Evaluación de Clones de OmpA

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Evaluación de la efectividad de los clones obtenidos a 
partir de DNA-Shuffling de OmpA de Escherichia coli 
como biosurfactantes para la reducción de viscosidad 
en crudos 
David Felipe Villamil Martínez 
Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero Químico 
Asesor, 
Andrés Fernando González Barrios 
Ingeniero químico, M. Sc., Ph. D 
 
 
Departamento de ingeniería química 
Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia 
Junio de 2017 
 
 
 
 
Objetivo general 
Evaluar las propiedades surfactantes de los clones obtenidos del DNA-shuffling aplicado a la proteína transmembranal 
OmpA realizadas a la proteína OmpA de E.coli W3110/pCA24N 
 
Objetivos específicos 
 Producir los clones derivados de la proteína OmpA de E.coli W3110/pCA24N haciendo uso de IPTG como agente 
inductor 
 Preparar emulsiones crudo-agua (O/W) usando los clones 6 u 12 de la proteína OmpA como biosurfactantes. 
 Evaluar y analizar el comportamiento reológico de las emulsiones variando las concentraciones de los clones 
derivados de la proteína OmpA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evaluación de la efectividad de los clones obtenidos a partir de DNA-Sfuffling de OmpA de Escherichia coli como 
biosurfactante para la reducción de viscosidad en crudos 
David Felipe Villamil Martínez, Andrés González Barrios Ph.D 
Universidad de los Andes, facultad de ingeniería, Departamento de ingeniería Química 
 
 
RESUMEN: El uso de microrganismos en la industria del crudo es cada vez más frecuente ya que los biosurfactantes 
producidos a partir de estos, poseen moléculas anfifilicas que tienen la capacidad de reducir la tensión interfacial en 
crudos. Escherichia coli es una de los microrganismos más utilizados para el estudio de dichos biosurfactantes ya que su 
genoma es ampliamente conocido y proteínas transmembranales tales como OmpA posee propiedades anfifilicas que 
pueden ser aprovechadas y aplicadas como biosurfactantes a la industria petrolera en Colombia. Adicionalmente también 
se sabe que procesos de ingeniería de proteínas como DNA-sfluffling aplicados a E.coli permite obtener mutaciones que 
mejoran las propiedades anfifilicas de las proteínas de interés. El presente proyecto tiene como objetivo estudiar el efecto 
de la proteína transmembranal OmpA y de dos mutaciones de la misma proteína (clon 6 y 12) aplicados a emulsiones 
O/W. Para esto se prepararon emulsiones al 60% de crudo variando el porcentaje de proteína en 5 puntos (0.2%, 0.4%, 
0.6%, 0.7% y 0.8%). El proceso fue llevado a cabo en 3 pasoso: análisis de crecimiento de bacteria, producción de proteína 
y emulsificación y evaluación de las emulsiones por medio de la aplicación de un rango de esfuerzo cortante de 1 a 750 
s−1. Se demostró que el clon 6 junto inducido tiene una reducción en la viscosidad del 95% haciendo de este un buen 
candidato para el estudio y desarrollo de mecanismos de trasporte de crudo a largo de oleoductos que sean viables 
económicamente y seguros para el medio ambiente. Del mismo modo el clon 12 no inducido mostro una reducción del 
80% en la viscosidad de la emulsión haciendo de este un candidato secundario para el estudio y desarrollo de 
biosurfactantes. Por otro lado, la proteína original OmpA mostro propiedades de reducción, sin embargo no mostro ser 
tan efectiva como los clones 6 y 12. 
 
Key words: E.coli, Curva de crecimiento, inducción, proteína, clon, viscosidad, emulsión 
 
1. Introducción 
 
La demanda energética actual requiere de un uso 
óptimo de los recursos disponibles. Una de las fuentes 
más significativas de energía proviene de la explotación 
del crudo y sus derivados. Sin embargo este recurso es 
cada vez más escaso y una gran cantidad de energía se 
requiere para poder extraerlo de las reservas actuales. 
Debido al agotamiento de las mismas, explotar el crudo 
pesado es una de las mayores dificultades que enfrenta 
esta industria ya que el trasporte a lo largo de los 
oleoductos a los puntos de refinamiento se convierte en 
un proceso complejo debido a las elevadas densidades 
(mayores a 934 Kg/m3 o a partir de 22.3° API) y altas 
viscosidades de los crudos que a su vez causan poco 
desplazamiento a lo largo de los conductos de 
transporte [4] 
 
El principal problema radica en que el crudo no es 
fácilmente extraíble de las fuentes debido a los altos 
contenidos de sulfuro y diversos metales como el níquel 
[8]. Por consiguiente, las viscosidades de estos crudos 
oscila entre 100 mPa s a más de 105 mPa s de los cuales 
el máximo tolerable para trasporte por tuberías son 
crudos con viscosidades menores a 400 mPa s. Por ende 
la viscosidad es la propiedad más importante para la 
industria petrolera en procesos de explotación, 
transporte, conducción y refinamiento del material [4]. 
 
