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1 Grado: Nombre: TEMA: ¿CÓMO PUEDO EXTRAER Y SEPARAR LOS PIGMENTOS DE LAS HOJAS DE LAS PLANTAS? Grado 6 Ciencias Naturales ¿De qué está hecho todo lo que nos rodea? INTRODUCCIÓN Empezamos por observar y analizar el video “Cromatografía”. Nos reunimos en grupos y respondemos los interrogantes y las situaciones problema propuestas: Análisis del experimento “Cromatografía”. 1. ¿Qué paso con los colores originales? 2 2. ¿Que colores subieron más rápido por la tira? 3. ¿Cómo podemos explicar que los pigmentos de cada tinta se ubican en las tiras en distintas posiciones? 4. ¿Por qué cuando sumergimos el extremo de las tiras de papel con las muestras de tinta en el alcohol, los colores se separan y extienden? 5. ¿Cuál es la función de las tintas en este experimento? 6. ¿Cuál es la función del papel filtro en este experimento? 7. ¿Cuál es la función del alcohol en este experimento? 3 8. ¿Por qué razones este experimento es un ejemplo sencillo del método cromatografía? 9. Según lo observado y analizado en el video, ¿para qué sirve la cromatografía? Análisis de situaciones problema: A continuación vamos analizar algunas situaciones problema, respondiendo a los interrogantes y argumentando nuestras respuestas. 1. Hemos preparado una vinagreta (vinagre y aceite de oliva) para aderezar una ensalada de vegetales. ¿Qué tipo de mezcla es? ¿Cómo podemos extraer el vinagre y el aceite? 2. Tomamos una muestra de agua de mar. ¿Qué métodos podemos usar para separar sus componentes? 3. Deseamos separar los componentes de una solución preparada disolviendo removedor de esmalte (acetona) en agua. ¿Qué método podemos utilizar? 4 4. Colocamos tinta en agua. ¿Cómo podemos saber qué componentes tiene la tinta? 5. Hemos extraído extracto de hojas de perejil, de espinaca y de col, en diferentes recipientes. ¿Qué método podemos utilizar para averiguar qué sustancias están presentes en los extractos de estas plantas? Al terminar socializamos las respuestas que hemos dado a los diferentes interrogantes relacionados con el video “Cromatografía” y con las situaciones problema, recibimos retroalimentación de parte del docente y de los compañeros de clase. En la naturaleza observamos hojas, flores y frutos de las plantas, de diversos colores, especialmente el color verde es el más abundante en los vegetales, seguramente alguna vez nos hemos preguntado ¿qué sustancias son las que dan color a las plantas? Sabemos que las células vegetales tienen cloroplastos, organelos que se aprecian de color verde porque contienen pigmentos como: clorofila a, clorofila b y cromoplastos que contienen pigmentos como beta carotenos, xantofilas y antocianinas, cuyas características comparamos en la tabla 1. Actividad 1: La cromatografía como método de separación de mezclas 5 1.1 CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL Entendamos que las técnicas cromatográficas representan una de las herramientas más importantes para el científico, por ejemplo, la introducción de la cromatografía bidimensional en papel, es considerada por muchos autores, como una herramienta tan útil como el microscopio, figura 1.. Tabla 1. Características de los pigmentos. Pigmentos Características Clorofila Posee un átomo central de Magnesio en un anillo de porfirina junto a un alcohol insaturado de nombre fitol, en el carbono 3 la clorofila a, de color verde azulado, tiene un grupo metilo (-CH3), mientras que la clorofila b, de color verde amarillento, tiene un grupo aldehído (-CHO); la clorofila b tiene mayor polaridad que la a. Carotenos Son hidrocarburos, formados por carbono e hidrógeno, se disuelven en solventes no polares, sus colores van desde el amarillo hasta el anaranjado, son abundantes el beta caroteno y el alfa caroteno. El caroteno más importante es el beta caroteno. Los carotenoides en las plantas cumplen funciones como fotoprotectores de la clorofila, enzimas y lípidos y como pigmentos accesorios en la fotosíntesis, porque forman parte de los complejos clorofila-proteína, encargados de realizar el transporte electrónico y la conversión de energía luminosa en biomasa. Xantofilas Son derivados oxigenados de los carotenos, son solubles en alcohol, por lo general amarillas, las más abundantes son la luteína y violaxantina. Antocianinas Son pigmentos de las flores y en algunas ocasiones de hojas, tallos y raíces de los vegetales, en una gama que va desde el rojo hasta el azul. Actualmente tienen gran uso como colorantes naturales y antioxidantes. Figura 1. Microscopio. 