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1 Selección de consorcios nativos (planta-microorganismos) que facilitan la rizorremediación de suelos contaminados con metales pesados Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de CIENCIAS BIOLOGICAS Matias Ernesto, Benavidez Director de tesis: Dra Alicia M. Godeas Consejero de estudios: Dra Alicia M. Godeas Lugar de trabajo: Lab. de Microbiología del Suelo, DBBE, FCEN-UBA Buenos Aires 2021 2 Titulo Selección de consorcios nativos (planta-microorganismos) que facilitan la rizorremediación de suelos contaminados con metales pesados Resumen La cuenca baja del Matanza-Riachuelo presenta importantes problemas socio-ambientales, esta es la cuenca hidrográfica más grande de la región metropolitana y es de gran importancia su recuperación y saneamiento. En este sentido, el presente trabajo detalla los resultados obtenidos luego de realizar una prospección del área de estudio, caracterizar el suelo, revisar la vegetación espontánea y seleccionar una especie vegetal para los ensayos de rizorremediación. Además, se logró, caracterizar la comunidad de Hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) con tecnicas morfológicas y moleculares y las rizobacterias endófitas asociadas a estos últimos dando como resultado el aislamiento e identificación de un HFMA y 37 rizobacterias endófitas asociadas al micelio y esporas. Se obtuvieron los mapas de distribución espacial de algunos de los metales pesados en los diferentes tejidos de cada órgano de la planta seleccionada, como así también en las diferentes estructuras fúngicas de los HFMA utilizados en los ensayos. Senecio bonariensis fue la planta seleccionada y se la propone como tolerante y acumuladora de Metales Pesados (MP). Aplicados en conjunto en un suelo contaminado el sistema rizorremediador conformado por S. bonariensis, la cepa de HFMA Rhizophagus intraradices (GB8) y la Bacillus sp. (Bacteria 2) se propone como candidato para la fitoestabilización de Cr, Cu, Ni y Zn. 3 Title “Selection of native consortiums (plant-microorganisms) that facilitate the rhizoremediation of soils contaminated with heavy metals” Abstract The lower basin of Matanza Riachuelo presents important socio-environmental problems, this is the largest hydrographic basin in the metropolitan region and its recovery and sanitation is of great importance. In this sense, the present work details the results obtained after conducting a survey of the study area, characterize the soil, review the spontaneous vegetation and select a plant species for rhizoremediation tests. In addition, it was possible to characterize the AMF community and the endophytic rhizobacteria associated with the latter, resulting in the isolation and identification of an arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) and 37 endophytic rhizobacteria associated with mycelium and spores. The maps of spatial distribution of heavy metals in the different tissues of each organ of the selected plant were obtained, as well as in the different fungal structures of the AMF used in the tests. Senecio bonariensis was the selected plant and is proposed as tolerant and accumulator of MP. Applied together in a contaminated soil, the rhizoremediator system formed by S. bonariensis, the AMF Rhizophagus intraradices (GB8) y la Bacillus sp. (Bacterium 2) is proposed as candidate for the phytostabilization of Cr, Cu, Ni and Zn. 4 Agradecimientos Esta tesis no hubiera sido posible sin la colaboración de muchas personas que de una u otra manera facilitaron el camino para alcanzar la meta. En primer lugar, a mis compañeras de laboratorio Laura, Roxana, Vanesa, Alicia M., Marina R. y Mariana quienes estuvieron siempre cerca, respondiendo inmediatamente a todas mis consultas y haciendo que todo sea más simple. Estaré siempre agradecido por su generosidad y predisposición. También agradezco a la Dra. Marta Cabello (Instituto de Botánica Carlos Spegazzini - FCNyM-UNLP) y las Dras. Vanesa Silvani y Roxana Colombo (Lab. de Microbiología del Suelo, DBBE-FCEN-UBA) que colaboraron con la clasificación de los hongos formadores de micorrizas arbusculares. Mi agradecimiento especial a los Dres. Mario Debray y Emmanuel De la Fourniere y la los Lic. Nahuel Muler y Nahuel Vega de la Gerencia de Investigación y Aplicaciones del Centro Atómico Constituyentes (CNEA) por sus grandes contribuciones para llevar adelante éste trabajo. A mí Co-Directora Dra. Adalgisa Scotti gracias por haberme contactado con estos grandiosos profesionales y haberme brindado la posibilidad de trabajar con el Modulo de Depuración Vegetal. A mis Directoras las Dras. Alicia M. Godeas y Adalgisa Scotti por resolver con suma eficiencia cualquier inconveniente técnico y haber proporcionado el andamiaje para la totalización de este trabajo. Al Lic. Pablo Simon, División Plantas Vasculares, Museo de Ciencias Naturales de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo (UNLP), por haberme ayudado con la determinación taxonómica de los organismos vegetales, a la Cooperativa “Evita Montonera” Avellaneda Pcia de Bs As, que colaboró en el mantenimiento del predio donde se hizo el experimento de campo, a la Secretaria de Técnica de la FCEN-UBA y en especial al Sr. Cañete (chofer) quien siempre predispuesto brindó sus servicios para la búsqueda de suelos contaminados y traslado de muestras desde la FCEN hasta el Riachuelo y desde el Riachuelo hasta la FCEN. Al Dr. Hernan Sialino por su gran colaboración con las bacterias endófitas de raíz y muy especialmente a el Sr. Hector Verna encargado del Campo Experimental de la FCEN-UBA por su constante apoyo y colaboración con las plantas de invernadero. Al Dr. Pablo Pomata, profesional de apoyo a la investigación del INGEBI quien realizó los cortes delgados de los órganos vegetales. 5 A mis queridos amigos Damián, Jerónimo, César y Gabriel por estar siempre y entender lo que significa la tesis. Y especialmente a Maia Castelao por su apoyo en casi todo el recorrido de mi tesis y especial colaboración con el ensayo de mesocosmos. A mis padres Viviana y Marcelo por haberme dado los valores del respeto, la paciencia y el amor por lo que uno hace, que sin ello hoy poco podría decir o hacer. Y mis herman@s Estefania, Sofia y Elias que simpre se preocuparon y brindaron su apoyo. Y finalmente al sistema científico y tecnológico: a esta Universidad, a Universidad Tecnológica Nacional, la Universidad Nacional de Cuyo, el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas y la Comisión Nacional de Energía Atómica. Sin su apoyo esta tesis no hubiera sido posible. 6 Índice Agradecimientos ................................................................................................................................. 4 Introducción general ......................................................................................................................... 14 ¿Es posible recuperar un ambiente contaminado? ...................................................................... 15 Contaminación ambiental ............................................................................................................. 16 Tres tipos principales de contaminación ambiental: aire, agua y suelo ....................................... 17 Aire ............................................................................................................................................ 17 Agua ........................................................................................................................................... 17 Suelo .......................................................................................................................................... 17 La cuenca hidrográficaMatanza Riachuelo ................................................................................... 18 Legislación ambiental en la República Argentina .......................................................................... 20 Fuentes de contaminación ............................................................................................................ 21 a) Saladeros ........................................................................................................................... 21 b) Industria del cuero (curtiembres) ......................................................................................... 21 c) Industria petroquímica .......................................................................................................... 23 d) Generación de energía .......................................................................................................... 23 Los metales pesados (MP) ............................................................................................................. 24 Los MP más representativos del suelo .......................................................................................... 25 Cadmio (Cd) ............................................................................................................................... 25 Cromo (Cr) ................................................................................................................................. 26 Cobre (Cu).................................................................................................................................. 27 Níquel (Ni) ................................................................................................................................. 27 Plomo (Pb) ................................................................................................................................. 