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42 HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004 Biorremediación de residuos del petróleo Paola Andrea Vargas Gallego / René Ricardo Cuéllar / Jenny Dussán 43 44 HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004 Figura 2. Explotación del crudo http://www.dep.fem.unicamp.br/boletim/BE13/artigo4.htm Figura 1. Atentado contra el oleoducto Caño-Limón Coveñas http://www.yachana.org/reports/colombia/photos/P3170114.JPG > Biorremediación de residuos del petróleo Paola Andrea Vargas Gallego / René Ricardo Cuéllar / Jenny Dussán Según la Compañía Colombiana de Petróleos, ECOPETROL, durante los últimos quince años el oleoducto Caño Limón- Coveñas ha sufrido más de novecientos atentados terro- ristas, hechos que han conducido al derramamiento de más de 450 millones de litros de petróleo en el medio ambiente. El impacto ambiental por los derrames de crudo, ha deja- do más de 2.600 kilómetros entre ríos y quebradas, y alrededor de 1.600 hectáreas de ciénagas afectadas. Sólo en 1998, subversivos del ELN ocasionaron el más grande derrame de crudo en aguas continentales del mundo, con un volumen superior a los 14’787.000 litros de petróleo, tragedia comparable con el accidente del buque petrolero Exxon Valdez, que vertió en las aguas de Alaska 42 millo- nes de litros del crudo el 24 de marzo de 1989. Dadas estas circunstancias los daños a las fuentes hídri- cas, suelos, aire, fauna y vegetación son prácticamente irremediables, pues los procesos de descontaminación no alcanzan a cubrir todas las áreas afectadas y se reali- zan mucho tiempo después de que el crudo ha penetrado el ecosistema. Sin embargo, no todos los lodos aceitosos son causados por atentados contra la infraestructura petrolera, también son resultado de la actividad de la broca durante la perfora- ción en busca de yacimientos, la cual genera un lodo acom- pañado de hidrocarburo que se extrae hasta la superficie. 45 Figura 3. Microorganismo degradador de petróleo, fotografía del Centro de Investigaciones Microbiológicas, CIMIC La biorremediación La biorremediación es el proceso utilizado por el hombre para detoxificar variados contaminantes en los diferentes ambientes –mares, estuarios, lagos, ríos y suelos– usan- do de forma estratégica microorganismos, plantas o en- zimas de estos. Esta técnica es utilizada para disminuir la contaminación por los hidrocarburos de petróleo y sus derivados, metales pesados e insecticidas; además se usa para el tratamiento de aguas domésticas e industriales, aguas procesadas y de consumo humano, aire y gases de desecho. Afortunadamente la biotecnología ha permitido el desa- rrollo de diversas estrategias que pueden ser utilizadas con el fin de restaurar el suelo y la calidad ambiental, de acuerdo con las necesidades y dimensiones del proble- ma a solucionar. A continuación se enumeran algunas, pero en general no hay una “fórmula secreta” que garan- tice el éxito de la biorremediación. BIOESTIMULACIÓN: como su nombre lo indica, consiste en es- timular los microorganismos nativos del suelo adicionan- do nutrientes como nitrógeno o fósforo. BIOAIREACIÓN: es una forma de estimulación realizada con ga- ses, como por ejemplo oxígeno y metano, estos son adicio- nados de forma pasiva en el suelo para estimular la actividad microbiana. BIOAUMENTACIÓN: es la inoculación de una alta concentra- ción de microorganismos en el suelo contaminado para facilitar la biodegradación. Como se van a inocular, estos microorganismos deben ser seleccionados del suelo que se desea tratar. COMPOSTAJE: esta estrategia de biorremediación utiliza mi- croorganismos aeróbicos y termófílos, formando pilas de material que deben ser mezcladas y humedecidas perió- dicamente para promover la actividad microbiana. FITORREMEDIACIÓN: es el uso de plantas para remover, con- tener o transformar un contaminante. Esta puede ser di- recta, donde las plantas actúan sobre el compuesto, o indirecta, donde estas se utilizan para estimular