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DESARROLLO DE UN PROTOTIPO PARA LA DETECCIÓN DE GRUPOS FUNCIONALES DE COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES ASOCIADOS AL DETERIORO ALIMENTARIO ANA MARÍA GONZÁLEZ BONILLA UNIVERSIDAD EL BOSQUE FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE BIOINGENIERÍA BOGOTÁ, D.C. 2020 ANA MARÌA GONZÀLEZ BONILLA 2 DESARROLLO DE UN PROTOTIPO PARA LA DETECCIÓN DE GRUPOS FUNCIONALES DE COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES ASOCIADOS AL DETERIORO ALIMENTARIO ANA MARÍA GONZÁLEZ BONILLA Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de: Bioingeniero Modalidad de Trabajo de Grado: Desarrollo de Producto Tutor: Jorge Armando Oliveros Hincapié Cotutora: Yudtanduly Acuña Monsalve UNIVERSIDAD EL BOSQUE FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE BIOINGENIERÍA BOGOTÁ, D.C. 2020 DEDICATORIA A Dios por darme la oportunidad de alcanzar mis sueños y metas de ser una mujer con un título profesional. A mi mamá y mi hermana por ser mi apoyo incondicional durante este camino que emprendí hace 5 años para poder cumplir con el logro de ser Bioingeniera. Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 4 AGRADECIMIENTOS Antes que nada, quiero agradecer a mi familia por brindarme el apoyo, esfuerzo y amor incondicional durante mi crecimiento y desarrollo personal. Agradecer a los encargados de la dirección del proyecto los ingenieros Jorge Armando Oliveros y Yudtanduly Acuña por sus aportes, apoyo, dedicación y paciencia durante el desarrollo de este proyecto de grado. CONTENIDO RESUMEN ....................................................................................................................... 13 ABSTRACT ..................................................................................................................... 15 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 17 1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ................................................................................ 19 2. JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................... 21 3. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................ 23 4. ESTADO DEL ARTE ................................................................................................ 24 5. MARCO REFERENCIAL .......................................................................................... 27 5.1. Seguridad e Inocuidad Alimentaria ................................................................ 27 5.2. Agentes y enfermedades de transmisión alimentaria ................................... 27 5.3. L. monocytogenes ........................................................................................... 28 5.3.1. Patogenicidad ............................................................................................. 28 5.3.2. Estadísticas ................................................................................................ 29 5.4. Deterioro Alimentario ...................................................................................... 29 5.5. Contaminación en alimentos listos para el consumo humano .................... 30 5.6. Generación de compuestos orgánicos volátiles generados por organismos patógenos ................................................................................................................... 30 5.7. Grupos funcionales asociados al deterioro del alimento ............................. 31 5.8. Métodos de medición de COVs en muestras alimentarias ........................... 31 5.8.1. Sistemas electrónicos para la detección de compuestos orgánicos volátiles 31 5.8.2. Sensores asociados a la identificación de grupos funcionales .................... 32 5.8.3. Elementos electrónicos para medir COVs .................................................. 33 5.8.4. Sensores electrónicos quimio resistivos y sensores de condiciones ambientales .............................................................................................................. 34 5.9. Microbiología predictiva.................................................................................. 36 5.9.1. Velocidad especifica de crecimiento ........................................................... 36 5.10. Machine learning .......................................................................................... 36 5.10.1. Modelos de estimación ............................................................................... 37 5.10.2. Regresión lineal múltiple ............................................................................. 38 5.10.3. Matriz de confusión y métricas ................................................................... 39 5.10.4. Clasificador k- vecinos más próximos ......................................................... 40 5.11. Marco legal ................................................................................................... 41 6. LEVANTAMIENTO DE REQUERIMIENTOS ............................................................ 42 6.1. Requerimientos de Funcionalidad ................................................................. 42 Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 6 6.2. Requerimientos de Calidad ............................................................................. 43 6.3. Requerimientos de Restricción ...................................................................... 45 6.4. Requerimientos del algoritmo de predicción y clasificación ....................... 45 7. METODOLOGÍA PROPUESTA ................................................................................ 46 7.1. Investigación de grupos funcionales asociados a los compuestos orgánicos volátiles....................................................................................................................... 46 7.2. Selección de herramientas y métodos para la identificación y recolección de las diferentes variables .............................................................................................. 46 7.3. Adquisición de componentes ......................................................................... 47 7.4. Diseño de primera versión del prototipo para la adquisición de datos generados por el arreglo de sensores ...................................................................... 47 7.4.1. Arreglo de Sensores MQ, temperatura y humedad relativa ........................ 47 7.4.2. Sensor SGAS 707 ...................................................................................... 48 7.4.3. Diseño de Algoritmo para la Obtención de datos ........................................ 48 7.5. Sistema de medición de temperatura interna del prototipo ......................... 49 7.5.1. Sistema de Medición .................................................................................. 50 7.5.2. Sistema de Calefacción .............................................................................. 51 7.5.3. Integración del sistema temperatura y del sistema de calefacción .............. 51 7.6. Sistema de control........................................................................................... 52 7.7. Sistema de alimentación ................................................................................. 52 7.8. Sistema de interacción con el usuario ........................................................... 52 7.9. Diseño del algoritmo obtención de datos sistema de temperatura y calefacción .................................................................................................................52 7.10. Ingeniería de detalle – diseño e impresión PCB ........................................ 53 7.11. Caracterización de los sistemas de medición diseñados ......................... 53 7.11.1. Etapa de precalentamiento ......................................................................... 53 7.11.2. Calibración – Verificación del Funcionamiento del Sensor SGAS 707 frente a la sensibilidad de Sustancias. ................................................................................... 53 7.11.3. Calibración y verificación de funcionamiento de los sensores MQ .............. 54 7.11.4. Calibración y Curvas de variación de medida sistema de medición y control de temperatura y humedad ....................................................................................... 54 7.12. Plan de pruebas ........................................................................................... 55 7.13. Pruebas de asepsia ...................................................................................... 56 7.14. Implementación de modelos Machine Learning ........................................ 56 7.14.1. Diseño y desarrollo interfaz de microbiología predictiva ............................. 58 7.14.2. Diseño y desarrollo de la interfaz del modelo de predicción de crecimiento con regresión Múltiple ..................................................................................................... 62 7.15. Diseño y desarrollo de modelo Machine Learning de calidad de alimentos cárnicos ...................................................................................................................... 66 7.15.1. Algoritmo de clasificación de características ............................................... 67 7.15.2. Etapa de entrenamiento ............................................................................. 67 7.15.3. Métricas de evaluación ............................................................................... 67 7.15.4. Métricas de evaluación ............................................................................... 