28 Zinc (Zn) ..................................................................................................................................... 28 Remediación de suelos contaminados con MP............................................................................. 29 Metodologías de remediación ambiental ................................................................................. 30 Métodos biológicos (Biorremediación): .................................................................................... 31 Microbioma vegetal ...................................................................................................................... 37 La simbiosis micorrízica ............................................................................................................. 39 Diseño del sistema remediador .................................................................................................... 47 Elección del tipo de planta ........................................................................................................ 47 Selección de técnicas de remediación de suelos ...................................................................... 48 7 Experiencias en el país .................................................................................................................. 49 OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................................... 52 OBJETIVOS PARTICULARES ............................................................................................................ 52 HIPÓTESIS DE TRABAJO ................................................................................................................. 52 CAPITULO 1 ....................................................................................................................................... 53 Objetivo ....................................................................................................................................... 54 Objetivos específicos ................................................................................................................ 54 Hipótesis ..................................................................................................................................... 54 Introducción .................................................................................................................................. 55 Materiales y métodos ................................................................................................................... 56 Sitio de muestreo y colección de muestras .............................................................................. 56 Identificación taxonómica de las especies vegetales encontradas ........................................... 59 Estudio de la colonización micorrízica ...................................................................................... 59 Cultivos trampa y extracción de esporas de HFMA ...................................................................... 60 Resultados ..................................................................................................................................... 61 Discusión ....................................................................................................................................... 65 Objetivo ......................................................................................................................................... 69 Hipótesis ........................................................................................................................................ 69 Introducción .................................................................................................................................. 70 Materiales y Métodos ................................................................................................................... 71 Estudio de las comunidades de HFMA ...................................................................................... 71 Estudio de las comunidades de HFMA mediante el método de pirosecuenciación. ................ 72 Resultados ..................................................................................................................................... 75 Discusión ....................................................................................................................................... 78 Capítulo 3 .......................................................................................................................................... 81 Objetivo general ............................................................................................................................ 82 Objetivos específicos ..................................................................................................................... 82 Hipótesis ........................................................................................................................................ 82 Introducción .................................................................................................................................. 83 Materiales y Métodos ................................................................................................................... 84 Identificación de las cepas bacterianas ..................................................................................... 85 Caracterización fisiológica de las cepas bacterianas ................................................................. 86 Ensayo con plantas: Efecto de los endófitos PGP Enterobacter sp. (cepa 2Av) y HFMA sobre el crecimiento de plantas y captación de Cu, Ni, Cr y Zn en S. bonariensis .................... 88 8 Cosecha de las plantas y análisis de las variables ..................................................................... 90 Resultados .....................................................................................................................................91 Discusión ....................................................................................................................................... 99 Capítulo 4 ........................................................................................................................................ 102 Objetivos ..................................................................................................................................... 103 Objetivos específicos ................................................................................................................... 103 Hipótesis ...................................................................................................................................... 103 Introducción ................................................................................................................................ 104 Materiales y Métodos ................................................................................................................. 106 Determinación de las condiciones de germinación de S. bonariensis .................................... 106 Ensayo de fitorremediación de MP ......................................................................................... 107 Resultados ................................................................................................................................... 115 Órganos aéreos ....................................................................................................................... 128 Órganos subterráneos ............................................................................................................. 128 Discusión ..................................................................................................................................... 131 Ensayo preliminar a campo (TRL 7) ................................................................................................. 138 Anexo 1 ............................................................................................................................................ 142 Anexo 2 ............................................................................................................................................ 146 Conclusiones finales ........................................................................................................................ 150 Bibliografía ...................................................................................................................................... 