Para solucionar este problema diversas estrategias se 
ha desarrollado para reducir la tensión superficial del 
crudo. Dentro de estas se encuentra incrementar la 
temperatura para reducir la viscosidad y de esta manera 
transportarlo. Sin embargo la cantidad de energía 
aplicada para para mantener la temperatura a través de 
largas distancias aumenta considerablemente los costos 
del proceso haciendo de esta una alternativa poco 
viable [6]. Otra alternativa utilizada es la emulsificación 
del crudo por medio de surfactantes estabilizadas en 
una fase continua de agua [6]. Esta técnica es 
ampliamente utilizada a pesar de los altos recursos 
destinados al estudio del surfactante adecuado. La 
escogencia de este depende de las propiedades de la 
emulsión como lo son la estabilidad y propiedades 
reológicas que están fuertemente influenciadas por la 
temperatura, el tamaño de gota y su distribución y 
producción de una fase monodispersa para su adecuado 
manejo [7]. Para la formación de dichas emulsiones se 
hace uso de máquinas de dispersión, molinos coloidales 
y homogeneizadores de alta presión por medio de la 
aplicación de altas tasas de esfuerzo para la formación 
de las gotas [6]. 
 
Dentro del concepto de formación de emulsiones, 
parámetros como la tensión interfacial y viscosidad se 
vuelven muy relevantes. Ambas propiedades están 
estrechamente ligadas a las fuerzas de interacción 
moleculares pero poseen conceptos diferentes. La 
viscosidad es una propiedad intrínseca al fluido que 
mide la trasferencia de momentum y resistencia de la 
sustancia a ser movida cuando se aplica un esfuerzo 
sobre ella. Por otro lado la tensión superficial e 
interfacial se remite a las fuerzas de interacción 
molecular con otro compuesto. No es propiamente una 
propiedad del fluido pero si es una propiedad que cubre 
la interacción entre 2 compuestos químicos cuando 
están en contacto [11]. De este modo cuando la tensión 
interfcial entre el crudo y el agua disminuye, la 
viscosidad disminuye. 
 
A pesar de los diferentes métodos para emulsificar el 
crudo, se posee problemas para desemulsificar la 
muestra una vez haya llegado a su destino. Por otro lado 
este tipo de surfactantes tienden a estar presentes en 
los ríos, mares y a obstruir tratamientos de aguas 
residuales por acumulando lodos. Esto hace que los 
surfactantes tengan un impacto sobre el medio 
ambiente principalmente sobre la calidad fisicoquímica 
e hidrobiológica de las aguas superficiales [5]. 
 
Debido a esto, nuevas alternativas el estudio e 
investigación se han desarrollado para reducir el 
porcentaje de contaminación de los mecanismos de 
visco reducción. Dentro de esta nueva línea de 
investigación se encuentran los biosurfactantes. Estos 
son de alto interés hoy en día ya que son compatibles 
con el medio ambiente y provienen de fuentes de 
materia prima renovables, no son tóxicos y son 
biodegradables [10]. A parte de esto, poseen una 
estructura única que les permite abarcar un mayor 
rango en las aplicaciones en la industria, poseen una alta 
selectividad y actividades específicas que les permite 
actuar en condiciones ambientales extremas como lo 
son altosy bajos pH y salinidad [10]. 
 
Los biosurfactantes son producidos en su gran mayoría 
por bacterias y se pueden clasificar de acuerdo a su 
estructura química y su origen microbiano [10]. Pueden 
ser moléculas anfifilicas estructuradas de polisacáridos 
y cadenas de ácidos grasos saturados e insaturados [10]. 
Debido a esta composición, las moléculas poseen 
propiedades de reducción de tensión superficial e 
interfacial entre líquidos y la formación de micelas y 
micro emulsiones entre dos fases diferentes [10]. Dichos 
biosurfactantes se pueden a su vez clasificar en 2 
grandes grupos, compuestos con bajo peso molecular 
como glicolipidos y compuestos con alto peso molecular 
conocido como bioemulsificantes que ayudan a 
estabilizar las emulsiones de manera más eficiente 
entre agua-crudo [10]. Gracias a estas propiedades, los 
biosurfactantes pueden ser aplicados a numerosas 
industrias tales como detergentes, productos y 
formulación farmacéutica, cosméticos, comida y a la 
industria petrolera. 
 
Dentro de los organismos más importantes que 
producen biosurfactantes se encuentra Escherichia coli 
(de ahora en adelante nombrada como E.coli) que posee 
una proteína transmembranal conocida como OmpA 
que contiene cadenas hidrofobicas e hidrofilidas que 
interactúan con el periplasma y el medio de la 
membrana (Amrita vishwa vivyapeetham University, 
2011) 
 
 
Ilustración 1. Modelo de la proteína transmembranal OmpA 
[7] 
Gracias a este estructuramiento y a sus propiedades, la 
proteína ofrece potencial para ser usada como 
biosurfactante en la industria petrolera. 
 