68 7.15.5. Fase de visualización gráfica ...................................................................... 68 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 69 8.1. Selección de herramientas y métodos para la identificación y recolección de las diferentes variables .............................................................................................. 69 8.2. Especificaciones de sensores Seleccionados .............................................. 70 8.2.1. Sensor SGAS 707 ...................................................................................... 70 8.2.2. Sensor MQ-3 .............................................................................................. 70 8.2.3. Sensor MQ-5 .............................................................................................. 70 8.2.4. Sensor MQ-135 .......................................................................................... 71 8.2.5. Sensor de humedad HIH 4000 ................................................................... 71 8.2.6. Sensor de temperatura Max 6675 .............................................................. 71 8.2.7. Celdas peltier ............................................................................................. 71 8.3. Matrices de decisión para la selección de componentes electrónicos ....... 72 8.4. Diseño del prototipo inicial para la adquisición de los datos generados por el arreglo de sensores de gas ................................................................................... 74 8.4.1. Adquisición de la señal arreglo sensores familia MQ. ................................. 74 8.5. Diseño del algoritmo para la obtención de los datos del sistema de sensores MQ 76 8.6. Sistema de medición de la temperatura interna del prototipo ..................... 77 8.7. Diseño de algoritmo para la obtención de los datos del sistema de temperatura y la calefacción ..................................................................................... 78 8.8. Selección de las dimensiones del prototipo .................................................. 80 8.9. Selección del material del prototipo............................................................... 80 8.9.1. Matriz de decisión para la selección del material del prototipo .................... 80 8.9.2. Hermeticidad del prototipo .......................................................................... 81 8.10. Diseño e impresión de PCB modulares de sensores modulares ............. 81 8.11. Ingeniería de detalle ..................................................................................... 84 8.11.1. Sistema de medición de compuestos orgánicos volátiles ........................... 84 8.12. Sistema de procesamiento .......................................................................... 85 8.13. Sistema de alimentación ............................................................................. 88 8.14. Sistema de interacción con el usuario ....................................................... 89 8.15. Sistema de almacenamiento ....................................................................... 90 Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 8 8.16. Diseño físico del prototipo .......................................................................... 91 8.16.1. Diseño y estructura Externa- caja principal ................................................. 91 8.16.2. Diseño y estructura externa- Almacenamiento sensórica. .......................... 95 8.17. Planos del prototipo .................................................................................... 96 8.18. Verificación del funcionamiento de los sensores de gas ......................... 96 8.18.1. Calibración por sensibilidad del sensor SGAS 707 Datasheet .................... 96 8.18.2. Gráfica de comportamiento sensor SGAS 707 ........................................... 97 8.18.3. Calibración por sensibilidad del sensor MQ-3Datasheet ............................. 99 8.18.4. Gráfica de comportamiento sensor MQ-3 ................................................. 100 8.18.5. Calibración por sensibilidad del sensor MQ-5 Datasheet .......................... 102 8.18.6. Gráfica de comportamiento sensor MQ-5 ................................................. 103 8.18.7. Calibración por sensibilidad sensor MQ-135 Datasheet ............................ 105 8.18.8. Gráfica de comportamiento sensor MQ-135 ............................................. 105 8.18.9. Variación de medida sistema de medición y control de Temperatura ....... 106 8.19. Diseño y desarrollo de interfaz de evaluación de modelo de microbiología predictiva .................................................................................................................. 108 8.19.1. Interfaz Modelo predictivo ......................................................................... 109 8.20. Visualización del funcionamiento de la interfaz gráfica y el modelo de predicción microbiana ............................................................................................. 110 8.21. Diseño y desarrollo de la interfaz del modelo de predicción del crecimiento con regresión múltiple ............................................................................................. 111 8.21.1. Adquisición y procesamiento de las señales ............................................. 112 8.21.2. Características de entrada ........................................................................ 112 8.21.3. Característica de salida ............................................................................ 112 8.21.4. Extracción de las características ..............................................................114 8.21.5. Error total del algoritmo ............................................................................ 115 8.21.6. Cálculo de thetas y de fórmula de la correlación entre las entradas y salida del sistema 117 8.21.7. Etapa de visualización de modelo regresión múltiple ................................ 118 8.22. Diseño y desarrollo del modelo de clasificación K-vecinos ................... 119 8.22.1. Etapa de Visualización del clasificador K-NN ........................................... 123 9. Costo del prototipo ............................................................................................... 126 10. CONCLUSIONES ............................................................................................... 127 11. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 129 12. REFERENCIAS .................................................................................................. 130 LISTA DE ILUSTRACIONES Ilustración 1 Árbol del problema. ............................................................................ 20 Ilustración 2 Crecimiento de L. monocytogenes en agar PALCAM ........................ 28 Ilustración 3 Principales vías metabólicas primarias y secundarias. ...................... 31 Ilustración4 Producción de grupos funcionales asociados a contaminación microbiana. ............................................................................................................ 33 Ilustración 5 Sensor HIH-4000. .............................................................................. 35 Ilustración 6 Modulo de termocupla tipo k MAX 6675. ........................................... 35 Ilustración 7 Métodos de validación Machine Learning. ......................................... 37 Ilustración 8 Clases asignadas por K-vecinos........................................................ 40 Ilustración 9 Esquemático electrónico del sistema de sensores MQ y DHT11. ..... 74 Ilustración 10 Diagrama esquemático del circuito de acondicionamiento del calentador del sensor SGAS 707. .......................................................................... 75 Ilustración 11 Sistema de medición y calefacción del prototipo. ............................ 77 Ilustración 12 Esquema electrónico PCB de sistema de medición de sensores MQ. ............................................................................................................................... 82 Ilustración 13 Esquema electrónico PCB de sistema de temperatura y calefacción. ............................................................................................................................... 82 Ilustración 14 Esquema electrónico PCB del sistema de acondicionamiento del calentador del sensor SGAS 707. .......................................................................... 83 Ilustración 15 Esquema electrónico PCB del sistema general de integración de los componentes electrónicos. .................................................................................... 83 Ilustración 16 Arreglo de sensores prototipo preliminar. ........................................ 84 Ilustración 17 Arreglo de sensores finales para la detección de COVs en matrices alimentarias............................................................................................................ 85 Ilustración 18 Diseño esquemático final de sistema de procesamiento. ................ 86 Ilustración 19 Sistema de alimentación. ................................................................. 88 Ilustración 20 Sistema de interacción con el usuario y el almacenamiento. .......... 89 Ilustración 21 Partes de Sistema electrónico tipo modular en configuración Shell.90 Ilustración 22 Vista frontal Ensamble final de prototipo ........................................ 91 Ilustración 23 Vista lateral de ensamble final de prototipo. .................................... 