Produção de Bioplásticos a partir de E. coli

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Crecimiento y producción de bioplásticos a partir de 
Escherichia coli genéticamente modificada 
Paula Andrea Romero Valderrama 
Asesora: Johana Husserl Orjuela, PhD. 
 
Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de los Andes. 
Resumen 
Debido a las problemáticas asociadas a los plásticos de un solo uso (e.g. explotación de recursos 
no renovables y contaminación de ecosistemas), se han formulado alternativas que promuevan 
la producción de plásticos de fácil degradación. Estos pueden ser producidos naturalmente por 
Ralstonia eutropha, pero dado sus deficientes tasas de crecimiento se han buscado alternativas 
como la modificación genética de microorganismos como Escherichia coli. En este proyecto, 
se buscó comprobar que clones de E. coli modificadas previamente por medio del método 
CRISPR/Cas9-𝜆 Red y los genes asociados a la producción de PHA provenientes de Ralstonia 
eutropha H16, con la adición de un promotor (PaldA) inducido en presencia de ácido oleico, 
eran capaces de producir PHA. Para esto, se realizaron comprobaciones con tinción de gram y 
negro de sudán que indicaban presencia de un material polimérico en células que correspondían 
morfológicamente a E. coli. Debido a esto se realizó un proceso de extracción, donde se obtuvo 
una fina capa de polímero por E. coli. Es necesario comprobar en estudios futuros si el material 
resultante corresponde a PHA y llevar el proceso a una posible producción a gran escala por 
medio de prototipos de PTAR’s. 
Palabras claves: PHB, E. Coli, Ralstonia eutropha H16, Ácidos grasos volátiles
Introducción 
Hoy en día es común encontrar en el mercado una amplia variedad de plásticos de un solo uso. 
Estos suelen provenir de combustibles fósiles y no son considerados biodegradables, por lo cual 
suelen acumularse. En consecuencia, para 2010 se estima que entre 4 y 12 toneladas de residuos 
plásticos fueron desechados en los ecosistemas marinos (Geyer, R. , Jambeck, J. R., Law, K. L. 
(2017)), y de la misma manera se tienen afectaciones en las fuentes de agua dulce y en 
ecosistemas terrestres.Por lo expuesto previamente, surge como una alternativa la producción 
de bioplásticos, que, como lo indica Romero (2005) son menos contaminantes y su fabricación 
requiere menor gasto de recursos no renovables. 
En estudios previos se ha determinado que bacterias como Ralstonia eutropha (H16) (R. 
eutropha) son capaces de producir polihidroxibutirato (PHB) en medios con nutrientes 
limitados y exceso de carbono (Steinbüchel, A. Schubert, P. Timm, A & Pries, A. (1990)). Si 
bien estos representan una ventaja ambiental en comparación de los plásticos derivados del 
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pretroleo, su uso es limitado debido a sus altos costos de producción (Nikel, P. I, Galvagno, M. 
A, Pettinari, M. J, & Méndez, B. S. (2005)). 
Se han investigado mecanismos para poducir estas sustancias de forma más eficientes 
mediante el uso de microorganismos. R. Eutropha, por ejemplo, contiene un operon productor 
de PHB que contiene las enzimas 3-cetotiolasa (PhaA), acetoacetil-CoA reductasa dependiente 
de NADPH (PhaB), y PHA sintasa (PhaC) que son utilizadas para la producción del 
biopolímero PHB (Hiroe, A, Tsuge, T, Tsuge, K, Itaya, M, & Nomura, C. T. (2012)). Sin 
embargo, R. Eutropha tiene un crecimiento muy lento y por esto en una investigación pasada 
se intentó generar el biopolímero a partir de microorganismos modificados (E coli), luego de 
incluir los genes asociados a estas enzimas en su genoma (Zúñiga, T. (2018)). Los 
microorganismos modificados contienen el fragmento PaldA-phaBCA-tetR, que permiten la 
producción de PHB. Ya que la modificaión es en el genoma, se elimina la necesidad del uso de 
antibióticos que son necesarios al usar plásmidos (Zuñiga, T (2018) & Galeano, L. (2019)). 
 
