación del contenido de almidón, azúcares e invertasa. . 2.6 Señalamiento de variables de la hipótesis 2.6.1 Variable independiente: Evaluación del proceso de maduración de la uvilla. 2.6.2 Variable dependiente: Contenido de azúcares, almidón e invertasa. 35 CAPÍTULO III 3 Metodología de la investigación 3.1 Enfoque La presente investigación se enfocó en la determinación cuantitativa del punto adecuado de maduración de la uvilla (Physalis peruviana) mediante la medición del contenido de azúcares, almidón e invertasa, con el propósito de establecer la posible correlación con propiedades cualitativas tales como el color del capuchón y de la fruta en sí, manejadas a nivel de productor.3.2 Modalidad básica de la investigación El presente estudio se sustentó en diferentes aspectos como son, la investigación de campo, bibliográfica y experimental. 3.2.1 De Campo Se utilizaron varias muestras de uvillas (Physalis peruviana) con tres estados de madurez (verde, pintona, madura) para hacer un seguimiento de su maduración basado en análisis físico – químicos y cualitativos. 3.2.2 Bibliográfica El objetivo fue detectar, amplificar e indagar varios enfoques, sobre conceptualizaciones y teorías de varios autores con datos investigativos de la uvilla (Physalis peruviana) con el propósito de sustentar la investigación por medio de documentos, libros, y otras publicaciones. 36 3.2.3 Experimental La investigación determinó el punto adecuado de maduración basado en parámetros medibles como la disminución del contenido de almidón por su transformación en azúcar y la actividad de la invertasa presente en la fase final de maduración del fruto. 3.3 Nivel o tipo de investigación 3.3.1 Exploratorio En el presente estudio se investigó la variación de la cantidad de almidón y azúcares existentes en la uvilla (Physalis peruviana) en relación al grado de madurez del fruto, compuestos generados a través de la actividad de enzimas que intervienen en esta transformación. 3.3.2 Descriptivo Se estableció el punto óptimo de maduración de la uvilla (Physalis peruviana) mediante la comparación de diferentes propiedades físicas y químicas cuantificadas para tres estados de madurez. 3.4 Población y muestra 3.4.1 Población Para esta investigación se determinó como población o universo a las plantas de uvilla cultivadas por uno de los socios de la Asociación Artesanal Tierra Productiva del cantón Quero. 3.4.2 Muestra Se tomó 2 libras de uvilla por cada estado de maduración para analizar los parámetros físico-químicos. 37 3.5 Operacionalización de variables 3.5.1 Operacionalización de la variable independiente: Parámetros óptimos de maduración. ABSTRACTO CONCRETO Conceptualización Dimensiones Indicadores Ítems Básicos Técnicas o Instrumentos La maduración es el desarrollo de una serie de características físico-químicas que permiten definir color, olor, textura, y tamaño del fruto En general disminuye el color verde debido a una reducción del contenido de clorofila y al incremento en la síntesis de pigmentos de color amarillo, naranja y rojo (carotenoides y antocianinas) y las propiedades organolépticas cambian debido a la hidrólisis de los almidones que se transforman en azúcares Estados de Maduración Características, físicas como color forma y tamaño °brix pH ¿Qué es la madurez? ¿Qué parámetros determinan el estado de madurez? Tabla de color Medida directa de °Brix Determinación por espectrofotometría de contenido de almidón, glucosa. Elaborado por: Vinicio Herrera, 2014 38 3.5.2 Operacionalización de la variable dependiente: Cuantificación de almidón, azúcares e invertasa. ABSTRACTO CONCRETO Conceptualización Categorías Indicadores Ítems Básicos Técnicas e Instrumentos La cuantificación de almidón, azúcares y pH determinan el avance en el proceso de maduración del fruto de la uvilla desde su inicio cuando predomina el almidón en la fruta y su descenso debido a su transformación en azúcares así como la variación del pH. La