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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
Capacidad antagonista de Enterococcus faecium 
aislados de un queso mexicano contra patógenos 
de interés en alimentos. 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
PRESENTA 
 ANA LUCÍA RÍOS FUERTE 
CIUDAD UNIVERSITARIA, CD.MX., 2018 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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 - 1 - 
 
JURADO	ASIGNADO:	
	
PRESIDENTE:	 	 Profesor:	CARMEN	ADRIANA	MENDOZA	RODRIGUEZ	
	
VOCAL:		 	 Profesor:	GLORIA	DIAZ	RUIZ	
	
SECRETARIO:		 Profesor:	MARICARMEN	QUIRASCO	BARUCH	
	
1er.		SUPLENTE:		 Profesor:	FRANCISCO	RUIZ	TERAN	
	
2°	SUPLENTE:		 Profesor:	ELSI	IDELI	JUAREZ	ARROYO	
 
 
SITIO	DONDE	SE	DESARROLLÓ	EL	TEMA:	
DEPARTAMENTO	DE	ALIMENTOS	Y	BIOTECNOLOGÍA,	 EDIFICIO	E,	 LABORATORIO	312.	
FACULTAD	DE	QUÍMICA,	UNAM.	
	
SE	 RECONOCE	 LA	 BECA	 RECIBIDA	 POR	 EL	 PROYECTO	 DGAPA	 PAPIIT	 IN222717:	
“ESTUDIO	 Y	 APLICACIONES	 DE	 LAS	 PROTEÍNAS	 Y	 PÉPTIDOS	 OBTENIDAS	 DEL	
METAGENOMA	 Y	 BACTERIAS	 DE	 QUESOS	 TRADICIONALES	 MEXICANOS”.	 ESTE	
PROYECTO	 FUE	 FINANCIADO	 POR	 EL	 PROYECTO	 DGAPA	 PAPIIT	 IN222717	 Y	 POR	 EL		
PROGRAMA	DE	APOYO	A	LA	INVESTIGACIÓN	Y	EL	POSGRADO	PAIP-FQ	CON	LA	CLAVE	
5000-9102.	
 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 DRA MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
 
 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
 M EN C. CINDY ADRIANA ESTRADA HERNÁNDEZ 
 
 
 
SUSTENTANTE : 
 ANA LUCÍA RÍOS FUERTE 
 
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Capacidad antagonista de Enterococcus faecium 
aislados de un queso mexicano contra patógenos de 
interés en alimentos. 
 
Índice 
 
1. Resumen ............................................................................................................. 1 
2. Introducción. ....................................................................................................... 3 
3. Marco teórico......................................................................................................3 
3.1. Bacterias ácido lácticas. ............................................................................. 3 
3.2. Compuestos antimicrobianos de origen proteínico.....................................5 
3.2.1 Bacteriocinas ............................................................................................. 5 
3.2.2. Peptidoglucano hidrolasas (PGHs). ........................................................ 7 
3.2.3. Importancia de compuestos antibacterianos de origen proteínico para 
la inocuidad en alimentos. ............................................................................... 10 
3.3. Generalidades de Enterococcus spp ....................................................... 11 
3.3.1. Presencia de Enterococcus en alimentos ............................................ 11 
3.3.2 Controversia del género Enterococcus ................................................. 13 
3.4. Semipurificación de proteínas. .................................................................... 13 
3.4.1. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE).............................................................................................................15 
3.4.2. Zimogramas. ........................................................................................... 15 
4. Antecedentes. ................................................................................................... 17 
4.1. Queso bola de Ocosingo .............................................................................. 17 
4.1.1. Bacterias ácido lácticas aisladas del queso Bola de Ocosingo ........ 19 
5. Justificación. .................................................................................................... 19 
6. Hipótesis. .......................................................................................................... 19 
7. Objetivos ........................................................................................................... 20
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7.1. General ........................................................................................................... 20 
7.2. Particulares .................................................................................................... 20 
8. Metodología experimental. .............................................................................. 21 
8.1 Diagrama General ........................................................................................... 21 
8.2. Reactivación de las cepas ............................................................................ 22 
8.3. Cinéticas de crecimiento .............................................................................. 22 
8.4. Obtención del extracto crudo. ..................................................................... 22 
8.5. Liofilizado del extracto crudo....................................................................... 23 
8.6. Precipitación con ácido tricloro acético (TCA). ......................................... 23 
8.7. Precipitación con (NH4)2SO4 al 60 % y 80 %. .............................................. 23 
8.8. Precipitación con (NH4)2SO4 y TCA. ............................................................. 24 
8.9. Adsorción- Desorción. .................................................................................. 24 
8.10 Determinación de proteína .......................................................................... 24 
8.11. Difusión en agar .......................................................................................... 25 
8.12.Electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) .. 26 
8.13. Tinción de plata. .......................................................................................... 27 
8.14. Zimogramas ................................................................................................. 28 
9. Resultados y discusión. .................................................................................. 29 
9.1. Caracterización de las cepas. ...................................................................... 29 
10. Conclusiones. ................................................................................................. 52 
11. Perspectivas ................................................................................................... 52 
12. Bibliografía ...................................................................................................... 53 
13.Anexos. ............................................................................................................ 62 
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1. Resumen 
 
Entre los quesos genuinos mexicanos se encuentra el queso Bola de Ocosingo. 
Es un producto fabricado de manera artesanal caracterizado por el empleo de 
leche bronca y ausencia de cultivo iniciador. Por esta razón, es importante conocer 
la microbiota que forma parte de éste, ya que tiene relevancia en la inocuidad y las 
características propias del producto. En una amplia variedad de alimentos 
fermentados existe un grupo predominante de bacterias llamadas ácido lácticas 
(BAL). Son diversos los géneros que pertenecena este grupo y como 
consecuencia de su metabolismo, son capaces de producir compuestos 
extracelulares con capacidad antimicrobiana que van desde ácidos orgánicos 
hasta los que son de carácter proteínico como las bacteriocinas y peptidoglucano 
hidrolasas (PGHs). 
En el grupo de trabajo se aislaron 5 cepas (2, 3, 6, 9a y 10) identificadas como 
Enterococcus faecium (E. faecium) de muestras de queso Bola de Ocosingo. 
Dentro de las BAL, Enterococcus es un género que no es generalmente 
reconocido como seguro (GRAS) porque existen cepas patógenas de origen 
nosocomial. Sin embargo, se estableció que las cepas de este estudio no 
pertenecen al complejo clonal 17 (CC17) que está asociado a cepas que causan 
infecciones en pacientes hospitalizados (Urrieta, 2018). 
El objetivo de este trabajo fue determinar si las cepas de E. faecium, aisladas de 
queso Bola de Ocosingo, tienen la capacidad de producir compuestos 
antimicrobianos de origen proteínico (bacteriocinas y/o PGHs) que actúen contra 
Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Escherichia coli, Staphylococcus 
aureus y cepas de enterococos de origen nosocomial, con lo cual se conocería 
como contribuyen estas cepas en la inocuidad del alimento fermentado en estudio. 
Se realizaron cinéticas de crecimiento para la determinación del tiempo en el que 
las cepas alcanzan su fase logarítmica tardía y la fase estacionaria temprana. Se 
observó en las pruebas presuntivas por difusión en agar, que las muestras 
liofilizadas concentradas hasta 20x provenientes de la fase logarítmica tardía de 
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crecimiento ejercían una actividad antibacteriana contra S. enterica y E. faecalis 
YLV. 
Posteriormente se realizaron perfiles electroforéticos y zimografías contra los 
microorganismos indicadores, las cepas de origen nosocomial y Micrococcus 
lysodeikticus para la detección de actividad lítica, donde el mejor método de 
concentración y semipurificación fue el precipitado con sulfato de amonio al 80 % 
p/v. 
Se identificaron bandas con actividad en los zimogramas contra los 4 
microorganismos indicadores y una cepa de Enterococcus faecalis de aislado 
clínico, a las cuales se les asignaron pesos moleculares aproximados que van de 
los 23 kDa hasta los 78 kDa y, considerando su peso molecular, se propone que 
podrían ser PGHs. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. Introducción 
La fermentación es una de las técnicas ancestrales más usadas para conservar, 
producir o transformar alimentos y bebidas. Esta práctica consiste en la 
modificación de la estructura de diferentes materias primas alimenticias mediante 
la acción de diversos microorganismos que, a través de su actividad metabólica, 
traen como consecuencia modificaciones en el alimento relacionadas con su 
sabor, olor, textura o color (Wacher, 2014). 
Los consumidores de productos lácteos tradicionales fermentados han 
incrementado su ingesta debido a la calidad, su diversidad gastronómica y los 
efectos positivos de éstos en la salud humana. Los quesos fermentados 
producidos de manera artesanal exhiben, en general, una mayor intensidad de 
perfiles de sabores y olores que los elaborados industrialmente, así mismo, las 
propiedades sensoriales típicas de estos quesos son el resultado de la diversidad 
de especies y microbiota regional (Terzić-Vidojević et al., 2015). 
Los microorganismos de un alimento fermentado constituyen una microbiota 
compleja, sin embargo, gracias a técnicas moleculares y de aislamiento, se han 
logrado identificar géneros de bacterias predominantes en este tipo de alimentos, 
dentro de las cuales se pueden encontrar las bacterias ácido lácticas. 
3. Marco teórico 
3.1. Bacterias ácido lácticas 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) se han utilizado desde la antigüedad debido a 
su capacidad de producir y conservar alimentos, además son habitantes del tracto 
gastrointestinal de humanos y animales (Gonçalves de Almeida et al., 2015). 
Constituyen un grupo diverso de bacterias que se encuentran ampliamente 
distribuidas en la naturaleza. Son bacilos o cocos Gram positivo, no esporulados, 
catalasa negativo, anaerobios facultativos que producen ácido láctico como 
producto mayoritario de la fermentación de carbohidratos. De acuerdo con la vía 
metabólica que se utilice para catabolizar los azúcares, pueden ser 
homofermentativas o heterofermentativas. Las bacterias homofermentativas 
metabolizan la glucosa en ácido láctico a través de la vía de Embden-Meyerhof. 
En la vía heterofermentativa, se forman cantidades de ácido láctico y otros 
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productos como acetato, etanol y CO2; además por esta vía se producen 
metabolitos que intensifican el sabor y aroma como el diacetilo, es por esto, que 
en la industria alimentaria se prefiere utilizar géneros de BAL que sean 
heterofermentativas (Carr et al., 2002). 
Los principales géneros que comprenden el grupo de las BAL son: Aerococcus, 
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Weisella, Lactococcus, 
Tetragenococcus, Vagococcus y Enterococcus (Salminen et al., 2004). 
Algunas características para que las BAL puedan ser aplicadas en la industria 
alimentaria se enlistan a continuación (Mazzoli et al., 2014): 
1.- A excepción de algunas cepas de Enterococcus, las BAL deben ser 
consideradas como “Generalmente reconocido como seguro” (GRAS). 
2.- Son organismos que se adaptan a condiciones industriales de estrés, muestran 
una tolerancia alta a pHs ácidos y poseen un intervalo de temperatura de 
crecimiento amplio, desde los 20 a 45 ºC (dependiendo del género y cepa). 
3.- Son capaces de metabolizar numerosos monosacáridos (como hexosas y 
pentosas) y disacáridos. 
4.- Naturalmente, las BAL producen muchos metabolitos con aplicación en 
sistemas alimenticios e industrias de otra índole, como moléculas 
antimicrobianas, aromas y sabores (acetaldehído), suplementos alimenticios 
(vitaminas), agentes texturizantes (exopolisacáridos), edulcorantes (manitol). 
 