154 9 Indice de las Figuras Figura 1| Ubicación de la Cuenca Matanza-Riachuelo Figura 2| Comparación de diferentes métodos de limpieza del suelo Figura 3| Diferentes formas de fitorremediación Figura 4| Interacciones planta-microorganismo presentes en la rizosfera y en los suelos Figura 5| Diferentes estrategias de crecimiento y ramificación de hifas en HFMA´s Figura 6| Representación esquemática de contribución de las MA a la adquisición y distribución de MP de la planta Figura 7| Tratamiento de la muestra Figura 8| Ubicación del sitio de muestreo Figura 9| Sitio de muestreo Figura 10| a) arbúsculo. B) espora Figura 11| Porcentaje y número de esporas de morfotipos de Glomeromycota (100 gr/s) Figura 12| Esporas observadas Figura 13| Efecto de la inoculación de los microorganismos sobre la biomasa, la captación total de Cr Figura 14 | Efecto de la inoculación de los microorganismos sobre la biomasa, la captación total de Ni Figura 15| Efecto de la inoculación de los microorganismos sobre la biomasa, la captación total de Zn Figura 16| Efecto de la inoculación de los microorganismos sobre la biomasa, la captación total de Cu Figura 17| Representación esquemática del módulo de depuración vegetal Figura 18| Fotografias del MDV Figura 19| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Cr Figura 20| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Ni Figura 21| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Cu Figura 22| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Zn 10 Figura 23| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Fe Figura 24| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Mn Figura 25| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Ti Figura 26| La influencia de los microorganismos probados en la biomasa de la planta, la captación total de Al Figura 27| Mapas de distribución espacial de MP de esporas de Rhizoglomus intraradices cepa GB8 Figura 28| Mapas de distribución espacial de MP del MER de Rhizoglomus intraradices cepa GB8 Figura 29| Mapas de distribución espacial de MP del corte trasversal de la raíz de S. bonariensis Figura 30| Mapas de distribución espacial de MP del corte longitudinal tangencial de la raíz de S. bonariensis micorrizada con la cepa autoctona GB8 Figura 31| Mapas de distribución espacial de elementos mayoritarios del corte trasversal en el sector medio de la lámina de S. bonariensis. Figura 32| Mapas de distribución espacial de elementos mayoritarios del corte trasversal de la raíz de S. bonariensis. Figura 33| Mapas de distribución espacial de elementos mayoritarios del corte longitudinal tangencial de la raíz de S. bonariensis micorrizada con la cepa autoctona GB8 Figura 34| Mapas de distribución espacial de MP del micelio de Rhizoglomus intraradices cepa GB8. Figura 35| Mapas de distribución espacial de iones en esporas de Rhizoglomus intraradices cepa GB8. 11 Indice de las tablas Tabla 1| Costos asociados con los distintos tipos de métodos de rehabilitación de suelo Tabla 2| Plantas terrestres y acuáticas que muestran una absorción de metales pesados apreciable Tabla 3| Caracteristicas fisicoquímicas y contenido de MP de suelos de la cuenca baja del MR Tabla 4| Colonizacion de las raíces de las especies vegetales encontradas en la cuenca baja del MR Tabla 5| La abundancia de MOTUs de HFMA´s Tabla 6| Abundancia de los MOTUs de HFMA en el sitio RB Tabla 7|Características químicas del suelo utilizado para la formación del sustrato B Tabla 8| Cepas aisladas y tolerancia a MP (CMI) Tabla 9| Cepas aisladas y características fisiológicas de los aislamientos Tabla 10| Composición química del sustrato (suelo y ceniza volcánica) al inicio del experimento Tabla 11| Composición química del sustrato (suelo y ceniza volcánica) al termino del experimento Tabla 12| Concentracion (µg/g) de los diferentes elementos detectados por micro-PIXE y Factor de Bioconcentración Tabla 13| Valores de MP detectados en escala temporal de ambos tratamientos (espectrofotometría de absorción atómica) 12 13 14 Introducción general 15 ¿Es posible recuperar un ambiente contaminado? La contaminación del suelo es un problema global, buscar su solución requiere esfuerzos conjuntos para prevenirla, minimizarla y remediarla. La prevención de la contaminación del suelo es una de las prioridades del mundo, dado que el costo de remediar o cambiar el uso de la tierra es demasiado alto. Las actividades humanas son las principales fuentes de contaminación del suelo, siendo necesario desarrollar tecnologías industriales respetuosas con el medio ambiente e implementar técnicas de gestión sostenible del suelo. La reducción de la liberación diaria de productos químicos peligrosos al medio ambiente tambiéndebería ser una prioridad (FAO, 2018). Existen diferentes metodologías para mitigar la contaminación ambiental en general y en particular la de los suelos. Cuando ésta se produce por metales pesados los tratamientos in situ más empleados se realizan: a) diluyendo el contaminante a niveles seguros, ya sea incorporando suelo limpio (Musgrove, 1991) o bien arando en profundidad (Thompson-Eagle y Frankenburger, 1992, Zhitong et al, 2012). b) inmovilizando el contaminante (Mench et al, 1994, Chen et al, 2019) se logra formando complejos (Wills, 1988), o aumentando el pH del suelo mediante el encalado que lleva a la formación de hidróxidos insolubles de Cd, Cu, Zn y Ni y reduce su biodisponibilidad en la solución del suelo (Adriano, 1986, Changfeng et al, 2019), c) lavando o extrayendo el contaminante del suelo (Elliott et al, 1989, Tuin y Tels, 1991, Sharma et al, 2018). Esta técnica produce un residuo con altos contenidos de metales pesados que requieren un tratamiento adicional (Dennis et al, 1994) este método, aunque efectivo, es costoso, d) utilizando microorganismos. Este procedimiento es económico y ha sido empleado con éxito en la remoción de compuestos orgánicos. Aún no esta disponible para la remediación en gran escala de contaminantes inorgánicos (Flathman et al, 1994, Wuana y Okieimen, 2011). Todas las técnicas mencionadas anteriormente son eficientes en estudios a escala de laboratorio y a escala piloto. Hasta el momento, sólo se han realizado algunos estudios de campo para probar su eficiencia y eficacia (Burns et al, 1996, Liu et all, 2017). Los procedimientos fisicoquímicos utilizados para la remediación del suelo lo inutilizan como medio para el crecimiento de las plantas durante un largo tiempo, ya que eliminan a la mayoría de los organismos del suelo, incluyendo aquellos que son beneficiosos, tales como las 16 bacterias que fijan el nitrógeno, los hongos micorrízicos y la fauna. Esta información demuestra la necesidad de desarrollar técnicas adecuadas in-situ para la eliminación de contaminantes no volátiles y no móviles del suelo (Wheeler, 1994, Peng et al, 2009). Las plantas que absorben metales pesados del suelo ofrecen un método alternativo y menos costoso para extraer estos elementos directamente del suelo (fitorremediación). Ellas cuentan con mecanismos constitutivos (presentes en la mayoría de los fenotipos) y/o adaptativos (presentes sólo en los fenotipos tolerantes) para acumular o tolerar altas concentraciones de contaminantes en su entorno, constituyendo así una herramienta para la biorremediación in- situ (Suman et al, 2018, Sumiahadi y Acar, 2018, Ashraf et al, 2019). El aire, el agua y el suelo puros, podrian considerarse inexistentes (Tames, 2019). Siempre están presentes elementos que, para algunos fines, pueden considerarse impurezas. La contaminación puede ser considerada como una de las consecuencias de la actividad humana, que directa o indirectamente pueden tener efecto perjudicial sobre los organismos o estructuras vivas, y que también reducen la calidad del agua, aire o suelo para cualquier uso posterior. En este contexto, el término "contaminación natural" no tiene sentido y no debe utilizarse. Debemos reconocer la influencia de nuestras actividades en el ambiente y distinguir los efectos debidos a causas naturales en los estándares de calidad, de aquellos que pueden denominarse contaminación. Contaminación ambiental La contaminación ambiental afecta a todas las formas de vida en nuestro planeta. Se define como: el aumento/disminución de los componentes físicos y biológicos del sistema biosfera que afecta de manera adversa los procesos naturales. Los contaminantes pueden ser sustancias o energías naturales que están por encima/debajo de los niveles prístinos. Cualquier uso de los bienes comunes a una velocidad mayor que la que tiene la naturaleza para restaurarse puede resultar en la contaminación del aire, el agua y la tierra. La contaminación ambiental se hace evidente cuando el sistema no puede procesar o neutralizar los subproductos de las actividades humanas que se desarrollan llegándose a un desequilibrio en el ambiente. Se sabe que la contaminación tuvo un crecimiento acelerado a nivel global desde el siglo XIX (Maldonado, 2009). Esto coincidió con el inicio de la revolución industrial, que produjo problemas a nivel global. Factores como el crecimiento de la población, el avance tecnológico y la urbanización invariablemente imponen mayores demandas al ambiente (Vargas, 2005) y explotan al máximo el uso de los bienes comunes. 17 Tres tipos principales de contaminación ambiental: aire, agua y suelo Aire La contaminación del aire se produce por la adición de químicos a la atmósfera producto de la actividad industrial (Maldonado, 2009). Los productos más importantes son: partículas finas producidas por la combustión de carbón y petróleo usados en la generación de energía, gases como dióxido de azufre, óxidos de nitrógeno, monóxido de carbono y vapor de agua, disminución de la cantidad de ozono producto del smog urbano, partículas de aerosoles, asbestos y formaldehido, de los materiales de construcción, ganadería, entre otros. La contaminación del aire determina la formación de lluvia ácida la cual se produce cuando el dióxido de azufre (SO2) y los óxidos de nitrógeno (NOX) que se emiten a la atmósfera reaccionan con agua para formar ácidos sulfúrico y nítrico. El agujero de ozono en la atmósfera superior permite que la radiación ultravioleta del sol ingrese a la Tierra e influya en la distribución de la vegetación. El ozono en la atmósfera inferior regula el intercambio gaseoso de las plantas al bloquear los estomas y afectar negativamente las tasas de fotosíntesis de las plantas, reduciendo el crecimiento de ellas (Grulke y Heath, 2019). El impacto de la lluvia ácida y la radiación ultravioleta hace que el suelo sea inadecuado para el crecimiento de microorganismos. Agua La contaminación de las aguas se produce por la incorporación a las mismas de