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1 TEMA VI. INTRODUCCIÓN LA CÉLULA 1.TEORÍA CELULAR 2.MODELOS DE ORGANIZACIÓN CELULAR 3.MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS 4.TÉCNICAS PARA MICROSCOPÍA 5.MÉTODOS BIOQUÍMICOS PARA EL ESTUDIO DE LAS CÉLULAS 1.TEORÍA CELULAR Los estudios sobre la célula comenzaron a mediados del siglo XVII y vienen ligados a la mejora en la calidad de los microscopios. Los primeros conocimientos sobre la célula se remontan a año 1665, gracias a Robert Hooke que, al analizar un trozo de corcho con un sencillo microscopio construido por él mismo, descubrió que estaba formado por una especie de celdillas parecidas a las de un panal de abejas, a las que denominó células. Un contemporáneo de Hooke, Anthony van Leeuwenhoek, construyó microscopios simples de hasta 200 aumentos, y descubrió múltiples microorganismos al estudiar el agua de las charcas y de los fluidos de los animales, a los que llamó animáculos. Pero hasta que no se dispuso de buenos microscopios, a principios del siglo XIX, no se realizaron nuevos descubrimientos. Así, en 1831, Robert Brown descubrió un corpúsculo al que denominó núcleo y poco después Purkinje descubrió el medio interno viscoso al que denominó protoplasma. El protoplasma que rodea el núcleo pasó a llamarse citoplasma. Pero, la teoría celular no se desarrolló hasta 1839. Su desarrollo se atribuye al botánico Schleiden y al zoólogo Schwann, que enunciaron, que todas las células son morfológicamente iguales y que todos los seres vivos están constituidos por células. Años más tarde, en 1855, Virchow amplió la teoría celular al postular que, sólo pueden aparecer nuevas células a partir de otras ya existentes. Brucke la completó al decir que la célula es el ser vivo más pequeño y sencillo que existe. Y Weisman en 1880 amplió diciendo, que hay una continuidad entre las células primitivas, que aparecieron hace 3.800 m.a. y las células actuales. Así, la teoría celular queda definida por los siguientes principios: La célula es la unidad anatómica y fisiológica de todos los seres vivos: es capaz de realizar todos los procesos metabólicos necesarios para permanecer con vida. Todos los seres vivos están constituidos por una o más células. La célula es la unidad genética de los seres vivos: contiene toda la información sobre la síntesis de su estructura y el control de su funcionamiento, y es capaz de transmitirla. Toda célula proviene, por división, de otra célula (ya existente). “Omnis cellula ex cellula" Las reacciones químicas que constituyen el metabolismo de un ser vivo, tienen lugar en sus células. Esto condujo a la primera definición de célula: Unidad anatómica y fisiológica de todos los seres vivos. Esto es válido excepto para los virus. 2 A pesar de haber sido aceptada la teoría celular, los científicos seguían considerando al tejido nervioso como una excepción, ya que mostraba una estructura reticular, donde no era posible diferenciar unidades celulares. Fue Santiago Ramón y Cajal, el que hizo posible la generalización de la teoría celular, al demostrar la individualidad de la neurona en su teoría neuronal (1889). Gracias a estos estudios recibió el premio Nobel de Medicina en 1906. 1.1 FORMA Y TAMAÑO DE LAS CÉLULAS Por su tamaño, las células son muy variadas, desde milésimas de milímetro hasta algunas visibles a simple vista, como los huevos de las aves. Pero, por regla general tienen tamaños microscópicos, diámetros comprendidos entre 0.5 y 20 µm. 1μm=10-6m=10-3mm 1nm=10-9m 1A° Angstron=10-10m La forma de las células está relacionada con la función que desempeñan. Así las células que flotan en un líquido (eritrocitos) tienen forma aproximadamente esférica, las neuronas, para transmitir el impulso nervioso tienen largas prolongaciones, etc. … 2. MODELOS DE ORGANIZACIÓN CELULAR Todas las células constan de: Membrana plasmática constituida básicamente por lípidos formando una bicapa, en la que hay englobadas o adheridas a su superficie proteínas. Citoplasma, que abarca el medio interno líquido o citosol, con una serie de orgánulos. Material genético, constituido por una o varias moléculas de ADN. En los seres vivos, existen dos tipos de organización celular claramente diferenciados: ORGANIZACIÓN PROCARIOTA ORGANIZACIÓN EUCARIOTA Típica de las células más sencillas y primitivas Típica de células más complejas Carecen de auténtico núcleo, por lo que el ADN, que es una sola molécula circular, se encuentra disperso en el citoplasma en una región llamada nucleoide. Puede presentar pequeñas moléculas de ADN circular denominadas plásmidos Poseen núcleo, el material