Para su multiplicación, requieren de azúcares como la glucosa y lactosa, además 
de aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento, por eso la leche es un 
medio adecuado que satisface la proliferación de las BAL. 
Sin embargo, estos microorganismos son también utilizados como cultivos 
iniciadores para la fermentación de vegetales como pepinillos o aceitunas; en 
productos cárnicos (principalmente embutidos); además de derivados lácteos tales 
como el yogurt, mantequilla y quesos (Ramírez et al., 2011). 
Las BAL son importantes en la manufactura y maduración de los quesos porque, 
ya sean nativas o incorporadas en la leche de proceso, tienen varias funciones en 
la elaboración de estos (Villegas De Gante et al., 2016): 
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v Ayudan a madurar la leche antes de la adición del cuajo, lo que implica una 
ligera acidificación en algunas variedades de queso trayendo como 
consecuencia una disminución en el tiempo de gelificación. 
v A través de la fermentación láctica ayudan a descalcificar la red 
tridimensional caseínica, lo cual afecta la textura del producto final. 
v El ácido láctico generado durante la fermentación contribuye en la selección 
de la microbiota de la pasta (sobre todo en los quesos de leche cruda); si el 
pH disminuye hasta 4.5 es difícil que la microbiota patógena pueda 
multiplicarse, lo cual es favorable para la inocuidad del producto. 
v La actividad lipolítica y proteólica tiene influencia en la formación de 
compuestos de aroma y sabor típicos de variedades de quesos madurados, 
como lo son los ácidos grasos libres y transformaciones enzimáticas de 
algunos aminoácidos produciendo amoniaco, ácidos orgánicos (ácido 
acético, ácido propiónico, ácido isobutírico) y dióxido de carbono. 
v Pueden producir componentes de origen proteínico que inhiben el 
crecimiento de otros microorganismos, como las bacteriocinas o 
peptidoglucano hidrolasas (PGHs) (Parra, 2010; Salminen et al.,2014). 
 
3.2. Compuestos antimicrobianos de origen proteínico 
3.2.1. Bacteriocinas 
Las bacteriocinas son péptidos antibacterianos sintetizados ribosomalmente, de 
bajo peso molecular, en general, menores a 10 kDa, secretadas por diversas 
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, capaces de inhibir el crecimiento de 
otros miembros de la misma especie productora (bajo espectro) o miembros de 
distintos géneros bacterianos (de amplio espectro). Se caracterizan por ser 
estables en intervalos amplios de pH y al calor (Olvera- García et al., 2015; Cotter 
et al., 2017). 
La producción de bacteriocinas ocurre de forma natural durante la fase logarítmica 
del desarrollo bacteriano o al final de la misma, guardando relación directa con la 
producción de biomasa (Beristain-Bauza et al., 2012). 
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Además, hay un continuo interés en el estudio de las bacteriocinas producidas por 
las BAL, y algunos autores sugieren una clasificación independiente de otro tipo 
de proteínas antimicrobianas. 
Las bacteriocinas se dividen en cuatro clases (Cotter et al., 2017; Ahmad et al., 
2017). 
v Clase I: incluye a los lantibióticos, que son pequeños péptidos de entre 19 y 
38 aminoácidos de longitud (con un peso molecular menor a 5 kDa) que 
contiene residuos de lantionina, β-metil-lantionina o aminoácidos 
deshidratados, los que son producto de modificaciones postraduccionales. 
Pueden actuar de dos formas: se pueden enlazar al lípido II que es el 
principal transportador de subunidades de peptidoglucano del citoplasma a 
la pared celular, lo que trae como consecuencia una incorrecta síntesis de 
la pared y por ende la muerte. Además, pueden utilizar al lípido II como una 
molécula de acoplamiento para anclarse e insertarse en la membrana 
celular y formar poros, lo que lleva a la bacteria a una muerte rápida. 
v Clase II: son péptidos con un peso molecular menor a 10 kDa, de 30 a 60 
aminoácidos de longitud, carentes de lantionina, termoestables. Su 
mecanismo de acción consiste en inducir la permeabilización de la 
membrana y por lo tanto la salida de moléculas del interior de las bacterias. 
v Clase III (Bacteriolisinas): Termolábiles, de alto peso molecular (>30 kDa) y 
actúan mediante lisis de la pared celular. 
v Clase IV ( bacteriocinas complejas) : Éstas contienen restos lipídicos o de 
carbohidratos necesarios para su actividad, cuyo mecanismo de acción no 
ha sido descrito aún. 
 
En la Figura 1 se observa el mecanismo de acción de 3 clases de bacteriocinas. 
 
 
 
 
 
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La nisina es un ejemplo de una bacteriocina de clase I, la cual es producida por 
algunas cepas de Lactococcus lactis y actualmente es la única bacteriocina 
aprobada por la FDA como GRAS y que se usa como aditivo en productos 
enlatados y quesos fermentados para inhibir el crecimiento de Clostridium 
botulinum y en procesos de pasteurización para inhibir a Listeria monocytogenes 
(Parente et al., 2017; Beristain-Bauza et al., 2012). 
3.2.2. Peptidoglucano hidrolasas (PGHs) 
La pared celular bacteriana contiene una capa de peptidoglucano (heteropolímero 
de azúcares y aminoácidos) que rodea la membrana citoplasmática, proporciona 
fuerza y rigidez, y es la estructura responsable de mantener la forma de la célula 
en la mayoría de las bacterias (Frirdich y Gaynor, 2013). 
En las bacterias Gram-positivas, la pared celular contiene una capa gruesa de 
peptidoglucano la cual forma múltiples capas y representa una conformación 
tridimensional que da origen a una pared celular muy fuerte y rígida. Además se 
Figura 1. Modo de acción de las bacteriocinas de clase I, II y bacteriolisinas 
(adaptado de Cotter et al., 2005) 
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asocian a otros compuestos como ácidos teicóicos y lipoteicóicos y/o 
polisacáridos. En cambio, el peptidoglucano de la pared celular de las Gram-
negativas constituye una sola capa delgada, la cual se rodea por una segunda 
membrana lipídica exterior que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas 
(Richards, 2017). 
 
Las peptidoglucano hidrolasas (PGHs) son un grupo heterogéneo de enzimas que 
se involucran en un gran número de funciones que requiere el peptidoglucano, si 
bien éstas son comúnmente asociadas con la destrucción de la pared celular. 
Estas enzimas tienen una función biológica en diferentes etapas del desarrollo 
bacteriano como: el crecimiento, división celular, en la regulación del crecimiento 
de la pared celular, separación de las células hijas durante la división y autolisis, 
entre otras. Para las bacterias patógenas, las PGHs juegan un papel importante 
en la adhesión y en el desarrollo de la respuesta inflamatoria (Lortal y Chapot-
Chartier, 2005; Eckert et al., 2006; Vollmer et al., 2008b). 
 
Las PGHs se han clasificado en glucosaminidasas, amidasas, muramidasas y 
endopeptidasas de acuerdo con el tipo de enlace que son capaces de romper en 
el peptidoglucano (Lortal y Chapot-Chartier et al., 2005). Tienen pesos 
moleculares que pueden ir desde los 27 kDa hasta los 137 kDa. (Götz et al., 
2014). En la Figura 2 se explican los sitios de acción de las PGHs (Gly: Glicina, 
L/D-Ala: Alanina, L/D-Lys: Lisina, m-DAP: ácido meso-diaminopimélico, D-Glu: 
ácido D-glutámico). 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Las N-acetilmuramoil-L-alanina amidasas rompen el enlace amida entre ácido N-
acetilmurámico y la L-alanina (L-Ala) del péptido. Las peptidasas son capaces 
de hidrolizar el último aminoácido del extremo carboxilo de los péptidos 
(carboxipeptidasas), o de romper completamente los puentes formados por los 
péptidos (endopeptidasas). Las N-acetilglucosaminidasas y las N-
acetilmuramidasas hidrolizan los enlaces β-1,4 de la cadena de glicanos (Gly-Gly) 
(Olvera- Gacía et al., 2015). 
Algunas PGHs han sido utilizadas como agentes antibacterianos, por ejemplo, la 
lisostafina es una endopeptidasa que hidroliza enlaces específicos de la pared 
celular de S. aureus y tiene aplicaciones terapéuticas para tratar infecciones 
causadas por este microorganismo (Kumar, 2008). 
 