residuos industriales y domiciliarios, así como por el arrastre de productos químicos utilizados en la producción agrícola y de hidrocarburos (Maldonado, 2009) que causan disminución de la biodiversidad en los cuerpos de agua. Los fertilizantes (nitrogenados y fosforados) utilizados en la agricultura provocan el crecimiento excesivo de algas que producen toxinas y situaciones de anoxia (Brown et al, 2006). Cuando el agua está contaminada con productos químicos como pesticidas, hidrocarburos, contaminantes orgánicos persistentes o MP, aparecen en la población diversas enfermedades o afecciones relacionadas con la ingesta de agua contaminada (Vargas, 2005). Suelo La contaminación del suelo se debe al vertido de desechos industriales y domésticos (Brutti et al, 2018). Los contaminantes comunes del suelo son los hidrocarburos, los solventes y los 18 metales pesados. Las fuentes de ingreso de estas sustancias al suelo entre otras son: plantas generadoras de energía, refinerías de petróleo, plantas petroquímicas, minería, productoras y distribuidoras de combustibles, el transporte por carretera (vehículos de motor) y las industrias navieras y aeronáuticas. El sector doméstico es otra fuente importante de compuestos químicos orgánicos e inorgánicos que genera desechos los cuales pueden acabar en vertederos tales como detergentes u otros roductos de limpieza, medicamentos que viaan en la orina entre otros o incineradores que conducen a la contaminación del suelo y también del aire (Maldonado, 2009). La presencia de metales pesados en el suelo se observa con frecuencia tanto en los países desarrollados como en los países en via de desarrollo. El plomo y el mercurio son los metales pesados más comunes, siendo ambos nocivos para la salud humana (Vargas, 2005). Los suelos contaminadosalteran el metabolismo de las plantas y reducen los rendimientos de cultivos. La vegetación absorbe los contaminantes del suelo y al pasarlos a la cadena alimentaria ocasiona problemas sanitarios (Brutti et all, 2018). La cuenca hidrográfica Matanza Riachuelo Una cuenca hidrográfica es un área en la cual el agua proveniente de las lluvias que escurren a través del terreno se reúne en un río, lago o mar. La Cuenca Matanza Riachuelo (CMR) recoge el agua de las precipitaciones, forma arroyos que confluyen en un curso de agua principal llamado rio Matanza en sus orígenes y Riachuelo en su tramo final. Esta cuenca está ubicada en el área metropolitana sur de la Ciudad Autónoma de Bs. As. y noreste de la provincia de Bs.As (Fig. 1 ) y constituye una de las más contaminadas del planeta y la más contaminada del país (Colombo et all, 2020). 19 Figura 1| Ubicación del lugar de muestreo: (A) Posición relativa en sudamérica, (B) Posición en la provincia de Buenos Aires. (C) detalle de la Cuenca Matanza Riachuelo. Nace como un río pequeño, en el partido de Las Heras, donde los arroyos Castro y Cobey se juntan para formar, en el paso de la Horqueta, el Río Matanza del que sus principales afluentes son los arroyos Cañuelas, Chacón y Morales en la provincia de Buenos Aires y el Cildáñez (actualmente entubado) en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, el río cambia su nombre en el puente de la Noria y pasa a llamarse “Riachuelo”. El río Matanza – Riachuelo, tiene un recorrido de aproximadamente 80 km, es un cauce de la llanura pampeana con meandros que permite formaciones de lagunas, debido a la poca pendiente del suelo. Así, con poca velocidad desemboca en el Río de La Plata dando lugar a la boca del Riachuelo, nombre que lleva el barrio homónimo, La Boca. El origen del nombre se remonta al año 1536, durante la primera fundación de Buenos Aires por Pedro de Mendoza, el cronista de la expedición, Ulrico Shmidt lo llama “Pequeño Río” y Ruiz Díaz de Guzmán lo designa “Riachuelo de las naves”(Cagliani, 2000). En el tramo superior, el río, corre sin mayores dificultades (sólo se han construido algunos canales para orientar el escurrimiento disperso), en cambio desde que ingresa a la planicie baja, el cauce pierde sus características naturales. En las márgenes de la cuenca media y baja se ha desarrollado una de las áreas de mayor concentración industrial del país, siendo la cuenca baja la de mayor degradación ambiental. Más de 24.000 establecimientos industriales (curtiembres, petroquímicas, textiles, metalúrgicas y de galvanoplastia, entre otros) están radicados en esta zona siendo los dos primeros los más importantes para la región (ACUMAR, 2012). A D 20 Legislación ambiental en la República Argentina En la Argentina la legislación ambiental ingresa en las modificaciones hechas en la Constitución Nacional (CN) del año 1994. En éstas se incorpora el artículo 41 o artículo del derecho a un ambiente sano. Aparecen conceptos tales como sustentabilidad, residuos peligrosos y daño al ambiente, entre otros. Posteriormente se sancionaron a nivel nacional una serie de leyes de protección del ambiente o gestión sustentable. Una de las más relevantes es la 25.675, la Ley General del Ambiente (Cousido, 2010) que fija los presupuestos mínimos de la protección ambiental. Entendiendose por presupuesto mínimo, a toda norma que concede una tutela ambiental uniforme o común para todo el territorio nacional, y tiene por objeto imponer condiciones necesarias para asegurar la protección ambiental. En su contenido, debe prever las condiciones necesarias para garantizar la dinámica de los sistemas ecológicos, mantener su capacidad de carga y, en general, asegurar la preservación ambiental y el desarrollo sustentable. A continuación, se detallan el resto de las leyes de presupuestos mínimos: Ley N°25612 de Residuos industriales; Ley N°25670/02 de Gestión y eliminación de PCB; Ley N°25688/02 de Gestión ambiental de aguas; Ley N°25831/03 de Acceso a la información pública; Ley N°25916/04 de Gestión y protección ambiental para la gestión integral de residuos domiciliarios; Ley N°26331/07 de Protección ambiental de los bosques nativos. De este modo, la Nación (art. 41 de la CN) dicta las normas que contengan los presupuestos mínimos de protección ambiental, sin alteración de las facultades y jurisdicción de las provincias, tomando en consideración los art. 122 y 124 de la CN y las Provincias dictan de normas necesarias para complementarlas. En la provincia de Buenos Aires la ley general del ambiente Ley N° 11.723, es muy similar a la 25.675 de Nación sólo que en varios aspectos es más rigurosa. En el año 2008, un fallo de la Corte Suprema de Justicia de la Nación que involucra la Cuenca del MR sentó un precedente en los juicios y fallos de la temática ambiental del país. En la 21 misma se encuentran demandados Estados y empresas nacionales, provinciales y municipales; públicos y privados. Fuentes de contaminación En la cuenca las fuentes de contaminación son antiguas, se originan en las curtiembres las refinerías y la usina de generación de energía, todas estas actividades utilizan metales pesados (MP). Ya durante la colonia se hicieron evidentes los primeros problemas de contaminación. El espacio natural se fue transformando por el desarrollo de la sociedad que, instalada en sus orillas, necesitaba satisfacer sus necesidades habitacionales, productivas y comerciales (Merlinsky, 2008). Las vaquerías (lugar donde se tienen y se crían vacas) constituyeron una de las primeras actividades en la región. En 1801 se instalaron los primeros saladeros en las márgenes del río y en él se arrojaban restos de cuero, carne, huesos y grasa de animales (Malpartida, 2011, Infobae, 2019). a) Saladeros El primer saladero industrial de Buenos Aires fue creado en 1810, por los ingleses Roberto Staples y Juan Me Neile. Posteriormente (1815), la sociedad formada por Juan Manuel de Rosas, Juan Terrero y Luis Dorrego estableció en Quilmes (provincia de Buenos Aires) el saladero “Las Higueritas”. A fines de 1820 había más de veinte saladeros en Buenos Aires que vertían sus desechos en la cuenca. Los residuos generados por los saladeros fueron fuente de una gran contaminación orgánica sobrepasando la capacidad de la cuenca para degradar los residuos arrojados en ella. b) Industria del cuero (curtiembres) La industria del cuero procesado empezó a ser importante en el siglo XVIII. Desde el comienzo del siglo sufrió un crecimiento exponencial, en 1778 se exportaban 150000 cueros anuales pero al terminar el siglo eran enviados a Europa, 17.000.000. En el proceso del curtido se utilizaban (y se utilizan) alrededor de 500 kilos de productos químicos para procesar una tonelada de cuero crudo; se estima que un 85% de estos no se incorporan en el cuero sino que en el meor de los casos sontratados en lantas de tratamiento de efluentes o si no terminan como contaminantes en algún efluente clandestino. La producción también requiere la 22 eliminación de la mayoría de los componentes de la piel cruda, de la cual se aprovecha sólo el 20% del peso; el otro 80% se descarta como residuo (Malpartida, 2011). Como consecuencia directa, se generan importantes volúmenes de residuos, sólidos o como efluentes líquidos, con una combinación extremadamente compleja de compuestos orgánicos e inorgánicos que hace que el sector sea altamente contaminante. En la actualidad los impactos ambientales resultantes del proceso de producción del curtido de cueros están centrados en: 1) La utilización de cromo (III) con la posible oxidación a cromo (VI). 2) El proceso de biodegradación de la materia orgánica, con un alto contenido de sales y ácidos que es descargada en efluentes y consume el oxígeno disuelto del cuerpo de agua.3) La inadecuada disposición de los residuos (pelo, recortes y virutas de cuero, restos de pinturas y envases) los cuales quedan inutilizables para compostaje u otros métodos de aprovechamiento y/o disposición, como consecuencia de la carga química que poseen. 