Por otro lado, la aplicación de la ingeniería genética a 
microorganismos es reciente pero con amplio campo de 
trabajo. Su principal objetivo consiste en mejorar por 
medio de técnicas genéticas proteínas ya existentes [9]. 
Para llevar a cabo estos procesos de manera asertiva, se 
tiene que conocer la secuencia de ADN del 
microorganismo, específicamente la sección que 
codifica para la proteína, la funcionalidad de esta y su 
estructura tridimensional [9]. 
 
En un estudio llamado “Protein engineering as a tool to 
improve the surfactant activity of OmpA protein from 
Escherichia coli” Dirigido por Andrés González y 
ejecutado por Vanessa Núñez se demostró que el uso de 
técnicas de ingeniería de proteínas como DNA-shuffling 
es eficiente para proporcionar clones de E.coli cuya 
alteración se encuentra en el fragmento que codifica 
para la proteína transmembranal OmpA. Como 
resultado 25 clones de esta bacteria fueron obtenidos 
de los cuales 2 mostraron propiedades surfactantes 
mayores a la proteína original. El objetivo del presente 
trabajo pretende estudiar los efectos que tienen las 
proteínas extraídas de los clones 6 y 12 de una librería 
de 25 clones en emulsiones crudo-agua con el 60% 
crudo, variando el porcentaje de proteína en cada una 
de las muestras con el fin de emulsificar el crudo y poder 
brindar nuevas alternativas en transporte de petróleo a 
lo largo de oleoductos. 
 
 
 2. Metodología 
 
En este procedimiento experimental se trabajan con 
E.coli K-12 W3110/pCA24N y los clones 6 y 12 obtenidos 
al realizar DNA-shuffling. La metodología seguida se 
realizó con el fin de obtener la proteína transmembranal 
OmpA y sus análogos clon 6 y clon 12 inducidas y no 
inducidas para construir un grupo de emulsiones con 
diferentes porcentajes de proteína manteniendo 
constante el porcentaje de crudo en cada una de las 
muestras. Esto permite evaluar la efectividad de las 
proteínas inducidas. Para desarrollar el proyecto, el 
procedimiento se dividió en 3 fases. Una primera etapa 
en donde se analiza el crecimiento bacteriano para 
determinar el punto óptimo de inducción de la proteína. 
La segunda etapa consta de la obtención de la proteína 
y su cuantificación en el equipo NanoDrop 
proporcionado por el equipo de laboratorio. Finalmente 
la tercera etapa consiste en producir las emulsiones y 
evaluar la viscosidad a diferentes tasas de cizalla (1 a 750 
S−1). 
 
 
 
2.1 Microrganismos y medio 
 
El primer paso del proceso experimental es determinar 
la tasa de crecimiento de las bacterias para poder 
inducir al microrganismo para la producción de la 
proteína OmpA. En primera instancia se dispuso la 
bacteria E.coli K-12 W3110/pCA24N OmpA en agar LB 
previamente auto clavado. El agar tiene una 
concentración de Nacl 10g/L, Agar 15 g/L, Extracto de 
levadura 5 g/L tryptona 10g/L. Adicionalmente, 
cloranfenicol fue adicionado como antibiótico hasta 
obtener una concentración de 50 µg/ml. El proceso 
mencionado anteriormente se realizó en una cabina de 
flujo laminar previamente esterilizada con solución 
esterilizante y expuesta a radiación Ultravioleta durante 
15 minutos. Se realizó una siembra del microorganismo 
en 3 cajas de Petri con el fin de obtener colonias 
aisladas. Estas cajas se incuban overnight a 32 °C para 
posteriormente tomar una colonia asilada e inocularla 
en 40 ml de medio LB líquido con cloranfenicol a una 
concentración de 50 µLg/ml previamente sometido a 
autoclave. El inoculo realizado se deja en un shaker 
durante 16 horas a 37 °C y 250 rpm. 
 
Por otra parte los clones 6 y 12 de E.coli fueron tomados 
de la librería de 25 clones obtenida a partir de proceso 
de DNA-Sfluffling a condiciones de refrigeración de -81 
°C. Cada uno de los clones se siembra en 2 cajas de Petri 
con medio LB previamente sometido a autoclave. A este 
medio se adiciona ampicilina como antibiótico a una 
concentración de 50 µg/ml. Las cajas de Petri se incuban 
a 32 °C overnight para posteriormente tomar una 
colonia y sembrarla en 40 ml de agar líquido LB. El 
inoculo se lleva a un agitador durante 16 horas a 37 °C y 
250 rpm 
 
2.2 Curva de crecimiento de E.coli en 
Erlenmeyer 
 
Del inoculo en el volumen de 40 ml se tomó una alícuota 
de 10 ml y se sembró en 400 ml de medio liquido LB con 
cloranfenicol a una concentración de 50 µLg/ml. Este 
medio LB de 400 mL fue sometido a autoclave 
previamente. Este inoculo se somete a condiciones de 
crecimiento de 250 rpm y 32 °C. Se tomaron mediciones 
de absorbancia a una longitud de onda de 600 nm el 
espectrofotómetro cada hora. Con los datos obtenidos 
se construyó la curva de crecimiento. 
 