Figura 2. Representación esquemática de los sitios de acción de las PGHs en la pared celular de 
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. 
Ácido N-acetilmuramico (MurNAC) contorno amarillo y N-acetylglucosamina (GlcNAc) contorno rojo, 
conectados por enlaces glicosídicos β-1,4. (Tomado y adaptado de Oliveira et al., 2012). 
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3.2.3. Importancia de compuestos antibacterianos de origen proteínico para 
la inocuidad en alimentos 
 
La contaminación de alimentos por bacterias patógenas como Listeria 
monocytogenes (L. monocytogenes), Salmonella, Campylobacter, Clostridium, 
Escherichia coli (E. coli), Staphylococcus aureus (S. aureus), entre otras, 
presentan un desafío importante para la industria alimentaria y los sistemas de 
cuidado de la salud a escala global, causan enfermedades transmitidas por los 
alimentos y la muerte, además de conllevar una elevada carga económica. 
Por estas razones, se necesitan con urgencia métodos innovadores para la 
detección y control de microorganismos patógenos en los alimentos. En particular, 
las enzimas con actividad lítica proveen de herramientas casi ideales para el 
desarrollo de dichos métodos (Schmelcher y Loessner, 2016). 
Un antimicrobiano debe tener un método de acción específico, no debe cambiar 
las características organolépticas ni las propiedades de textura del producto 
alimenticio, además, debe ser una sustancia inocua para el consumo humano. Las 
PGHs y bacteriocinas se postulan a ser unos buenos candidatos para el control de 
crecimiento de patógenos (Oliviera et al., 2012). Sin embargo, para la aplicación 
de estos compuestos en el control de enfermedades transmitidas por alimentos, se 
debe considerar un análisis de su estabilidad en la matriz alimenticia, condiciones 
fisicoquímicas en las que se aplican, inversión en su producción y deben de ser 
permitidos como un productode control biológico por agencias internacionales 
reguladoras de alimentos, además de ser aceptados por el consumidor final. 
La adición directa de las PGHs y/o bacteriocinas purificadas a alimentos 
constituyen una posible estrategia para el control de enfermedades transmitidas 
por patógenos, además de representar una alternativa eficiente para alargar la 
vida de anaquel. Actualmente se ha demostrado que, en alimentos fermentados 
como carne, leche y sus derivados, enlatados, pescados, entre otros, existen 
microorganismos dentro de su microbiota que sintetizan estos compuestos de 
carácter proteínico, lo que contribuye potencialmente en la biopreservación de 
estas matrices alimentarias (De la Fuente et al., 2010). 
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3.3. Generalidades de Enterococcus spp. 
Son cocos Gram positivo, catalasa negativo, anaerobios facultativos, producen 
ácido láctico a partir de hexosas por homofermentación, y, heterofermentativos 
para las pentosas (Salminen et al., 2004). Además, se diferencian de otras BAL 
por su facultad de crecer en un intervalo de temperatura de 10 a 45 °C, con 6.5 % 
p/v de NaCl, en presencia de 40 % p/v de sales biliares y en un rango de pH entre 
4.4 a 9.6. Están asociados con una variedad de hábitats tales como suelo, plantas, 
agua, tracto gastrointestinal de humanos y animales, incluyendo a aves, insectos y 
reptiles. También están asociados con alimentos; muy probablemente como 
resultado de la contaminación de fuentes vegetales o animales y se ha 
demostrado que funcionan como indicadores de higiene en el procesamiento 
industrial de alimentos. Asimismo, se han encontrado en numerosos alimentos 
fermentados (Lauková, 2012; Franz et al., 2003, Giraffa 2014). 
 
3.3.1. Presencia de Enterococcus en alimentos 
Éste género de bacterias forman parte de la microbiota de un gran número de 
alimentos, especialmente los de origen animal, como la leche, derivados lácteos, 
carnes y embutidos. Su resistencia a la pasteurización lenta (63 ºC/30 minutos) y 
su adaptabilidad para crecer en condiciones adversas (pH, temperatura, NaCl), los 
habilitan para colonizar alimentos crudos, procesados y tratados térmicamente. 
Los enterococos también pueden desarrollarse durante la fermentación de 
alimentos, y ciertas cepas son deseables por su contribución al desarrollo de 
sabor y aromas durante la maduración de quesos, por ejemplo. Además se 
encuentran en una gran variedad de productos cárnicos fermentados, como 
algunos tipos de salami italiano, y salchichas crudas alemanas (con variantes 
nacionales y regionales). También se han aislado cepas de enterococos en 
productos fermentados de origen vegetal como la aceituna verde estilo español y 
de mariscos crudos (Giraffa 2002; 2014). 
Algunas de las especies de Enterococcus aisladas de alimentos son E. faecalis, E 
faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. mundtii , E. durans, entre otras. 
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Estudios en la microbiota de quesos tradicionales elaborados con leche bronca de 
oveja, cabra y vaca en países del Mediterráneo, indican que los enterococos 
juegan un papel muy importante en la maduración de éstos, probablemente por 
proteólisis, lipólisis, y por descomposición del citrato contribuyen a los sabores y 
compuestos aromáticos volátiles característicos de dichos quesos, además de 
aportar texturas y acelerar la maduración (Foulquié et al., 2006). 
La presencia de enterococos en quesos tradicionales puede ser deseable, ya que 
muchos estudios indican que cepas de este género pueden tener una influencia 
positiva en la producción y maduración de algunos quesos como: Manchego, 
Armada, Cebreiro, Picante, Feta, Mozzarella, Caprino, entre otros (Giraffa, 2003). 
Además, el género Enterococcus, al pertenecer al grupo de las BAL, ha sido 
particularmente estudiado debido a su potencial biotecnológico; ejemplo de éste 
es su comportamiento como probiótico y su capacidad de producir péptidos con 
actividad antimicrobiana como bacteriocinas y/o peptidoglucano hidrolasas (Olvera 
et al., 2018). 
Se han caracterizado peptidoglucano hidrolasas de algunas especies del género 
Enterococcus, por ejemplo: se han identificado dos hidrolasas autolíticas en 
Enterococcus hirae, la muramidasa-1, que es una N-acetilmuramidasa con una 
forma activa de 87 kDa (Dolinger et al., 1988), y la muramidasa-2, que tiene dos 
formas activas, una de 125 kDa y otra de 75 kDa (Dolinger et al.,1989). 
En 2018, Serrano y colaboradores clonaron y expresaron en Escherichia coli una 
nueva PGH con actividad N-acetilglucosaminidasa (AtlD), producida por una cepa 
de E. faecalis aislada de Queso Cotija, logrando caracterizarla bioquímicamente. 
Su peso molecular es de 62-75 kDa, con un punto isoeléctrico de 4.8, temperatura 
y pH óptimo de 50 ºC y 6-7 respectivamente; además, mostró actividad 
antibacterial contra L. monocytogenes, Staphylococcus aureus y cepas 
enterococales de origen clínico. 
También se han identificado bacteriocinas con actividad sobre L. monocytogenes, 
como las enterocinas A y B secretadas por cepas de E. faecalis (Berstain-Bauza, 
et al., 2012). 
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El género Enterococcus es el más controvertido de las BAL, ya que este grupo de 
bacterias no son consideradas como GRAS. 
 
3.3.2 Controversia del género Enterococcus 
Los enterococos son importantes para la maduración y el desarrollo del aroma de 
ciertos quesos y embutidos tradicionales, especialmente aquellos producidos en el 
área mediterránea; también se usan como probióticos humanos. Sin embargo, son 
importantes patógenos nosocomiales que causan bacteriemia, endocarditis y otras 
infecciones, y se ha demostrado que algunas cepas son resistentes a diferentes 
antibióticos o son capaces de adquirir resistencia (Franz et al., 2011). Ésta 
dualidad aumenta la preocupación sobre su uso como probióticos o como cultivos 
iniciadores en la industria alimentaria. Las diferencias entre un enterococo 
patógeno y una cepa aparentemente segura para su uso en alimentos no son 
claras. Ya está establecido que la taxonomía molecular de los enterococos no es 
suficiente para distinguir entre estos dos tipos de cepas, no obstante, análisis de 
genómica comparativa sugieren que las cepas enterococales provenientes de 
alimentos pertenecen a grupos clonales diferentes a las cepas nosocomiales. Es 
claro que unos pocos genes no son suficientes para determinar el nicho de una 
cepa de enterococos, sin embargo, estos pueden representar una herramienta 
efectiva como biomarcadores para diferenciar entre cepas patógenas de las que 
no lo son (Olvera 2013; Olvera et al., 2018). 
 
3.4. Semipurificación de proteínas 
Mucho de lo que conocemos sobre la función individual de proteínas proviene de 
estudios de proteínas aisladas de muestras heterogéneas. Se puede argumentar 
que no todas las proteínas actúan de la misma manera en su entorno nativo, pero, 
al menos estudiarlas de forma purificada y aislada, proporciona un punto de 
partida detallado (Grant, 2016). 
Hay varios aspectos que deben considerarse para seleccionar un método para 
purificar una proteína, por ejemplo, para qué se usará, cuáles son sus 
 - 14 - 
características (tamaño, carga, solubilidad), la cantidad que se requiere purificar, 
etc. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas. 
En el análisis de proteínas microbianas, se parte de un extracto crudo, que 
requiere concentrarse partiendo de la localización de la o las proteínas (intra o 
extracelulares) en cultivos celulares. Para eliminar contaminantes, se centrifugan 
las muestras y se separan por gravedad los componentes del extracto basándose 
en su densidad; en el caso de que las proteínas sean extracelulares, como es el 
caso de las PGHs y bacteriocinas, se desechan las células. 
Obtenido este extracto, se somete a tratamientos para la separación de proteínas 
en fracciones, uno de los métodos más utilizados es la precipitación. Para que unaproteína precipite se debe modificar el ambiente que la rodea y existen varias 
estrategias para lograr tal fin: cambio de pH, incremento en la temperatura, adición 
de disolventes, de moléculas cargadas, etcétera (Sánchez, 2013). 
Algunos métodos para la precipitación de proteínas se describen a continuación 
(Quesada, 2007): 
v Precipitación con sulfato de amonio [(NH4)2SO4]: Se basa en la baja 
solubilidad que tienen las proteínas en disoluciones salinas concentradas. 
La acción de la sal es liberar el agua unida a la proteína por puentes de 
hidrógeno, lo cual provoca su precipitación. 
v Precipitación por adición de aniones o cationes: Si una proteína se 
encuentra en una solución a un pH por debajo de su punto isoeléctrico, 
tiene carga positiva y reacciona con aniones de ácidos; entonces si se le 
agrega alguno como el tricloroacético (TCA), reacciona con la proteína y el 
producto es insoluble en la solución y precipita. 
v Adsorción-desorción: Este método se ha utilizado para la semipurificación 
de bacteriocinas, y, se fundamenta en una propiedad de las bacteriocinas 
para adsorberse a la membrana celular bacteriana a un pH de 5. Después 
se debe disminuir el pH a 2 para facilitar la desorción y liberación del 
compuesto de interés de la membrana celular de la bacteria hacia el medio. 
Finalmente, la preparación se concentra por evaporación del disolvente 
(Álvarez-Cisneros et al., 2010; Lugo 2013). 
 - 15 - 
3.4.1. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 
 