92 Ilustración 24 Prototipo final ensamblado. ............................................................. 93 Ilustración 25 Comunicación del prototipo con interfaz LabVIEW®. ...................... 94 Ilustración 26 Vista superior de etapa componentes electrónicos del prototipo. .... 95 Ilustración 27 Curva de calibración sensor SGAS707 en presencia de concentraciones de cetonas. ................................................................................. 97 Ilustración 28 Curva de validación de pruebas de detección de grupos funcionales cetonas. ................................................................................................................. 98 Ilustración 29 Curva de calibración del sensor MQ-3 en presencia de concentraciones de alcoholes. ............................................................................. 100 Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 10 Ilustración 30 Curva de validación de pruebas detección de grupos funcionales alcoholes. ............................................................................................................. 101 Ilustración 31 Curva de calibración sensor MQ-5 en presencia de concentraciones del propano. ......................................................................................................... 103 Ilustración 32 Curva de validación de pruebas detección de propano volátil. ...... 103 Ilustración 33 Curva de calibración sensor MQ-135 en presencia de concentraciones de iones amonio. .................................................................................................. 105 Ilustración 34 Construcción e implementación de interfaz de modelo de predicción microbiano específico para L. monocytogenes. ................................................... 108 Ilustración 35: Construcción e implementación de interfaz de modelo de predicción microbiano específico para L. monocytogenes. ................................................... 109 Ilustración 36 Visualización gráfica de modelo de predicción. ............................ 110 Ilustración 37 Interfaz del modelamiento predictivo en funcionamiento, y resultado de parámetros. ..................................................................................................... 111 Ilustración 38 Extracción de las características sin normalizar y con ruido ......... 113 Ilustración 39 Normalización de las características de entrada del modelo de regresión múltiple. ................................................................................................ 114 Ilustración 40 Gráfica del modelo predictivo vs comportamiento de crecimiento poblacional microbiano con datos reales extraídos de articulo base. .................. 116 Ilustración 41 Visualización gráfica de modelo de regresión múltiple. ................. 118 Ilustración 42 Visualización gráfica de modelo de regresión múltiple. ................. 119 Ilustración 43 Matriz de dispersión de las cuatro clases establecidas para determinar la calidad del alimento en el modelo de clasificación. .......................................... 120 Ilustración 44 Grafica de matriz de dispersión entre dos clases. ......................... 121 Ilustración 45 Matriz de confusión del algoritmo de clasificación de la calidad de las matrices cárnicas. ................................................................................................ 123 Ilustración 46 Interfaz gráfica de modelo de clasificación de la calidad de alimentos cárnicos. .............................................................................................................. 124 LISTA DE ECUACIONES Ecuación 1:Precisión. ............................................................................................ 39 Ecuación 2:Sensibilidad. ........................................................................................39 Ecuación 3: Especificidad. ..................................................................................... 40 Ecuación 4 Perdida de agua. ................................................................................. 60 Ecuación 5 Producción ácido láctico. .................................................................... 61 Ecuación 6 Velocidad de crecimiento. ................................................................... 61 Ecuación 7 crecimiento microbiano ....................................................................... 61 Ecuación 8 Características extraídas del comportamiento de los sensores en función del crecimiento microbiano. ................................................................................... 63 Ecuación 9 Función hipótesis ............................................................................... 64 Ecuación 10 Función de coste. .............................................................................. 65 Ecuación 11 Solución analítica. ............................................................................. 65 Ecuación 12 Métricas de evaluación. ..................................................................... 68 Ecuación 13 Error cuadrático medio .................................................................... 115 Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 12 LISTA DE TABLAS Tabla 1 sensores específicos para la detección de grupos funcionales ................ 34 Tabla 2 Conjunto de datos de entrada en relación con salida del sistema. ........... 38 Tabla 3 Matriz de confusión para dos o más clases. ............................................. 39 Tabla 4 Rangos de Activación del sistema de Calefacción. ................................... 51 Tabla 5 Parámetros cardinales de condiciones óptimas de crecimiento microbiano para L. monocytogenes. ........................................................................................ 60 Tabla 6 Características extraídas del comportamiento de los sensores en función del crecimiento microbiano. ................................................................................... 64 Tabla 7 Clases establecidas para clasificar la calidad de matrices alimentarias. . 67 Tabla 8 Tabla de sensores seleccionados para la detección de los compuestos orgánicos volátiles. ................................................................................................ 69 Tabla 9 Selección final de componentes para la medición de diferentes grupos funcionales que conforman los compuestos orgánicos volátiles. ........................... 70 Tabla 10 Matriz de decisión de selección de sensor detector de múltiples gases. 72 Tabla 11 Matriz de decisión de selección de sensor específico para la detección de grupos funcionales con presencia de alcoholes..................................................... 72 Tabla 12 Matriz de decisión de selección de sensor específico para la detección de grupos funcionales asociados a la presencia de metano, propano y butano. ........ 72 Tabla 13 Matriz de decisión de selección de sensor específico para la detección de la presencia de Metano, Butano y sus derivados................................................... 73 Tabla14 Matriz de decisión de selección de sensor específico para la detección de la temperatura interna del prototipo. ...................................................................... 73 Tabla 15 Matriz de decisión de selección de sensor específico para la detección de humedad relativa interna del prototipo. .................................................................. 73 Tabla 16 Rangos establecidos para el funcionamiento de sistema de calefacción- celdas peltier. ......................................................................................................... 78 Tabla 17:criterios de orientación para la decisión de material del prototipo. .......... 80 Tabla 18 Datos arrojados durante las experimentaciones. .................................... 99 Tabla 19 Curva de validación de pruebas detección de grupos funcionales alcoholes. ............................................................................................................. 102 Tabla 20 Curva de validación de pruebas detección de propano en el espectro de cabeza. ................................................................................................................ 104 Tabla 21 Curva de datos teóricos para la detección de NH4 en el espectro de cabeza. ................................................................................................................ 106 Tabla 22 Tabla de medición de temperatura vs tiempo de respuesta. ................ 107 Tabla 23 Parámetros de thetas óptimos generados en el modelo de regresión múltiple. ............................................................................................................... 117 Tabla 24 Resultados de comparación entre clases del clasificador. .................. 