6 La cromatografía (del griego chroma = color y graphos = escritura), se relaciona con los pigmentos fotosintéticos. En 1906, el botánico ruso Tswett, publicó un procedimiento para separar un extracto vegetal a través de una columna rellena con carbonato de calcio, obtuvo pigmentos de diferentes colores que inspiraron el nombre del procedimiento y dieron inicio a una metodología para separar e identificar sustancias complejas, muy importantes en la ciencia, por ejemplo, cromatografía sobre papel, figura 2. La Unión Internacional de Química Pura y Aplicada IUPAC, define la cromatografía como un método físico de separación, mediante el cual, los componentes de una mezcla se separan por distribución entre dos fases, la fase estacionaria (FE) y la fase móvil (FM). El proceso de separación obedece al equilibrio entre las fuerzas de propulsión promovidas por la fase móvil y las fuerzas de retención generadas por la fase estacionaria, figura 3. Cada sustancia tiene una migración diferencial, según sus características físicas y las fuerzas intermoleculares que establezca con las dos fases. Los pigmentos fotosintéticos se separan mediante cromatografía sobre papel, figura 4, a través de un mecanismo de adsorción física, según la polaridad de cada pigmento y las fuerzas intermoleculares que establecen con los grupos hidroxilo libres de la celulosa que constituye el papel y con la estructura del disolvente de la fase móvil. En el cromatograma de la figura 5, observamos que la clorofila b por ser más polar se adhiere intensamente y más rápido; los carotenos son menos fuertes para interactuar con el papel, quedan disueltos en la fase móvil y son arrastrados por ella con un retardo mayor. El disolvente o eluyente que constituye la fase móvil, actúa como fuerza propulsora y con su estructura química contribuye a que los pigmentos se separen mediante sucesivos procesos de adsorción-desorción. Figura 2. Cromatografía sobre papel. Figura 3. El solvente sube por el papel. Figura 4. Separación de componentes. Figura 5. Cromatograma pigmentos vegetales. 7 Los procesos de separación dependen del equilibrio entre las fuerzas intermoleculares entre el soluto, la fase estacionaria y la fase móvil. Para extraer los pigmentos se utiliza acetona, porque es polar y tiene amplio margen de solubilización. El proceso de extracción se debe realizar de forma rápida, en un ambiente fresco, con luz tenue. La identificación de los pigmentos a partir del cromatograma, se lleva a cabo mediante el parámetro Rf, factor de retardo o de retención, el cual relaciona la distancia recorrida por cada pigmento y la del eluyente, según la ecuación: Luego de analizar el video “Cromatografía sobre papel”, respondemos las preguntas siguientes: 1. ¿En qué consiste el proceso de cromatografía? 2. ¿Por qué los pigmentos vegetales se separan cuando realizamos la cromatografía sobre papel? 3. ¿Cómo podemos explicar que en el cromatograma obtenido, cada pigmento se encuentre a una distancia diferente? Rf = distancia recorrida por el pigmento distancia reorrida por el eluyente 8 4. ¿Qué función cumple el eluyente en el método de cromatografía? 5. ¿Qué importancia tiene en la cromatografía el parámetro Rf? 6. ¿Por qué se utiliza la acetona para extraer los pigmentos de las hojas? 7. ¿Por qué se considera la cromatografía como una de las herramientas más importantes para la ciencia actual? 8. Qué semejanzas encontramosentre los procesos analizados en los videos “Cromatografía” y “Cromatografía sobre papel”. 9 Al terminar, socializamos las respuestas y bajo la orientación del docente valoramos la importancia de aprender acerca de la cromatografía como método de separación de mezclas. 1.2 ¿CÓMO PODEMOS SEPARAR LOS PIGMENTOS DE LAS HOJAS DE ESPINACA POR CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL? Vamos a lograr la extracción de los pigmentos de las hojas de espinaca (Spinacea oleracea L.) mediante extracción directa ascendente, utilizando una mezcla de hexano- acetona como eluyente. 