Una técnica para visualizar las proteínas es la electroforesis. Ésta puede usarse 
para separar y comparar una mezcla compleja de proteínas, evaluar la pureza de 
una proteína durante el proceso de purificación y permite conocer algunos valores 
aproximados de las características fisicoquímicas de las proteínas, como el 
tamaño. 
En condiciones nativas, la migración diferencial de las proteínas dependerá tanto 
de la carga como del tamaño, así como la estructura de la proteína, pero cuando 
se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el 
dodecil-sulfato de sodio (SDS por sus siglas en inglés), se pierde la estructura 
terciaria y cuaternaria de las proteínas, se uniforman sus cargas, por lo que la 
migración sólo depende de su peso molecular. La electroforesis de proteínas se 
realiza (generalmente) en geles formados por el polímero entrecruzado 
poliacrilamida (PAGE Polyacrilamide Gel Electrophoresis, por sus siglas en 
inglés). Después, las proteínas se visualizan añadiendo un colorante como el azul 
de Coomassie que se fija a las proteínas, pero no al gel (Nelson y Cox, 2006; 
Sánchez 2013). Con este colorante se pueden visualizar de 0.1 a 0.5 μg de 
proteína. 
Sin embargo, la tinción con plata es más sensible que el azul de Coomassie. El 
fundamento de la tinción con plata se basa en la reducción de plata desde un 
estado iónico a un estado metálico. En la práctica, la tinción con plata permite 
detectar cantidades más pequeñas de proteína (varía entre 2 a 5 ng) y así verificar 
fácilmente la pureza de la muestra (Kavran y Leahy, 2014). 
 
3.4.2. Zimogramas 
Los métodos zimográficos se basan en la separación de enzimas por 
electroforesis en gel de poliacrilamida seguida de un paso de renaturalización; al 
recobrar su estructura funcional, la actividad de la enzima se detecta por su efecto 
sobre el sustrato que se ha embebido, esparcido o sobrepuesto en el gel (García-
Cano et al., 2015). 
 - 16 - 
Este método permite una detección simultánea de la actividad enzimática y una 
estimación del peso molecular, además de que posee una elevada sensibilidad. 
(Hardt et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 17 - 
4. Antecedentes 
4.1. Queso bola de Ocosingo 
En México se elabora una gran cantidad de quesos genuinos (artesanales) 
distribuidos en diversas regiones a lo largo del país. Entre éstos se encuentra el 
queso Bola de Ocosingo, que es elaborado a partir de un proceso artesanal cuya 
calidad y características están ligadas al origen: Ocosingo, que es el municipio 
más grande de Chiapas. Se cree que está inspirado originalmente en el queso 
holandés Edam (González-Córdova et al., 2016). 
Se compone de una bola de queso doble crema forrada con dos capas de queso 
elaboradas de leche descremada hasta el punto de “quesillo”; el forrado se realiza 
después de 21 días de maduración a temperatura ambiente tropical (López et al., 
2015). La leche con la que se elabora el Queso Bola proviene exclusivamente del 
ganado de la región, cruza de cebú y pardo suiza. Se presenta como una bola 
dura con un diámetro de 8 a 12 cm y un peso de entre 400 g y 1 kg (Figura 4). 
Como rasgos sensoriales característicos de éste queso destacan el aroma y sabor 
ácido, además de que la pasta es moldeada y desmoronable con un sabor amargo 
residual (Villegas de Gante et al., 2016). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Queso bola de Ocosingo, Chiapas. 
(González-Córdova et al., 2016) 
 - 18 - 
El proceso de elaboración de forma general es el siguiente (Cervantes et al., 
2014): 
Recepción y colado: La leche cruda se recibe por la mañana y se cuela en un 
lienzo de algodón. 
Cuajado y reposado: Previamente a la adición del cuajo, se agrega un poco de 
crema, con la intención de que el producto final sea un queso doble crema, si no 
es el propósito, no se adiciona crema y el resultado será un queso crema 
simplemente. Se agrega una dosis de cuajo líquido (quimosina) y se deja reposar 
la leche durante 24 horas aproximadamente, a temperatura ambiente del lugar de 
producción. 
Levantado o manteado: Al siguiente día, se coloca la cuajada con un pequeño 
recipiente en una bolsa o manta de algodón. 
Escurrido y salado: Se incorpora sal fina a la cuajada y se deja escurrir unas 
horas. Pasadas 20 o 24 horas de escurrido, se sala nuevamente la cuajada y se 
cambia la manta de algodón. 
Madurado de la pasta: La masa se deja reposar para que “madure” y se cambia la 
manta cada tercer día. Durante cada cambio de manta, la pasta se amasa. Se 
debe madurar según lo declaran las reglas de uso de la marca colectiva territorial, 
propiedad de los queseros organizados, al menos 21 días al ambiente. 
Moldeado: Se forman porciones de 400 g o más con las manos, se compactan y 
se les imparte una forma casi esférica. Finalmente, las piezas se forran con dos 
capas sucesivas de cuajada hilada y caliente, elaborada con leche descremada. 
Este material rico en caseína, al enfriarse y orearse se endurece y funciona como 
empaque protector. 
Finalmente, el consumo de este queso va desde el núcleo, ya sea untado, tajado o 
desmenuzado, como la corteza, tras calentarla, asarla o freírla. 
Un análisis proximal de una muestra del núcleo del Queso Bola de Ocosingo 
(Villegas de Gante et al., 2016), arrojó los siguientes resultados: 47.85 % 
humedad, 37.37 % de grasa, 28.81 % de proteínas, 2.17 % de cenizas y 4 % de 
sal. 
 
 - 19 - 
4.1.1. Bacterias ácido lácticas aisladas del queso Bola de Ocosingo 
En 2016, un grupo de alumnos de la Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas 
lograron aislar dos géneros de BAL presentes en el queso de Bola, Lactobacillus 
fermentum y Enterococcus faecium, las cuales se identificaron mediante la 
secuenciación del gen ADNr 16S (Grajales et al., 2016). 
Urrieta, en 2018, evaluó mediante un método de tipificación molecular (MLST) si 
las cepas de Enterococcus faecium tenían relación con otras cepas de éste mismo 
género aisladas de alimentos o con cepas pertenecientes al complejo clonal de 
alto riesgo 17 (CC17), asociado a aislados de origen nosocomial. Determinó que 
las cepas formaban parte de aislados agrícolas y de alimentos, y que debido a la 
ausencia de factores de virulencia y baja resistencia adquirida a los antibióticos 
éstas no representan un riesgo para la salud de los consumidoresde queso bola 
de Ocosingo. 
 
5. Justificación. 
Se han reportado compuestos de origen proteínico secretados por enterococos en 
matrices alimenticias similares (quesos) que poseen actividad antibacteriana frente 
a bacterias patógenas que evidencian la importancia de este género en la 
inocuidad de los alimentos. 
El propósito de este trabajo es determinar si las 5 cepas aisladas de E. faecium 
son capaces de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas de interés en 
alimentos (L. monocytogenes, S. aureus, E. coli y S. enterica) y además de actuar 
contra cepas de su mismo género obtenidas de aislados clínicos para así evaluar 
su capacidad antagónica. 
 
6. Hipótesis. 
A través de la capacidad de producción de compuestos antimicrobianos de 
naturaleza proteínica, Enterococcus faecium aislado del queso Bola de Ocosingo 
contribuirá a la inocuidad microbiológica del queso elaborado con leche no 
pasteurizada. 
 
 - 20 - 
7. Objetivos 
 7.1. General 
Determinar la actividad antimicrobiana de Enterococcus faecium aislada del queso 
bola de Ocosingo a causa de compuestos de naturaleza proteínica. 
 
 7.2. Particulares 
• Evaluar la actividad antimicrobiana extracelular en la fase de crecimiento 
exponencial tardía y la estacionaria temprana. 
• Evaluar métodos de concentración de proteínas y péptidos extracelulares 
para obtener la mayor cantidad de actividad antimicrobiana a través de 
ensayos semicuantitativos, particularmente contra bacterias patógenas 
como: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, 
Salmonella enterica, Enterococcus faecium y E. faecalis de origen 
nosocomial. 
• Por medio de geles de SDS-PAGE y zimogramas, establecer el peso 
molecular de las proteínas con actividad bacteriolítica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 21 - 
 
8. Metodología experimental 
 8.1 Diagrama General 
 La metodología experimental se muestra de manera resumida en la Figura 5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Reactivación y verificación de 
cepas puras 
Enterococcus faecium aislados 
del queso Bola de Ocosingo, 
Chiapas 
Cinéticas de 
crecimiento 
Fermentación para obtención de 
compuestos extracelulares 
Centrifugar 
Extracto crudo 
Precipitación con 
TCA 
Liofilizado 
Pruebas de difusión en 
agar Perfil electroforético 
Precipitación con 
(NH4)2SO4 (60 y 80%) 
Adsorción- Desorción 
Zimogramas 
Neutralizar 
Filtrar 
Precipitación 
con TCA y 
(NH4)2SO4 
Figura 5. Diagrama de metodología experimental. 
 - 22 - 
 