invertasa, es una enzima que se encarga de transformar la sacarosa (azúcar común) en glucosa y fructosa. Contenido de Almidón, azúcares y medición de pH Contenido de Glucosa formada a partir de la sacarosa Actividad de Invertasa Concentración de Almidón y de azúcares °brix pH Concentración de Glucosa °brix Actividad de Invertasa ¿Cuál es la cantidad de almidón y azúcares presentes en los estados de maduración de la uvilla? y cual el pH de la fruta? ¿Qué cantidad de Glucosa contiene la uvilla al final de su maduración? ¿La actividad de la invertasa depende del estado de madurez? Método para cuantificar almidón por espectrofotometría Etanol 80% Rotavapor Baño termostático Medida directa pH Medida directa °brix Método enzimático colorimétrico para glucosa (GLUCOSA MR) Determinación por espectrofotometría Elaborado por: Vinicio Herrera, 2014 39 3.6 Recolección de información La recolección de información para los parámetros de cosecha de la Uvilla (Physalis peruviana) se realizó tomando en cuenta tres estados de madurez (verde, pintona y madura) con muestras de uvilla producidas mediante dos técnicas diferentes de cultivo, realizadas en un lote de terreno del cantón Quero. Fase experimental 3.6.1 Preparación de las muestras para análisis. Para el desarrollo de la parte experimental se utilizaron muestras de 5,5ml y 6,83gr uvilla en tres estados de madurez: verde, pintona, madura, después de haber sido lavadas y secadas para su preparación. Para las determinaciones de almidón y azúcares, la molienda se realizó en un mortero, y se preparó la muestra como se describe a continuación: De las muestras líquidas producidas con uvillas pintonas y maduras, se tomó 5,5ml y para las muestras de uvilla verde (muestra no líquida) se tomó 6,83gr. A cada muestra se añadió 8 ml de etanol al 80%, y luego de 1 hora de agitación se centrifugó durante 20 minutos. Este procedimiento se realizó con 5 alícuotas por cada muestra para obtener el volumen necesario para los análisis. Se colectó el sobrenadante de los 5 tubos, se evaporó el etanol en un Rotavapor a 78 °C, se recogió el concentrado para análisis de azúcares totales, azúcares reductores y glucosa una vez medido el volumen el cual se almacenó en refrigeración hasta realizar cada una de las réplicas del ensayo. El precipitado se utilizó para análisis de almidón luego de secarlo a 40 °C hasta obtener un polvo libre de humedad. 40 3.6.2 Cuantificación de almidón En tubos de polipropileno de 15 ml se colocó 50 mg de muestra (polvo seco de uvilla obtenido a partir del precipitado de la extracción con etanol), se añadió bajo agitación 1ml de agua (H2O) destilada y 1ml de hidróxido de potasio (KOH) 4M. Se incubó la suspensión por 2 horas (con agitación magnética). A continuación se añadió 2ml de buffer acetato 0,2 M de pH 4,5, 1ml de Ácido Clorhídrico (HCl) 2M y se reguló el pH hasta llegar a 6,0 con HCl 2M, 0,5M y 0,1M, para un fácil ajuste del pH. Seguidamente se agregó 20 µl de -amilasa termoestable (termamyl 120 L; de Novo-Nordisk) y se incubó la mezcla a ebullición durante 30 minutos con agitación intermitente (cada 5 minutos). Luego de la hidrólisis parcial del almidón se agregó 1 ml de buffer acetato 0,2M de pH 4,5 y se reguló el pH a 4,5, valor óptimo para la amiloglucosidasa. Finalmente, se agregó 20 µl de amiloglucosidasa (AMG 300L, de Novo- Nordisk y se llevó a incubación a 50 °C por 2 horas, para producir la hidrólisis completa del almidón. Se centrifugó la solución obtenida para eliminar cualquier residuo sólido y evitar interferencias en las lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro. Para la cuantificación de la glucosa generada por la hidrólisis de almidón, se preparó una curva estándar de glucosa de la siguiente manera. 