1.2.1 Materiales y reactivos Hojas frescas de espinaca, tijeras, toallas de papel para cocina, papel aluminio, 2 gramos de sulfato de magnesio, 10 gramos de arena silícea, mortero y mango, embudo de filtración con papel filtro, erlenmeyer de 250 ml. 10 Disolvente de extracción de pigmentos: 8 ml de acetona; eluyente: 40 mL de una mezcla de hexano-acetona (8,5 de hexano por 1,5 de acetona, volumen a volumen); papel de filtro Whatman N°1, o similar, de 5 x 21 centímetros, en su defecto filtros de papel para café; 2 Potes de vidrio de 20, 5 m de alto por 7 cm de diámetro, los rotulamos 1 y 2; pequeña varilla de madera o un lápiz para sostener el papel filtro; cinta adhesiva para sostener el papel filtro unido al trozo de madera o lápiz; capilares de vidrio o micropipetas, o en su defecto pitillos de pequeño diámetro; pipeta graduada de 10 ml; balanza; cámara fotográfica o celular. 11 1.2.2 procedimiento Se recomienda a los estudiantes tomar fotos o grabar videos de cada etapa del proceso, para documentar el video o presentación que deben elaborar posteriormente en la tarea. Paso 7. Maceramos muy bien hasta obtener una pasta uniforme. ¿Cómo es el aspecto de la pasta obtenida? 12 ¿Para qué agregamos acetona a la pasta obtenida? ¿Por qué es necesario tapar la muestra? ¿Qué aspecto tiene la mezcla obtenida? ¿Qué aspecto tiene la muestra filtrada obtenida? ¿Qué hemos extraído en la muestra filtrada obtenida? 13 ¿Para qué trazamos la línea en el borde inferior del papel? ¿Qué observamos en el papel? 14 ¿En qué orden aparecen los pigmentos en el papel? ¿Qué pigmentos hemos podido identificar? ¿En qué orden aparecen los pigmentos obtenidos? ¿Cómo podemos explicar el orden en que aparecen los pigmentos en el papel? 15 1.2.3 separación de pigmentos vegetales por cromatografia sobre papel realizada en casa En caso de no poder realizar la práctica en la Institución Educativa, podemos realizarla en casa, de la siguiente manera: 1.2.3.1 materiales • Mortero o machaca ajos • Tijeras • 2 Papeles de filtro para café • Alcohol etílico o etanol • Arena lavada • 1 Frasco o vaso de vidrio de boca ancha, transparente. • Embudo • Hojas de espinaca o de col 1.2.3.2 procedimiento • Quitar las nervaduras a las hojas y cortarlas en trozos pequeños dentro del mortero o machaca ajos. • Colocar un poco de arena lavada dentro del mortero y macerar las hojas con ayuda del mango del mortero. • Añadir un poco de etanol de manera que se cubra la muestra de las hojas trituradas, macerar hasta que el líquido adquiera un color verde intenso • Acomodar el papel de filtro para café sobre el embudo y colocar el embudo sobre el frasco o vaso de vidrio. • Depositar la mezcla sobre el papel de filtro, recogiendo el filtrado de pigmentos vegetales en el frasco o vaso de vidrio. • Introducir el segundo papel de filtro en el frasco que contiene el extracto de pigmentos vegetales, de manera que la parte ancha quede hacia abajo y se sostenga en posición vertical sobre la muestra de pigmentos vegetales. • Dejar en reposo por unos 30 minutos. • Extraer el papel y dejar secar. • Observar el resultado del cromatograma. • Analizar los resultados. • Respondemos las preguntas propuestas a lo largo del procedimiento 1.2.2. 1.2.4 evaluación del cromatograma e identificación de pigmentos Al finalizar el proceso de secado del papel, Identificamos los pigmentos encontrados con la ayuda del cromatograma de la figura 5. La separación mediante cromatografía sobre papel de los pigmentos fotosintéticos 16 de las plantas analizadas, trascurre a través de un proceso de adsorción, el cual depende de la polaridad de cada pigmento y del tipo de fuerzas intermoleculares establecidas con la estructura del papel y del eluyente. Ahora analizamos la relación entre los pigmentos y la clasificación de las plantas. Los pigmentos son compuestos químicos que confieren color porque pueden reflejar o transmitir la luz visible. El color de un pigmento está determinado por la absorción selectiva de determinadas longitudes de onda de la luz y la reflexión de otras. Los cloroplastos son organelos que contienen clorofila a y b (color verde), los cromoplastos contienen otros pigmentos como xantofilas (colores amarillos), carotenos (colores anaranjados) y antocianinas (colores violetas y azules). Los pigmentos fotosintéticos constituyen la base de la vida sobre el planeta Tierra, porque son los encargados de captar la energía lumínica transformándola en energía 1.3 LOS PIGMENTOS Y LA CLASIFICACIÓN DE LAS PLANTAS Figura 6. Variedad de pigmentos en las plantas. 