8.2. Reactivación de las cepas 
Se trabajó con 5 cepas de Enterococcus faecium aisladas de queso bola de 
Ocosingo (2, 3, 6, 9a y 10) almacenadas en crioviales de 2 mL a -20 °C. 
Para la reactivación de las cepas se inocularon 100 µL de los crioviales en 3 mL 
de caldo Man, Rogosa y Sharpe (MRS; OXOID) estéril y se incubaron a 37 °C 
durante 12 h en una incubadora estática (Gravity Convection E-71); 
posteriormente se procedió a inocular 100 µL de cada cultivo en 9 mL de caldo 
MRS estéril, y fueron incubados durante 4 h a 37 °C. De este inóculo, se hicieron 
tinciones de Gram y se observaron al microscopio para verificar la pureza de los 
cultivos (cocos Gram +), además se les realizó la prueba de catalasa. Por último, 
se colocaron 900 µL del cultivo en crioviales con 900 µL de glicerol al 30 % (diluido 
con agua desionizada) como crioprotector y se almacenaron a -70 °C. 
8.3. Cinéticas de crecimiento 
Se preparó un preinóculo de las cepas reactivadas en 3 mL de caldo MRS estéril y 
se incubaron por 12 h a 37 °C. Posteriormente, a dos matraces Erlenmeyer con 50 
mL de caldo MRS se les adicionaron 50 µL del pre-inóculo y se tomaron alícuotas 
de 1 mL cada 30 min en un matraz desde el tiempo cero hasta las 12 h de 
crecimiento y el segundo matraz de las 12 a 24 h a 37 °C en incubación estática. A 
cada alícuota se le determinó el pH con un potenciómetro (34 pH Meter Beckman) 
y la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm con un espectofotómetro 
(BIOMATE 3). Al final se graficó el logaritmo natural (Ln) de la densidad para 
determinar las fases de crecimiento de cada cepa y el pH en función del tiempo. 
8.4. Obtención del extracto crudo. 
Se adicionaron 50 µL de un pre-inóculo a 50 mL de caldo MRS, se incubaron a 
37 °C por el tiempo necesario para que alcanzaran la fase logarítmica tardía y la 
fase estacionaria de crecimiento. Para la obtención de los compuestos 
extracelulares, cada una de las muestras se centrifugó a 8000 rpm durante 15 
minutos a 4 °C en una centrífuga (Biofuge Primo R). Se desecharon los botones 
celulares y los sobrenadantes obtenidos se neutralizaron a pH 7 con NaOH 50 % 
p/v con el fin de descartar que el efecto antibacteriano sea debido a la producción 
 - 23 - 
de ácidos orgánicos, H2O2, diacetilo, entre otros; posteriormente, se filtraron con 
una membrana de 0.22 µm (Millipore®). 
8.5. Liofilizado del extracto crudo 
Las muestras se congelaron a -70 °C y se liofilizaron en un equipo LABCONCO 
Freezer Dry System. El liofilizado se resuspendió en 1 mL de amortiguador de 
fosfatos 100 mM, pH 7. La veces que se concentraron las muestras fue de 20. 
8.6. Precipitación con ácido tricloro acético (TCA) 
A partir de 1.8 mL del extracto crudo se precipitaron las proteínas con TCA al 10 % 
v/v para lo cual se adicionaron 200 µL de TCA al 100 % p/v. Cada muestra se 
agitó a 150 rpm, 4 °C por 2 h. Posteriormente se centrifugaron las muestras a 
14000 rpm durante 15 min (Allegra X-30R Centrifuge Beckman Coulter; USA) y el 
sobrenadante se desechó. El precipitado obtenido se resuspendió en 1 mL de 
acetona al 90 % v/v para volver a ser centrifugado con las mismas condiciones, 
por lo menos dos veces más, esto con el fin de eliminar los restos de TCA en la 
muestra. Finalmente, se dejaron las muestras en campana de extracción para que 
el remanente de acetona se evaporara y se almacenaron a -20 °C. 
8.7. Precipitación con (NH4)2SO4 al 60 % y 80 % 
Se utilizaron 100 mL del extracto crudo y se llevó a cabo la precipitación de 
proteína con sulfato de amonio (NH4)2SO4 al 60 % p/v y al 80 % p/v de saturación. 
Se utilizó (NH4)2SO4 al 60 % como primera concentración de saturación. Sin 
embargo, se decidió probar hasta una concentración del 80 % en donde las 
proteínas del extracto continuaron precipitando. Para ello se adicionaron poco a 
poco 51.6 g de (NH4)2SO4 por cada 100 mL de extracto crudo, manteniendo en 
agitación y una temperatura de 4 °C. La suspensión se retiró de agitación y se 
centrifugó a 8000 rpm por 20 min a 4 °C; el sobrenadante se desechó y el 
precipitado que se formó fue resuspendido en 1 mL de amortiguador de fosfatos 
100mM, pH 7, hasta que se disolvió completamente. 
Posteriormente se realizó una diálisis para eliminar del exceso de (NH4)2SO4 en 
las muestras ya que pudiera intervenir con otras mediciones. Se utilizó una 
membrana para diálisis de tamaño de corte de 1 kDa contra agua destilada fría en 
agitación durante 18 h a 4 °C. 
 - 24 - 
Pasadas las 18 h, se retiraron las muestras de agitación y se almacenaron en 
microtubos de 1.5 mL a 4 °C hasta su uso. 
8.8. Precipitación con (NH4)2SO4 y TCA 
Las muestras que se precipitaron con (NH4)2SO4 al 80% se utilizaron para 
posterior precipitación con TCA al 10% como se describió anteriormente. El botón 
formado se resuspendió en 500 µL de amortiguador de fosfatos 100 mM pH 7. 
8.9. Adsorción- Desorción 
Se realizó una semipurificación y concentración de los compuestos extracelulares 
(recomendado para bacteriocinas) por medio de adsorción-desorción dependiente 
del pH, con algunas modificaciones en las condiciones (Dündar et al., 2014; 
Álvarez-Cisneros, 2011). 
A 150 mL de cultivo de cada una de las cepas de Enterococcus faecium se les 
aplicó esta metodología. Se utilizaron las fermentaciones en el punto de la fase 
logarítmica tardía. Fueron sometidas a un tratamientotérmico a 70°C por 30 
minutos, esto con el fin de inactivar proteasas que pudieran encontrarse en el 
medio (Katla et al., 2003). Posteriormente, se realizó la adsorción de los posibles 
compuestos antimicrobianos ajustando cada extracto crudo a un pH de 5 con 
NaOH 50 % p/v y se dejó en agitación a 150 rpm por 16 h a 4 °C. Pasado este 
tiempo, se centrifugaron las muestras a 8000 rpm por 15 min a 4 °C para obtener 
un precipitado y éste se lavó 2 veces con un amortiguador de fosfatos 5 mM pH 
6.5 y se centrifugó 2 veces más. Para la desorción, el precipitado se resuspendió 
al 5 % del volumen de fermentación (150 mL) en una solución de metanol al 30 % 
v/v acidificado a pH 1.5 con HCl concentrado y se dejó en agitación a 150 rpm 
durante 18 h a 4°C. 
Las muestras se centrifugaron a 8000 rpm por 15 min a 4°C, se recuperó el 
sobrenadante y se ajustó a pH 7 con NaOH 50 % p/v. Éste se llevó a un rotavapor 
a 65 °C por 15 minutos a 60 rpm para eliminar el metanol presente en las 
muestras. Finalmente las muestras se congelaron a -20 °C hasta su uso. 
8.10 Determinación de proteína 
En una microplaca de 96 pozos (COSTAR®) se colocaron 160 µL de cada una de 
las muestras diluidas en 10-1 o hasta 10-2 y se les adicionaron 40 µL del reactivo de 
 - 25 - 
Bradford (Bio-Rad), se homogeneizó la reacción y se dejó reposar por al menos 5 
minutos antes de tomar la lectura. La concentración de proteína se determinó a 
una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro para microplacas Epoch 
(Biotek). Los valores obtenidos se interpolaron con una curva patrón de albúmina 
sérica bovina (0-10 µg/mL). 
8.11. Difusión en agar 
Para la determinación del efecto antibacteriano se realizaron pruebas de difusión 
en agar con los extractos crudos, los que fueron liofilizados y los obtenidos por 
adsorción-desorción (estos últimos solo se probaron contra Listeria 
monocytogenes). Se utilizaron los siguientes microorganismos blanco de interés 
en alimentos: Escherichia coli DH5α, Staphylococcus aureus ATCC 6558, Listeria 
monocytogenes, Salmonella enterica Typhimurium ATCC 14028, así como 
enterococos de origen nosocomial: E. faecalis YLV, E. faecalis ATCC 29212, E. 
faecalis V583 y una cepa aislada de chorizo mexicano: E. faecium MXVK29 (todas 
cepas colección del laboratorio 312, Conjunto E, Facultad de Química. UNAM). 
En cajas Petri, se colocaron 20 mL de medio Infusión Cerebro Corazón (BHI, por 
sus siglas en inglés) con agar al 1 % p/v, una vez solidificadas, se les adicionó una 
sobrecapa de 10 mL del medio BHI con agar al 0.8 % p/v y con el microorganismo 
a probar. 
La preparación del medio BHI con agar al 0.8 % p/v con el microorganismo 
indicador fue de la siguiente manera: se realizó un preinóculo del que se tomaron 
50 µL y se depositaron en 3 mL de caldo BHI, se incubaron a 37°C durante 8 a 
12 h en una incubadora estática. A partir del preinóculo se hizo una dilución 1:100 
con solución salina isotónica estéril (SSI); de dicha dilución se tomaron 800 µL y 
se agregaron a 9.2 mL de medio BHI con agar al 0.8 % p/v. Con la parte superior 
de una punta para micropipeta P1000 estéril se hicieron los pozos sobre la doble 
capa de agar y en cada uno se agregaron 200 µL de las muestras del extracto 
crudo, del liofilizado y del extracto de adsorción desorción probado únicamente 
contra Listeria monocytogenes. Adicionalmente, se probó el caldo MRS sin 
inocular y sometido a los mismos tratamientos para descartar que la actividad 
 - 26 - 
inhibitoria se debiera al medio. Las cajas se incubaron a 37 °C de 12-18 h en una 
incubadora estática. 
Finalmente se midió el diámetro del halo de inhibición con ayuda de un vernier. 
Como controles positivos para la realización de difusión en agar contra los 
microorganismos de interés en alimentos se utilizaron Nisaplin® (100µg/mL) y 
Ampicilina (SIGMA) (100 µg/mL). 
Nisaplin®: Producto comercial cuyo compuesto activo es la nisina, una 
bacteriocina natural producida por Lactococcus lactis, con actividad frente a una 
gran cantidad de bacterias Gram (+) incluyendo a los géneros Listeria, Clostridium, 
Bacillus y las Bacterias Ácido Lácticas (BAL). Inhibe el desarrollo de células 
vegetativas (destrucción de membrana citoplasmática) o la germinación de 
esporas termorresistentes. 
Ampicilina: es un antibiótico beta-lactámico con actividad bactericida. Inhibe la 
síntesis de peptidoglucano (PuBChem, National Center for Biotechnology 
Information). 
Para los controles positivos de la metodología adsorción-desorción se utilizaron 
las cepas E. faecalis FAIR E-77( Belgian coordinated collections of 
microorganisms), productora de la enterocina AS-48 y la cepa E. faecium MXVK29 
(aislada de chorizo mexicano por el grupo de trabajo del Dr. M. Collins de Queen’s 
University of Belfast) productora de una enterocina de clase IIa. 
8.12. Electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) 
Se realizó la electroforesis en geles de SDS-Tris-Glicina al 12% p/v y SDS-Tris-
Tricina al 16 % p/v para obtener el perfil electroforético y su zimograma (que es 
una técnica electroforética que permite observar actividad de enzimas) para poder 
observar la actividad lítica de las proteínas contra el microorganismo indicador 
Micrococcus lysodeikticus. Además de este microorganismo, se realizaron geles 
con células de los microorganismos utilizados en la prueba de difusión en agar, 
con el fin de identificar las bandas de actividad lítica. 
Las muestras precipitadas con TCA se calentaron a ebullición durante 5 minutos 
junto con el amortiguador de carga (4x) que contiene un agente reductor (2- 
mercaptoetanol) que contribuye a la desnaturalización de las proteínas rompiendo 
 - 27 - 
los enlaces disulfuro de éstas. Las muestras se dejaron enfriar y finalmente se les 
adicionaron 30 µL del amortiguador de fosfatos 100 mM, pH 7. De esta última 
preparación se depositaron los volúmenes necesarios para que todas las cepas 
se estandarizaran en cantidad de proteína de 14 µg. 
Se llevó a cabo el procedimiento anterior con las muestras obtenidas del extracto 
crudo precipitado con (NH4)2SO4 al 60 y 80 %. De éstas se tomaron 50 µL y se 
mezclaron con el amortiguador de carga (4x), se llevaron a ebullición durante 5 
minutos y se dejaron enfriar. Finalmente se depositaron 45 µL en cada pozo. 
La electroforesis fue realizada en el equipo MiniPROTEAN®II (Electrophoresis 
Cell; BioRad) usando un marcador de peso molecular Precision Plus Protein® 
Standars (Bio-Rad) con las siguientes condiciones: 80 V durante 15 minutos y 
posteriormente a 120 V durante 90 minutos a 4 ºC para los geles de Tris-Glicina. 
Para los geles realizados con Tris-Tricina, las condiciones de electroforesis 
cambiaron a 80 V durante 6 h a temperatura de refrigeración (4 °C). 
Las proteínas se tiñeron con la metodología de tinción de plata. 
8.13. Tinción de plata 
1.- Se fijó el gel con una solución de etanol al 30 % v/v ácido acético al 10 % v/v 
toda la noche en agitación. 
2.- Se lavó 2 veces con etanol al 30 % v/v durante 30 minutos cada lavado. 
3.- Se lavó con agua desionizada durante 10 minutos 2 veces. 
4.-Se agregó solución de plata 0.1 % p/v y se dejó en agitación durante 30 
minutos. 
5.- Se lavó nuevamente con agua desionizada 40 segundos, 2 veces. 
6.- Se reveló el gel con una solución de carbonato de sodio/formaldehído (2.5 %/ 
37 % p/v) que se preparó al momento, en agitación y hasta la aparición de bandas. 
7.- Se enjuagó con agua de la llave 2 veces y se agregaron 50 mL de ácido 
acético al 10 % v/v para detener la reacción. 
 