 
2.3 Curva de crecimiento de los clones 
6 y 12 
 
Se realiza el mismo procedimiento del numeral 2.2 en 
400 ml de medio líquido LB con ampicilina como 
antibiótico. 
 
2.4 inducción con IPTG 
 
Para realizar la inducción se cultivó E.coli en 40 ml de 
medio líquido LB durante 16 horas a 37 °C y 250 rpm. 
Después de este tiempo se toma un inoculo de 5 ml y se 
cultiva en 400 ml de medio liquido LB a 37 °C y 250 rpm. 
La inducción se realiza con una solución de IPTG 
(isopropil-𝛽-D-1-tiogalactopiranosido) a 0.047 g/ml. 
Con las curvas de crecimiento previamente realizadas, 
se determinó que el mejor tiempo de inducción para 
OmpA cuando el 𝑂𝐷600 se encuentra 0.8 que equivale a 
200 minutos después de haber iniciado la incubación. El 
mismo procedimiento se realizó para los clones 6 y 12 
induciendo cuando el 𝑂𝐷600 se encuentra en 0.6 y 0.8 
respectivamente. Después del momento de la inducción 
se deja cada uno de los medios líquidos con E.coli, clon 
6 y clon 12 por un periodo de 5 horas en incubación a 
una temperatura de 37 °C y 250 rpm con el fin de 
finalizar la fase de crecimiento. 
 
 
2.5 Obtención de Proteína inducidas 
 
Después de cumplir las 5 horas en incubación, se 
deposita el contenido de cada uno de los Erlenmeyer en 
falcons con capacidad de 50 ml. Estos falcon se 
centrifugan a 4500 rpm durante 15 minutos. El 
sobrenadante se descarta y el biomaterial obtenido en 
la parte inferior se almacena a -20 °C overnight. 
Posteriormente se utiliza 4 ml de una solución de 
sonicación (50 𝑚𝑀 𝑁𝑎2𝑃𝑂3, 300𝑚𝑀 𝑁𝑎𝐶𝑙, 0.01% 
Tween-20 y 1% Tripton-X100) por cada gramo de 
biomasa obtenido del proceso de centrifugación 
mencionado anteriormente. Esta solución se lleva al 
sonicador de punta de Sonics & Material®en baño de 
hielo con el fin de lisar las bacterias. El material de este 
proceso es dispuesto en tubos eppendorf de 1 ml cada 
uno y llevados a un proceso de centrifugación a 13000 
rpm y 15°C durante 15 minutos. El sobrenadante 
resultante se almacena en tubos falcons de 15 ml cada 
uno y la parte inferior se descarta junto con los tubos 
eppendorf. 
 
 
 
 
2.6 Obtención de proteínas no 
inducidas 
 
Se replicó el procedimiento utilizado en el numeral 2.1. 
Después de realizar el inoculo en 400 ml de medio 
liquido LB para cada uno de los microorganismos (E.coli, 
clon 6 y clon 12) se deja en incubación durante 13 horas 
a 37 °C y 250 rpm. El contenido de cada uno de los 
Erlenmeyer se deposita en falcons de 50 ml y se sigue el 
procedimiento experimental mencionado en el numeral 
2.4. 
 
2.7 Cuantificación de proteína 
 
La cuantificación de la proteína obtenida se realizó por 
espectrofotometría a una longitud de onda De 𝑂𝐷280 
en el equipo NanoDrop. Para calibrar el equipo se tomó 
como blanco una alícuota de 2 𝜇𝑙 y a partir de este valor 
se midió con alícuotas del mismo volumen el contenido 
de cada uno de los sobrenadantes obtenidos del último 
proceso de centrifugación. El proceso se realizó en el 
software computación Poteins A280® proporcionado 
por el equipo de laboratorio. 
 
 
2.8 Preparación de emulsiones crudo-
agua 
 
Una vez cuantificada la proteína se prepararon 
emulsiones entre 15 y 30 gramos dependiendo de la 
disponibilidad de proteína obtenidas. Para cada uno de 
los microorganismos se realizaron emulsiones con 
porcentajes w/w de 0.8%, 0.7%, 0.6%,0.4% y 0.2% con 
60% de crudo y el porcentaje restante con agua 
destilada. Las muestras de crudo se depositaron en 
falcons de 50 ml cada uno junto con la fase acuosa que 
contiene la proteína requerida de acuerdo al porcentaje 
seleccionado. Debido a que el crudo con el que se 
trabajó posee una gravedad API de 13.6 es necesario 
utilizar una gran cantidad de energía para homogeneizar 
la emulsión. En este caso se utilizó un sonicador de 
punta de Sonics & Materials® variando la amplitud entre 
37% a 40% a lo largo de 40 ciclos 20sX40s. Una vez 
terminado el proceso se dejó reposar las muestras 
durante 1 hora para posteriormente medir su 
comportamiento reológico. 
 