17 química a través del proceso de fotosíntesis. Los pigmentos primarios tienen como función principal captar la energía lumínica, la bacterioclorofila en procariotas y la clorofila a en eucariotas. Los pigmentos accesorios, carotenos, xantofilas y antocianinas, tienen como función ampliar el espectro de absorción de los pigmentos primarios y protegerlos de la luz excesiva. En las tablas 2 y 3, podemos apreciar los pigmentos primarios y accesorios presentes en los diferentes organismos fotosintéticos. Tabla 2. Pigmentos en Procariotas. Procariotas Pigmento primario Pigmentos accesorios Longitud de onda absorbida Bacterias purpúreas Bacterioclorofila a Bacterioclorofila a Azul-violeta a rojo Bacterioclorofila b Bacterias verdes sulfúreas Bacterioclorofila a Bacterioclorofila a Azul a rojo Cianobacterias Clorofila a Ficocianina Violeta-azul a anaranjado-rojo Ficocianina Naranja Aloficocianina Verde Rojo 18 Los pigmentos clorofílicos, clorofilas a y b, cuya estructura molecular se aprecia en la figura 7, son los más abundantes en la tierra, deben su color a la capacidad de absorber la longitud de onda de la luz roja y azul, transmitiendo los demás colores, los cuales observamos en distintas tonalidades de verde. Tabla 3. Pigmentos en Eucariotas. Eucariotas Pigmento primario Pigmentos accesorios Longitud de onda absorbida Algas rojas Clorofila a Ficocianina Violeta-azul a anaranjado-rojo Ficocianina Naranja Aloficocianina Verde Rojo Algas marrones Clorofila a Clorofila c Violeta-azul a rojo Algas verdes, musgos y plantas vasculares Clorofila a Clorofila b Violeta-azul a anaranjado-rojo Carotenos alfa y beta Azul-verde Xantofilas Figura 7. Clorofilas a y b. 19 El color que presenta un determinado órgano vegetal, como el fruto, figura 9, depende generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinación de ellos. El color del pigmento está determinado por la longitud de onda no absorbida y que por lo tanto refleja. Los pigmentos negros absorben todas las longitudes de onda que les llegan, mientras que los pigmentos blancos reflejan prácticamente toda la energía que les llega, cada pigmento tiene un espectro de absorción característico. Los carotenoides, figura 8, comprenden los carotenos y las xantofilas, cumplen la función de ser pigmentos accesorios en la captación de energía lumínica y la de ser moléculas capaces de disipar la energía excedente, evitando daños para las plantas. Las algas verdes presentan similitud con las plantas terrestres en su metabolismo, tipos de pigmentos fotosintéticos, clorofilas a y b, así como en su estructura celular, lo cual evidencia el origen de las plantas terrestres a partir de este grupo. Se distribuyen ampliamente en todos los ambientesacuáticos, poseen un cloroplasto bien definido, con un color verde intenso. Los sistemas naturales de clasificación se basan esencialmente en estudios comparativos de características morfológicas y anatómicas, algunas muy generales, para clasificar en las categorías más grandes Reino, división, clase, orden y otras más específicas, para agrupar en familias, géneros, especies. Figura 9. Variedad de pigmentos en los frutos. Figura 8. Carotenoides. 20 A partir del desarrollo de la química de productos naturales, botánicos y químicos sugirieron la posibilidad de caracterizar y clasificar las plantas basándose en sus constituyentes químicos. El desarrollo de los métodos de investigación química, como la cromatografía, han contribuido al desarrollo de la Quimio Taxonomía, figura 10, clasificación con base en las estructuras moleculares de las plantas. Figura 10. Quimio taxonomía. El análisis de la composición química específica es importante en la taxonomía y sistemática de especies no solamente de plantas sino de todos los seres vivos. La presencia de pigmentos predominantes en los seres vivos, ha tenido influencia en los nombres de categorías taxonómicas y en su clasificación taxonómica, como en la taxonomía de las algas. Las algas constituyen parte esencial de los ecosistemas acuáticos, realizan fotosíntesis convirtiendo la energía solar en energía química, representada en la productividad primaria, toman