 
 
 
 - 28 - 
8.14 Zimogramas 
Para la detección de la actividad lítica se emplearon zimogramas, geles SDS-
PAGE pero con células embebidas de diferentes microorganismos. Se utilizaron 
células liofilizadas (Sigma-Aldrich, USA) de Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 
y células (con una densidad óptica de 8 a 10) muertas por esterilización (121°Cpor 15 min) de los patógenos E. coli, S. aureus, Listeria monocytogenes, 
Salmonella enterica Tiphymurium y E. faecalis YLV. Dichos geles se corrieron a 
las mismas condiciones que los de electroforesis y, posteriormente, se incubaron a 
37 ºC a 50 rpm durante 18 h en una solución renaturalizante (Tris-HCl 100 mM pH 
8 y tritón al 1 % v/v) propiciando que las proteínas en el gel vuelvan a su 
plegamiento nativo y así poder observar si existe actividad lítica. Las tinciones de 
este gel se realizaron con una solución de azul de metileno (que contiene 
hidróxido de potasio al 0.01 % y azul de metileno al 0.1 %) durante 20 minutos y 
posteriormente se destiñeron con lavados constantes de agua destilada. 
Las imágenes se obtuvieron mediante el uso de un documentador de geles 
(GelDoc, Bio-Rad). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 29 - 
9. Resultados y discusión 
9.1. Caracterización de las cepas 
En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos durante la tinción de Gram 
realizadas a las 5 cepas de enterococos utilizadas para este trabajo. Todas las 
cepas presentaron morfología cocoide, agrupados en diplococos y tétradas, 
además de ser Gram positivas y catalasa negativas. Sin embargo, al observar al 
microscopio la cepa identificada como 9a presentaba morfologías diferentes en el 
campo de observación combinadas con cocos. 
Tabla 1. Características fenotípicas de las cepas de trabajo. 
 
La cepa 9a fue purificada con ayuda del agar Kanamicina Esculina Azida (KAA por 
sus siglas en inglés) que es selectivo por la presencia de un antibiótico y 
diferencial para el crecimiento del género Enterococcus. Se observaron colonias 
puntiformes con áreas negras alrededor de las mismas mostradas en la Figura 6, 
debido a la formación de compuestos fenólicos de hierro derivados de los 
productos de hidrólisis de la esculina y el Fe2+ (The OXOID Manual, 1990), con lo 
cual se considera que la cepa la conforman solo enterococos. De éste aislamiento 
se tomó una colonia para realizar nuevamente una tinción de Gram, posterior 
reactivación y conservación en criovial. 
 
 
 
 
Cepa/ Clave de 
identificación 
Gram Morfología Prueba de la 
catalasa 
2 (+) Cocos - 
3 (+) Cocos - 
6 (+) Cocos - 
9a (+) Cocos y bacilos 
largos 
- 
10 (+) Cocos - 
 - 30 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cinéticas de crecimiento. 
Se realizaron cinéticas de crecimiento de las 5 cepas de E. faecium purificadas 
con el propósito de determinar el tiempo en que los cultivos alcanzan las fases 
logarítmica tardía y estacionaria temprana, ya que se ha reportado previamente en 
otro queso tradicional artesanal madurado (Queso Cotija) que al obtener 
sobrenadantes de estas fases de crecimiento, los extractos presentan la máxima 
actividad antibacteriana (Delgado, 2013). 
Los parámetros medidos para la curva de crecimiento fueron la densidad óptica 
(D.O), ya que en una suspensión bacteriana, la cantidad de microorganismos está 
directamente relacionada (Ramírez et al., 2006) y la disminución del pH, 
relacionado con el metabolismo de los azúcares que llevan a cabo los 
enterococos. 
En el caso de las curvas de crecimiento microbiano se suelen aplicar logaritmos a 
los valores de D.O de los microorganismos en el cultivo. Esto permite que en la 
fase de crecimiento exponencial, la relación entre la densidad óptica y el tiempo 
sea lineal (Stanbury et al., 2017). 
Figura 6. Colonias de E. faecium cepa 9a aisladas en medio KAA. 
 - 31 - 
Las cinéticas de crecimiento se obtuvieron de acuerdo con la metodología antes 
descrita y se muestran los resultados del promedio y desviación estándar de dos 
réplicas en las Figuras 7, 8, 9, 10 y 11. En rojo se señalan los intervalos de tiempo 
de donde se extrajeron los sobrenadantes para cada una de las cepas de E. 
faecium, con flechas moradas y naranjas se resaltan las horas que se 
consideraron como el inicio de las fases logarítmica tardía y estacionaria 
temprana, respectivamente. 
 
 
 
 
 
0 5 10 15 20
4
4.5
5
5.5
6
6.5
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
pH
ln
 D
.O
 
60
0 
nm
Tiempo (h)
Figura 7. Cinética de crecimiento de cepa 2 de E. faecium aislada de queso Bola 
de Ocosingo en medio MRS / 37ºC . Se muestra el promedio y desviación estándar 
de dos réplicas. En rojo se señala el intervalo de tiempo de obtención de 
sobrenadantes. Flechas morada y naranja indican inicio de fases logarítmica tardía 
y estacionaria temprana. 
 - 32 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
0 5 10 15 20
4
4.5
5
5.5
6
6.5
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
pHLn
 D
.O
60
0 
nm
Tiempo (h)
0 5 10 15 20
4
4.5
5
5.5
6
6.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
pH
ln
 D
.O
 
60
0 
nm
Tiempo (h)
Figura 9. Cinética de crecimiento de cepa 6 de E. faecium faecium aislada de queso 
Bola de Ocosingo en medio MRS / 37ºC. Se muestra el promedio y desviación estándar 
de dos réplicas. En rojo se señala el intervalo de tiempo de obtención de 
sobrenadantes. Flechas morada y naranja indican inicio de fases logarítmica tardía y 
estacionaria temprana. 
Figura 8. Cinética de crecimiento de cepa 3 de E. faecium faecium aislada de queso 
Bola de Ocosingo en medio MRS / 37ºC. Se muestra el promedio y desviación estándar 
de dos réplicas. En rojo se señala el intervalo de tiempo de obtención de 
sobrenadantes. Flechas morada y naranja indican inicio de fases logarítmica tardía y 
estacionaria temprana. 
 