4) Luego del curtido, la etapa de terminación involucra: pigmentos que contienen metales pesados (plomo, cadmio, cromo, etc.); fluorados y polímeros orgánicos compuestos de estaño que actúan como catalizadores así como los desengrasantes percloroetileno y tricloroetileno. 5) Se utilizan también solventes como: acetato de butilo, etilacetato, acetona, ciclohexanona, alcohol isopropílico, metiletilcetona. (2-butanona), 2-pentanona, acetato de etilo, ciclohexano, di-isobutilcetona (DIBK), xileno, metil isobutilcetona (MIBK), tolueno, etilbenceno, entre otros. 6) Se hace uso ineficiente del agua ya que requieren aproximadamente 1000 litros por cuero terminado, generando grandes volúmenes de efluentes vertidos diariamente a las corrientes de agua (Malpartida, 2011). De acuerdo a los análisis de contaminación industrial realizados, las 170 curtiembres establecidas en la cuenca (Malpartida, 2011), aportan unas 26.000 toneladas de Demanda Biológica de Oxígeno (DBO) por año. Están ubicadas en su mayoría en el Partido de Lanús, siguiendo en cantidad en el Partido de Avellaneda y en menor medida en Lomas de Zamora, La Matanza y la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. El sector de las curtiembres fue identificado por la Secretaría de Ambiente y Desarrollo Sustentable de la Nación (SAyDS) en el año 2006, como responsable del 50% de la degradación ambiental de la cuenca. Todo lo antes mencionado en cuanto a la industria curtiembrera, se podría evitar con la instalación de plantas de tratamiento de efluentes liquidos. 23 c) Industria petroquímica Las refinerías de petróleo son otra fuente importante de contaminantes. El polo petroquímico de Dock Sud junto con la refinería de crudo ubicada en Valentín Alsina (Partido de Lanús) contaminan las aguas de esta región. Si bien los componentes mayoritarios son los hidrocarburos alifáticos y en menor medida los aromáticos, el crudo tiene otros contaminantes tales como el S, Co, Fe, Ni, Cr, V que se suman a otros metales pesados que se usan como catalizadores en la refinación (Malpartida, 2011). d) Generación de energía La generación de energía eléctrica térmica se realiza por combustión controlada de una sustancia en una máquina o motor. Esta sustancia puede ser carbón, petróleo, gas o biomasa vegetal. Uno de los principales impactos que tiene la generación térmica es la emisión de contaminantes a la atmósfera, lo cual depende directamente del combustible que se utilice. Las principales emisiones de un sistema termoeléctrico son: material particulado (PM10), dióxido de azufre (SO2), óxidos de nitrógeno (NOx) y monóxido de carbono (CO) (Malpartida, 2011). Cuando se utiliza gas natural, se genera principalmente NOx, en el caso de quema de petróleo y carbones se emiten todos los contaminantes antes mencionados. Durante la quema de carbón se le suma la contaminación por metales pesados tales como níquel y vanadio. En este último caso el enfriamiento del vapor que sale de las turbinas se realiza utilizando grandes volúmenes de agua. Esta, al retornar al cauce original, vuelve con una alta temperatura generando una alteración en la zona donde es descargada el agua. En el caso de la CMR el área industrial de Dock Sud es la más afectada, (delimitada por el Riachuelo, el canal Sarandí y el Río de la Plata) allí se encuentran instaladas (Malpartida, 2011): 2 refinerías de petróleo; 8 plantas de descarga, almacenaje y embarque de petróleo y sus derivados; 4 plantas de descarga, almacenaje y embarque de productos químicos; 1 central termoeléctrica. 24 Los metales pesados (MP) La contaminación ambiental por MP comenzó con la domesticación del fuego por la humanidad, la deposición de pequeñas cantidades de metales traza durante la combustión de leña, alteraba los niveles de metales en el ambiente de las cuevas (Nriagu, 1996). Luego, con el descubrimiento de la minería y la manufactura de metales, se desarrolla un vínculo cercano entre metales, contaminación con metales y la historia humana. La minería y el comercio de recursos minerales se convirtieron en una característica clave de la economía primitiva, y las técnicas de recuperación de metales alcanzaron el estatus de barómetro del avance tecnológico para las culturas antiguas (Nriagu, 1996). De este modo, durante la época del Imperio Romano, se requirieron grandes cantidades de MP para mantener el alto nivel de vida, especialmente Pb (80,000 a 100,000 toneladas métricas por año), Cu (15,000 tons/año), Zn (10,000 tons/año) y Hg (> 2 tons/año) (Nriagu, 1996). Más tarde, la Revolución Industrial demandó una mayor cantidad de metales que provocó un aumento exponencial de la contaminación, tanto en cantidad absoluta como en número y tipo de compuestos metálicos tóxicos liberados al ambiente. Aproximadamente el 90% de las salidas de las minas se consumieron en el siglo XX. Estos inventarios muestran que las liberaciones industriales acumulativas de MP en el ambiente son masivas y generalizadas y han superado los ciclos bioegoquímicos naturales de los metales en muchos ecosistemas (Nriagu, 1996). El término "metales pesados" engloba a cualquier elemento metálico que tienga una densidad atómica superior a 4 g/cm3, o 5 veces o más, mayor que el agua (Huton y Symon, 1986, Battarbee et al, 1988, Duruibe et al, 2007) y sea tóxico o venenoso incluso a baja concentración (Lenntech, 2004). "Metales pesados" es un término colectivo general, que se aplica al grupo de metales y metaloides. Aunque no todos los MP son tóxicos (algunos de ellos son necesarios para los seres vivos como micronutrientes) alguno de ellos constituyen un serio problema ambiental cuando su concentración aumenta. Los más importantes son: el mercurio (Hg), el plomo (Pb), el cadmio (Cd) y el talio (Tl), el cobre (Cu), el zinc (Zn) y el cromo (Cr). Al hablar de contaminación por MP, muchas veces, se incluye a otros elementos tóxicos tales como el berilio (Be) o el aluminio (Al), o algún metaloide como el arsénico (As) (Cetin et al, 2011). Las fuentes de contaminación ambiental por MP son: la minería y la fundición de metales, la quema de combustibles fósiles, fertilizantes, lodos de aguas residuales, pesticidas, residuos municipales, fundición, pigmentos y pilas (Cetin et al, 2011, Niazi et al, 2011, 2015, Shahid et al, 2015). Se liberan al ambiente en 25 forma de compuestos (inorgánicos y orgánicos) y/o elementos y persisten después de que estas actividades terminan. Ross (1994) dividió las fuentes antropogénicas de contaminación por MP en cinco grupos de acuerdo a su origen: 1. Agricultura (Zn, As, Pb, Cd, Cu, selenio (Se), el acetato de fenilmercurio y el HgCl2 se usaron masivamente como pesticidas (de la Fournière et al, 2007) y uranio (U)) 2. Minería y fundición metalífera (Cd, Pb, As y Hg) 3. Industria en general (Cd, Hg, As, Cr, Cu, Co, Ni y Zn) 4. Eliminación de desechos (As, Pb, Cu, Cd, Cr, Zn y Hg) 5. Deposición atmosférica (As, Pb, Cr, Hg, Cu, Cd y U) Los suelos son el sumidero principal y terminal para los MP liberados en el ambiente, varios países que se enfrentan a la contaminación del suelo por MP difieren sustancialmente en el reconocimiento del problema, en las estrategias y tecnologías para enfrentarlo (Myoung Soo Ko et al, 2015, Baldantoni et al, 2016). Se sabe que existen 10 millones de sitios contaminados en todo el mundo, con un ≥50% de los sitios contaminados con MP (He et al, 2015). La mayoría de estos sitios contaminados con MP existen en países desarrollados, es decir, los Estados Unidos de América, Australia, Alemania, Suecia y China debidoa su mayor uso en procesos industriales (Foucault et al, 2013, Goix et al, 2014). Los MP más representativos del suelo Cadmio (Cd) Se trata de un elemento que no es esencial para la vida de ningún organismo conocido. El cadmio se presenta asociado en forma natural con minerales de zinc y plomo, la mayor parte del cadmio utilizado se obtiene a partir de los minerales de zinc, este hecho permite señalar que se moviliza con facilidad. Este metal es altamente resistente a la corrosión por lo que se lo utiliza en galvanoplastia, en la elaboración de electrodos de baterías alcalinas, en la industria metalúrgica marítima, y en la industria del plástico. Otros compuestos a partir del cadmio también se utilizan como fungicidas, insecticidas y nematicidas. El cadmio en el suelo proviene de las emisiones de chimeneas e incineración no controlada asi como la utilización de determinados combustibles (Lenntech, 2004). El cadmio al igual que otros metales, se une a proteínas intracelulares (metalotioneinas) que son aquellas que portan grupos sulfhidrilos (-SH) dentro de su composición. La toxicidad depende de su interferencia en procesos fisiológicos, sin embargo existe también fuerte 26 evidencia de su acumulación en diversos órganos (Duruibe et al, 2007). El cadmio vertido a los ríos puede ingresar en la cadena trófica por consumo de agua, peces y moluscos (almejas y otros bivalvos). Cromo (Cr) El cromo es un metal, que en su forma elemental trivalente y en concentraciones muy pequeñas (trazas) es esencial en el metabolismo de muchos organismos. Su presencia conjuntamente con la niacina o ácido nicotínico permiten el metabolismo normal de la glucosa. Con el cromo se producen aleaciones con hierro (ferrocromo) que se utilizan en la industria del acero, del vidrio y del cemento, también se utiliza en el curtido de cueros. El ácido crómico se utiliza para la realización de cromados (Sankhla et al, 2016). La