Adicionalmente a la capacidad de producir PHB, el fragmento PaldA-phaBCA-tetR 
contiene un promotor Aldehído deshidrogenasa A (PaldA) que es indicido en presencia de ácido 
oléico. Esto permite la producción de PHB en clones de E. coli cultivados medio LB con ácido 
oleico como inductor. Como lo mencionan Han, M.J., Lee, J. W., Lee, S. Y., & Yoo, J. S. (2008), 
este promotor ha sido efectivo en las observaciones realizadas en la presencia de estos ácidos 
para modificaciones en E. coli. Tanto el ácido oleico como los ácidos grasos volátiles (AGV’s) 
se suelen “encontrar en los mismos efluentes residuales, tales como aguas residuales urbanas y 
aguas residuales de la industria de alimentos” (Zúñiga, T. (2018)), lo que lleva a una potencial 
utilización de estos clones para la producción de bioplásticos utilizando aguas residuales como 
sustrato. 
 
Metodología 
Se tomaron los clones construidos previamente (Zuñiga, T (2018) & Galeano, L. (2019)) que se 
encontraban almacenados en a -81°C. Se usaron tres clones distintos que se encontraban 
disponibles en la librería. Simultáneamente se tomó también una muestra de R. eutropha, esto 
con el fin de obtener un control positivo de la producción de PHB. Los tres clones y R. eutropha 
fueron cultivados en caldo LB. Los tres clones de E.Coli fueron cultivados en incubadora a 
37°C por 24 horas, mientras que R. eutropha fue cultivada a 30°C por 3 días. Tras el crecimiento, 
se realizó una siembra y posterior cultivo en Agar LB. Como control negativo se utilizó E.Coli 
no modificada genéticamente. 
Con el fin de que los clones de E. coli produjeran el biopolímero, estos fueron sembrados 
en medio LB con aceite de oliva como fuente de ácido oleico con una concentración de 5g/L. 
Para inducir la producción en R. eutropha, se sembró el microorganismo en medio LB al 15% 
de concentración, agregando ácido butírico en una proporción de 1:20 con el fin de tener las 
condiciones favorables para la producción de polímero. Se realizó tinsión de gram para verificar 
la pureza de las células de E. Coli y R. Eutropha. 
Para verificar la producción de PHB en los cultivos, se realizó una tinción con Negro 
de Sudán, ya que este es capaz de mezclarse con los lípidos celulares y teñirlos (Corrales 
Ramírez, L. C., & Caycedo Lozano, L. (2020)). Para maximizar la cantidad de biomasa para el 
proceso de extracción, se generaron nuevos cultivos de los tres clones de E. coli y del control 
positivo R. Eutropha. Los clones de E coli se crecieron en un volumen de 15 mL de caldo LB 
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con ácido oléico (5g/L) a 150 rpm y 30°C por 24 horas. R. eutropha se agregó nuevamente se 
creció en caldo LB al 15% y ácido butírico a 150 rpm y 30°C por 3 días. 
 
Posterior al crecimiento, las muestras fueron centrifugadas a 7200 g por 30 minutos, se 
removió el sobrenadante se llevó el pellet a ultracongelación. La biomasa seca del pellet de las 
muestras de E. coli y R. eutropha se obtuvo mediante liofilización por 48 horas. Para la 
extracción del polímero, se agregó a cada pellet una solución de 50% de cloroformo y 50% de 
hipoclorito de sodio al 7% (v/v). Esta solución se mantuvo en agitación a 150 rpm por 1 hora y 
15 minutos a 30°C, y posterior a esto se centrifugaron las muestras a 10000g por 15 minutos. 
 
