Biologia_molecular_2005

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Principios de Biología Molecular
2º Curso de Postgrado en Salud 
Reproductiva
Centro Rosarino de Estudios Perinatales
Gustavo Leguizamón
Unidad de Embarazo 
de Alto Riesgo
Hitos en el camino hacia la 
secuenciación de ADN
• 1940 reconocimiento de AND como 
material de herencia
• 1953 estructura de la doble cadena
• 1966 decodificación del código genético
• 1972 tecnología del ADN recombinante
• 1975-1977 tecnología de la secuenciación 
de ADN
• 1983 mapeo genético de enfermedad 
(Huntington)
• 1990 lanzamiento del PGH
• 1996 comienza la secuenciación
• 2001 borrador
Hitos en el camino hacia la 
secuenciación de ADN
Watson & Crick 
• Watson: zoologo, Crick: físico
• “En 1947 Crick no poseia conocimientos 
de biología ni de quimica orgánica o 
cristalografía..” – www.nobel.se
• Aplicando las reglas de Chagraff y las 
imàgenes de rayos X de Rosalind Franklin 
construyeron el modelo de la doble hélice
• En 1953 Nature: “It has not escaped our 
notice that the specific pairing we have 
postulated immediately suggests a 
possible copying mechanism for the 
genetic material.”
Watson & Crick with DNA model
Rosalind Franklin with X-ray image of DNA
Porquè era necesario secuenciar 
el genoma humano?
• Las enfermedades son producto de 
interacciones del medio-genes
• Los progresos relacionados a 
enfermedades asociadas a un gen
• Cáncer, cardiopatía, hipertensión: 
asociadas a componente genético
Múltiples genes comprometidos
Difícil su estudio
Proyecto genoma humano: 
objetivos
• Identificar los 30.000 a 35.000 genes 
humanos
• Determinar la secuencia de los 3 millones 
de pares de bases
• Almacenar la información en bases de 
datos
• Mejorar las herramientas de análisis
• Transferencia de tecnología al sector 
privado
• Analizar las implicancias éticas, legales y 
sociales
Proyecto Genoma Humano
Major events in the history of Molecular Biology 
2000-2001
• 2001 International 
Human Genome 
Sequencing: primer 
borrador de la 
secuencia del 
genoma humano
Niveles de organización
• Nucleo = biblioteca
• Cromosomas = estantes
• Genes = libros
Purinas Pirimidinas
DNA Components
• Nitrogenous Base:
N is important for hydrogen bonding between bases 
A – adenine with T – thymine (double H-bond)
C – cytosine with G – guanine (triple H-bond)
• Sugar: 
Ribose (5 carbon)
Base covalently bonds with 1’ carbon
Phosphate covalently bonds with 5’ carbon
Normal ribose (OH on 2’ carbon) – RNA
deoxyribose (H on 2’ carbon) – DNA 
dideoxyribose (H on 2’ & 3’ carbon) – used in DNA sequencing
• Phosphate:
negatively charged
Estructura del ADN
Base 
(A,T, C or G)
Azùcar
Fosfato
Antiparalela
Double helix of DNA
• The double helix of DNA has these features:
Concentration of adenine (A) is equal to thymine
(T) 
Concentration of cytidine (C) is equal to guanine 
(G). 
Watson-Crick base-pairing A will only base-pair 
with T, and C with G
base-pairs of G and C contain three H-bonds, 
Base-pairs of A and T contain two H-bonds. 
G-C base-pairs are more stable than A-T base-
pairs
Two polynucleotide strands wound around each 
other.
Double helix of DNA
• The DNA strands are assembled in the 5' to 3' direction by 
convention, we "read" them the same way.
• The phosphate group bonded to the 5' carbon atom of one 
deoxyribose is covalently bonded to the 3' carbon of the 
next.
• The purine or pyrimidine attached to each deoxyribose
projects in toward the axis of the helix.
• Each base forms hydrogen bonds with the one directly 
opposite it, forming base pairs (also called nucleotide pairs). 
Superestructura
Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.
The Histone Code
• State of histone tails govern TF access to 
DNA
• State is governed by amino acid sequence 
and modification (acetylation, 
phosphorylation, methylation)
Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.
DNA, RNA, and the Flow of Information 
TranslationTranscription
Replication
Replicación del DNA
• Semiconservadora
• Diferentes 
mecanismos para 
cada cadena
DNA RNA: Transcription
• DNA gets transcribed by 
a protein known as RNA-
polymerase
• This process builds a 
chain of bases that will 
become mRNA
• RNA and DNA are similar, 
except that RNA is single 
stranded and thus less 
stable than DNA
Also, in RNA, the base 
uracil (U) is used 
instead of thymine (T), 
the DNA counterpart
Transcription
• Transcription is highly regulated. Most DNA is in a 
dense form where it cannot be transcribed. 