3.6.3 Preparación de la curva estándar de glucosa con DNS Para la preparación de la curva estándar se tomó 0,2-0,4-0,6-0,8 y 1 ml de la solución madre de glucosa (1 mg/ml), y se completó el volumen de cada una hasta 1 ml con agua destilada, se agregó 1 ml de solución de ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) en cada tubo, se agitó y se llevó a ebullición durante 5 minutos, luego de los cuales se enfrió en un baño de agua fría, se agregó 8,6 ml del agua destilada, se agitó, y se procedió a leer las absorbancias de cada tubo en un espectrofotómetro, a una longitud de onda de 540 nm, frente 41 a un blanco preparado de idéntica manera con 1 mlde agua destilada. Los datos de absorbancias se reportan en la Tabla A3. Para la cuantificación de la glucosa en las muestras de la hidrólisis de almidón, se tomó una alícuota de 0,2 ml de muestra centrifugada, se añadió 0,8 ml de agua destilada, se adicionó con agitación 1 ml de solución de DNS y se procedió de idéntica forma que con los estándares obteniendo las absorbancias de la Tabla A3 El contenido de glucosa se obtuvo a partir de la ecuación que relaciona la concentración de glucosa con la absorbancia a partir de la curva estándar que se muestra en el Gráfico A1. Los valores obtenidos se multiplicaron por el factor de dilución (relación de mezcla de la solución con agua) y por el factor de transformación de glucosa a almidón (0,9) obtenido con la siguiente relación. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla A4. PMGLUCOSA (C6H 12O6 )=180 gr mol PM AGUA (H2O )=18 gr mol Pesodecada residuo de glucosaen elalmidón=(180−18) gr /mol Pesodel residuode glucosa enel almidón=162gr /mol Relación glucosa /almidón= 162gr /mol 180 gr /mol =0,9 42 Los resultados finales se determinaron por medio de la siguiente fórmula: 0,082 abs= 0,759 mg/ml x 8,2 ml aforados x 0,9 factor transformación= 5,60 mg de Almidónenuvilla verde= C xVA x FT xM MI MT MS Donde: C= Concentración de glucosa obtenida a partir de la absorbancia de la muestra VA=Volumen al cual se aforó la muestra FT= Factor de transformación de glucosa a almidón M=Masa de la alícuota recolectada de la muestra MI=Masa inicial necesaria en el análisis MT=Masa total de muestra MS=Masa seca en 1 gr de uvilla de Almidón enuvilla verde= 0,759mg /ml x 8,2ml x0,9 x1,32 gr 0,05 gr 6,83gr deuvilla 0,31gr uvilla seca de Almidónenuvilla verde=69,80mgde almidóndeuvilla /uvilla seca de Almidón enuvilla verde=0,06980 gr almidónuvilla seca x 100 de Almidónenuvilla verde=6,98 de almidóndeuvilla verde 43 3.6.4 Cuantificación de glucosa Para la valoración cuantitativa de glucosa se utilizó el método enzimático colorimétrico de Trinder (1969) con el reactivo GLUCOSA MR (Linear Chemicals S.L) en el cual la glucosa es oxidada a D-gluconato por la glucosa oxidasa (GOD), con formación de peróxido de hidrógeno. En presencia de peroxidasa (POD), el fenol y la 4-aminoantipirina (4-AA) se condensan por acción del peróxido de hidrógeno, para formar una quinonaimina roja cuya concentración es proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. β−D−Glucos a+H 2O+O2GOD → D−Gluconato+H 2O2 4−AA+Fenol H 2O2 ⇒ POD ⇒ Quinonaimina+H 2O Composición de los reactivos R1: Monoreactivo: Tampón fosfato 100 mmol/L pH 7,5, glucosa oxidasa > 10 KU/L, peroxidasa > 2 KU/L, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, fenol 5 mmol/L CAL: Patrón de Glucosa. Glucosa 100 mg/dL (5,55 mmol/L). Patrón primario de matriz orgánica. Para el análisis de glucosa en las muestras de uvilla, en los 3 estados de madurez, se tomó 200 µL del sobrenadante libre de etanol (evaporado con la ayuda del Rotavapor a 78 °C) y se añadió 2 mL de R1: Monoreactivo. 