genético en forma de cromosomas o cromatina se encuentra separado del citoplasma por la membrana nuclear No existe compartimentación en el citoplasma por lo que carecen de orgánulos celulares, excepto ribosomas Citoplasma compartimentado mediante membranas (numerosos orgánulos con sistemas de membranas) Ribosomas 70 S Ribosomas 80 S División simple por fragmentación División por mitosis o meiosis La mayoría son células de pequeño tamaño (1-10 µm) Son de mayor tamaño (10-100 µm) La membrana no posee colesterol La membrana plasmática posee colesterol Cuando presentan flagelos, estos están formados por la proteína flagelina Cuando presenta flagelos o cilios, estos están formados por microtúbulos proteicos de tubulina. Arqueobacterias, eubacterias, cianofíceas Animales, vegetales, hongos, algas, protozoos 3 Las células eucariotas se clasifican a su vez en animales y vegetales: CÉLULA ANIMAL CÉLULA VEGETAL Carece de pared celular Posee pared celular de celulosa Carece de cloroplastos Posee cloroplastos Carece de gránulos de reserva de almidón Posee gránulos de reserva de almidón Posee varias vacuolas pequeñas Posee una o pocas vacuolas grandes, que constituyen el vacuoma. El núcleo suele estar en posición central El núcleo suele estar en posición lateral Posee centriolos Carece de centriolos Posee cilios Carece de cilios Tiene muchos lisosomas Tiene pocos lisosomas 4 2.1 RELACIÓN ESTRUCTURA-FUNCIÓN Las células han de realizar las funciones de los seres vivos. Las funciones están estrechamente relacionadas con su estructura. FUNCIÓN DE NUTRICIÓN Según la forma en que las células obtienen energía, se clasifican en: a) Autótrofas fotosintéticas: Utilizan la energía lumínica para sintetizar moléculas orgánicas a partir de materia inorgánica. Es típico de las vegetales y las cianobacterias. b) Autótrofas quimiosintéticas: utilizan la energía procedente de la oxidación de moléculas inorgánicas para sintetizar compuestos orgánicos. c) Heterótrofas: obtienen la energía que necesitan de la oxidación de moléculas orgánicas, por medio del metabolismo oxidativo (fermentación y respiración). FUNCIÓN DE RELACIÓN Las células están en relación constante con su medio ambiente. La membrana plasmática capta estímulos del medio, para que la célula elabore las respuestas más adecuadas. En la membrana, están las moléculas encargadas de la recepción de mensajeros químicos, como son los neurotransmisores y las hormonas. FUNCIÓN DE REPRODUCCIÓN La vida se autoperpetúa gracias a la división celular. En las células eucariotas la reproducción se realiza por mitosis y meiosis. En las procariotas por división simple. 2.2 ORGANIZACIÓN ACELULAR: VIRUS Los virus son estructuras muy sencillas, presentan un tamaño entre 30 y 300nm. Son organismos constituidos por un ácido nucleico (ADN o ARN), una cápsula proteica llamada cápsida, constituida por proteínas globulares (capsómeros) que protegen al ac. nucleico, y en ocasiones, está rodeada por una envoltura membranosa (que procede de las células en las que desarrollan su ciclo). Los virus carecen de metabolismo propio, ya que no poseen enzimas para realizarlo.Para su reproducción requieren materia, energía y el sistema enzimático de otro ser vivo. Por tanto, son parásitos obligados. 2.3 ORIGEN Y EVOLUCIÓN CELULAR Una vez se originaron en la Tierra los primeros compuestos orgánicos, se piensa que las primeras moléculas que fueron capaces de autorreplicarse, fueron las moléculas de ARN (ribozimas), (por la capacidad catalítica de ARN). Posteriormente, surgieron otras moléculas más especializadas y estables a la hora de portar la información genética, fue el ADN, que supuso una importante ventaja selectiva cuando aparecieron las primeras células, que ya contaban con una membrana protectora que las rodeaba. Parece ser que los primeros microorganismos vivientes fueron procariotas heterótrofos (se alimentaban de compuestos orgánicos de la sopa primitiva) y anaerobios (adaptados a una atmósfera reductora). Cuando los nutrientes empezaron a escasear, comenzaron a surgir las primeras células procariotas fotoautótrofas anaerobias (fotosíntesis anoxigénica) que podían utilizar energía procedente de la luz y compuestos químicos inorgánicos para su crecimiento. Después de algún tiempo, algunas de estas células (las cianobacterias) empezaron a realizar una fotosíntesis oxigénica (desprendiendo oxígeno). Así, la atmósfera fue enriqueciéndose de oxígeno, que hoy en día es indispensable para la vida de los organismos con respiración aerobia. 