 
2.9 Medición de propiedades 
reológicas 
 
Para medir la efectividad que tiene las emulsiones sobre 
la viscosidad, se realizan pruebas de esfuerzo a las 
muestras obtenidas. Este procedimiento se realiza por 
medio del reómetro ARG2 de TA Instruments® junto con 
el software computacional Rheology Advantage 
Instrument control AR. En este equipo se pretende 
realizar una prueba de flujo entre 2 planos paralelos 
distanciados 1100 𝜇𝑚 para la estabilización y 
estandarización del equipo y 1000 𝜇𝑚 para correr cada 
una de las pruebas. La geometría utilizada corresponde 
a un plato metálico “Steel plate” de 20 nm con cero 
grados de inclinación cuya calibración y medición del 
“cero” tiene un periodo de espera de 5 minutos cada vez 
que se inicializa una prueba. Finalmente el proceso de 
medición fue realizado por un Flow Step de 1 a 750 1/𝑠 
con escala logarítmica, 3 puntos por década y a una 
temperatura de 20 °C. Cada prueba tiene una duración 
de 10 minutos en donde se registra tasas de esfuerzo 
junto con la viscosidad de acuerdo a la velocidad de 
rotación de la geometría. 
 
3. Resultados y Análisis 
 
Las condiciones bajo las cuales se incubaron las 
bacterias fueron específicas debido a que el crecimiento 
está afectado tanto por factores físicos como 
nutricionales [9]. Para cada uno de los microorganismos 
el crecimiento se dio de manera variante. La ilustración 
2 muestra que para E.coli, luego de 200 minutos, este 
entra en fase estacionaria ya que los valores de 
absorbancia son cada vez menores y poco distanciados 
entre sí. A diferencia de la fase exponencial que tiene 
lugar entre los 60 y 200 minutos. Al cabo de 500 minutos 
se puede afirmar que el crecimiento de E.coli se 
estabiliza alcanzando un valor máximo de absorbancia 
de 1.83 a 600 nm. Para el clon 6 se puede observar que 
la fase exponencial empieza cerca del minuto 170 en 
donde la absorbancia es de 0.15 a 600 nm. Transcurridos 
los 400 minutos se comienza a estabilizar el crecimiento 
del clon 6 hasta llegar a un máximo pico de absorbancia 
de 0.807 haciendo de este el menor pico alcanzado 
entre los 3 microorganismos evaluados. Para el clon 12 
el crecimiento presenta un comportamiento acotado 
por el comportamiento de los microorganismos 
análogos (OmpA y clon 6). Este empieza a estabilizar su 
crecimiento trascurridos 300 minutos llegando a un 
máximo pico de absorbancia de 1.464 a 600 nm. 
 
 
 
Ilustración 2. Curvas de crecimiento de E.coli, clon 12 y clon 6. 
 
Con la información que proporciona la ilustración 2 se 
puede determinar el punto de inducción para la 
sobreexpresión de la proteína de cada uno de los 
microorganismos evaluados. Para E.coli se puede 
observar que el punto óptimo de inducción se da 
cuando la densidad óptica es de 1.5 a 600 nm debido a 
que en este punto, la bacteria sale de la fase 
exponencial y entra a la fase estacionaria de 
crecimiento. Es decir que la inducción se realiza 5 horas 
después de haber comenzado la incubación cuando el 
crecimiento empieza la etapa de estabilización. El 
mismo criterio de inducción fue utilizado para el clon 6 
y clon 12 dando como resultado que el punto óptimo 
corresponde cuando la densidad óptica es de 0.4 y 1.1 a 
600 nm respectivamente. 
 
Cuando se termina el proceso de inducción, se procede 
a dos procesos de centrifugación. El primero recupera la 
biomasa que se asienta en la parte inferior de los falcons 
que corresponde a los microrganismos. El segundo 
proceso de centrifugado tiene lugar después de la lisis 
celular en donde se recupera el sobrenadante donde 
están suspendidas las proteínas producidas. En este 
punto se mide la densidad de proteína para E.coli , clon 
6 y clon 12. 
 
Tabla 1. Densidad de proteína producida por E.coli, clon 6 y 
clon 12. 
 