 - 33 - 
 
 
 
 
 
 
0 5 10 15 20
4
4.5
5
5.5
6
6.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
pH
ln
 D
.O
 
60
0 
nm
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
4
4.5
5
5.5
6
6.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
pH
ln
 D
.O
 
60
0 
nm
Tiempo (h)
Figura 11. Cinéticas de crecimiento de cepa10 de E. faecium faecium aislada de queso 
Bola de Ocosingo en medio MRS / 37ºC. Se muestra el promedio y desviación estándar de 
dos réplicas. En rojo se señala el intervalo de tiempo de obtención de sobrenadantes. 
Flechas morada y naranja indican inicio de fases logarítmica tardía y estacionaria 
temprana. 
 
Figura 10. Cinética de crecimiento de cepa 9a de E. faecium faecium aislada de queso 
Bola de Ocosingo en medio MRS / 37ºC. Se muestra el promedio y desviación estándar 
de dos réplicas. En rojo se señala el intervalo de tiempo de obtención de sobrenadantes. 
Flechas morada y naranja indican inicio de fases logarítmica tardía y estacionaria 
temprana. 
 
 - 34 - 
De acuerdo con la adaptación del inóculo de cada una de las cepas al medio de 
cultivo, se observa que las cinco cepas de E. faecium alcanzan la fase logarítmica 
tardía alrededor de las 10 y 11 h y la fase estacionaria temprana entre las 11 y 
12 h. A pesar de ser la misma especie y las mismas condiciones de incubación, 
cada una de las cepas mostró una cinética diferente, lo que explica la divergencia 
en biomasa final y la diferencia de pH entre ellas; no obstante, desde el inicio de la 
fermentación, se observa que en el tiempo cero la biomasa inicial es distinta, 
atribuyendo esto a que las cepas se encontraban en congelación, por lo que, al 
descongelarlas, éstas pueden ser dañadas celularmente provocando una pérdida 
de viabilidad (Sánchez y Corrales, 2005). 
Los enterococos al pertenecer a las BAL producen ácido láctico a lo largo de la 
curva de crecimiento, lo que explica el descenso del pH del medio de cultivo. Este 
descenso inicia con un valor de 6 al comienzo de la fermentación y alcanzan un 
valor promedio de 4.7 al final de ésta. Es probable que en conjunto con las cepas 
aisladas de Lactobacillus fermentum, E. faecium contribuya con el sabor ácido 
característico del queso Bola de Ocosingo, ya que ambos son capaces de crecer 
eficientemente a valores de pH de hasta 4 (valor aproximado de pH del queso 
Bola de Ocosingo), y se consideran heterofermentativos facultativos, lo que 
implica la producción de otros ácidos orgánicos a lo largo de la fermentación 
(Salminen et al., 2004). 
Una vez determinadas las horas en las quelas cepas de estudio alcanzaban las 
fases de crecimiento de interés, se obtuvieron los sobrenadantes y se 
concentraron para la determinación de proteína y posterior utilización en ensayos 
de difusión en agar. 
Determinación de proteína. 
Se midieron las concentraciones de proteína de los tratamientos aplicados al 
extracto crudo. Estas determinaciones fueron realizadas para el extracto crudo 
(sobrenadante libre de células) de las dos etapas de crecimiento antes 
mencionadas, así como para concentrar por liofilización, por precipitación con 
(NH4)2SO4 y TCA, y la combinación de éstos. 
 
 - 35 - 
La concentración de proteína se muestra en la Tabla 2. 
 
Tabla 2. Concentración de proteína de los extractos crudos de las 5 cepas de E. 
faecium sometidas a los diferentes tratamientos (µg/mL). 
 
Tratamiento 
 
 
Cepa 
Extracto 
crudo fase 
logarítmica 
tardía 
(µg/mL) 
Extracto 
crudo fase 
estacionaria 
temprana 
(µg/mL) 
Extracto 
crudo 
liofilizado 
fase 
logarítmica 
tardía 
(µg/mL) 
Extracto 
crudo 
liofilizado 
fase 
estacionaria 
temprana 
(µg/mL) 
Precipitado 
con TCA 10 
% (µg/mL) 
 
(a) 
Precipitado 
con 
(NH4)2SO4 al 
80% 
(µg/mL) 
 (a) 
Precipitado 
con 
(NH4)2SO4 
80 % y 
TCA 10 % 
(µg/mL) 
 (a) 
2 593.35 442.15 874.70 703.20 28.03 571.80 20.42 
3 576.60 496.60 703.85 612.65 17.07 324.60 50.12 
6 520.60 525.25 856.75 784.55 19.77 257.74 15.27 
9 a N.D. N.D. 676.20 599.80 25.07 319.10 34.14 
10 N.D. N.D. 562.05 172.25 24.48 418.90 37.48 
* N.D – no determinado 
*a – de la fase logarítmica tardía. 
 
Para la determinación de proteína se utilizó el método de Bradford, ya que es un 
ensayo reproducible y rápido; la unión del colorante azul de Comassie G-250 y la 
proteína se da en aproximadamente 2 minutos y es estable hasta por 1 hora 
(Bradford, 1976). Se observa que en los tratamientos por liofilizado y precipitación 
con (NH4)2SO4 al 80 %, la cantidad de proteína cuantificada es la más elevada. Sin 
embargo, la liofilización también implica la concentración de carbohidratos y no se 
enfoca en una purificación parcial de proteínas, mientras que la precipitación con 
sulfato de amonio o con TCA, sí (Serrano, 2010). 
La adición de TCA a una preparación enzimática, hace que las proteínas 
precipiten pues perturba el enlace de hidrógeno que establecen las moléculas de 
agua alrededor de la proteína, por lo que ya no pueden permanecer solubles y 
éstas se deben recuperar por centrifugación. Sin embargo, las proteínas pierden 
su estructura y se desnaturalizan (Koontz, 2014), por lo que, si se requiere 
mantener la actividad de la o las proteínas, deben colocarse en una solución 
renaturalizante para poder visualizar dicha actividad, o, probar con variantes de 
 - 36 - 
precipitación con TCA u otros métodos de concentración y precipitación como el 
salado (salting out) usando sulfato de amonio. No obstante, una deficiencia del 
uso del salado para purificar proteínas, es que los contaminantes a menudo 
coprecipitan con las proteínas de interés (Duong-Ly y Gabelli, 2014), mientras que 
la precipitación con TCA los elimina. Por esta razón, se optó por combinar estas 
dos metodologías de precipitación de proteínas, esperando generar una mayor 
concentración, pero, al observar los resultados de la Tabla 2, se obtuvieron 
cantidades similares a solo precipitar con TCA, lo cual indica que no hubo una 
mejora al combinar las dos técnicas, y que la utilización del (NH4)2SO4 al 80 % 
por sí solo, precipita mayor cantidad de proteína de las muestras. 
 
Pruebas presuntivas de difusión en agar. 
Uno de los métodos más utilizados para detectar actividad inhibitoria es el de 
difusión en agar (Liu et al., 2014). 
En la Figura 12 se muestran los resultados obtenidos de la actividad 
antibacteriana de los extractos crudos liofilizados contra Salmonella enterica 
Typhimurium. Estos son producto de la fase logarítmica tardía y se observa que 
las cepas 2 y 3 de E. faecium, fueron las únicas que presentaron actividad 
antagónica del crecimiento de esta bacteria, mientras que los extractos 
provenientes de la fase estacionaria temprana no presentaron dicha actividad 
(Figuras no mostradas). Los ensayos se realizaron por duplicado y se utilizó como 
control positivo Ampicilina a una concentración de 100 µg/mL, además de medio 
MRS sometido a las mismas condiciones de concentración para descartar que 
éste fuera el que pudiera ejercer un efecto antibacteriano sobre el microorganismo 
indicador. 
 
 
 
 
 
 
 - 37 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las muestras de los extractos de las cepas de estudio difundieron con una 
coloración ámbar, ya que éstos llevan un tratamiento de liofilizado, que si bien es 
el método más adecuado para conservar enzimas y se extrae cerca del 95% de 
agua por sublimación (Ramírez, 2006), además se concentran componentes del 
medio en el que se encuentra como lo son peptona, glucosa, y extracto de 
levadura que contribuyen al color del sobrenadante resuspendido en amortiguador 
de fosfatos, por esto, resultó difícil una medición del halo de inhibición en 
comparación con el control positivo, además de ser de menor diámetro. 
Figura 12. Pruebas de difusión en agar BHI, microorganismo blanco: 
Salmonella enterica Typhimurium. Extracto crudo liofilizado (fase logarítmica 
tardía) de las 5 cepas de Enterococcus faecium aislados de queso Bola de 
Ocosingo después de 12 hrs de incubación. Control positivo (Ampicilina 100 
µg/mL.) 
 - 38 - 
 
Al utilizar los mismos extractos crudos liofilizados que tuvieron actividad contra S. 
enterica en la difusión realizada contra E. faecalis YLV, se observaron halos de 
inhibición más grandes alrededor del pozo donde se colocaron las muestras. En 
este caso, las cepas de E. faecium que impidieron el crecimiento de E. faecalis 
YLV, fueron las identificadas como 2, 3 y 6 (Figura 13). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cepa 3 
Cepa 2 
Cepa 6 
Cepa 3 Cepa 2 
Cepa 6 
Ampicilina 
Figura 13. Prueba de difusión en agar BHI, microorganismo blanco: Enterococcus faecalis YLV. 
Extracto crudo liofilizado (fase logarítmica tardía) de las 5 cepas de Enterococcus faecium 
aisladas de queso Bola de Ocosingo y control positivo (Ampicilina 100 µg/mL.) 
 - 39 - 
En los casos contra Salmonella enterica Typhimurium y E. faecalis YLV, los 
extractos proteínicos detuvieron por completo el crecimiento de las bacterias 
inoculadas en las cajas Petri, por lo que se infiere que tienen actividad bactericida 
y no bacteriostática (Serrano, 2010), y que, además son efectivos para bacterias 
con Gram diferente. 
 