5 El último antepasado común universal, conocido por sus siglas en inglés LUCA (last universal common ancestor), es el hipotético primer ser vivo del cual descienden todos los existentes 2.3.1 TEORIA ENDOSIMBIOTICA Hace 1500 m.a. aparecieron las primeras células precursoras de las eucariotas, conocidas como urcariotas, eran bacterias que perdieron su cápsula, aumentaron de tamaño e incorporaron estructuras proteicas que les darían forman y consistencia (citoesqueleto). Según la teoría endosimbiótica de Lynn Margulis, los eucariotas no han surgido a partir de un procariota único, sino que se originaron por la simbiosis de dos o más tipos de bacterias diferentes. Por lo tanto, orgánulos de la célula eucariota, como son las mitocondrias y cloroplastos proceden de la endosimbiosis entre una célula urcariota primitiva, con capacidad de fagocitosis, y distintos tipos de procariotas primitivos (así se explica que las mitocondrias y los cloroplastos tengan su propio ADN). Las mitocondrias surgirían de bacterias aerobias, los cloroplastos de cianobacterias, los cilios y flagelos de bacterias espiroquetas, etc. 3. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS Las células se estudian mediante los microscopios y, básicamente, se conocen dos tipos de microscopía, la óptica y la electrónica. Los microscopios son instrumentos que nos permiten observar imágenes aumentadas de objetos muy pequeños, como las células. 3.1 MICROSCOPÍA ÓPTICA El microscopio óptico está constituido por dos lentes de aumento denominadas ocular y objetivo, que utiliza los fotones de la luz visible para realizar observaciones. Los rayos luminosos, que proceden de una fuente de luz, inciden sobre la preparación, y la atraviesan hasta llegar a la lente del objetivo del microscopio. El microscopio óptico se compone de las siguientes partes: Fuente de iluminación: Una lámpara eléctrica, que permite la iluminación de la muestra. Elementos mecánicos: Conjunto de piezas para sostener la parte óptica y la muestra a observar: o Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en él se encuentra la fuente de iluminación. o Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el portaobjetos con la preparación, y unas escalas que ayudan a conocer qué parte de la muestra se está observando. La platina presenta 2 tornillos, en la parte inferior de la misma, que permiten desplazar la preparación sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal. o Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Es el soporte de oculares y objetivos. o Revólver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos. o Brazo: une el tubo a la platina. o Tornillo macrométrico: Sirve para obtener un primer enfoque de la muestra al utilizarse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible. o Tornillo micrométrico: Sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez que se ha realizado el enfoque con el macrométrico. Desplaza verticalmente la platina, pero de forma prácticamente imperceptible https://es.wikipedia.org/wiki/Idioma_ingl%C3%A9s https://es.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo 6 Elementos ópticos: Son tres sistemas de lentes: condensador, objetivo y ocular: o Condensador: concentra los rayos de luz sobre la muestra, obteniéndose así una mayor iluminación. Suele llevar un diafragma para regular la cantidad de luz y adecuarla a las necesidades de la observación. o Objetivo: recoge los rayos de luz que atraviesan la muestra, y produce una imagen aumentada de la misma. Los microscopios suelen tener varios objetivos, de distintos aumentos, fijados a una pieza giratoria o revólver. o Ocular: amplifica la imagen producida por el objetivo, y la enfoca en el ojo. (Permite acceder visualmente a la muestra, aumentando la imagen). 3.1.1 CALIDAD DE LOS MICROSCOPIOS ÓPTICOS La amplificación total, es el producto de los aumentos debidos al objetivo por los del ocular. Así, por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo de 10 aumentos (10X) y un ocular de 4 aumentos (4X), la imagen observada es 40 veces mayor que la realidad. Pero, la calidad de un microscopio no sólo viene determinada por el número de aumentos, sino también por su poder de resolución o distancia mínima para que dos puntos próximos se vean como puntos diferentes, que depende fundamentalmente de la longitud de onda utilizada λ: cuanto menor sea ésta, el poder de resolución será mayor (son inversamente proporcionales). El poder de resolución del microscopio óptico es de 0.2μm=200nm=0.0002mm El poder de resolución también se define como la capacidad para distinguir dos puntos muy próximos como distintos y separados. También depende del índice de refracción del medio, que existe entre el objetivo y la preparación (aire normalmente). Con el objetivo de inmersión se utiliza como medio aceite, que al tener mayor índice de refracción que el aire (1,5 frente a 1 del aire), aumente la resolución. 