44 La cantidad total de glucosa presente en la muestra original se determinó mediante la siguiente expresión de Glucosa enuvillaverde= C x VR MI MS Donde: C= Concentración de glucosa obtenida de la absorbancia de la muestra VR=Volumen obtenido del Rotavapor MI=Masa inicial requerida para el análisis MS=Masa seca en 1 gr de uvilla de Glucosaenuvillaverde= 1,773 mg ml x 4,7ml recogidosde Rotavapor 6,83gr deuvilla muestrainicial 0,31gr deuvilla seca de Glucosaenuvillaverde=3,935mgglucosa / gruvilla seca de Glucosa enuvillaverde=0,0039 gr glucosa uvilla seca x100 de Glucosa enuvillaverde=0,39 gr de glucosa100 gruvilla seca 45 46 3.6.5 Curva de calibración para glucosa con reactivo MR Para preparar la curva estándar de glucosa con el reactivo MR, se equilibró los reactivos y muestras a temperatura ambiente, se realizó una dilución 1/20 de la concentración de la solución madre de glucosa y a partir de ella se tomó 0, 100, 125, 150, 175 y 200 µL y se completó el volumen de cada una hasta 200 µL con agua destilada y se agregó 2 ml de R1: Monoreactivo. Se mezcló cada tubo y se dejó reposar 15 minutos a temperatura ambiente ó 5 minutos a 37 C y, se leyeron las absorbancias (A) de las muestras y de cada patrón a 500 nm en el espectrofotómetro frente al blanco de reactivo, preparado con 200 L de agua destilada y 2 ml de R1: Monoreactivo. El color es estable hasta 2 horas después de la adición del reactivo, si está protegido de la luz. Los datos de absorbancias se reportan en la Tabla A7 y la curva de calibración en la Tabla A8. La pendiente de la recta será el factor que relaciona a la absorbancia obtenida a 500 nm con la concentración de glucosa en la muestra. 3.6.6 Cuantificación de sacarosa La cuantificación de sacarosa se realizó después de la hidrólisis de la muestra del sobrenadante del extracto etanólico para cada uno de sus tres estados de madurez, debido a que la sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que son azúcares reductores. En la determinación de sacarosa se empleó 5 ml del extracto; se agregó 0,3 ml de ácido clorhídrico (HCl) concentrado, se calentó la solución hasta llegar a 70°C y se mantuvo a esta temperatura durante 15 minutos, contados desde el momento en que las soluciones alcanzaron la temperatura. 47 Se neutralizó la solución con hidróxido de sodio (NaOH) 1M, y se llevó el volumen a 20 ml con tampón fosfato de sodio de pH 7,4 y se procedió a cuantificar la sacarosa por medio de la glucosa liberada en la hidrólisis. El contenido de sacarosa puede ser estimado mediante la cuantificación enzimática de la glucosa generada en la hidrólisis utilizando el método enzimático colorimétrico con monoreactivo para GLUCOSA MR. menos la cantidad de glucosa inicial. La expresión final para el cálculo de la cantidad de sacarosa es la siguiente: 0,102 abs = 1,582 mg/ml de Sacarosa enuvilla verde= C xVA xVR MI MS Donde: C= Concentración de glucosa obtenida de la absorbancia de la muestra VA=Volumen al cual se aforó la muestra VR=Volumen obtenido del Rotavapor MI=Masa inicial requerida para el análisis MS=Masa seca en 1 gr de uvilla de Sacarosa enuvilla verde= 1,582 mg ml x5,782ml4,7mlde Rotavapor 6,83gr deuvilla muestra inicial 0,31gr deuvilla seca de Sacarosa enuvilla verde=20,16mg glucosa /gr uvilla seca de Sacarosa enuvilla verde=0,0202 gr glucosa uvilla seca x100 de Sacarosa enuvilla verde=2,02 sac . y glu /100gr uvilla seca 48 2,02 sac . y glu /100 gruvilla seca−0,39 glu=3,25gr sacarosa/100gr uvilla seca 49 3.6.7 Cuantificación de azúcares reductores En la cuantificación de azúcares reductores se utilizó ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) (Miller, 1959), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir a una longitud de onda de 540nm mediante la preparación de una curva de calibración de glucosa (Tabla A3). Para esta determinación se mezcló 1 ml de muestra concentrada de uvilla obtenida del sobrenadante del extracto etanólico en cada uno de sus tres estados de madurez con 1 ml de solución de DNS y se procedió como se describe en 3.6.3. Para la expresión final de resultados de azúcares reductores se procedió de la siguiente manera: 0,428 abs= 4,304 mg/ml x 4,7 ml del Rotavapor de Azu . Reductores enuvilla verde= C xVR MI MS Donde: C= Concentración de azúcares reductores obtenidos de la absorbancia de muestra VA=Volumen al cual se aforó la muestra VR=Volumen obtenido del Rotavapor MI=Masa inicial requerida para el análisis MS=Masa