gas carbónico convirtiéndolo en materia orgánica o biomasa, la cual se constituye en la base de la cadena alimenticia en los ecosistemas acuáticos; reciclan nutrientes y producen oxígeno, determinando la productividad del ecosistema. Las algas azul verdosas o cianobacterias, figura 11, son organismos muy antiguos, son procarióticas, poseen clorofila a y pueden hacer fotosíntesis, se distribuyen en ambientes variados como fuentes termales, en el suelo, en el hielo, sobre superficies húmedas de rocas y árboles; son las responsables de la acumulación de oxígeno en la atmósfera de la tierra, tienen la capacidad de fijar el nitrógeno en el agua, a partir del nitrógeno gaseoso de la atmósfera, por lo cual influyen en la fertilidad de los suelos.Figura 11. Alga azul verdosa. 21 A continuación, como ejemplos de Quimio taxonomía, en la Tabla 4, se muestra la clasificación de las algas y del orden Caryophyllalles, especificando los pigmentos vegetales, sustancias que reservan y que están presentes en su pared celular, como criterios tenidos en cuenta en su taxonomía. Las algas pardas deben su nombre a su coloración predominante, determinada por las xantofilas como fucoxantina y flavoxantina, poseen también los pigmentos clorofila a, c, beta caroteno, forman grandes bosques submarinos, como se aprecia en la figura 12. Las algas rojas, son muy diversas y dominantes en el agua del mar, poseen un pigmento fotosintético característico llamado ficobilina (ficoeritrina y ficocianina) que le da el color rojo; contienen además otros pigmentos como carotenos (anaranjados) y xantofilas (amarillos), dando la apariencia de un jardín acuático, como se observa en la figura 13. Figura 12. Bosques de algas pardas. Figura 13. Jardín de algas rojas. 22 Tabla 4. Ejemplos de Quimio taxonomía. Taxonomía Tipo de pigmento Sustancias de reserva Pared celular División Clorófitas Figura 14. Algas verdes. Clorofilas a y b, carotenos. Almidón similar a plantas terrestres. Celulosa, en algunos grupos sílice. División Euglenofitas Figura 15. Euglena. Clorofilas a y b, carotenos. Almidón paramilo (glucopiranósido) Ausente División Crisófitas Figura 16. Diatomeas. Clorofilas a y c, xantofilas. Aceite de crisolaminarina Celulosa y sílice. 23 División Feófitas Figura 17. Algas pardas. Clorofila ay c, fucoxantina. Manitol, laminarina. Celulosa, ácido algínico. División Rodófitas Figura 18. Algas rojas. Clorofila a y d, ficoeritrina, fucixantina, carotenos. Almidón de florideas (parecido al glucógeno). Celulosa, pectinas, algunas CaCO3. División Angiospermas Orden Caryophyllales Figura 19. Remolacha. Betalaínas Almidón y azúcares. La mayoría de sus familias producen betalaínas, pigmentos nitrogenados que actúan como pigmentos rojos y amarillos. La remolacha debe su color a los pigmentos betacianina y betaxantina. 24 1.4 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA PRÁCTICA Luego del análisis anterior, utilizando la técnica de mesa redonda, socializamos los resultados obtenidos en la práctica, comparándolos con los que obtuvieron los demás grupos de trabajo, contrastándolos con la información presentada por el docente en la explicación sobre Quimio Taxonomía y consultamos acerca de las características e importancia de los pigmentos vegetales que identificamos en el procedimiento de laboratorio realizado ya sea en la institución educativa o en casa. 1.5 JUGUEMOS A IDENTIFICAR PIGMENTOS EN LAS PLANTAS Vamos a observar imágenes de partes de algunas plantas identificando el nombre del pigmento predominante en cada una: Tabla 5. Identifiquemos pigmentos en las plantas. IMAGEN CARACTERÍSTICAS PIGMENTO PREDOMINANTE Figura 20. Frambuesa. Nombre común: Frambueso Nombre científico: Rubus idaeus Arbusto perenne de hasta 2,5 metros de altura. Su fruto es de sabor fuerte y dulce, contiene ácido elágico, beneficioso en la prevención de cáncer. Clorofilas Xantofilas Carotenos Antocianinas Figura 21. Algas verdes. Existen unas 7000 especies de algas verdes, unas 800 de ellas son marinas, hay algunas que viven varios años, otras son estacionales, en condiciones favorables originan mareas verdes. Clorofilas Xantofilas Carotenos Antocianinas 25 1.6 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS Sabemos que cromatografía significa gráfica de colores y que actualmente la cromatografía