microor- ganismos en la rizosfera. Landfarming La técnica más usada para la biorremediación de los lo- dos contaminados con hidrocarburos y de otros desechos de la industria petrolera es la denominada landfarming. Se realiza trasladando los contaminantes a un suelo no contaminado, el cual ha sido preparado con anterioridad Es allí donde tiene su génesis nuestro trabajo, que con- siste en apoyar desde la microbiología una labor interdis- ciplinaria para remediar los pasivos ambientales que genera la empresa petrolera. Origen y composición del petróleo El petróleo es el resultado de la degradación anaeróbica de materia orgánica, durante largos períodos de tiempo y bajo condiciones de alta temperatura y presión, que la convierte en gas natural, crudo y derivados del petróleo. El petróleo crudo es una mezcla extremadamente com- pleja y variable de compuestos orgánicos, donde la ma- yoría de los ellos son hidrocarburos, que varían en peso molecular desde el gas metano hasta los altos pesos moleculares de alquitranes y bitúmenes. Estos hidrocar- buros pueden presentarse en un amplio rango de estruc- turas moleculares: cadenas lineales y ramificadas, anillos sencillos, condensados o aromáticos. Los dos grupos principales de hidrocarburos aromáticos son los mono- cíclicos, el benceno, tolueno y xileno (BTEX) y los hidro- carburos policíclicos (PAHs) tales como el naftaleno, antraceno y fenantreno. Diversidad microbiana en ambientes contaminados Los suelos contaminados contienen gran cantidad de mi- croorganismos que pueden incluir un número de bacte- rias y hongos capaces de utilizar hidrocarburos [1], que representan un uno por ciento (1%) de la población total de aproximadamente 104 a 106 células por gramo de sue- lo. También, se han encontrado cianobacterias y algas capaces de degradar hidrocarburos. Los suelos conta- minados con hidrocarburos contienen más microorga- nismos que los suelos no contaminados, pero su diversidad microbiana es más reducida [2, 3]. 46 HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004 Figura 4. Diversidad microbiana presente en una muestra de suelo contaminada con crudo, fotografía del Centro de Investigaciones Microbiológicas, CIMIC Figura 5. Diversidad microbiana presente en una muestra contaminada con crudo, fotografía del Centro de Investigacio- nes Microbiológicas, CIMIC para evitar su contaminación y la de las aguas subterráneas con sustancias que puedan producirse durante el tratamien- to. Para ello se efectúa el diseño del lugar donde se deposi- tan los contaminantes, aislando el material de tratamiento del área no contaminada con una tela impermeable. Para empezar el procedimiento, se hace una búsqueda y selección de bacterias nativas aisladas de las muestras de suelos que se encuentran contaminados, ya que estas tienen la capacidad catabólica para crecer bajo las condi- ciones físico-químicas y de estrés a las que están some- tidas, y tendrán un mejor desempeño a la hora de la biorremediación. La búsqueda comienza en el procesamiento de una mues- tra de suelo mediante una serie de diluciones, tratando de obtener aquellos morfotipos cultivables; ya que una gran parte de los microorganismos del suelo no pueden ser recuperados en medios para el cultivo de microorga- nismos. Además de una búsqueda general, se realiza una específica a través de medios selectivos y diferenciales, en la cual se pretende aislar ciertos morfotipos como las Pseudomona sp. y bacterias lactosa positivas –bacterias capaces de utilizar la lactosa–, debido a su bien conocida actividad degradadora de hidrocarburos. Luego, estas diluciones son sembradas en diferentes medios de cultivo donde grandes familias de morfotipos se hacen presentes; éstas varían en densidad y diversi- dad. La diversidad está determinada por los morfotipos recuperados que se diferencian según su morfología macroscópica –su aspecto físico–, mientras que la den- sidad está determinada por el número total de individuos que pertenecen a un grupo con una morfología