seca en 1 gr de uvilla de Azúcaes Reductores= 4,304 mg ml x 4,7ml recogidosde Rotavapor 6,83 gr deuvillamuestra inicial 0,31 gr deuvillaseca de Azúcaes Reductores=9, 459mgdeazureduc ./ gruvilla seca de Azúcares Reductores=0,0094mgdeazu .reduc . /gr uvilla seca x100 de Azúcares Reductores=0,0094mgdeazu .reduc . /gr uvilla seca x100 50 de Azúcaes Reductores=0,94 gr deuvilla seca /100gr deuvilla seca 3.6.8 Determinación de la actividad enzimática de la invertasa Para este ensayo se utilizó polvo seco de uvilla obtenido mediante tres extracciones con acetona al 80% y dos extracciones con acetona al 100%, utilizando 4 gr de uvilla previamente molida en un mortero con hielo seco para obtener un polvo fino, para sus tres estados de madurez, a esto se añadió 10 ml de acetona a -10 °C. Cada extracción se centrifugó durante 15 min a 4 °C. Las fases de disolvente se descartaron, y el sedimento final se secó a temperatura ambiente hasta obtener el polvo seco que contenía la enzima. El polvo seco, fue almacenado a temperatura de congelación hasta su utilización como fuente de enzima en la determinación de la actividad enzimática. Extracción de la enzima a partir del precipitado obtenida con acetona Se incubó 150 mg de polvo seco de uvilla en 3 ml de 10/20 mM de buffer citrato/fosfato pH 6 (0,5 M) con cloruro de sodio (NaCl) durante 1 hora a 4 °C. Los tubos se centrifugaron 2 veces por 20 minutos, los sobrenadantes claros se gelfiltraron mediante el empleo de una columna de Sephadex G-25 de acuerdo a la metodología descrita por el fabricante (General Electric, Health Care). La invertasa se eluyó de la columna con tapón de extracción y fue utilizada en la determinación de actividad. Para la determinación de la actividad enzimática se verificó el tiempo de reacción catalizado por la invertasa durante el cual la velocidad de formación de producto es constante y máxima. Por esta razón se determinó la cinética de 51 formación de producto durante 4h y en intervalos de tiempo de 1 hora a 40 C, para todos los extractos se utilizó la curva de calibración presentada en el Gráfico A1. Se tomo 0,5 ml de la muestra obtenida con enzima obtenida más 0,5 ml de sustrato (sacarosa), y cada hora se detuvo la reacción con 1 ml de ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) (Miller, 1959), se hirvió las muestras por 5 minutos se añadió 8,6ml de agua destilada y se procedió a la lectura de la absorbancia. La preparación del blanco se realizó invirtiendo el orden de adición de los reactivos, colocando 0,5 ml de la muestra enzimática, inactivándola con 1ml de DNS para luego añadir 0,5 ml de sustrato (sacarosa). Las absorbancias se reportan en la Tabla A16 y A17. Adicionalmente, se determinó el peso de las uvillas, el contenido de sólidos de las muestras utilizando un medidor de grados brix (Brix) y el pH medido con un potenciómetro, junto con los valores de porcentaje de humedad que se reportan en las Tablas A2. 3.7 Procesamiento y análisis. Tanto para la cuantificación de glucosa como para la estimación del contenido de almidón se utilizó un diseño de bloques con arreglo factorial AxB; siendo (A) Estados de madurez y (B) La aplicación de tutoreo, y para la determinación de la actividad enzimática de la invertasa se empleó un diseño de bloques con arreglo factorial AxBxC. Los factores estudiados fueron: (A) Aplicación de tutoreo; (B) Estados de madurez; y (C) Tiempo de la actividad de generación de producto de la enzima: .El procesamiento y análisis estadístico de la información se realizó en los programas Excel y STATGRAPHICS. Mediante análisis de varianza ANOVA y pruebas de comparación múltiple para determinar el mejor tratamiento, con el 95 % de confianza. 