 
 
 
En la tabla 1, se evidencia un incremento de 22 % en la 
concentración de OmpA inducido con respecto a la 
proteína no inducida. Sin embargo la cantidad de 
proteína obtenida es menor debido al volumen de la 
muestra. Del mismo modo se ve un incremento del 4% 
para el clon 6 también con un significativo aumento en 
la cantidad de proteína total. Finalmente el 
microorganismo que presentó un mayor aumento de la 
concentración de proteína es el clon 12 con un 34% por 
encima de su análogo sin inducir. El Aspecto de cada uno 
de estos productos corresponde a un líquido 
amarillento cuya principal característica es la facilidad 
para formar espuma lo cual se relaciona directamente 
con el comportamiento de los Surfactantes [5]. 
 
 
Tabla 2. Cantidad de Proteína agregada a cada una de las 
emulsiones estudiadas 
 
 
 
Posteriormente se procedió a emulsificar el crudo con 
las proteínas. Dentro del proceso experimental fue 
notoria una dificultad para emulsificar las muestras ya 
que no todas alcanzaron la fase de emulsificación que se 
pretendía. Es decir que a pesar de someter la muestra a 
energía ultrasónica, al finalizar los ciclos se podían ver 
fácilmente las 2 fases (agua y crudo). Para disminuir la 
tasa de falla, se incrementó la amplitud de trabajo de 
37% a 40% en el sonicador de punta de Sonics & 
Materials®. A lo largo del rango de esfuerzo (de 1 a 750 
1/s) el crudo emulsificado presenta comportamiento de 
un fluido pseudoplastico puesto que a medida que 
incrementa el esfuerzo, disminuye la viscosidad de 
fluido [10]. Sin embargo cuando se sometió a prueba 
una muestra compuesta en su totalidad de crudo, la 
viscosidad se mantiene en un valor de 20 Pa s hasta 
alcanzar una tasa de cizalla de 46.42 1/s en donde esta 
empieza a decrecer rápidamente hasta alcanzar un valor 
de 0.05 Pa s. El comportamiento presentado por el 
crudo pertenece a los plásticos de Benigham porque 
Microorganismo Volumenobtenido (ml) Concentración (mg/ml) mg de proteína
OmpA No inducida 7,5 71,57 572,56
OmpA Inducida 6,5 87,56 569,14
clon 6 No inducida 8 71,51 572,08
Clon 6 Inducida 8,5 74,76 635,46
Clon 12 No inducida 8 64,74 517,92
Clon 12 Inducida 7,5 87,28 654,6
porcentaje 0,8 0,7 0,6 0,4 0,2
OmpA 1,11 0,97 0,83 0,55 0,27
OmpA inducido 2,51 2,2 1,37 1,25 0,45
clon 6 1,98 1,73 1,49 0,99 0,49
clon 6 inducido 4,97 1,89 1,62 1,085 0,81
con 12 3,7 3,24 2,7 1,85 0,92
clon 12 inducido 2,74 2,4 2,06 1,16 0,68
Emulsiones ( ml de solucion con proteina suspendida) 
para movilizar el fluido es necesario alcanzar una tasa de 
cizalla específica para el fluido (46.42 1/s) [10]. 
 
 
 
 
Ilustración 3. Efecto de la proteína OmpA no inducida de 
E.coli en emulsiones 60% crudo 
En la ilustración 3 se ve que al preparar una muestra de 
crudo-agua al 60% de crudo (blanco) se evidencio que la 
viscosidad de la muestra decrece a partir de un esfuerzo 
de 13.65 1/s. Esto significa que se redujo en 30 % la 
energía inicial para la movilización del fluido. Para la 
proteína transmembranal OmpA sin inducir se observó 
una mejora del 50% en la viscosidad de la muestra 
cuando la composición de la proteína es de 0.6% en la 
emulsión, haciendo que la viscosidad llegue a valores 
cercanos a 1 Pa s cuando la tasa de esfuerzo es mínima 
(10 1/s). Por otro lado la efectividad obtenida por las 
emulsiones con concentración de proteína 0.2%, 0.4% y 
0.7% es desfavorable. Esto debido a que la viscosidad en 
cada una de las muestras respectivas aumento con 
respecto al blanco e incluso con respecto al crudo al 
100%. 
 
 
Ilustración 4. Efecto de la proteína transmembranal OmpA 
inducida de E.coli en emulsiones 60% crudo 
 
Al estudiar el efecto de la proteína transmembranal 
OmpA de E.coli inducida como se muestra en la 
ilustración 4, se muestra un efecto favorable sobre las 
mismas con respecto a los datos arrojados por la 
proteína sin inducir. En primer lugar las emulsiones con 
porcentaje 0.4%, 0.6%, 0.7% y 0.8% mostraron ser más 
efectivas en la reducción de la viscosidad. Las 
emulsiones con porcentaje 0.8% y 0.4% resaltan por 
lograr una reducción de viscosidad de 38% con respecto 
a la muestra de crudo 100% y 32% con respecto al 
blanco. Para emulsiones de 0.4% hay una mejora en la 
viscosidad ya que este valor disminuye 79.5% haciendo 
notable la inducción de la proteína con respecto a su 
análogo sin inducir. Para emulsiones 0.7% se evidencia 
una reducción en la viscosidad de 77% con respecto a la 
emulsión con proteína sin inducir. Finalmente se 
evidencia que para muestras con 0.8%, 0.7% y 0.4% de 
proteína se reduce la energía necesaria para movilizar el 
fluido en 95.3% con respecto a la energía requerida para 
una muestra 100% crudo. 
 