comprende un grupo de técnicas que se utilizan para identificar sustancias mediante la separación de los componentes de mezclas y la purificación de compuestos, lo que hace que sea una técnica muy valiosa tanto en la investigación científica como en la industria. Aunque existen varias técnicas, todas tienen una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido que permanece fijo o en la misma posición y la fase móvil puede ser un líquido o un gas que se desplaza o mueve a través de una superficie y de la fase estacionaria. Las sustancias que constituyen las muestras analizadas interaccionan tanto con la fase estacionaria como con la fase móvil, de manera que la rapidez en su desplazamiento depende de estas interacciones, cuando se analiza una mezcla, cada componente se mueve diferente. Figura 22. Girasol. Nombre común: Girasol Nombre científico: Helianthus annuus Planta herbácea, alimenticia, oleaginosa y ornamental. Gira según la posición del sol, debido a que tiene fototropismo positivo. Clorofilas Xantofilas Carotenos Antocianinas Figura 23. Papaya. Nombre común: Papaya Nombre científico: Carica papaya El tronco no posee ramas. El fruto es una baya ovoide oblonga, carnosa y jugosa, las semillas son de color negro. Es alimenticia. Clorofilas Xantofilas Carotenos Antocianinas Consulta acerca de los usos e importancia en la actualidad de cada uno de los ejemplos del interactivo. 26 Según el tipo de equilibrio involucrado, el cual es determinado por la fase estacionaria utilizada, la cromatografía puede ser de: • Adsorción • Partición • Intercambio iónico • Exclusión • Afinidad 1.6.1 cromatografia de adsorción Es una de las técnicas más empleadas para la separación de mezclas en sus componentes puros, purificación de un compuesto y comparación de compuestos que se creen idénticos. La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. El adsorbente a emplear debe tener las siguientes características: • Insoluble en el disolvente elegido. • No debe reaccionar con la sustancia a separar. Figura 24. Característicasde la fase estacionario o adsorbente. 27 • No debe actuar como catalizador. • Debe tener una composición uniforme y ser incoloro, con el fin de poder localizar visualmente los diferentes compuestos en caso de que sean coloreados. • El tamaño de sus partículas influye en el grado de separación, cuanto menor sea el tamaño de sus partículas, menor es la velocidad d emigración y mayor es la separación. • Los adsorbentes muy activos establecen interacciones relativamente intensas con las moléculas del soluto, haciendo que su paso a lo largo de la superficie del adsorbente sea relativamente lento. • Los dos adsorbentes más corrientes son: la alúmina que es muy activo y el gel de sílice que tiene una actividad intermedia. Para que el proceso ocurra se requiere la presencia de un disolvente, o mezcla de disolventes, La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido – sólido), o un gas (cromatografía gas – sólido), el disolvente o mezcla de disolventes interaccionan con el adsorbente y los compuestos de la muestra; esta interacción triple entre muestra, disolvente y adsorbente, establece las proporciones relativas en que los componentes de la muestra se fijan y migran a través del adsorbente, determinando la separación entre los mismos. La polaridad del disolvente influye en la efectividad del proceso, el cambio de un disolvente menos polar a otro de mayor polaridad, ocasiona una atracción relativamente mayor de la muestra analizada, por parte del disolvente, favoreciendo que migre en mayor grado a través del adsorbente. Figura 25. Características de la Fase móvil o disolvente. 28 Son ejemplo de disolventes: hexano, éter de petróleo, ciclo hexano, sulfuro de carbono, tetracloruro de carbono, etc. En cuanto a los componentes de la muestra, entre más polaridad tengan mayor es su capacidad de adsorción, se ha establecido de mayor a menor capacidad de adsorción: 1. Ácidos carboxílicos 2. Alcoholes, aminas y tiol 3. Aldehídos, cetonas y ésteres 4. Haluros orgánicos 5. Hidrocarburos no saturados, a mayor insaturación mayor capacidad de adsorción 6. Hidrocarburos saturados. Este tipo de cromatografía se basa en el diferente grado de adsorción de cada compuesto orgánico sobre la superficie de una sustancia químicamente