122 RESUMEN El deterioro en matrices alimentarias se da, principalmente, por el desarrollo de actividades microbianas asociadas a la degradación de sustratos que componen el alimento como proteínas, carbohidratos y lípidos, generando cambios en las propiedades intrínsecas, atributos sensoriales y generación de compuestos orgánicos volátiles desagradables convirtiéndolo en un alimento no apto para el consumo humano (Lorenzo et al., 2018; Odeyemi, Alegbeleye, Strateva, & Stratev, 2020). Para el año 2019 el Instituto Nacional de Salud registró un incremento del 56% en los reportes de casos por enfermedades de transmisión alimentaria, donde el 67% de los registros corresponde a reportes generados por deficiencias en la manipulación de alimentos en el hogar y el 25% restante a brotes asociados por el consumo de alimentos, en establecimientos públicos (Guerrero, 2016; Lucía et al., n.d.). El presente trabajo de grado tiene como objetivo desarrollar un prototipo para la medición de diferentes grupos funcionales de compuestos orgánicos volátiles, generados en matrices alimentarias asociados al deterioro alimentario a través de un arreglo de sensores de gas y la medición de la temperatura y la humedad de las condiciones internas del prototipo. Para la definición del problema se investigaron los antecedentes relacionados con la identificación del deterioro de los alimentos por la presencia de microorganismos patógenos, lo cual permite la contextualización de la problemática asociada a la seguridad e inocuidad alimentaria; seguido, se planteó la justificación frente a la importancia de desarrollar herramientas y equipos que permitan la medición de los compuestos orgánicos volátiles generados por la proliferación de agentes patógenos en los alimentos. Los argumentos teóricos y la normatividad de base se exponen en el marco referencial, como, así mismo, la revisión de otros estudios enfocados en el desarrollo de equipos electrónicos en el campo de la inocuidad de los alimentos. La metodología planteada se desarrolla en función del cumplimiento de cada uno de los objetivos. Para el primer y segundo objetivo se utilizó la metodología CDIO, la cual consiste en contextualizar, diseñar e implementar un prototipo para la detección de diferentes grupos funcionales de compuestos orgánicos volátiles asociados al deterioro alimentario. Para el diseño del prototipo inicialmente se realizó la revisión de estudios que desarrollan equipos para la detección de los compuestos orgánicos volátiles, después se desarrollaron dos componentes: el diseño del hardware electrónico en Arduino® y el diseño físico en el programa de diseño Fusion 360®. Después, el segundo objetivo, el cual consiste en construir un prototipo que permita registrar gases relacionados con grupos funcionalesde los compuestos orgánicos volátiles, implementando un control de temperatura y monitoreo de la humedad. La construcción se realizó mediante la formulación de los Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 14 requerimientos necesarios para la medición por los componentes electrónicos, se incorporó el diseño físico del prototipo para medir los cambios en la resistencia de los sensores por la presencia de los gases generados en el alimento. Para el desarrollo del tercer objetivo, se implementó una interfaz gráfica en el software de ingeniería LabVIEW® para que permita relacionar los compuestos orgánicos volátiles con la presencia de microorganismos asociados al deterioro alimentario. Se desarrollaron 3 modelos de predicción del comportamiento microbiano frente a la variación de los componentes electrónicos; el primero, hace referencia a un modelo de microbiología predictiva con base en argumentos teóricos; el segundo, se desarrolló mediante la extracción de datos experimentales del artículo “Electronic nose dataset for beef quality monitoring in uncontrolled ambient conditions”, evaluando la correlación entre los datos arrojados por los sensores MQ3,5,135, temperatura y humedad en la predicción del comportamiento de crecimiento poblacional microbiano. El último modelo hace referencia a un sistema Machine Learning de tipo K-NN que permite clasificar una muestra desconocida en clases de calidad establecidas por el estudio, anteriormente, mencionado. Palabras clave: Deterioro alimentario, Machine Learning, compuestos orgánicos Volátiles, modelo predictivo, ABSTRACT Deterioration in food matrices is mainly due to the development of microbial activities associated with the degradation of substrates that make up food such as proteins, carbohydrates and lipids, generate changes in intrinsic properties, sensory attributes and the generation of unpleasant volatile organic compounds, making it unfit for human consumption (Lorenzo et al., 2018; Odeyemi, Alegbeleye, Strateva, & Stratev, 2020). By 2019, the National Health Institute recorded a 56% increase in case reports of foodborne diseases, with 67% of the records corresponding to reports generated by deficiencies in household food handling and the remaining 25% to outbreaks associated with food consumption in public establishments (Guerrero, 2016; Lucía et al., n.d.). This degree work aims to develop a prototype for the measurement of different functional groups of volatile organic compounds generated in food matrices associated to food spoilage through an array of gas sensors and the measurement of temperature and humidity of the internal conditions of the prototype. To define the problem, background research was done on the identification of food deterioration due to the presence of pathogenic microorganisms, which allows the contextualization of the problem associated to food safety and innocuousness, followed by the justification of the importance of developing tools and equipment that allow the measurement of volatile organic compounds generated by the proliferation of pathogenic agents in food. Theoretical arguments and basic regulations are presented in the reference framework, as well as the review of other studies focused on the development of electronic equipment in the field of food safety. The proposed methodology is developed according to the fulfillment of each one of the objectives. For the first and second objectives, CDIO methodology was used, which consists of contextualizing, designing and implementing a prototype for the detection of different functional groups of volatile organic compounds associated to food spoilage. For the design of the prototype, we initially reviewed studies that develop equipment for the detection of VOCs, then we developed two components: the design of the electronic hardware in Arduino® and the physical design in the Fusion 360® design program, then the second objective which consists of building a prototype that allows the recording of gases related to functional groups of VOCs, implementing a temperature control and humidity monitoring. The construction was done by formulating the necessary requirements for the measurement by the electronic components, the physical design of the prototype was incorporated to measure the changes in the resistance of the sensors by the presence of the gases generated in the food. For the development of the third objective, a graphic interface was implemented in the engineering software LABVIEW® that allows to relate the volatile organic compounds with the presence of microorganisms associated with food spoilage. Three models of prediction of microbial behavior in front of the Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 16 variation of electronic components were developed, the first one refers to a predictive microbiology model based on theoretical arguments, the second one was developed through the extraction of experimental data from the article "Electronic nose dataset for beef quality monitoring in uncontrolled environmental conditions", evaluating the correlation between the data thrown by the sensors MQ3,5,135, temperature and humidity in the prediction of the behavior of microbial population growth. The last model refers to a K-NN classifier which allows to classify an unknown sample in quality classes established by the previously mentioned study. INTRODUCCIÓN El estudio de la calidad e inocuidad de los alimentos a nivel mundial es importante frente al desarrollo de tecnologías y estrategias que garanticen la producción de los alimentos según la normativa vigente(Potravinarstvo, 2018). La inocuidad puede verse afectada, por diferentes factores como: factores biológicos, factores ambientales, fallas en la cadena de procesamiento y contaminación cruzada por la manipulación de diferentes alimentos en un mismo espacio o por el uso de implementos no esterilizados. La afectación por factores biológicos en alimentos como hortalizas, lácteos y frutas se da por la presencia de bacterias patógenas que pueden ser adquiridas por diferentes medios, principalmente por las practicas antihigiénicas durante el proceso y envase de los productos, deficiencia en la cadena de refrigeración y por mala manipulación durante su procesamiento, con llevando al deterioro de los alimentos (“Calidad e inocuidad de alimentos,” n.d.; Caraballo Guzmán, González Hurtado, Cuesta-Astroz, & Torres, 2020) En consecuencia, el consumo de alimentos contaminados por patógenos entéricos como L. monocytogenes, S. aureus, E. coli y Pseudomonas. spp acarrean el desarrollo de enfermedades de transmisión alimentaria (ETAS), las cuales generan intoxicaciones en el sistema digestivo, por la ingesta de toxinas liberadas por los procesos metabólicos propios del crecimiento microbiano. El desarrollo de enzimas y toxinas microbianas, se ven limitadas en su desarrollo por los factores intrínsecos del alimento como: el pH, la actividad de agua (Aw) en relación directa con los factores extrínsecos como la humedad relativa, la temperatura y la atmósfera gaseosa en la que se encuentre el alimento fomentando su incremento poblacional y el deterioro de la calidad del alimento en función del tiempo (Instituto Nacional de Salud Subdirección de Investigación, n.d.