La solución centrifugada se dispuso en embudos de decantación, en estas se tuvo la 
separación en tres fases que correspondían al hipoclorito de sodio junto con los compuestos 
inorgánicos, el material celular y el cloroformo que contenía disuelto el polímero; esto se 
muestra en la Figura 3. Posterior a esto se vertió la parte inferior, correspondiente al cloroformo 
con el bioplástico disuelto de cada una de las muestras a un beaker y se añadió metanol a 4°C 
en una proporción de 10:1 con el cloroformo obtenido. Estas mezclas se dejaron reposar por 20 
horas a una temperatura de 4°C, posterior a esto se evaporo la solución a temperatura ambiente 
en una cabina de extracción. 
 
Resultados 
En la Figura 2 se encuentran los resultados obtenidos de la tinción de gram para los tres clones. 
Se puede observar que para dos de los clones correspondena bacilos gram negativos; sin 
embargo, el clon p-10 muestra cocos, por lo cual se descartó este clon. En los clones p-1b y p-
9 se asume que no hay contaminación de otros microorganismos. 
 
Figura 1. Fase inorgánica, material celular y fase 
orgánica obtenida. 
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Figura 2. Tinciones de gram 
En el caso de la tinción con Negro de Sudan, como se muestra en la Figura 3, se obtuvieron 
resultados positivos para la producción de polímeros en el clon p-9, que resultaban similares a 
los obtenidos con el control positivo; y simultáneamente no eran semejantes a lo que se observó 
en el control negativo. El clon p1b también mostro la producción de biopolímeero, aunque en 
menor grado. Debido a esto, se realizó el proceso de extracción de los polímeros almacenados 
en las células de E. coli y R. eutropha. Esta extracción se hizo con base en lo planteado por 
Jaramillo (2017) y modificada por Merlo (2018). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Como resultado la extracción con solventes, se pudo observar una delgada capa de color 
blanco (Figura 4), que corresponde al polímero resultante de la extracción. 
a. Tinción gram clon p-1b b. Tinción gram clon p-9 c. Tinción gram clon p-10 
b. Clon p-9 a. Clon p-1b 
c. Control negativo d. Control positivo 
Figura 3. Tinciones de Negro de Sudán 
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Figura 4. Capa de material polimérico en el proceso de evaporación 
Sin embargo, al tener todo el cloroformo y metanol evaporado se encontró que se tenía 
una capa muy delgada de material de color blanquecino en el fondo de los beakers. Dado a que 
estos eran una capa muy fina no fue posible retirarla como una lámina compacta, sino que por 
el contrario se raspo con una espátula el fondo de los recipientes para obtener el polímero y se 
almaceno a -20°C (Figura 5), para realizar un análisis del material y determinar si este 
corresponde a las características del PHB deseado. 
 
Cabe resaltar que al momento de retirar la capa que contenía el material obtenido del 
clon p-1b no fue posible obtener el material de la base, asimismo se hace énfasis en que se 
realizaron dos cultivos de R. eutropha de los cuales se pudo extraer el material polimérico. 
a. R. eutropha [1] b. R. eutropha [2] 
 
c. Clon E. coli p-10 
 
d. Clon E. coli p-9 
 
Figura 5. Material polimérico obtenido 
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Los resultados del proceso de extracción fueron consistentes con las observaciones de la 
proueba de negro sudán, en donde la mayor producción de phb se logró en el clon p-9. La 
producción de PHB en este clon, se etima que fue incluso mayor que en R. Eutropha (de forma 
cualitativa). 
 
Conclusiones 
Según los procedimientos realizados, se pudo determinar que los clones de E. coli, 
especialmente el clon p-9, son capaces de producir un material que se cree corresponde a PHB. 
Esto se indicó en un primer momento debido a que, mediante la tinción de negro sudan se pudo 
observar la presencia de lípidos al interior de las células correspondientes a los clones de E. coli 
modificado. Asimismo, tanto en los resultados de las tinciones, como en los resultados de la 
extracción se evidenciaron resultados similares con el control positivo (R. eutropha). 
Como paso a seguir se recomienda hacer una evaluación del tipo de material que fue 
obtenido en la extracción. Una vez sea confirmado que se trata de un PHB, se puede plantear 
un modelo de reactor que use como sustrato una mezcla que simule las condiciones esperadas 
en una PTAR y evaluar así la producción en masa de este polímero. 
 
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