7 3.1.2 TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS Microscopía óptica normal (de campo claro coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos, que aumentan el contraste y revelan detalles que no se aprecian de otra manera. Microscopía de campo claro: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados. Microscopía en campo oscuro: utiliza luz muy intensa concentrada sobre la muestra, sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes, invisibles con iluminación normal. Microscopía en contraste de fase: se usa para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para muestras delgadas, o células aisladas. Es muy útil para examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en medicina. Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada. Fue diseñado para observar relieves de especímenes difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro. Se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases Microscopía de fluorescencia: una sustancia naturalen las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayos luminosos: esto se conoce como fluorescencia. Incorpora una lámpara especial, que emite una luz excitadora de los fluorocromos, con los que se tiñen las muestras a observar, y que permite el paso de la luz emitida por el fluorocromo. Microscopía confocal: es un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de la célula. Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra. Se utiliza un láser como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su volumen, creando muchas imágenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional. Para observar preparaciones con este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes. 3.2 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA El microscopio electrónico utiliza como fuente de “iluminación” un haz de electrones en vez de rayos de luz. Se consigue una resolución normal para los objetos biológicos de 2nm=0.002μ, o sea, unas 100 veces mayor que la resolución del microscopio óptico. Las lentes no son de vidrio si no electroimanes, que generan un campo magnético que condensa el haz de electrones que pasa por su eje central. 3.2.1TIPOS DE MICROSCÓPIOS ELECTRÓNICOS Microscopio electrónico de transmisión (MET): permite la observación de muestra en cortes ultrafinos. Dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizarlo, debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de angstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fluorescencia http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fluorescencia http://es.wikipedia.org/wiki/Diafragma http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1ser 8 Microscopio electrónico de barrido (MEB): crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto y no es necesario cortarlo en capas para observarlo. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Se basa en recorrer la muestra con un haz de electrones, de forma parecida a un barrido. Los e- del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de e- secundarios. Los e- perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico. A medida que el haz de e- barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de microscopio, al contrario que los TEM o los ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. 9 4.TÉCNICAS PARA MICROSCOPÍA 4.1TÉCNICAS PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA Las células, además de diminutas, generalmente son incoloras y translúcidas, por lo que su observación requiere la aplicación de técnicas que aumenten el contraste de sus componentes para hacerlos visibles, normalmente mediante el uso de colorantes. 4.2TÉCNICAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Como la muestra ha de deshidratarse para su observación en vacío, debe fijarse por métodos especiales que eviten la distorsión por el secado. Por otra parte, como los electrones tienen un poder de penetración muy limitado, han de obtenerse cortes ultrafinos; para ello la muestra se incluye en un material de gran dureza, como ciertas resinas, se corta con un ultramicrotomo provisto de una cuchilla de vidrio o de diamante, y finalmente se contrasta mediante sales de metales pesados como el U o el Pb. 4.2.1 CRIOFRACTURA Consiste en la congelación de muestras biológicas con nitrógeno líquido (-195°C), seguido de un corte o fractura y el sombreado metálico o recubrimiento con carbono