 
 
Ilustración 5. Efecto de la proteína transmembranal obtenida 
del clon 12 no inducido de E.coli en emulsiones 60% crudo 
Para el clon 12 se evidencia un efecto de reducción de 
viscosidad con respecto a la proteína original OmpA, tal 
como lo muestra la ilustración 5. Para emulsiones con 
porcentaje 0.2%, 0.7% y 0.8% hay una reducción de 
viscosidad de 67%, 65% y 82% respectivamente con 
respecto a la muestra 100% crudo. También es 
observable que estas muestras tienen 2% adicional más 
cuando se compara con el blanco.
 
Ilustración 6. Efecto de la proteína transmembranal obtenida 
del clon 12 inducido de E.coli en emulsiones 60% crudo 
Del mismo modo, como se observa en la ilustración 6, 
para el clon 12 inducido se puede apreciar una 
reducción en la viscosidad del 27%, 64%, 50% y 65% para 
emulsiones con porcentaje de proteína de 0.2%, 0.6%, 
0.7% y 0.8% respectivamente. A pesar de que los datos 
obtenidos por el clon 12 inducido son favorables con 
respecto al crudo y el blanco en la reducción de 
viscosidad, estos no mostraron tener tanta eficiencia 
como los datos obtenidos por el clon 12 sin inducir. Esto 
se evidencia en las emulsiones con composición de 
proteína de 0.2% ya que la muestra compuesta de 
biomasa no inducida presenta una efectividad mayor 
del 40% en comparación con la muestra inducida, 
tomando como referencia de comparación la muestra 
100% crudo. Para las emulsiones con porcentaje de 
proteína 0.8% y 0.7% se evidencia el mismo fenómeno 
ya que la emulsión con Biomasa no inducida tiene 17% 
mayor efectividad que la emulsión con biomasa 
inducida para el primer caso y 15% mayor efectividad 
para el segundo caso. 
 
 
 
 
Ilustración 7. Efecto de la proteína transmembranal obtenida 
del clon 6 no inducido de E.coli en emulsiones 60% crudo 
Para el clon 6 se evidencia en la ilustración 7 un 
comportamiento similar a los resultados obtenidos por 
la proteína OmpA original. Para este caso, la emulsión 
con porcentaje de proteína de 0.2% no presenta un 
resultado favorable en la reducción de la viscosidad. Sin 
embargo a tasa de cizalla superiores a 46.42 si presenta 
una disminución en la viscosidad con respecto al crudo. 
Para la emulsión con porcentaje de proteína 0.4% se ve 
in ligero aumento en la viscosidad. A pesar de esto a 
partir de tasas de cizalla mayores a 21.54 la viscosidad 
empieza a disminuir con respecto a la muestra de crudo. 
Para emulsiones 0.6% de biomasa se encontró que tiene 
un comportamiento similar al crudo para el rango de 
esfuerzo propuesto. El comportamiento que más 
eficiencia presento fue la emulsión son 0.7% de proteína 
que redujo la viscosidad en 64.7% con respecto al 
crudo. 
 
 
 
Ilustración 8. Efecto de la proteína transmembranal obtenida 
del clon 6 inducido de E.coli en emulsiones 60% crudo 
 
Finalmente el clon 6 inducido presenta uno de los 
mayores porcentajes de reducción de viscosidad como 
se ve en la ilustración 8. Esto es notorio en la emulsión 
al 0.4% de biomasa inducida donde la viscosidad se 
reduce en 95% con respecto al crudo. La energía 
necesaria para movilizar una emulsión de este tipo se ve 
optimizada a lo largo de rango de taza de cizalla 
propuesto. Por otro lado la emulsión con 0.8% de 
biomasa inducida presenta una reducción del 74% con 
respecto a la viscosidad arrojada por el crudo. Esto se 
debe a que en este caso en particular la 
homogeneización de la muestra no se dio en su 
totalidad. Es decir que parte de la fase acuosa no 
emulsificó de manera exitosa con la fase presente en el 
crudo dejando gotas visibles en el producto final de esta 
emulsión. 
 