macros- cópicacomún. Estos datos de densidad y diversidad son de gran valor. Primero, porque nos indican acerca de la calidad micro- biana del suelo, ya que un suelo que tiene gran número de morfotipos, es un suelo que tiene vida y por ende pre- senta una buena prospección para la biorremediación debido a su posible alta actividad microbiana. Segundo, porque aquellos morfotipos que se encuentren en mayor número serán seleccionados por su habilidad para so- 47 Figura 6. Cultivos puros de morfotipos aislados de una muestra contaminada con crudo, fotografía del Centro de Investigaciones Microbiológicas, CIMIC Figura 7. Formulación de un pool degradador de hidrocarburos a gran escala, fotografía del Centro de Investigacio- nes Microbiológicas, CIMIC Figura 8. Trabajo de Landfarming; fotografía: cortesía del ing. Hugo Vladimir Ramírez brevivir a la presión selectiva del contaminante y para usarlo como fuente de energía y carbono, pues por eso están creciendo. Ya seleccionados los morfotipos se conforma un consor- cio o pool de microorganismos degradadores de hidro- carburos y, utilizando la estrategia de bioaumentación, se hace una producción a mayor escala y en proporciones estratégicas de estos. En esta producción debe tenerse en cuenta el volumen de suelo contaminado para biorre- mediar, la concentración del contaminante y las clases de morfotipos que se aislaron. Importancia del pool microbiano La formulación de un pool microbiano permite combinar y complementar sus funciones metabólicas para que co- lectivamente biodegraden un compuesto. En muchos ca- sos algunos morfotipos sólo pueden realizar una parte de toda una cadena de reacciones químicas para llegar a compuestos que puedan ser fácilmente utilizados por los organismos del mismo consorcio u otros que estén pre- sentes en el ambiente. Además, al estar en grupo los morfotipos pueden tolerar los cambios físico-químicos que se den en el ambiente durante el proceso de biorre- mediación. Cabe aclarar que se necesita un análisis más profundo para la identificación de los morfotipos que serán usados en la biorremediación, ya que alguno de estos puede ser patógeno para plantas, animales o el hombre por el proce- so de bioaumentación. Sin embargo, partimos del principio de que son morfotipos ambientales, los que inmediatamente se acabe su fuente de alimento bajan a un número que no cause disturbio en el ambiente. Además se realiza una cui- dadosa revisión de reportes de enfermedades de origen bacteriano en la zona. El pool que se formuló es aplicado en el suelo contamina- do por técnicos e ingenieros ambientales para dar inicio a la biorremediación. Durante el tratamiento se hace el monitoreo de las poblaciones microbianas, con el fin de determinar si la cantidad inicial de microorganismos au- menta o disminuye después de ser adicionado al suelo contaminado. Así mismo se realiza la determinación de TPHs –hidrocarburos totales de petróleo–, con el fin de observar si hubo o no degradación (figura 9). Otros factores en la degradación de hidrocarburos La transformación de los compuestos orgánicos en el ambiente está influenciada por un número de factores que se pueden agrupar en aquellos que afectan el crecimiento y metabolismo de los microorganismos y aquellos que afectan al compuesto en sí mismo. La biodegradación de los hidrocarburos está asociada con el metabolismo y cre- cimiento microbiano, y por lo tanto cualquiera de los fac- tores que afectan al crecimiento microbiano puede influenciar la degradación. La degradación aeróbica de los hidrocarburos es consi- derablemente más rápida que el proceso anaeróbico [4], de modo que la oxigenación será necesaria para mante- ner las condiciones aeróbicas para una rápida degrada- ción. Un suelo con una estructura abierta favorecerá la transferencia de oxígeno y un suelo anegado de agua ten- drá un efecto contrario. La temperatura afecta el creci- miento microbiano, así que a bajas temperaturas la 48 HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004 