presencia de cromo en elevadas concentraciones en el agua de ríos y arroyos ha sido atribuída a contaminación industrial. Las sales hexavalentes son utilizadas en el anodizado de aluminio y en las curtiembres (Taghipour et al, 2016) industrias presentes en la CMR, donde históricamente se asentaron los primeros mataderos y saladeros de carne y cueros. La presencia de la forma hexavalente es indicadora de actividad industrial puesto que el cromo trivalente es el estado de oxidación que comúnmente tienen los compuestos de cromo naturales. El cromo hexavalente se encuentra en los cromatos de calcio, sodio y zinc entre otros así como en el ácido crómico. El cromo hexavalente es de 100 a 1000 veces más toxico que el trivalente, dependiendo el organismo que se trate (Shekhawat et al, 2015). Por su parte el cromo trivalente forma parte de óxidos, de carbonatos y fosfatos, entre otros. La contaminación en el aire puede provenir de plantas de ferrocromo y de las torres de enfriamiento que usualmente usan cromo como inhibidor de la corrosión y del polvo de cemento (el cemento “Portland” tiene 41,2 mg de cromo por Kg del cual 2,9 es hexavalente, MSAS, 1988). También se presume su liberación a la atmósfera a través de los hornos de ladrillo, dado que es una práctica común incorporar virutas de cuero curtido (residuo de curtiembres) a la argamasa de barro que le confiere propiedades deseadas a los ladrillos. El cuero curtido posee sales trivalentes de cromo, pero el ambiente oxidante de los hornos podría transformarlo a hexavalente. El cromo hexavalente es altamente oxidante y en contacto con materia orgánica se reduce a la forma trivalente formando un compuesto más estable. La forma trivalente de los iones es levemente tóxica para los organismos como su forma hexavalente ya que el trivalente se oxida rápidamente. Es de destacar que el poder oxidante del cromo hexavalente produce irritaciones y desencadena respuestas celulares anormales, razón por la cual se lo considera un inductor cancerígeno (Sankhla et al, 2016). En la piel, sus 27 efectos se verifican a partir de dermatitis con edemas y ulceraciones que cicatrizan con lentitud. Cobre (Cu) El cobre es un elemento imprescindible para la vida, es requerido en pequeñas cantidades e interviene como activador o cofactor de diversas enzimas de animales y plantas así como en el transporte de oxígeno en invertebrados (Wang et al, 2013). Naturalmente se encuentra formando sulfuros y óxidos de cobre, en la industria se lo utiliza para la producción de cables eléctricos y una gran cantidad de utensilios, en aleación con el zinc forma bronce lo cual admite diversas utilidades (Sankhla et al, 2016). En concentración elevada se transforma en un elemento altamente tóxico, siendo muy dañino en el agua para muchos organismos como crustáceos, anélidos, peces y plantas (Irwin et al, 1998, Wang et al, 2013). En los organismos acuáticos y de respiración branquial su efecto biológico principal se asocia a la coagulación del mucus epitelial en los peces, aumentando la barrera para la hematosis e induciendo metaplasias en esos y otros tejidos. Níquel (Ni) El níquel se encuentra como constituyente de diversos minerales como la calcopirita y la pertendita. Forma parte natural de la composición de los suelos debido a su gran distribución en la corteza terrestre. El níquel es enviado a la atmósfera en el proceso minero que implica la conversión de los minerales de níquel en sus compuestos para la industria. Confiere dureza a las aleaciones, con cobre, hierro, cromo y zinc, por esto sus usos industriales se encuentran en la producción de acero inoxidable (Sankhla et al, 2016). Combinado con cloro, azufre y oxígeno forma compuestos que se disuelven fácilmente en el agua. Se lo utiliza también en la fabricación de baterías o acumuladores, como así también en la industria de los plásticos. El carbonilo de níquel es uno de los compuestos más tóxicos. Las vías de ingreso importantes son la superficie del cuerpo y la respiratoria, siendo una sustancia alergénica en la piel y vías respiratorias. Los órganos más afectados por la exposición al níquel metálico y compuestos solubles (como Ni2+) son la cavidad nasal, los pulmones y riñones. La vía de ingreso por ingestión es poco significativa. Se lo considera una sustancia oncogénica. La exposición al sulfato de níquel (polvo de refinerías) por parte de personal de refinerías ha causado tumores pulmonares y nasales (Irwin et al, 1998, Das et al, 2018). 28 Plomo (Pb) El plomo no es un elemento esencial para los seres vivos en ninguna concentración, generalmente, se extrae de minas con bocaminas o a cielo abierto, se encuentra sobre todo en estado de sulfuro (galena de plomo) o unido a la plata (plomo argentífero). Se oxida rápidamente al aire, pero con la combinación de ciertos ácidos se forman sales muy venenosas. Al tener un elevado peso molecular, el plomo es muy susceptible de acumularse en los seres vivos y posee un enorme grado de toxicidad sobre ellos, desde los microorganismos responsables de la degradación de la materia orgánica hasta el hombre (Wani et al, 2015). Las fuentes más importantes de liberación de plomo a la atmósfera fueron los escapes de los vehículos, en los que se usan derivados alquílicos de plomo como aditivos antidetonantes en los combustibles de los motores de combustión interna (Duruibe, 2007), baterías en desuso y las emisiones industriales. Para el control del primero de estos dos factores, cada vez está más extendida la utilización de motores con catalizador para nafta sin plomo, aunque en ese caso se utilizan otros compuestos peligrosos como el benceno (Sankhla et al, 2016). Para la década del 60 se ha calculado que el plomo es introducido por el hombre en el ciclo sedimentario en cantidades comparables a las de los procesos naturales, cifra que llegó a ser sobrepasada y hoy está en descenso.Todas las mediciones acerca de los efectos del plomo en los sistemas vivos son adversas, incluyendo aquellas relativas a la supervivencia, crecimiento, aprendizaje, reproducción, desarrollo y metabolismo en general. El plomo no tiene una función esencial en el metabolismo que sea conocida, cosa que sí ocurre con otros metales. Aun cuando estas sean sólo trazas, todos los compuestos del plomo son potencialmente dañinos o tóxicos, especialmente el tetraetilo de plomo. El plomo participa en reacciones biológicas que determinan su absorción por los organismos. En general actúa como inhibidor de enzimas, alterando el metabolismo celular y por bioacumulación, tiende a depositarse en el tejido óseo. El plomo es un metal muy tóxico para los organismos acuáticos y sobre todo para los peces (Lee et al, 2019). Zinc (Zn) El zinc es uno de los elementos más abundantes y se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza. Puede ser encontrado en el aire, suelo y agua. El zinc es un componente importante de la nutrición y necesario para varias enzimas, sobre todo las deshidrogenasas, por lo tanto debe ser suministrado en la dieta, de ahí su existencia en casi todos los alimentos (en muy baja cantidad) lo cual lo transforma en un elemento esencial para la vida animal y vegetal (Duruibe, 2007). Este metal se utiliza en la soldadura, en la fabricación de baterías, en 29 las galvanizadoras. Tiene aplicaciones en la industria de pinturas y en farmacología, formando parte de formulaciones fungicidas de uso dermatológico. En concentraciones elevadas, sus efectos son dañinos para la vida silvestre, en general peces e invertebrados, particularmente crustáceos. También resulta tóxico para las algas. Dado que los MP de los suelos, no pueden ser degradados por los organismos el desafío es desarrollar soluciones innovadoras y rentables para que sean seguros para la vida humana y proteger las funciones de los ecosistemas. Remediación de suelos contaminados con MP Se entiende por remediación ambiental a la eliminación o reducción del/de los contaminante/s del ambiente. La corrección de los valores de MP depende de los requisitos reglamentarios de cada país (Sabir et al, 2015). Para remediar de manera eficiente los suelos contaminados con MP es necesario implementar tecnologías específicas para cada contaminante. En las últimas dos décadas se han desarrollado numerosas técnicas de remediación de suelos (Verbruggen et al, 2009, Murtaza et al, 2014, Sabir et al, 2015). Estas técnicas tienen como objetivo reducir las fracciones totales y/o biodisponibles de MP en los suelos y su posterior acumulación en la cadena alimentaria (Bhargava et al, 2012). Las técnicas convencionales para remediar los MP de los suelos contaminados se basan en métodos físicos, químicos y biológicos (Fig. 2), que se pueden usar (o no) combinados entre sí para remediar los sitios contaminados. 