• To begin transcription requires a promoter, a small 
specific sequence of DNA to which polymerase can 
bind (~40 base pairs “upstream” of gene)
• Finding these promoter regions is a partially solved 
problem that is related to motif finding. 
• There can also be repressors and inhibitors acting in 
various ways to stop transcription. This makes 
regulation of gene transcription complex to 
understand.
Definition of a Gene
• Regulatory regions: up to 50 kb upstream of +1 site
• Exons: protein coding and untranslated regions 
(UTR)
1 to 178 exons per gene (mean 8.8)
8 bp to 17 kb per exon (mean 145 bp)
• Introns: splice acceptor and donor sites, junk DNA
average 1 kb – 50 kb per intron
• Gene size: Largest – 2.4 Mb (Dystrophin). Mean – 27 
kb.
Central Dogma Revisited
DNA hnRNA mRNA
protein
Splicing
Spliceosome
Translation
Transcription
Nucleus
Ribosome in Cytoplasm
Traducción
Traducción: codigo genético 
degenerado
Overview of DNA to RNA to Protein
A gene is expressed in two steps
Transcription: RNA synthesis
Translation: Protein synthesis
Western blot (SDS PAGE) 
• Gel de poliacrilamida (poro variable)
• Disociación de la proteina en unidades polipeptídicas 
por rotura de puentes S-S (agente reductor-
mercaptoetanol)
• El detergente SDS de carga negativa se une a la 
regiones hidrofóbicas de la proteina desplegandola y 
neutralizando su carga
• La migración es por tamaño ( no por forma ni carga)
• Identificación de proteinas 
Western blot (SDS PAGE) 
Western blot (SDS PAGE) 
Tratamiento del trabajo del parto 
prematuro:conclusiones parciales
• Tocolíticos: efectivos por 48-72 horas
• Corticoides: disminuyen la morbi-
mortalidad neonatal
• Antibióticos: no son efectivos en el 
tratamiento del TPP
?
Gemelos
Contracción Infección
RPM
?
? Parto pretérmino
Parto pretérmino: fundamentos de 
la tocolisis
Tocolíticos: mecanismo de acción
Ca++Ca++
Calmodulina-Ca
Ca++
Ca++
Voltaje dependientes
V.Ind
MLK
AMPc
Prog
A/M
Ocitocina
PGs
Beta miméticos Sulfato de Mg
Bloqueantes cálcicosIndometacina
Stress/Fisiológico Gemelar/PoliAbruptioInfección
Eje Inflamación Hemorragia Distención
Hip Hip decidual
CRH-Cortisol TNF
IL-1-6-8
Trombina Stretching
AA PGs
COX
PGDH
Inactivos
Proteasas
Amnion
Mecanismos de parto prematuro
Cox-2Cox-2
Antecedentes (I): inducción de la 
expresión de COX-2 mediante stretching 
celular
Mecánico
Químico
La síntesis de prostaglandinas en el amnios 
esta incrementada en mujeres que 
presentan parto prematuro secundario a 
sobredistención (gemelos y polihidramnios). 
Esto se debe a un aumento en la expresión y 
actividad de la iso-enzima COX-2.
Hipótesis
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
• Membranas de pacientes con parto 
pretérmino secundario a sobredistención 
controladas con membranas de pacientes sin 
trabajo de parto
• Determinación de PG E2 en amnion (EIA)
• Determinación de la expresión de COX-1 y 
COX-2 (Western Blot)
• Inhibición selectiva de COX-1 (SC 560) y de 
COX-2 (SC 236)
Método
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
Producción de PGE2 en amnion
Gemelos y polihidramnios 
Producción de PGE2 en amnion
Gemelos y polihidramnios 
00
20002000
40004000
TwinsTwins Poly-Poly-
hydramnioshydramnios
Non-Non-
LaborLabor
LaborLaborP
G
E
2
(p
g/
m
g 
tis
su
e)
P
G
E
2
(p
g/
m
g 
tis
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e)
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
*
*
* P < 0.05
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes 
con parto pretérmino secundario a gemelos 
y polihidramnios
Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes 
con parto pretérmino secundario a gemelos 
y polihidramnios
Amnion
PGE2 ASSAY
DMSO DMSO INDOMETHACIN SC236 SC560
H2O AA AA AA AA 
Controles
Leguizamón et al 2.000
Efecto de los inhibidores del COX sobre la 
producción de PGE2 por el amnion
Efecto de los inhibidores del COX sobre la 
producción de PGE2 por el amnion
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 3 4 5 6 7 8
IndoIndo
SC-236SC-236
SC-560SC-560
P
G
E
2
pr
od
uc
tio
n 
(%
 o
f c
on
tro
l)
TwinsTwins Poly-
hydramnios
Poly-
hydramnios
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
El parto prematuro secundario a 
embarazo múltiple o polihidramnios se 
asocia a un aumento de la expresión y 
actividad del COX-2 del amnion
Conclusión
Especulación: Los inhibidores selectivos de 
la COX-2 podrían ser tocolíticos efectivos y 
seguros
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Polymerase Chain Reaction 
(PCR)
Used to massively replicate DNA 
sequences.