Figura 9. Curva de degradación aproximada de TPHs en una estación en tratamiento; cortesía: ingeniero Hugo Vladimir Ramírez degradación será lenta. Así mismo el pH del suelo y la solubilidad del compuesto que debe ser degradado afec- tan el crecimiento bacteriano. La contaminación por hi- drocarburos también puede estar asociada con altos niveles de metales pesados, que pueden inhibir el creci- miento microbiano, dependiendo de la concentración y tipo de metales. Otro factor crucial es la accesibilidad del compuesto para su degradación en el interior del suelo, la cual está afec- tada por la estructura del mismo, su porosidad, compo- sición y por la solubilidad del compuesto. Algunos compuestos pueden ser adsorbidos por arcillas y por lo tanto pueden ser invulnerables a la degradación. Para superar este problema se han añadido surfactantes a sue- los contaminados con el objeto de mejorar la accesibili- dad de los hidrocarburos [5]. Los surfactantes son sustancias que contienen un segmento liposoluble –solu- ble en aceite–, y otro hidrosoluble –soluble en agua–, lo cual permite solubilizar el hidrocarburo desde la arcilla. Por otra parte, la presencia de un gran número de micro- organismos autóctonos en el suelo, capaces de degradar hidrocarburos será claramente una ventaja, porque evita la adición específica de microorganismos no autóctonos, que aunque degradadores, podrían no funcionar por no es- tar adaptados a las condiciones físico-químicas del lugar. En conclusión En general, en el proceso de landfarming se ha comproba- do la eficiencia de un consorcio microbiano sobre la utiliza- ción de un solo morfotipo, debido a que los morfotipos al estar en grupo pueden tolerar mejor los cambios físico- químicos en el campo y sus actividades metabólicas pue- den interactuar entre sí para la parcial o final biorremediación. Es necesario conocer las condiciones ambientales en las cuales se desea que los morfotipos trabajen, para así poder optimizar la biorremediación, cambiando los posibles parámetros físicos o químicos que puedan ir en contra de la actividad microbiana en el material a biorremediar o en el ambiente. Por último hay que resaltar la importancia que tiene la selección de microorganismos autóctonos –aislados del lugar para la biorremediación–, debido a que estos mor- fotipos se encuentran mejor adaptados al contaminante; a diferencia de morfotipos foráneos, que aunque con una gran actividad biorremediadora, pueden no funcionar bajo las condiciones ambientales del lugar. 49 > Referencias [1] Sutherland, J. B. (1992) Detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungi. J. Ind Microbiol., 9, 53-62. [2] Bossert, I. D. and Compeau, G. C. (1995) Cleanup of petroleum hydrocarbon contamination in soil, in L. Young and C. E. Cerniglia (eds), Microbial Transformation and degradation of Toxic Organic Chemicals. Wiley – Liss, New York, and John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp. 77-125. [3] Messarch, M. B. and Nies, L. (1997) Modification of heterothropic plate counts for assessing the bioremediation potencial of petroleum – contaminated soils. Environ. Technol., 18, 639 - 646. [4] Holliger, C. and Zehnder, A. J. B. (1996) Anaerobic biodegradation of hydrocarbons. Current Opinion in Biotechnol, 7, 326-330. [5] Mihelcic, J. R., Lueking, D. R., Mitzell, R. J. and Stapleton, J. M. (1993) Bioavailability of sorbed – ans separate – phase chemicals. Biodegradation, 4, 141-153. [6] http://www.mindefensa.gov.co/ derechos_humanos/medio_ambiente/ 20020308informeagua.html > Reseña de los autores Paola Andrea Vargas Gallego p-vargas@uniandes.edu.co Estudiante de Maestría en Microbiología. René Ricardo Cuéllar r-cuella@uniandes.edu.co Estudiante del programa coterminal de Maestría en Microbiología. Jenny Dussán jdussan@uniandes.edu.co Profesora asociada, Directora del Centro de Investigaciones Microbiológicas, CIMIC, y directora de tesis de los estudiantes mencionados.
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