30 Figura 2|Comparación de diferentes métodos de limpieza del suelo (Extraido de: Khalid et al, 2017). Metodologías de Remediación Ambiental Los suelos contaminados con MP pueden ser remediados ex-situ o in-situ. Aplicando métodos físicos, químicos y biológicos. Los métodos de remediación física incluyen (1) reemplazo de suelo, (2) aislamiento de suelo, (3) vitrificación y (4) electrocinética; los métodos biológicos generalmente incluyen (5) fitoevaporación, (6) fitoextracción y (7) fitoestabilización, y en los métodos químicos se realiza (8) lavado del suelo e (9) inmovilización. Sin embargo, los métodos biológicos y químicos pueden aplicarse conjuntamente dependiendo del tipo de metal, suelo, planta y reactivo químico. Además, la remediación asistida por microorganismos, quelatos y genica puede mejorar la efectividad de diferentes técnicas de fitorremediación (Khalid et al, 2017). Métodos ex-situ: Se requiere retirar el suelo del sitio contaminado para el tratamiento, y luego devolver el suelo tratado al mismo sitio. Los métodos ex-situ convencionales aplicados para la remediación de los suelos contaminados se basan en la excavación, la desintoxicación y destrucción de 31 contaminantes física, química o biologicamente, como resultado, el contaminante se somete a estabilización, solidificación, inmovilización, incineración o destrucción. Métodos in-situ: Se realizan en el lugar donde se produjo la contaminación (más información pag. 19 y 20). Reed et al (1992) definieron a las tecnologías in-situ de recuperación como la destrucción o transformación de los contaminantes, la inmovilización para reducir la biodisponibilidad y la separación de los contaminantes del suelo a granel. Los métodos in-situ se prefieren a los métodos ex-situ, debido a su bajo costo y menor impacto en el ecosistema (Ghosh y Singh, 2005). Métodos biológicos (Biorremediación): La biorremediación se refiere a un conjunto de metodologías que utilizan microorganismos o partes de ellos seleccionados naturalmente o por modificaciones de la ingeniería genética para degradar sustancias que se han trasladado a un lugar que no corresponde o están en cantidades no recomendables como resultante de un proceso productivo mal manejado o de un incidente natural (Brutti et al, 2018). En este proceso la biorremediación depende principalmente de los organismos (plantas, hongos, bacterias y archaea) que intervienen en la transformación/degradación de los contaminantes. Como la biorremediación es efectiva solamente cuando las condiciones ambientales permiten el crecimiento de los organismos y su actividad, su aplicación implica la manipulación de los parámetros que permiten el crecimiento microbiano haciendo así el proceso más rápido (Karigar y Rao, 2011). En este sentido el principal reto para la biorremediación consiste en diseñar las metodologías adecuadas para suprimir/mitigar/transformar los contaminantes, y definir las mejores estrategias de aplicación de cara a las condiciones ambientales, limitaciones presupuestarias, el cumplimiento normativo y la aceptación pública (Dzantor y Beauchamp, 2002). Fitorremediación El ecosistema tierra tiene gran capacidad (aunque finita) para amortiguar la contaminación, esto puede deberse a los diferentes procesos que llevan a cabo los organismos vivos y su capacidad de transformar el entorno haciéndolo propicio para la vida (Lovelock, 1985). En los comienzos de la vida, hace ya más de 3600 millones de años, las condiciones planetarias además de ser muy diferentes a las actuales eran adversas para algunos tipos de vida, la 32 temperatura del planeta era mayor a la actual, la capa de ozono no existía y los niveles de O2 eran bajos. Registros fósiles muestran que las primeras plantas terrestres aparecieron hace unos 415 MA y en ellas se hallaron estructuras muy semejantes a los HFMA (Redecker et al, 2013). Hace 150-200 MA aparecieron las primeras angiospermas. Este grupo de plantas se expandió hasta cubrir la mayoría de los ambientes debido a sus novedosas adaptaciones. Esta última radiación permitió a las plantas colonizar los ambientes más inhóspitos entre ellos los suelos metalíferos, en ellos abundan naturalmente altas concentraciones de MP y los organismos seleccionados por ambientes semejantes a este pueden ser utilizados en la fitorremediación de suelos contaminados con MP. Las tecnologías de biorremediación que utilizan plantas han sido denominadas técnicas de fitorremediación (phyto =planta + remedium=corregir o eliminar un mal). La idea de utilizar las plantas que acumulan metales para eliminar los MP y otros compuestos xenobióticos se introdujo por primera vez en 1983, pero el concepto se ha puesto en práctica durante los últimos años" (Prasad, 2003). Esta biotecnología se puede aplicar a los contaminantes orgánicos e inorgánicos presentes en el suelo (sustrato sólido), el agua (sustrato líquido) o elaire (Tabla 1). Actualmente se impulsa la utilización conjunta de las plantas verdes y su microbioma asociado (Kong y Glick, 2017) para el tratamiento in-situ de suelos y aguas contaminados ya que las actividades microbianas en la rizósfera (rizorremediación) aumentan la captación de MP y/o la degradación de xenobióticos de diferentes maneras alterando la movilidad y la biodisponibilidad de estos (Aafi et al, 2012, Yang et al, 2012, Ullah et al, 2015, Gube, 2016, Mishra et al, 2017). Los microbiomas interaccionan con las plantas a través de sustancias que promueven directamente su crecimiento como pueden ser las fitohormonas [ácido indolacético (AIA), citoquininas y giberelinas], sideróforos, ACC desaminasa y/o ácidos orgánicos (Seneviratne et al, 2017), estos compuestos mejoran el crecimiento de las plantas en suelos contaminados con MP (Ijaz et al, 2016, Santoyo et al, 2016). Las plantas por su parte influyen tanto en el ambiente inorgánico de la rizósfera como el biológico a través de sus exudados radicales. De este modo, los exudados de las raíces desempeñan un papel importante en el cambio de la biodisponibilidad de los metales, ya que la liberación de ciertos compuestos orgánicos no sólo moviliza los metales formando complejos metálicos, sino que también proporciona nutrientes y fuentes de energía a las comunidades microbianas que, a su vez, apoyan el crecimiento y la supervivencia de las plantas. Los exudados radicales pueden contener ácidos orgánicos y aminoácidos que funcionan como compuestos de unión intracelular para MP (Ma et al, 2016). La liberación de protones (H+) y enzimas que ayudan a la acidificación y la transferencia de electrones en la rizósfera, lo que conduce a una mayor 33 biodisponibilidad de estos elementos (Ma et al, 2016). Por otro lado, los cambios en las concentraciones de compuestos de exudados en presencia de MP pueden ayudar en el desarrollo de biomarcadores de ambientes contaminados. Recientemente, basado en técnicas de cromatografía de gases, espectrometría de masas (CG-Masa) y métodos metabolómicos, Luo et al (2017) mostraron que la planta acumuladora de Pb Sedum alfredii puede cambiar significativamente los tipos de exudados de la raíz, también se lograron identificar 15 compuestos que eran potenciales biomarcadores de la contaminación por Pb. Importancia económica de las prácticas de fitorremediación La remediación por métodos químicos, físicos o biológicos tiene diferentes costos, siendo los más caros los métodos fisicoquímicos de reparación del suelo (Mishra et al, 2017) varian entre los U$D 10 y 1000 por metro cúbico. En cambio, los costos de fitoextracción se estiman en un precio tan bajo como U$D 0.05 por metro cúbico (Ghosh y Singh, 2005) (Tabla 1). Tabla 1. Costos asociados con los distintos tipos de métodos de rehabilitación de suelo. (Extraída de: Hamlin, 2002. Phytoremediation Literature Review). Rango de costos de remediación (en dólares) Tipo de medio Método de remediación suelo = metro cúbico Suelo densidad aparente = 1.3 Vitrificación in-situ 360 1370 Incineración suelo 200 1500 Excavación y relleno sanitario 140 720 Lavado del suelo 80 860 Enjuague del suelo 50 270 Solidización y estabilización 40 200 Sistemas electrocinéticos 30 290 Biorremediación 10 310 Fitorremediación de suelos ˂1??? 150 34 Técnicas generales de fitorremediación Las técnicas de fitorremediación (Fig. 3) se pueden clasificar de acuerdo con la metodología empleada y / o la naturaleza del contaminante (Sharma et al, 2015): a) Fitoextracción: es un proceso de eliminación de los compuestos debido a la capacidad de algunas plantas de híper- absorber y acumular o translocar metales o metaloides a los vástagos. Una vez acumulados los metales en la parte aérea, ésta se cosecha y se retira, almacenándola en un lugar apropiado. Si el metal es no volátil, se puede quemar para obtener una ceniza rica en el metal. b) Fitoestabilización (e inmovilización): un proceso de contención usando las plantas a menudo en combinación con aditivos como adyuvante a la instalación de las mismas para Figura 3| Diferentes formas de fitorremediación (Extraido de Muños-Castellanos, 2010) estabilizar mecánicamente el sitio y reducir la transferencia de contaminantes a otros compartimentos del ecosistema y la cadena alimentaria; el compuesto orgánico o inorgánico se puede incorporar a la lignina o al humus del suelo. c) Fitoestimulación: el crecimiento de raíces promueve el desarrollo de microorganismos de la rizósfera capaces de degradar el contaminante, utilizando exudados como fuente de carbono. FITODEGRADACIÓN FITOVOLATILIZACION N FITOEXTRACCION FITOESTIMULACION CONTAMINANTE FITOESTABILIZACION RIZOFILTRACION 35 d) Fitovolatilización/rizovolatilización: procesos de eliminación que utilizan las capacidades metabólicas de plantas y microorganismos asociados a la rizósfera de transformar los contaminantes en compuestos volátiles que se liberan a la atmósfera. Algunos iones de elementos de los grupos XII, XV y XVI de la tabla periódica de los elementos como mercurio, selenio y arsénico son absorbidos por la raíz, entonces se convierten en formas menos tóxicas que son liberadas a la atmósfera. e) Fitodegradación: se aplica a contaminantes orgánicos que son degradados o mineralizados por actividades enzimáticas específicas, generalmente asociadas a microorganismos de la rizósfera. f) Rizofiltración: utilizar plantas terrestres para absorber, concentrar contaminantes disueltos en el sistema acuoso. Fitorremediación de suelos con MP Las plantas pueden acumular metales esenciales y no esenciales en sus tejidos. Éstas en su mayoría, aparentemente no son capaces