-a; Majumdar et al., 2018).Por otro lado el deterioro alimentario genera graves incidencias sobre el cumplimiento de los protocolos HACCP los cuales se establecen como la normativa institucional que rige y analiza los puntos críticos y peligros que puedan presentarse durante la producción de todos los alimentos (Salud Rubio Lozano et al., 2013). En Colombia, las enfermedades de transmisiónalimentaria hacen parte de los problemas que afectan ocurrentemente la salud pública, según la evaluación de los indicadores a nivel nacional reportados por el sistema de vigilancia Sivigila, entre los periodos de 2016 a 2018 se ha presentado un incremento del 2,5% de los casos positivos por intoxicación, principalmente, en alimentos cárnicos, lácteos, productos delicatessen y comidas preparadas en frio listas para el consumo, ocasionando preocupación en el sector productivo, en pequeños y grandes fabricantes en cuanto a garantizar la inocuidad y seguridad de sus productos durante el consumo y tiempo de vida del mismo, durante un periodo de tiempo, previamente establecido en cumplimiento con los estándares de la normatividad colombiana (Instituto Nacional de Salud Subdirección de Investigación). En la actualidad, las pruebas de calidad de identificación de microrganismos en los alimentos como los métodos microscópicos, prueba PCR y la prueba LAL para la Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 18 identificación endotoxinas constituyen un costo elevado y tiempo de respuesta , por lo cual en los últimos años se han estudiado y desarrollado diferentes métodos para identificación y predicción de la población microbiana en diferentes matrices alimentarias por medio de la implementación de instrumentación electrónica conformada por elementos semiconductores de óxido metálico (CMOS) y polímeros orgánicos conductores (CP), que permiten identificar compuestos orgánicos conformados por grupos funcionales como: aminas, alcoholes, aldehídos, cetonas, bencenos y amonio, que pueden relacionarse con la presencia de microorganismos en un alimento generados por las diferentes rutas metabólicas de los mismos durante su crecimiento poblacional(Casalinuovo, Di Pierro, Coletta, & Di Francesco, 2006; Majumdar et al., 2018). De igual forma la aplicación de modelos de predicción Machine Learning de crecimiento microbiano en diferentes matrices alimentarias mediante el análisis de los factores intrínsecos y extrínsecos que inhiban la velocidad de crecimiento y la proliferación de uno o varios microorganismos en un alimento, se pueden determinar por medio de modelos de estimación, según las características involucradas en el desarrollo y afectación del mismo en relación con el crecimiento de un microorganismo en el tiempo. Siendo estas alternativas métodos de detección temprana de la presencia de microrganismos en diferentes productos, la identificación del deterioro del alimento y un aporte en el control de calidad en el sector para pequeños y grandes productores de la industria alimentaria (Casalinuovo et al., 2006). El desarrollo de este trabajo de grado va dirigido al sector productivo alimentario, principalmente, a las empresas de producción y venta de alimentos listos para el consumo, los cuales tienen la necesidad de garantizar la calidad e inocuidad de los alimentos que adquieren de pequeños productores y agricultores. El desarrollo de este proyecto tiene como finalidad contribuir en el desarrollo de prototipos basados en la integración de instrumentación electrónica específica para detección de gases industriales que permitan la identificación temprana de la presencia de agentes patógenos en la producción final de alimentos aptos para el consumo humano, generando un impacto positivo en la disminución de casos detectados por el sistema de salud por consumo de alimentos en estado de deterioro. 1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA La seguridad alimentaria y la calidad de los alimentos se encuentran entre los retos que busca garantizar la industria y el sector productivo a la hora de sacar al mercado productos listos para el consumo humano, debido a la generación del deterioro de los alimentos frente a la presencia de microorganismos o por inconsistencias durante su proceso de producción, concibiendo el desarrollo de indicadores como cambios en su apariencia, generación de olores característicos de deterioro y cambios en su sabor y textura, catalogándolos como alimentos no aptos para ser consumidos, generando tanto afectaciones en la salud pública, como en pérdidas económicas para el sector y, por ende, el desperdicio de alimentos siendo el hambre y la desnutrición problemáticas a nivel mundial (Odeyemi et al., 2020). Entre los sectores que, eventualmente, deben lidiar con el deterioro alimentario frente al tiempo de consumo determinado para cada producto, se encuentra el sector cárnico, lácteo, hortalizas, frutas y alimentos delicatessen fabricados artesanalmente, para lo cual según análisis de producción estos alimentos pueden ser afectados por la colonización de agentes patógenos durante su procesamiento. El sistema de información de precios y abastecimiento del sector agropecuario colombiano (SIPSA) estima dentro del panorama mundial de producción de cárnicos un margen de 944.000 toneladas correspondientes a carne de canal, siendo Colombia el cuarto país de América latina con mayor producción de carne bovina durante 2015 (Federación Colombiana de Ganaderos, n.d.). Sin embargo, la falta de buenas prácticas y la falta de tecnificación del sector durante la cadena productiva de carne bovina genera deficiencias que favorecen condiciones para la proliferación microbiana, poniendo en riesgo la inocuidad del alimento, y por consiguiente, ocasionando afectaciones en la salud pública provocando enfermedades de transmisión alimentaria (Olea Normandin, 2007; Pajaro & Salazar, 2015). La contaminación de los alimentos puede darse por mala manipulación durante su procesamiento, principalmente, por factores humanos o por factores técnicos en cuanto a los protocolos de higienización en la maquinaria involucrada, generando la presencia de microorganismos por contaminación cruzada. La presencia de carga microbiana en la matriz alimentaria se evidencia en la etapa final de producción, empaque y distribución del producto (Invima, n.d.-a). La presencia de microorganismos puede llegar a originar deterioro de los productos, el cual es un proceso de cambio biológico y físico-químico generado en el alimento, calificándolo como inaceptable para el consumo humano (Wang, Li, Yang, Ruan, & Sun, 2016). Actualmente, existen diferentes técnicas como: cromatografía de gases, pruebas microbiológicas, trampa de agujas y narices electrónicas, en donde, debido a la complejidad y al elevado costo de las técnicas de laboratorio para determinar la presencia de microorganismos patógenos en los alimentos, se establece una dificultad para la evaluación de la calidad de los alimentos en corto tiempo y a bajo Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 20 costo (Montoya Rodríguez, 2014). En general, estas pruebas pueden tener un costo que oscila entre $150.000 y $400.000 COP y pueden tomar un tiempo estimado de 40 horas a 1 semana (“Kits de análisis de Listeria | Detección rápida y confiable de Listeria,” n.d.). La falta de dispositivos y herramientas de apoyo en la industria alimentaria que faciliten la verificación de la ausencia de patógenos como L. monocytogenes, E. coli S. aureus y demás microorganismos que se pueden presentar en productos cárnicos, lácteos, hortalizas y alimentos preparados, puede contribuir a que el lote de producción no cumpla con los parámetros de calidad establecidos por el decreto 1500 de 2007, el cual establece el reglamento técnico del sistema de inspección, vigilancia y control de la carne, derivados cárnicos, lácteos y demás productos destinados para el consumo humano (Pajaro & Salazar, 2015) (Minsalud, n.d.-b). Para el caso de alimentos cárnicos que presenten la presencia de L. monocytogenes se establece la normativa técnica 1325, la cual estipula total ausencia del microorganismo en las muestras de carne analizadas. (Icontec, 2008).Ilustración 1 Árbol del problema. 2. JUSTIFICACIÓN Los alimentos cómo las hortalizas, frutas, productos lácteos y cárnicos durante su cadena de procesamiento hasta su disposición final, suelen ser susceptibles al deterioro de sus propiedades, por fallas en su almacenamiento, refrigeración y manipulación, afectando así su inocuidad y calidad. Estos factores pueden ser afectados debido a la contaminación por agentes microbiológicos durante el desarrollo de la cadena productiva, la falta de buenas prácticas sanitarias y la exposición a nuevos factores ambientales, generando un ambiente propicio para la proliferación de microorganismos en la superficie donde se encuentran nutrientes que facilitan su crecimiento, generando afectaciones en la salud pública (Blanco- Ríos1, Casadiego-Ardila2, & Pacheco2, n.d.). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) actualmente se registran más de 250 tipos de enfermedades de transmisión alimentaria (ETAS), las cuales han presentado un crecimiento significativo durante los últimos años fomentando una problemática para el sistema de salud en el país (Muñoz, Vargas, Otero, Díaz, & Guzmán, 2011). Como ejemplo de un caso particular reciente de alimentos contaminados con L.monocytogenes, en España el ministerio de sanidad, consumo y bienestar social junto con la agencia española de seguridad alimentaria (AESAN) activaron una alerta alimentaria el 16 de agosto del presente año en Andalucía debido a la presencia de un brote de intoxicación por cárnicos contaminados por L.monocytogenes en carne mechada de la marca La Mecha (Blanco, Ríos,Casadiego Ardila, & Pacheco, 2011)(“Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social - Gabinete de Prensa - Notas de Prensa,” n.d.). Según un informe dado por la organización mundial de la salud (OMS), anualmente se registra en el sistema de salud aproximadamente 600 millones de personas en el mundo con cuadros infecciosos asociados a la ingesta de alimentos contaminados por bacterias, virus y parásitos, en donde se estima que uno de cada 10 personas son afectadas por consumir alimentos en un estado de deterioro medio (Cecilia & Blanco, n.d.). El cual puede llegar a ese estado por la variación de las condiciones del medio que facilitan la proliferación de diferentes microorganismos pudiendo generar contaminación cruzada del producto (Instituto Nacional de Salud Subdirección de Investigación, n.d.