A continuación, la Tabla 3 muestra los resultados de actividad específica para las 
cepas que presentaron actividad lítica, donde se considera el halo medido en mm, 
y la concentración de proteína en mg. 
 
 
 
 
 
En las últimas décadas el género Enterococcus ha surgido como un importante 
patógeno nosocomial que ha adquirido progresivamente resistencia a antibióticos, 
por lo que la producción de compuestos con actividad antagónica puede 
representar una alternativa no solo para la utilización de cepas como probióticos o 
cultivos iniciadores en alimentos, sino que además, pudieran ayudar en el control 
 
Cepa de 
E. 
faecium 
mm de 
inhibición en 
fase 
logarítmica 
tardía 
µL de muestra 
depositados por 
pozo. 
mg de 
proteína/ 
pozo 
Actividad 
específica en fase 
logarítmica tardía 
(mm/mg proteína) 
 
Salmonella enterica Typhimurium 
2 3 200 0.174 17.15 
3 3 200 1.298 2.31 
Enterococcus faecalis YLV 
2 1 200 0.133 7.52 
3 1 200 0.150 6.67 
6 4.5 200 0.148 30.40 
Tabla 3. Actividad específica de las muestras que presentaron halos de 
inhibición contra patógenos. 
 - 40 - 
de cepas patógenas de enterococos en hospitales. Por ejemplo, una cepa de E. 
faecium identificada como SF68, se ha usado en el tratamientocontra la diarrea y 
se considera como una alternativa al tratamiento con antibióticos (Lewenstein et 
al., 1979; Bellomo et al., 1980). Además, esta cepa fue capaz de inhibir el 
crecimiento de E. coli, Salmonella, Shigella spp. y Enterobacter spp. in vitro, y es 
resistente a valores bajos de pH, y tolerancia a sales biliares (Franz et al., 2011). 
Para la búsqueda de bacteriocinas que pudieran ser producidas por las cepas de 
E. faecium utilizadas en este trabajo, se utilizó la metodología de adsorción-
desorción. Este método concentra de mejor manera el extracto de la cepa 
(Álvarez-Cisneros et al., 2010) y se tienen reportes que para la purificación de 
estos compuestos de origen proteínico representa una metodología efectiva. En 
2017, Segundo, logró un rendimiento del 20% en la extracción de una posible 
enterocina producida por la cepa de E. faecium MXVK76 aislada de un producto 
cárnico. 
Se comenzó por la corroborar la efectividad del método al aplicarlo a 2 cepas 
previamente reportadas como productoras de enterocinas. La cepa E. faecalis 
FAIR E-77, productora de enterocina AS-48 (Belgian coordinated collections of 
microorganisms) y la cepa E. faecium MXVK29 aislada de un chorizo mexicano 
fermentado con una enterocina de clase IIa (Álvarez-Cisneros et al., 2010). El 
fundamento del método adsorción-desorción, consiste en cambiar el pH del cultivo 
para facilitar que el compuesto antimicrobiano se adhiera a la membrana celular y 
después que éste se despegue de la célula y quede en el medio para lograr la 
actividad antagónica 
Los extractos obtenidos, se probaron solo contra L. monocytogenes ya que ambas 
al pertenecer a la clase II de bacteriocinas, son reconocidas por su alta actividad 
antimicrobiana contra este microorganismo (Beristain-Bauza et al., 2012), 
obteniendo halos de inhibición, considerando un resultado positivo; como controles 
negativos se utilizaron cepas no productoras de compuestos inhibitorios de 
naturaleza proteínica: E. faecalis YLV y E. faecalis ATCC 29212 (Figura 14). 
 
 - 41 - 
Sin embargo, para las cepas de E. faecium aisladas del queso bola de Ocosingo, 
los extractos obtenidos no mostraron halos inhibitorios contra el microorganismo 
blanco, pudiendo deberse a que la cantidad secretada de proteína o péptidos no 
fuera la suficiente para lograr observar una actividad antagonista contra L. 
monocytogenes (Figura 15). 
 
 
Figura 14. Pruebas de difusión en agar BHI. Microorganismo blanco: Listeria 
monocytogenes. Muestras obtenidas por adsorción-desorción. Controles positivos a la 
derecha y controles negativos a la izquierda de las imágenes. Se muestran las réplicas. 
E. faecalis 
FAIR E-77 
E. faecium 
MXVK29 
E. faecalis 
FAIR E-77 
E. faecium 
MXVK29 
E. faecalis 
YLV 
E. faecalis 
ATCC292
12 
E. faecalis 
YLV 
E. faecalis 
ATCC292
12 
Figura 15. Pruebas de difusión en agar BHI. Microorganismo blanco: Listeria monocytogenes. 
Muestras obtenidas por adsorción-desorción de las 5 cepas de E. faecium aisladas de queso 
Bola de Ocosingo. Se muestran las réplicas y control positivo (Nisaplin 100 µg/mL). 
 - 42 - 
En el estudio del Queso Cotija, se han aislado diferentes especies del género 
Enterococcus y algunas cepas son productoras de compuestos proteínicos con un 
espectro de inhibición de bacterias Gram positivas y negativas. Ejemplo de ello, en 
2010, Olvera-García observó que 6 cepas de enterococos presentaban actividad 
lítica contra S. aureus, E. coli, S. enterica, L. monocytogenes entre otros, a través 
de ensayos de difusión en agar. También, Serrano en 2010, logró identificar por 
zimografía una banda de 87 kDa producida por E. faecalis con actividad sobre 
bacterias Gram positivas. 
El ensayo de difusión en agar no permite discernir si la acción antimicrobiana la 
ejercen bacteriocinas o PGHS presentes en el extracto de proteína; es por esto, 
que se decidió hacer geles de electroforesis y zimogramas, ya que al ser un 
método más sensible que la difusión en agar, se puede corroborar la actividad 
observada en las cajas Petri, además de poder observar la posible inhibición para 
los microorganismos indicadores en los que no se registraron actividades. 
 
SDS-PAGE y Zimogramas 
SDS-PAGE 
Las muestras de todos los tratamientos se sometieron a una electroforesis SDS-
PAGE en condiciones desnaturalizantes, con el propósito de separar las proteínas 
y determinar sus pesos moleculares aproximados; además de poder identificar 
cuales bandas presentaban actividad antibacteriana en el zimograma. 
Se compararon los patrones de bandeo de todas las muestras obtenidas de la 
fase logarítmica tardía, y, se decidió trabajar con las muestras precipitadas con 
sulfato de amonio al 80%, ya que comparadas con los otros tratamientos de 
concentración de proteína, éste fue el que presentaba un perfil electroforético más 
completo y definido, sin interferencias por la coloración del caldo MRS que 
pudieran ser causadas por carbohidratos presentes en los extractos, ya que al ser 
un medio rico en glucosa y peptona, desde el momento de esterilización se 
presentan reacciones de caramelización o de Maillard (Serrano, 2010), lo que 
impide que las bandas de proteína se visualicen correctamente. 
 - 43 - 
El perfil electroforético de las muestras precipitadas con (NH4)2SO4 en los primeros 
cinco carriles (2-6) comparadas con las muestras precipitadas con TCA en los 
últimos 4 carriles (7-10) se observan en la Figura 16. 
 
En la Figura 17, se presentan los perfiles electroforéticos de las muestras 
precipitadas con la combinación de las dos metodologías antes mencionadas. 
Para los extractos crudos y los liofilizados no se muestran los perfiles 
electroforéticos debido a su baja resolución en los geles e interferencias de 
coloración ámbar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
2 
 
3 
 
4 
 
5 
 
6 
 
7 
 
8 
 
9 
 
10 
 
Figura 16. Gel de poliacrilamida SDS-Tris-Glicina al 12 % teñido con plata. 
 Marcador de peso molecular estándar (1). Sobrenadantes precipitados con (NH4)2SO4 80 % de la 
fase logarítmica tardía. Cepa 2 (2), Cepa 3 (3), Cepa 6 (4), Cepa 9a (5), Cepa 10 (6). 
Sobrenadantes precipitados con TCA 10 % de la fase logarítmica tardía. Cepa 2 (7), Cepa 3 (8), Cepa 
6 (9), Cepa 9a (10). 
kDa 
 - 44 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Como se observa en la Figura 16, al contrastar dos de los métodos más 
recomendados para precipitar proteínas, el sulfato de amonio presenta ventajas 
sobre las muestras tratadas con TCA, ya que éste último es más drástico, pues se 
usa para concentrar muestras de proteína eliminando sales y detergentes, pero, 
afecta la estructura de las proteínas como ya se había mencionado. Además, 
como se visualiza en la Tabla 2, las muestras precipitadas con (NH4)2SO4 tienen 
un mayor contenido de proteína por mililitro de muestra que las tratadas con TCA, 
por lo que se pudo depositar una cantidad mayor de proteína en cada pozo del 
gel. 
En el caso de la combinación de métodos de precipitación (Figura 17), no resulta 
en un mejor perfil de bandeo y separación de proteína, sin embargo, para las 3 
metodologías, se pueden observar un patrón de bandeo constante con proteínas 
extracelulares de pesos entre 73 a 78 kDa y bandas con pesos moleculares que 
van de los 27 a 35 kDa. 
A pesar de tener mayor resolución y que el enfoque de geles de Tris-Tricina al 
16 % sea para proteínas de bajo peso molecular (Schägger y Von Jagow, 1987), 
en las muestras del estudio no representó un cambio significativo en cuanto al 
perfil electroforético (Figuras no mostradas). 
 
28 
Figura 17. Gel de poliacrilamida SDS-Tris-Glicina al 12 % teñido con plata. Muestras precipitadas con 
(NH4)2SO4+TCA de la fase logarítmica tardía . Marcador de peso molecular (1), Cepa 2 (2), Cepa 3 
(3), Cepa 6 (4), Cepa 9a (5), Cepa 10 (6). 
97 
66 
45 
31 
21 
14 
1 2 3 4 5 6 
kDa 
78 
37 
19 
 - 45 - 
Zimogramas 
Con el análisis de los perfiles