52 CAPÍTULO IV 4 Análisis e interpretación de resultados La maduración de las frutas es un proceso que las hace más agradables al paladar porque las frutas se vuelven más dulces, más suaves, menos verdes y menos ácidas conforme maduran. Durante la maduración se produce entre otros procesos la degradación enzimática de polisacáridos de reserva como el almidón que se transforma en compuestos solubles en agua como la fructosa, glucosa y sacarosa. Los resultados presentados en la Tabla A1 (Anexos) muestran que las uvillas (Physalis peruviana) cultivadas con tutoreo alcanzan un mayor tamaño y pesan aproximadamente el doble con relación a las muestras de fruta cultivadas sin tutoreo. En el caso de las uvillas verdes esa diferencia fue de 1,620,17gr a 3,540,35gr; en las uvillas pintonas el peso varió de 2,770,57gr a 6,910,36gr y en las uvillas maduras el peso se incrementó de 4,670,37gr a 8,280,55gr. Además del peso de la fruta, se determinó el contenido de sólidos solubles en el producto extraído por molienda de las uvillas con diferentes grados de madurez, cultivadas con y sin tutoreo. En las uvillas verdes y pintonas existe una diferencia de 2 Brix entre las uvillas cultivadas con y sin tutoreo, siendo el contenido mayor en las uvillas cultivadas con tutoreo. En el caso de las uvillas verdes, el contenido de sólidos solubles fue de 6 Brix para uvillas sin tutoreo y de 8 Brix en las uvillas con tutoreo y en las uvillas pintonas estos valores fueron de 9 y 11 Brix, respectivamente. Para las uvillas maduras el contenido de sólidos se incrementó en aproximadamente 1 Brix de 14,3 Brix en uvillas sin tutoreo a 15,2 Brix en uvillas con tutoreo lo que evidencia un mayor desarrollo y más rápida maduración de la fruta cuando está más expuesta a la luz (Tabla A2). En relación al pH, se observó que el valor descendió de 5 a 4 53 con la maduración en uvillas con y sin tutoreo (Tabla A2). Este fenómeno se produce porque los ácidos se degradan durante la maduración de las frutas. 4.1 Cuantificación de almidón Cada fruta madura naturalmente de acuerdo a su propio ritmo en ausencia de algún agente que acelere su maduración. La generalidad de frutas tiene un contenido mayor de almidón cuando no han alcanzado su madurez. Uno de los procesos que se desarrollan durante la maduración es la reducción en el contenido de almidón y el incremento en la cantidad de azúcares (glucosa y sacarosa). En la Tabla A4 se registran los datos para el cálculo del contenido de almidón en la uvilla en tres estados de madurez, cultivada con y sin tutoreo. En la Tabla A5 se observa la disminución en el contenido de almidón que experimentan las uvillas a medida que avanza el proceso de maduración. El contenido de almidón en uvillas verdes sin tutoreo fue de 6,48% y bajó a 2,82% en la fruta madura, mientras que en uvillas verdes con tutoreo fue de 9,63% y bajó a 2,70% en la fruta madura con tutoreo. Como se observa en el gráfico A2 el contenido de almidón en uvillas verdes con tutoreo es mayor con un valor medio de 9,63 % en comparación de 6,48% del almidón presente en uvillas verdes sin tutoreo y disminuye en ambos según avanza su estado de madurez, es decir la aplicación del tutoreo produce cambios desde el inicio de la formación del fruto de la uvilla (Physalis peruviana). En la Tabla B1 se muestra los resultados del análisis de varianza en la determinación del contenido de almidón, utilizando el 95% de nivel de confianza; se demuestra que existe diferencia significativa al aplicar los niveles del factor a (Estados de madurez), b (Aplicación de tutoreo). La prueba de comparación múltiple (Tukey) de la Tabla B2 con respecto al Estado de madurez y al almidón con un 95% de nivel de confianza, muestra 54 que en las uvillas verdes existe mayor cantidad de almidón con una media de abs de 3,5265 que da un contenido de 8,09% mientras que en uvillas maduras tiene 0,96 de abs el cual representa 2,19% de contenido. La Tabla B3 de la prueba de comparación múltiple para análisis de almidón con aplicación de tutoreo (con un 95 % de nivel de confianza), indica que en el tratamiento que se aplica tutoreo existe mayor cantidad de almidón con
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