-b). En la actualidad la identificación de diferentes microorganismos patógenos en los alimentos antes del proceso de empaque se realiza mediante análisis microbiológicos, que consisten en el aislamiento del patógeno en un medio de crecimiento selectivo, lo que resulta en un método costoso y que consume un tiempo considerable. Métodos de identificación como PCR se han implementado para la estandarización y validación de la presencia del patógenos, sin embargo, resulta ser un procedimiento de alto costo que dificulta la identificación rápida del microorganismo en este caso en un lote de carne listo para distribución al consumidor (Salud Rubio Lozano et al., 2013). Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 22 La presencia y reproducción de agentes microbianos producen diferentes compuestos orgánicos volátiles (COVs) que pueden determinar el estado del producto (Gu, Sun, Tu, Dong, & Pan, 2016). Este proyecto de grado pretende contribuir con la solución del problema de verificación rápida de la calidad de los alimentos frente a la predicción de la presencia de patógenos en alimentos al desarrollar un prototipo y así contribuir desde la integración de las ciencias biológicas y la ingeniería con la seguridad alimentaria, que es uno de los focos misionales del programa de Bioingeniería. Frente a la propuesta de solución establecida se realizó una encuesta a personas del sector e inspectores del INVIMA, donde se les preguntaba específicamente si sería de interés para el sector un equipo que pudiera indicar la evaluación de la calidad de los alimentos. Los encuestados afirmaron que las pruebas tradicionales demoran más de 72 horas, por lo que este prototipo inicial desarrollado en un proyecto de grado se establece como tiempo máximo para la obtención de resultados en 72 horas (ANEXO 1). 3. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS OBJETIVO GENERAL: ➢ Desarrollar un prototipo para la detección de diferentes grupos funcionales de compuestos orgánicos volátiles asociados al deterioro alimentario. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Diseñar un prototipo para la detección de diferentes grupos funcionales de compuestos orgánicos volátiles asociados al deterioro alimentario. 2. Construir un prototipo que permita registrar gases relacionados con grupos funcionales de los compuestos orgánicos volátiles, implementando un control de temperatura y monitoreo de la humedad. 3. Implementar una interfaz en LABVIEW® de análisis de datos que permita relacionar los compuestos orgánicos volátiles con la presencia de microorganismos asociados al deterioro alimentario. Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 24 4. ESTADO DEL ARTE En los últimos años se han desarrollado equipos y métodos orientados a la detección de patógenos infecciosos en los alimentos, con el fin de garantizar y preservar la inocuidad de los alimentos y en beneficio en de la salud pública, evitando la generación de enfermedades de transmisión alimentaria que puedan desencadenar otras patologías asociadas, afectando la calidad de vida de los seres humanos por ejemplo; Abdallah, S. et al., 2013, presentan un equipo de detección rápida y a bajo costo que mide las concentraciones de los compuestos volátiles generados en los procesos enzimáticos, a través de la implementación de un Cyrasone 320, el cual está compuesto por 24 sensores quimio resistivos específicos para compuestos orgánicos volátiles generados en el medio. Se evaluó la eficacia del equipo por medio de la inoculación en diferentes proporciones de matrices cárnicas a distintas concentraciones por un periodo de 5 días, dando como resultado del estudio la cuantificación de la proporción detectada de los compuestos orgánicos volátiles durante el periodo de tiempo en cada una de las muestras analizadas para, finalmente, realizar una correlación positiva entre los resultados en placa, en relación con los obtenidos en las matrices alimentarias (Abdallah, Al- Shatti, Alhajraf, Al-Hammad, & Al-Awadi, 2013). En el estudio realizado por Chen Zhang et al., 2016, se analizó la generación de compuestos volátiles de cinco especies bacterianas presentes en diferentes matrices alimentarias, identificando la presencia de E. coli O157:H7, L. monocytogenes, S. enteritidis, Shigella flexneri y S. aureus, por medio de la implementación de técnicas como cromatografía de gases y espectrometría de masas, demostrando que la mayoría de los compuestos orgánicos volátiles generados por E. coli o157:H7 y L. monocytogenes pertenecen a la cadena de 3- hidroxi-2-butanona, se analizó también la producción del biomarcador en relación con la incidencia del crecimiento microbiano, eso con el fin, de poder identificar diferentes patógenos transmitidos por alimentos siendo un aporte a la investigación, sobre contaminación en matrices alimentarias por agentes patógenos que generan compuestos orgánicos volátiles en el proceso de deterioro del alimento (De La, Salcido, Eleazar, & Corona, 2010; Zhu et al., 2017). En el artículo realizado en el 2015 Casaburi et al., se analiza el deterioro de matrices cárnicas debido al desarrollo desmesurado de colonias de microorganismos patógenos, los cuales liberan una cantidad considerable de metabolitos no deseados generando malos olores en los productos,se identifican alcoholes, fenoles, cetonas y ésteres etc. Por otro lado se analizan los sustratos presentes en la carne como la glucosa y otros derivados que generan un deterioro muscular (Casaburi, Piombino, Nychas, Villani, & Ercolini, 2015). En 2016 Spadafora et al., estudiaron la presencia de agentes microbianos en muestras de productos recién cortados, principalmente, en matrices de melón, analizando la incidencia de los agentes biológicos en la emisión de compuestos orgánicos volátiles generados por la alteración de la composición química en la matriz alimentaria, se validó la presencia de patógenos por medio de cromatografía de desorción térmica y espectrometría de masas de tiempo de vuelo, analizando los perfiles de los compuestos volátiles generados en muestras inoculadas con el patógeno, asociados a deterioro de la fruta en un periodo de incubación de 7 días a 4°C (Spadafora et al., 2016). El estudio realizado por Wijaya y sarno et al., en el año 2018 consistió en el desarrollo de un arreglo de sensores de gas de tipo (CMOS) para la evaluación rápida de la calidad de la carne de ganado vacuno durante un periodo de tiempo determinado en condiciones ambientales no controladas. La experimentación consistió en realizar pruebas en cinco cortes de carne por un periodo de tiempo de 2160 minutos, evaluando los cambios en la resistencia de los sensores con respecto al crecimiento microbiano, como así mismo la influencia de no controlar la temperatura y la humedad durante el periodo de evaluación dentro de la cámara diseñada, los datos registrados fueron enviados vía inalámbrica generando ruido en las señales adquiridas durante la evaluación. Adicionalmente, simultáneamente, a la experimentación se realizaron pruebas microbiológicas por recuento de placa del crecimiento poblacional de la carga microbiana en el periodo de tiempo, para finalmente, establecer clases de calidad del alimento con base en valor de recuento microbiológico, los resultados de esta investigación se utilizaron como base de datos para el desarrollo del modelo de predicción y clasificador de condiciones de calidad de alimentos en el presente proyecto. Esta investigación demuestra la relación directa de la sensibilidad de los componentes en relación con el crecimiento poblacional de microorganismos en matrices alimentarias (Wijaya, Sarno, & Zulaika, 2018). Durante el primer periodo del 2019; los autores Johnson y Atkin et al, implementan una E-nose por medio de la variedad de sensores que miden la voltamperometría y conductimetría de señales biológicas, haciendo que sea eficiente y a bajo costo para la detección de bacterias patógenas presentes en los alimentos. Esta investigación muestra la relevancia y el interés actual que existe en el desarrollo de métodos alternativos para la detección de patógenos en alimentos (Johnson, Atkin, Lee, Sell, & Chandra, 2019). Por otro lado la implementación de modelos Machine Learning de tipo teórico para analizar el comportamiento de un fenómeno de crecimiento microbiológico, se encontró el estudio realizado por Martínez, Dalgaard et al., en donde se realizó la aplicación de modelos de predicción microbiológica para determinar el comportamiento y la velocidad de crecimiento microbiano en diferentes tipos de quesos, a distintas etapas de maduración, como así, mismo se analizó la influencia en la inhibición del crecimiento microbiano por la presencia de las bacterias ácido Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 26 lácticas y la incidencia de factores ambientales como el pH y la actividad de agua (Aw),fomentando un ambiente propicio para la colonización de otros microorganismos en la periferia y núcleo de las diferentes muestras analizadas. Los modelos predictivos de crecimiento son herramientas que ayudan a identificar los puntos críticos