inerte, denominada adsorbente, de manera que la muestra analizada se ve atraída a zonas polares de la superficie del adsorbente por fuerzas electrostáticas, quedando reversiblemente ligado a la misma. Si los componentes de la muestra analizada no son coloreados, generalmente se usa una lámpara ultravioleta porque muchas sustancias que son incoloras a la luz ordinaria presentan una fuerte fluorescencia a la luz ultravioleta, o un revelador que es un reactivo con el que los componentes de la muestra adsorbidos formen cierta coloración, permitiendo su detección. Se puede llevar a cabo mediante cromatografía en columna, en capa fina, en papel, etc. Figura 25. Características de la Fase móvil o disolvente. 29 Figura 27. Detección de componentes de la muestra analizada. Figura 28. Cromatografía de partición. Los componentes de la muestra analizada se distribuyen entre dos fases a través de la combinación de los procesos de adsorción y desorción. 1.6.2 cromatografía de partición En la cromatografía de partición líquido-líquido, los solutos se reparten entre una fase móvil líquida y otra fase estacionaria líquida soportada sobre un sólido inerte, que no se mezclan entre sí, es decir son inmiscibles, por consiguiente los solutos se separan por su solubilidad. 30 La fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido – líquido), o un gas (cromatografía de partición gas – líquido, GLC). Por ejemplo la cromatografía sobre papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel de celulosa. Es una técnica sencilla que permite analizar pequeñas cantidades de muestra. En la cromatografía en capa fina, la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte (silica). Tabla 6. Cromatografía de partición. Tipo de fase estacionaria Principio cromatográfico Tipo de fase móvil Aparato para la fase estacionaria Tipo de cromatografía Cromatografía de adsorción Gas Columna Gas – sólido GC / GSC Competencia entre un sólido adsorbente y la fase móvil Líquido Columna Cromatografía líquida de alto rendimiento HPLC Capa plana Capa fina TLC Papel PC Cromatografía de partición Competencia entre una fase estacionaria líquida y la fase móvil Gas Columna Gas – líquido GC / GLC Fluido supercrítico SFC Líquido Columna Líquido – Líquido LC Cromatografía líquida de alto rendimiento HPLC 31 La cromatografía de gases es la técnica a elegir para separar compuestos orgánicos térmicamente estables y volátiles. La cromatografía de líquidos de alto rendimiento HPLC, es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y grupos polifuncionales de alto peso molecular. La HPLC ofrece las siguientes ventajas sobre la cromatografía de gas: • No está limitada por la volatilidad o estabilidad térmica de las muestras. • Fase móvil líquida interactiva en adición a una fase estacionaria activa. • La separación cromatográfica en HPLC resulta de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra con ambas fases, móvil y estacionaria. • Ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, permitiendo mayor variedad de interacciones selectivas y mayores posibilidades de separación. • Es fácil recobrar la muestra en la HPLC. • Cuando se han separado las fracciones, se recolectan en forma sencilla colocando un recipiente abierto al final de la columna. • Los componentes separados son fácilmente aislados de la fase móvil. En la cromatografía de fase normal, una fase estacionaria polar (como agua, metanol), se usa con una fase estacionaria no polar (como hexano); lo cual favorece que los compuestos polares sean retenidos y los no polares sean eluidos. En la cromatografía por fase reversa, se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase móvil polar, esto favorece que los solutos no polares sean retenidos y los solutos polares eluidos. Cromatografía de intercambio iónico Competencia entre una fase estacionaria de intercambio iónico y una fase móvil líquida Líquido Columna Intercambio iónico IEC Intercambio iónico de alto rendimiento HPIC Cromatografía de penetración Competencia entre una matriz de polímero y una fase móvil líquida Líquido Columna Exclusión molecular o filtración en gel GPC 32 En la actualidad, existen también otros dos tipos de cromatografía de partición líquido- líquido, las cuáles se establecen según la relación entre el sólido soporte inerte y la fase líquida estacionaria activa: Fase estacionaria adsorbida y fase estacionaria ligada. En la fase estacionaria adsorbida, ocurre una interacción fisicoquímica del disolvente con los sitios activos del sólido soporte. Figura 29. Cromatografía de partición en fase normal y fase reversa. Figura 30. Fase estacionaria adsorbida. 