de distinguir los metales o especies metálicas con las mismas propiedades fisicoquímicas o entre los dos isótopos del mismo metal. En este sentido, junto con los metales esenciales, también pueden acumular sus radioisótopos y metales tóxicos (Dushenkov et al, 1997). Debido a esta característica, varias plantas se utilizan con fines de remediación. Plantas de varias familias de Angiospermas se están utilizando en prácticas de fitorremediación. Un caso especial lo componen las plantas de la familia Asteraceae (Nikolic et al, 2015) que acumulan comparativamente mayor concentración de radionucleidos y metales pesados que otras (Turnau y Mesjasz-Przybylowicz, 2003, Tang y Willey, 2003) debido al alto factor de transferencia (proporción de la concentración de contaminantes en la planta y en el suelo en base al peso seco) y la aparición de endófitos de raíz que pueden catalizar el proceso. Cuando dos o más MP están presentes juntos, hay una competencia por los sitios de unión en la zona radical, y los coeficientes de bioacumulación para cada metal se reducen en comparación con la contaminación de un sólo metal (Keeling et al, 2003). En el caso de algunas plantas como Dahlia (Georgina wild), el aumento en la concentración de MP disminuye el crecimiento de las plantas (Shivhare y Sharma, 2012). A continuación, se muestra una lista de diferentes plantas con potencial fitorremediador (información recopilada por Sharma et al, 2015): 36 Tabla 2: Plantas terrestres y acuáticas que muestran una absorción de metales pesados apreciable Planta Metal Pesado Referencia Alyssum bertolonii L. Ni (Robinson et al, 1997a, b) Jatropha curcas L. Pb y Cd (Mangkoedihardjo y Surahmaida, 2008) Azolla pinnata R.BR Cr, Hg y Cd (Rai 2008, 2010) Brassica juncea L. Cd, Cr, Cu y Pb (Seth et al, 2012)Salix viminalis L. Cu, Pb y Zn (Pitre et al, 2010) Salix miyabeana Seemen. Cu, Pb y Zn (Pitre et al, 2010) Cannabis sativa L. Cd, Cr y Ni (Citterio et al, 2003) Cardaminopsis halleri L. Zn, Cu, Sn, Fe y Al (Neumann y Nieden, 2001) Ceratophyllum demersum L. Pb y Cr (Abdallah, 2012) Lemna gibba L. Pb, Cr, Cd, Co y Zn (Abdallah, 2012, Megateli et al, 2009) Eucalyptus globules Cr y Zn (Sarin y Pant, 2006, Arriagada et al, 2010) Eichornia crassipes (Mart.) Solms Zn, Cr, Cu, Cd, Pb, Ag y Ni (Odjegba y Fasidi, 2007) Helianthus annuus L. Cu, Zn, Pb, Hg, As, Cd y Ni (Jadia y Fulekar, 2008) Hydrocotyle umbellata L. Cr, Zn, Na y Cu (Khilji y Bareen, 2008) Lemna minor L. As, Hg, Pb, Cr, Co y Zn (Parra et al, 2012) Pteris vittata L. As, Cu y Cr (Kumari et al, 2011) Cynodon dactylon (L.) Pers. Pb, Co y Ni (Rathi et al, 2011) Vigna radiata (L.) R. Wilczek Pb, Co y Ni (Rathi et al, 2011) Commelina benghalensis L. Pb, Cd y Zn (Sekabira et al, 2011) Pluchea indica (L.) Less. Cr (Sampanpanish et al, 2006) Cynodon dactylon (L.) Pers. Cr (Sampanpanish et al, 2006) Vetiveria zizanioides (L.) Roberty As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Se y Zn (Danh et al, 2009) Amaranthus spinosus L. Cu, Pb, Cd, Zn y Cr ( Chinmayee et al, 2012) Phyla nodiflora (L.) Greene Cu y Zn (Yoon et al, 2006) Gentiana pennelliana L. Pb, Cu y Zn (Yoon et al, 2006) Typha latifolia L. Cu, Ni, Zn, Fe, Mn y Ca (Taylor y Crowder, 1983) Lupinus species Mn, Cd, Pb, Cr y Hg (Ximenez-Embun et al, 2001) Lolium italicum A. Braun Zn y Pb (Rizzi et al, 2004) Festuca arundinaceae Schreb. Zn y Pb (Rizzi et al, 2004) Anthyllis vulneraria L. Zn, Cd y Pb (Mahieu et al, 2011) Festuca arvernensis Zn, Cd, Pb (Frerot et al, 2006) Koeleria vallesiana Zn, Cd, Pb (Frerot et al, 2006) Armeria arenaria Willd. Zn, Cd, Pb (Frerot et al, 2006) Stackhousia tryonii Sm. Ni (Bhatia et al, 2005) Sebertia acuminata Pierre ex baill. Ni (Jaffre et al, 1976) Berkheya coddii L. Ni y Co (Robinson et al, 1997a,b, 1999) Pistia stratiotes L. Ag, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb y Zn (Odjegba y Fasidi, 2004) Sesbania drummondii (Rydb.) Cory Pb (Sahi et al, 2002) Solanum nigrum L. Cd y Pb (Gao et al, 2012) Arabis gemmifera Adans. Cd y Zn (Kubota y Takenaka, 2003) Sedum alfredii Hance Cd y Zn (Yang et al, 2004) Zygophyllum fabago L. Zn (Conesa et al, 2006) 37 Helichrysum decumbens Cambess. Pb (Conesa et al, 2006) Tamarix species L. Co (Conesa et al, 2006) Poa pratensis L. Pb y Cd (Liu et al, 2006) Genaphalium affine D. Don Pb (Liu et al, 2006) Conyza canadensis (L.) Cronq. Cd (Liu et al, 2006) Phytolacca acinosa Roxb. Mn (Liu et al, 2006) Elsholtzia splendens Nakai F. Maek. Cu, Zn, Pb y Cd (Wang et al, 2005) Trifolium repens L. Cd, Zn y Pb (Bidar et al, 2007) Lolium perenne L. Cd, Zn y Pb (Bidar et al, 2007) Raphanus sativus L. Cd, Cr, Cu, Ni y Zn (Pandey, 2006) Spinacia oleracea L. Cd, Cr, Cu, Ni y Zn (Pandey, 2006) Lepidum sativum L. Pb y As (Gunduz et al, 2012) Lactuca sativa L. Pb y As (Gunduz et al, 2012) Pisum sativum L. Pb, Zn y Cu (Kala y Khan, 2009) Amaranthus hybridus L. Cd, Ni, Pb y Hg (Chunilall et al, 2005) Amaranthus dubius Mart. Ex Thell. Cd, Ni, Pb y Hg (Chunilall et al, 2005) Mimosa caesalpiniaefolia Benth. Pb (Ribeiro de Souza et al, 2012) Erythrina speciosa Andrews Pb (Ribeiro de Souza et al, 2012) Schizolobium parahyba (Vell.) S.F.Blake Pb (Ribeiro de Souza et al, 2012) Sesbania drummondii Pb (Barlow et al, 2000) Ricinus communis cv. guarany Cd y Pb (De Souza Costa et al, 2012) Uno de los problemas que tienen las técnicas de fitorremediación es que altas concentraciones de los contaminantes tienden a inhibir el crecimiento de la planta, incluyendo el crecimiento de la raíz, debido al estrés oxidativo (Gerhardt et al, 2009) siendo necesario aplicar combinaciones de plantas con algunos microorganismos previamente seleccionados para aumentar la eficiencia de la extracción/transformación de contaminantes. Esta combinación es positiva para ambos organismos, sin embargo, poco se sabe acerca de este sinergismo entre plantas y microorganismos y los factores que generan las respuestas (Amora-Lazcano et al, 2010). Microbioma Vegetal Es definido como la totalidad de microorganismos, su material genético y las interacciones que se establecen en el espacio en donde viven, en nuestro caso particular es la rizósfera y los microorganismos alojados en otros tejidos de raíces. El microbioma vegetal es esencial para la vida de la planta: la protege del estrés biótico y abiótico (Mendes et al, 2013). El microbioma simbiótico es el consorcio microbiano de un 38 huésped en particular, que incluye todos los genes y las capacidades metabólicas del conjunto (planta-microorganismos). Los miembros de este consorcio interactúan con el huésped, entre ellos mismos y con otros organismos (Porras-Alfaro et al, 2011) de diferentes formas pudiendo establecer comunidades complejas y hasta superorganismos (Fig. 4). Se sabe que el microbioma de la planta extiende el potencial funcional de la misma mejorando su estado fisiológico (Mendes et al, 2013). Trabajos recientes mostraron que el éxito de la fitorremediación depende en gran medida de las relaciones microbianas con las plantas (Hassan et al, 2014). El ambiente del suelo tiene un efecto directo en la planta, el microclima de la rizosfera y la comunidad microbiana en el suelo. Los exudados de la raíz actúan como señales químicas directas entre la planta y el microbioma del suelo. La rizobiota reconoce las señales de exudado de la raíz y coloniza el rizoplano o el interior de la raíz. Los microrganismos del suelo interactúan colonizando las particulas del suelo y forman el microbioma rizosferico, por lo que, puede considerarse un derivado de la población microbiana total en el suelo. El microentorno en la rizosfera incluye el microbioma de la rizosfera (<3–5 mm de la raíz), el microbioma del rizoplano (en la interfaz raíz-suelo) y el microbioma interior de la raiz. El microbioma simbiótico de la raíz incluyen hongos micorrízicos, endófitos bacterianos y fúngicos y nódulos de simbiontes bacterianos (Coats y Rumpho, 2014). 39 Figura 4|Interacciones planta-microorganismo presentes en la rizosfera y en los suelos (extraido de Coats y Rumpho, 2014). La simbiosis micorrízica Si bien existen varios tipos de simbiosis fúngica, la simbiosis micorrízico arbuscular (MA) ocupa una posición central en el desarrollo de la rizósfera de las plantas (Barea et al, 2004) cerca del 90% de las plantas incluyendo angiospermas, briofitas y helechos forman este tipo de simbiosis. La formacion de una red hifal permite el acceso indirecto de la raiz a una gran parte del suelo de donde obtiene agua y nutrientes permitiendo el mejor crecimiento de las plantas. Tambien mejora la calidad del suelo mejorando su estructura. Hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) Los HFMA son microorganismos simbióticos que pertenecen al phylum Glomeromycota (Schüβler et al, 2001, Tedersoo et al, 2018). Representan uno de los grupos de organismos mas ampliamente distribuídos en la naturaleza y se encuentran en una gran variedad de ambientes (Read, 1991). Resultan determinantes de las conformaciones de los ecosistemas y tienen diversos roles tanto en ambientes naturales como antrópicos. En un sistema radical micorrízico arbuscular hay tres componentes principales: la raíz, el micelio intra-radical (MIR: dentro del apoplasto de la raíz) y el micelio extra-radical (MER: en el suelo circundante). El MIR de los HFMA está involucrado en la transferencia de nutrientes Endofito bacteriano 40 entre los simbiontes y se diferencia en: arbúsculos intracelulares, vesículas intra o intercelulares y circunvoluciones, cada una de estas estructuras posee una función particular (Bonfante-Fasólo, 1988, Morton et al, 1997). La formación
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