y peligros en el control de matrices alimentarias (Martinez-Rios, Gkogka, & Dalgaard, 2020). En el estudio realizado por polese et al. se incorporó un enfoque de modelización simplificada (SMA) frente al procesamiento de salami artesanal en lo que se refiere a fermentación seca, en condiciones de temperatura y humedad no controladas durante la producción y su almacenamiento, observando cómo se alteran los factores como el pH, actividad de agua propia del alimento, la presencia de ácido láctico y la inhibición de la velocidad de crecimiento microbiano frente a la presencia de bacterias ácido lácticas generan una afectación en la calidad del alimento. Se evaluó el impacto de cada factor bajo condiciones dinámicas medidas en 5 lotes de salami, con un recuento inicial de la densidad poblacional. Los cambios desmesurados por la sobrepoblación de las bacterias ácido lácticas, se presentan como un factor influyente en el crecimiento microbiano dependiente del tiempo. La implementación de un modelo predictivo de crecimiento se incluyó con el fin de simular éste y la cuantificación de la contribución fraccionada de la inhibición de ácido láctico y evaluar por medio de parámetros establecidos, en la literatura, la probabilidad de crecimiento en los lotes evaluados. Finalmente, se realizó la caracterización del salami con base en 2 modelos de predicción, los cuales fueron modelo de crecimiento/ no crecimiento, modelo de cinética lineal de tres fases en condiciones sub optimas de crecimiento, observando comó el crecimiento de ambas poblaciones en un punto de su crecimiento inhiben, mutuamente, su densidad poblacional (Polese, Del Torre, & Stecchini, 2017). 5. MARCO REFERENCIAL 5.1. Seguridad e Inocuidad Alimentaria Según la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) la seguridad alimentaria se define como el acceso económico y físico de la producción y disponibilidad de alimentos a nivel mundial, como principal derecho de todos los seres humanos al acceso de alimentos seguros, nutritivos e inocuos con el objetivo de garantizar la calidad de vida y alimentación adecuada (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, n.d.). La falta de inocuidad alimentaria actualmente es considerada según la FAO como la deficiencia o ausencia de condiciones seguras de los alimentos para el consumo humano, acarreando peligros en la salud de los consumidores, siendo estos de tipo químico, físico y microbiológico la cual debe regirse por el cumplimiento de la norma y deberes establecidos en cada país. Por este motivo la inocuidad alimentaria garantiza productos seguros en toda su cadena productiva desde su origen hasta la preparación y posterior empleo para consumo (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, n.d.). La contaminación en los alimentos se puede dar durante cualquiera de las etapas que conforman el proceso de producción hasta la etapa final de consumo, por lo cual, la inocuidad del alimento puede estar en riesgo debido a la falta de desinfección y limpieza en cada etapa (Møretrø & Langsrud, 2017). 5.2. Agentes y enfermedades de transmisión alimentaria Las enfermedades de transmisión alimentaria se presentan debido al consumo de alimentos contaminados o en mal estado que contienen una carga microbiológica considerable generando afectaciones en la salud de las personas, las ETAS pueden clasificarse, según el tipo de contaminación que presente el alimento, ya sea por presencia de microorganismos, e, intoxicaciones por presencia de toxinas en la matriz alimentaria (Guerrero, 2016). Diferentes bacterias Gram negativas como Pseudomonas spp y S.enteritidis y bacterias Gram positivas como L. monocytogenes y S. aureus pueden ser adquiridas por el alimento de diferentes formas; como durante el desarrollo de la cadena productiva del mismo, principalmente en las superficies que se encuentranen contacto con la matriz alimentaria. Éstas llegan a ser bacterias residenciales debido a la falta o deficiencia de los protocolos de higienización de las plantas productivas, se caracterizan por generar a bajas temperaturas biopelículas y bajo crecimiento celular, lo cual, fomenta un proceso de contaminación cruzada en los productos finales listos para el consumo humano, generando afectaciones en la calidad e inocuidad de los alimentos (Møretrø & Langsrud, 2017). Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 28 5.3. L. monocytogenes L. monocytogenes es un bacilo Gram positivo, crece a temperaturas óptimas de 30°C a 37°C, capaz de soportar altas y bajas temperaturas, con un desarrollo óptimo en pH de 4,4 a 9,6 y sus afecciones pueden variar según el tipo de cepa. La ingesta de alimentos contaminados, por este agente, puede generar síntomas de gastroenteritis, diarrea, cefalea, fiebre y depresión del sistema inmunológico según su periodo de incubación (Muñoz et al., 2011). La ingesta de alimentos con presencia de L. monocytogenes genera una enfermedad denominada listeriosis. En la mayoría de los casos clínicos, los pacientes que la padecen pueden llegar a presentar meningitis, envenenamiento en la sangre junto con cuadros clínicos de gastroenteritis. Los alimentos, principalmente, asociados con contaminación microbiológica de L. monocytogenes son; frutas, carne, productos derivados cárnicos, lácteos, hortalizas y pescados (Tait et al., 2014). En la ilustración N°2, se evidencia el crecimiento del microorganismo en medio de cultivo PALCAM, característico para el aislamiento y la diferenciación en muestras alimentarias altamente contaminadas (“Palcam Agar (Medio base) | Bioser,” n.d.). Ilustración 2 Crecimiento de L. monocytogenes en agar PALCAM. 5.3.1. Patogenicidad La listeriosis se define como una infección causada por el patógeno L. monocytogenes de tipo virulenta, la cual afecta, principalmente, personas con deficiencias en el sistema inmunológico, personas de la tercera edad, mujeres embarazadas y niños. El tipo de afectación puede llegar a ser tanto invasivo como no invasivo, según el modo de transmisión que presente el paciente y la concentración de unidades formadoras de colonias presentes en la matriz alimentaria. El cuadro clínico puede incluir: infección invasiva a nivel intestinal y sanguíneo, meningitis, gastroenteritis, enfermedades en el sistema nervioso, vómito, diarrea y fatiga muscular. Su grado de severidad depende del periodo de incubación de la enfermedad por lo que su tasa de mortalidad oscila entre un rango del 10% a un 80% (Instituto Nacional de Salud Subdirección de Investigación, n.d.- a). 5.3.2. Estadísticas Durante el transcurso de los años de 2009 a 2015, se detectó la prevalencia de un brote de agentes patógenos infecciosos en varias empresas dedicadas a la producción de derivados lácteos por parte del INVIMA, la cual por medio de inspección periódica determinó que un 30,9% de empresas dedicadas a la fabricación de derivados lácteos presentan brotes del patógeno en sus instalaciones y productos, debido a malas condiciones de infraestructura, protocolos de saneamiento y malas prácticas de manufactura(Invima, n.d.-a). De 2012 a 2015, el INVIMA registró un estudio de la presencia de agentes patógenos en muestras de derivados lácteos y cárnicos; como así mismo, la presencia de E. coli 0157:H7 en muestras fecales y en manos de operarios de alimentos en 5 departamentos de Colombia. Los resultados mostraron un incremento del 25% de afectación en productos cárnicos y derivados lácteos, un 19,2% en equipos e infraestructura de fábricas y un 29,9% en muestras de operarios y materia fecal (Invima, n.d.-b). En Europa se registraron, aproximadamente, 2.536 casos notificados durante el transcurso del periodo de 2016, de los cuales 1.524 casos corresponden a casos mortales por parte de las enfermedades asociadas al consumo de alimentos en estado de deterioro. Durante el periodo de 2008 a 2016 se registraron 260 muertes notificadas en Estados unidos por parte del centro para el control y prevención de enfermedades (Heir, Møretrø, Simensen, & Langsrud, 2018). Por otro lado, en el 2008 se notificó en Italia por parte de las entes regulatorias la detección de L. monocytogenes en salmón ahumado listo para consumo, el cual no requiere ningún proceso de cocción presentando un riesgo biológico según los criterios microbiológicos establecidos en el reglamento CEN°2073/2005 para alimentos con presencia de S.enteritidis, E. coli y L. monocytogenes (Jansen, Grabowski, Gerulat, & Klein, 2016). 5.4. Deterioro Alimentario Se establece como deterioro alimentario el cambio en las propiedades físicas y químicas de un alimento, originando cambios en la textura, propiedades organolépticas y generación de compuestos orgánicos volátiles. El deterioro puede presentarse, principalmente, por fallas en el sistema de procesamiento o la colonización de microorganismos, los cuales según el alimento y factores como el alto contenido de agua proporcionan las condiciones adecuadas para el crecimiento microbiano. En matrices cárnicas un indicador de colonización de microorganismos se da por la degradación de lipasas, proteasas, carbohidrasas principalmente, la degradación de moléculas de glucosa y la producción de compuestos como el acetato, la acetoína, el ácido acético y el ácido isobutírico, al igual que el crecimiento de bacterias ácido lácticas producto de la fermentación, responsables del sabor amargo en el alimento (Odeyemi et al., 2020). Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 30 5.5. Contaminación en alimentos listos para el consumo humano La carne bovina se encuentra compuesta por proteínas en un 74,4%, humedad en 21,8% y grasas en 3,3%, los cuales constituyen en conjunto un alto nivel nutricional y un vehículo para las enfermedades trasmisor de enfermedades de transmisión alimentaria por presencia de microorganismos en los seres humanos, la proliferación bacteriana puede darse por fallas durante las etapas: producción, procesamiento, manipulación, conservación, transporte y comercialización, que conforman la cadena productiva cárnica (Casaburi et al., 2015)(Wang et al., 2016). 5.6. Generación de compuestos orgánicos volátiles generados por organismos patógenos La generación de compuestos volátiles en matrices alimentarias, especialmente en cárnicos, se genera principalmente por contaminación microbiana de diferentes patógenos como hongos, bacterias y mohos, generados en su proceso de crecimiento y desarrollo metabólico como consecuencia de la falta de calidad sanitaria en los alimentos. La presencia de algunos microorganismos como S.enteritidis, L. monocytogenes, E. coli y Pseudomonas spp, originan compuestos orgánicos como hidrocarburos, cetonas, nitrógeno, alcoholes, aldehídos y demás compuestos que ocasionan malos olores, los cuales se ven limitados a las condiciones de crecimiento y factores externos como temperatura, humedad, valor nutritivo y calidad físico química en el alimento (Wang et al., 2016). La generación de COVs se debe a la descomposición de proteínas, carbohidratos y demás nutrientes en la matriz alimentaria por parte del microorganismo durante su crecimiento y las vías metabólicas primarias y secundarias (Wang et al., 2016). Las rutas metabólicas características de los microorganismos, pueden dar paso a la generación de diferentes compuestos orgánicos volátiles. Por ejemplo, dentro de las rutas más relevantes se encuentra la presentada en la ilustración 3, en donde se evidencia, que, por medio del rompimiento de los enlaces proteicos, se genera moléculas de glucosa. Ésta a su vez, por medio de la glucólisis genera piruvatoel cual, en presencia de dióxido de carbono, la enzima Acetoacetato sintasa y el gen alsS, genera Aceto lactato, seguido de la liberación de dióxido de carbono y en presencia de la enzima de Aceto lactato deshidrogenasa en presencia del gen alsD, finalmente, se genera 3-hidroxi-2-butanona y otros compuestos orgánicos como etanol y acetatos en el metabolismo secundario propios del crecimiento microbiano (“Metabolic pathway map indicating the steps of end product formation by... | Download Scientific Diagram,” n.d.). Ilustración 3 Principales vías metabólicas primarias y secundarias. 5.7. Grupos funcionales asociados al deterioro del alimento Durante el periodo de deterioro que pueden presentar los alimentos por cambios en las condiciones ambientales externas del medio, está la generación de compuestos orgánicos volátiles como putrescina, cadaverina, histamina, dimetilamina, trimetilamina compuestos por los grupos funcionales aminas y amoniaco. La presencia de olores a amoniaco es característico de putrefacción, de los alimentos los cuales se deben a la presencia de grandes cantidades de aminas y amoniaco en la matriz alimentaria (Dainty, 1982)(Atiya Ali et al., 2014). 5.8. Métodos de medición de COVs en muestras alimentarias La presencia de microorganismos en alimentos y derivados cárnicos, lácteos, frutas y hortalizas puede llegar a generar metabolitos líquidos y gaseosos debido a su crecimiento microbiano al realizar las descomposición proteica, de carbohidratos y grasas presentes en el alimento (Balasubramanian et al., 2008). Actualmente, la cromatografía de gases (GC) y la espectroscopia de masas (MS) son implementadas en la detección de compuestos volátiles generados en los alimentos producto de la oxidación de lípidos presentes en los cárnicos(Shahidi, 2016). 5.8.1. Sistemas electrónicos para la detección de compuestos orgánicos volátiles Actualmente, existen diferentes dispositivos electrónicos que proporcionan mediciones confiables en un corto tiempo en comparación con las pruebas y análisis microbiológicos. sin embargo, requieren de mucho tiempo y, si las técnicas no se realizan adecuadamente, pueden generar resultados erróneos y poco confiables, siendo los dispositivos electrónicos como es el caso de la nariz electrónica la cual permite detectar los diferentes gases generados en el alimento contaminado por bacterias y microorganismos que puedan llegar a generar una afectación en la salud Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 32 pública de los consumidores. Actualmente, los sistemas de identificación de gases a nivel industrial han sido implementados en la industria alimentaria para la identificar microorganismos, determinando la calidad de algunos alimentos como: cárnicos, pescado, frutas, productos lácteos y pollo (Balasubramanian et al., 2004). La nariz electrónica más conocida para detectar compuestos orgánicos como el etanol y el ácido acético, principales indicadores de deterioro en alimentos, es la Cyranose 320, la cual está compuesta por un arreglo de sensores de gas que permiten detectar concentraciones, en proporciones de hasta 100 ppm de los compuestos que se estén emitiendo en una matriz alimentaria, gracias a que su técnica de identificación no es invasiva (Mohapatra, Panigrahi, & Amamcharla, 2015). 5.8.2. Sensores asociados a la identificación de grupos funcionales La medición de compuestos orgánicos volátiles es un área de interés en gran número de aplicaciones, desde mediciones de calidad de aire hasta en seguridad industrial. Estas medidas se pueden obtener usando sensores industriales, como los sensores de metal-óxido-Silicio. El principio para la identificación de compuestos orgánicos volátiles generados por microorganismos se basa en el análisis de la fase volátil de una sustancia generada por el agente patógeno. Los sensores MOS cuentan con un perfil de sensibilidad y selectividad lo cual permite detectar la incidencia de los compuestos orgánicos generados a bajas concentraciones en la periferia de los alimentos. Además son resistentes a la humedad generada en el medio (Green, Chan, Dan, & Lin, 2011). El autor El Barbri, Llobet, El Bari, Correig, & Bouchikh et al., diseñó una nariz electrónica usando los sensores: familia TGS 823, 825, 826,831, 832, 882, los cuales identifican grupos aminos, alcoholes, xileno, tolueno, clorofluorocarbonos y halocarbonos. El objetivo de este trabajo era determinar por medio de la implementación de una nariz electrónica la calidad de la carne empacada al vacío (Hssina et al., 2017). El autor Wijaya, Sarno, & Zulaika et al. Presenta un arreglo con los siguientes sensores de la familia MQ: 135, 136, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9. Estos sensores fueron usados para evaluar la calidad microbiana de los alimentos con base a la respuesta en la resistividad a la presencia de compuestos orgánicos volátiles generados en las matrices alimentarias (Wijaya, Sarno, & Zulaika, 2018). La ilustración 7 presenta el registro de los cambios estandarizados detectados en los sensores en función del tiempo durante el cual se generó un crecimiento microbiano. Estos demuestran que sí es posible detectar gases en las concentraciones generadas por microorganismos en alimentos, inclusive usando sensores de corte académico como los MQ, y que además se pueden correlacionar gases detectados con crecimiento bacteriano (Wijaya et al., 2018). Ilustración 4 Producción de grupos funcionales asociados a contaminación microbiana. 5.8.3. Elementos electrónicos para medir COVs La integración de dispositivos electrónicos para la detección de compuestos orgánicos volátiles en alimentos, se presenta como un tema de estudio en la aplicación de sensores de tipo quimio resistivos compuestos por elementos metálicos semiconductores como SnO2, TiO2, que permiten la modificación de su resistividad interna eléctrica conforme a su principio de funcionamiento en la adsorción de oxígeno dentro de la banda de energía, originando la impregnación de electrones en la banda de conducción, generando un diferencial de deserción y un potencial electrostático en la superficie el elemento, generando una disminución en la altura de la barrera de potencial y por ende la reducción proporcional de la resistividad como respuesta a la presencia de gases en el medio (L.Castañeda- Aviña, n.d.). Cetonas - Alcoholes Amonio - Benceno Cetonas – Alcoholes- Ácidos Orgánicos- Aminas I-Butano Iso- Butano Fabricante IDT Sensors Fígaro Zheng Applied sensor Alphasense Zheng Zheng Referencia Sensor SGAS 707 TGS 822 MQ135 IAQ-100 PID-AH2 MQ3 MQ6 Rango de detección (ppm) 1-100 50 – 5000 10-100 450-2000 1-100 300- 10000 10- 10000 Potencia (mW) 400 660 800 ---------- 550 900 750 Ana María González Bonilla Proyecto de Grado- Programa de Bioingeniería | 34 Tabla 1 sensores específicos para la detección de grupos funcionales A continuación, se presenta en la Tabla 2 algunos sensores utilizados en la industria para la identificación de compuestos orgánicos volátiles por grupos funcionales, junto con la sección de anexos en donde se encontrará el datasheet de los sensores mencionados. Estos sensores tienen potencial para ser usados en una nariz electrónica que busque identificar grupos funcionales de COVs relacionados con actividad metabólica de microorganismos patógenos (“Sensor de Alcohol MQ3,” n.d.; “Sensor de gas propano - MQ-5 con board - Electronilab,” n.d.; “SGAS707 - Industrial Organic Chemical Sensor | Renesas,” n.d.). 5.8.4. Sensores electrónicos quimio resistivos y sensores de condiciones ambientales El sensor SGAS707 se caracteriza por ser un sensor de tipo quimio resistencia de estados sólido, detecta compuestos orgánicos
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