de la superficie de la muestra. Luego se elimina el tejido biológico subyacente al sombreado y se observa la réplica de la muestra, mediante el MET. 5. MÉTODOS BIOQUÍMICOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS Permiten identificar los distintos compuestos químicos de la célula: https://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno 10 Fraccionamiento celular. Consiste en separar los orgánulos de la célula. Cromatografía. Se utiliza para separar unas proteínas de otras. Electroforesis. Sirve para separar mezclas de proteínas en disolución. Autorradiografía o marcaje por isótopos. Permite detectar una molécula marcada, trazar sus movimientos, metabolismo, y a qué orgánulos celulares se incorpora. Difracción de rayos X. Sirve para determinar la disposición de los átomos de una proteína. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Sirve para determinar, conociendo la secuencia de aminoácidos, la estructura 3D de proteínas pequeñas (diseñada por ordenador). Coloraciones citoquímicas. Son técnicas de tinción específicas para poner de manifiesto distintos componentes químicos de la célula. Cultivos celulares. Permiten disponer de células vivas para poder proceder a su estudio. 5.1 CULTIVOS CELULARES Para cultivar células en el laboratorio, se extrae una muestra de tejido con características embrionarias y se disocian las células. Se aíslan células individuales, capaces de sobrevivir y multiplicarse en placas de cultivo, si se les suministra un medio de cultivo con nutrientes. Las células animales suelen morir después de un número determinado de divisiones en cultivo (unas 50 para las humanas). No obstante, en los cultivos a veces surgen células que se pueden seguir dividiendo indefinidamente, y con ellas se establecen líneas celulares que se usan en los laboratorios de todo el mundo. Las primeras líneas celulares procedían de tumores. Algunas se utilizan desde hace cincuenta años, como las que derivan de una muestra de cáncer uterino obtenida en 1951 de una paciente llamada Henrietta Lacks (de allí el acrónimo He La) Las células de una determinada línea celular no son idénticas, porque van sufriendo mutaciones a lo largo del tiempo. Cuando se quiere asegurar que todas las células sean idénticas, se aísla una célula y se trabaja con el grupo de células descendientes o clon. 5.2 FRACCIONAMIENTO CELULAR Para analizar el contenido de las células, se rompen suavemente y se separan sus orgánulos. Para ello los extractos de células rotas se centrifugan a alta velocidad. Se crea así un campo gravitatorio artificial, que hace que las partículas celulares tiendan a depositarse en el fondo del tubo. Cuanto más grande es una partícula, más rápidamente se desplaza al fondo del tubo. Mediante sucesivas centrifugaciones a velocidades cada vez mayores, se van obteniendo depósitos de componentes cada vez más pequeños. Estas fracciones mantienen su actividad biológica, constituyen extractos donde podemos estudiar un proceso sin la influencia de los otros componentes celulares. Si se desea separar las moléculas de una determinada fracción celular se utiliza la ultracentrifugación en gradiente de densidad. Se coloca el extracto sobre un tubo de centrífuga, al girar el aparato a una velocidad altísima, los materiales de la muestra se desplazan a lo largo del tubo formando bandas estrechas. La velocidad de sedimentación de cada componente (en unidades Svedberg) es una característica típica que depende de su tamaño y forma. https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1ncer_cervical https://es.wikipedia.org/wiki/Henrietta_Lacks 11 5.3 AUTORRADIOGRAFÍALa radioactividad es capaz de impresionar una placa fotográfica. Becquerel descubrió este fenómeno en 1896. Esta propiedad va a permitir, tanto seguir el destino de un compuesto radioactivo en el interior de un organismo como cuantificarlo, ya que la intensidad de la impresión en la placa fotográfica, es proporcional a la cantidad de radioactividad presente en la muestra. Se utilizan moléculas biológicas, a las que sustituye un elemento, como un H2 o el I, por otro elemento radiactivo, como el H3 o I 125, o bien incorpora un elemento radiactivo, que las células y los tejidos empleen, y así en un momento determinado se pueden interrumpir sus procesos biológicos mediante la fijación, quedando en ese momento la molécula con el isótopo radiactivo sorprendida en el lugar de la célula o el tejido por donde estaba pasando, o donde se almacena, dependiendo del tiempo que media entre la administración del producto y la fijación.
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