• How it works:
Separate the two strands with low heat
Add some base pairs, primer 
sequences, and DNA Polymerase
Creates double stranded DNA 
from a single strand.
Primer sequences create a 
seed from which double 
stranded DNA grows.
Repeat. Amount of DNA grows 
exponentially.1→2→4→8→16→32→
64→128
Denaturation
Raise temperature to 94oC 
to separate the duplex form 
of DNA into single strands
Design primers
• To perform PCR, a 10-20bp sequence on 
either side of the sequence to be amplified 
must be known because DNA pol requires a 
primer to synthesize a new strand of DNA
Annealing
• Anneal primers at 50-65oC
Annealing
• Anneal primers at 50-65oC
Extension
• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taq
pol to attach at each priming site and extend a 
new DNA strand
Extensiòn
• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taq
pol to attach at each priming site and extend a 
new DNA strand
Repeat
• Repeat the Denature, Anneal, Extension 
steps at their respective temperatures…
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
• Problem: Modern 
instrumentation cannot 
easily detect single 
molecules of DNA, 
making amplification a 
prerequisite for further 
analysis
• Solution: PCR doubles 
the number of DNA 
fragments at every 
iteration 1… 2… 4… 8…
DNA Arrays--Technical Foundations
• An array works by exploiting the ability of a given mRNA
molecule to hybridize to the DNA template. 
• Using an array containing many DNA samples in an 
experiment, the expression levels of hundreds or thousands 
genes within a cell by measuring the amount of mRNA bound 
to each site on the array. 
• With the aid of a computer, the amount of mRNA bound to the 
spots on the microarray is precisely measured, generating a 
profile of gene expression in the cell. 
Tipos de Microarrarys
GENÓMICOS DE EXPRESIÓN MUTACIONES
MICROARRAYS
Microarray GenMicroarray Genóómicomico
•• DetectaDetecta la la presenciapresencia o o ausenciaausencia de un de un gengen y en y en cucuáántas ntas 
copiascopias
••MicroarrayMicroarray de de ExpresiExpresióónn
•• Determina los niveles relativosDetermina los niveles relativos de de expresiexpresióónn ((mRNAmRNA) de ) de loslos
genesgenes
AnAnáálisis por Microarrayslisis por Microarrays
Duggan DJ. et al., Nature Genet. 21: 10-14 (Supplement) (1999).
An experiment on a microarray
In this schematic:
GREEN represents Control DNA
RED represents Sample DNA
YELLOW represents a combination of Control and Sample DNA
BLACK represents areas where neither the Control nor Sample DNA 
Each color in an array represents either healthy (control) or diseased (sample) 
tissue. 
The location and intensity of a color tell us whether the gene, or mutation, is 
present in 
the control and/or sample DNA. 
Tipos de Muestra Tipos de Muestra 
DiagnDiagnóóstico Pre y Poststico Pre y Post--natalnatal
• Sangre
• Líquido Amniótico 
Células en Cultivo
Células sin cultivar
• Vellosidades Coriónicas
• Blastómeros
• Cuerpos Polares
• Productos de Aborto
Análisis mediante microarray de expresión 
génica 
• Objetivo: identificar patrones de expresión 
génica durante el trabajo de parto 
prematuro y de término en el humano y la 
rata
• Análisis de microarray utilizando ARN 
miometral de pacientes con:
o Parto prematuro con y sin trabajo de parto
o Parto de término con trabajo de parto 
DNA Microarray
Tagged probes become 
hybridized to the DNA chip’s 
microarray.
Millions of DNA strands 
build up on each location.
77 genes 
incrementaron
su actividad (X2) en
pacientes con trabajo
de parto a tèrmino y 
pretèrmino
PTNL PTL TL 
Sin cambios
Aumento
Disminución
Agrupación funcional en clusters de 
genes de miometrio humano
Bethin et al
Agrupación funcional en clusters de 
genes de miometrio de rata
PTNL PTL TL 
Activación de 
diferentes genes en
el humano y en la 
rata