 
Ilustración 9. Porcentaje de reducción de viscosidad en 
emulsiones 60% crudo 
En la Ilustración 9 se resaltan los mejores 
viscoreductores para cada uno de los microorganismos 
tanto inducidos como no inducidos. En esta se ve que el 
clon 6 y clon 12 son mejores candidatos que el 
productos original de la proteína transmembranal 
OmpA. La proteína producida por E.coli inducida y no 
inducida obtienen los porcentajes más pequeños de 
reducción de viscosidad. Sin embargo siguen teniendo 
un efecto positivo sobre las emulsiones preparadas. 
Como se puede ver, los clones 6 y 12 tienen un mayor 
efecto en la reducción de viscosidad sobre la proteína 
original OmpA. Este comportamiento se puede deber a 
parámetros moleculares intrínsecos de cada proteína. 
En el estudio Conducido por Andrés Gonzales (Protein 
engineering as a tool to improve the surfactant activity 
of OmpA protein from Escherichia coli) se demostró que 
el cálculo de la energía libre de Gibbs es un parámetro 
teórico para medir la capacidad biosurfactantes de las 
proteínas basado en el peso molecular. Sin embargo no 
toma en cuenta otros parámetros que afecten la 
migración de la proteína a la interface y la formación de 
micelas [7]. Por otro lado se sabe que los clones 6 y 12 
no son iónicos lo que les permite moverse de manera 
más rápida a la interface y competir con los asfáltenos 
que estabilizan la emulsión [7]. La proteína original 
presenta un comportamiento iónico lo que permite que 
interactúe con compuestos aromáticos que están 
presentes naturalmente en el crudo y de esta manera 
tener másdificultad para llegar a la interface [7]. 
 
4. Conclusiones 
 
A lo largo del proyecto se afianzaron temas como el 
comportamiento de microorganismos y su aplicación a 
diferentes industrias como la petrolera. A partir del 
estudio de las curvas de crecimiento realizadas, se pudo 
analizar el momento óptimo de inducción con IPTG para 
obtener la sobreexpresión de la proteína OmpA de 
E.coli. A partir de este punto se realizó el proceso de 
purificación y extracción de la proteína para poder 
realizar las emulsiones y someterlas a estudio. Se 
demostró que los 3 microorganismos utilizados reducen 
la viscosidad del crudo a diferentes concentraciones. Sin 
embargo estas no tienen un comportamiento 
inversamente proporcional, es decir que a medida que 
aumenta la concentración de biomasa no 
necesariamente decrece la viscosidad de las emulsiones 
preparadas. La causa de lo anterior pudo ser que en el 
sobrenadante recuperado de los proceso se encuentra 
biomaterial adicional a la proteína OmpA. De los casos 
de estudio analizados se encontró que la emulsión con 
biomasa inducida con porcentaje 0.4% perteneciente a 
clon 6 reduce en 95% la viscosidad con respecto al 
crudo, haciendo de este el microrganismo con mayor 
capacidad de reducción de todos los casos de estudio 
analizados. Esto corresponde a los resultados obtenidos 
en estudios anteriores donde se demostró que el clon 6 
tiene una capacidad mayor de reducir la tensión 
interfacial [7]. También es evidente que la emulsión 
prepara con clon 12 No inducido al 0.8 de biomaterial 
reduce en un 80% la viscosidad del crudo utilizado. Lo 
anterior permite afirmar que este tipo de emulsiones 
podría ser utilizado en el trasporte de crudo a lo largo 
de oleoductos con un margen de costos razonable ya 
que proviene de fuentes renovables y no presenta 
toxicidad para el medio ambiente ya que proviene de 
microorganismos. 
 
5. Recomendaciones y Trabajo futuro 
 
La principal barrera en el desarrollo del proyecto se dio 
en la emulsificación de las muestras. Al momento de 
realizar el proceso de ultrasonido las muestras 
respondían de manera variante sin seguir un patrón 
definido. A pesar de que se aplicó el máximo tope de 
energía permitida, en muchas ocasiones las muestras 
presentaban 2 fases distinguibles. Adicionalmente el 
uso del equipo aumentaba la temperatura de la muestra 
y debido a los extendidos periodos de exposición de la 
proteína a las condiciones ambientales, esta pudo 
perder actividad de la proteína en las emulsiones 
realizadas. Se propone realizar un protocolo de 
emulsificación de crudo con material biológico para 
asegurar la efectividad de la actuación de la proteína. 
Debido a que muchas de las pruebas realizadas, se 
perdió material biológico debido a los acontecimientos 
mencionados anteriormente, también es importante 
producir un segundo lote de proteína para evitar 
contratiempos en caso de que alguna muestra se dañe. 
 
Por otro lado, se propone realizar un proyecto de 
optimización para encontrar la concentración adecuada 
de proteína que reduzca la viscosidad del crudo 
estudiado. Una vez obtenido la proporción optima y el 
microorganismo adecuado, se propone evaluar 
diferentes concentraciones de crudo para del mismo 
modo encontrar el porcentaje máximo de crudo 
aceptado para alcanzar el punto óptimo de 
emulsificación de crudo. 
 
6. Referencias 
 
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