33 La separación depende de la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas a una resina con grupos iónicos que poseen carga opuesta. El mecanismo de separación se base en un equilibrio de intercambio iónico, que generalmente ocurre en cinco etapas: En la fase estacionaria ligada, se establece un anclaje químico entre el sólido soporte y las moléculas de la fase estacionaria líquida. La cromatografía de partición en fase invertida o reversa con empleo de fases ligadas, es la más ventajosa y la más empleada. Figura 32. Cromatografía de intercambio iónico. Figura 31. Fase estacionaria ligada. 1.6.3 cromatografia de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas con base en sus propiedades decarga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer, cuyos iones compiten con los analitos o sustancias de la muestra por los sitios activos de la fase estacionaria. 34 • Primera etapa: apropiadas de pH y fuerza iónica, permitiendo la unión de las moléculas de soluto; los grupos que se intercambian están asociados con sus respectivos contra-iones. • Segunda etapa: Aplicación de la muestra y su adsorción, las moléculas del soluto intercambian cargas y se unen reversiblemente al gel. Las sustancias que no se unen al gel se eluyen de la cama del intercambiador. • Tercera etapa: Desorción de la muestra cambiando las condiciones de elusión, puede ser aumentando la fuerza iónico del eluyente o cambiando su pH. • Cuarta etapa: Remoción de sustancias no eluídas. • Quinta etapa: Regreso al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificación. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados que se asocian a contra-iones móviles. Los contra- iones se intercambian reversiblemente con otros iones de la misma carga sin que la matriz se altere. La matriz puede estar cargada positiva o negativamente y los contra-iones también, si los intercambiadores están cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados que se llaman intercambiadores aniónicos; si los intercambiadores están cargados negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se denominan intercambiadores catiónicos. La matriz puede estar constituida de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las características que tenga la matriz determinan sus propiedades cromatográficas, eficiencia, capacidad, recuperación, estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afecta su comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un intercambiador iónico, el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; el número 35 total y la disponibilidad determina la capacidad. Son ejemplo de intercambiadores aniónicos, dietilaminoetil (DEAE), Aminoetil cuaternario (AEC), Amonio cuaternario y de intercambiadores catiónicos, carboximetil (CM), sulfopropil (SP), metil sulfonato (S). Los intercambiadores iónicos fuertes se ionizan completamente mientras que los intercambiadores iónicos débiles solo se ionizan parcialmente. 1.6.4 Cromatografía De Filtración En Gel O Exclusión Molecular Por Tamaño Es una técnica de separación valiosa por su sencillez y eficacia para separar mezclas complejas de macromoléculas, se puede utilizar con fines analíticos, por ejemplo para determinar pesos moleculares de sustancias. Permite separar moléculas solvatadas de acuerdo a su tamaña y habilidad para penetrar la estructura tamiz de la fase estacionaria. La capacidad separadora reside en Figura 33. Cromatografía de filtración en gel. Figura 34.Volúmenes columna cromatográfica. el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas microscópicas, constituidas por largas cadenas de polímeros, unidas entre sí por enlaces químicos, formando una red tridimensional. En el interior de una columna de cromatografía se pueden distinguir varios volúmenes: 36 • Volumen total, Vt, es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado. • Volumen de vacío, Vo, es el volumen existente entre las esferas de gel. • Volumen ocupado por las esferas de gel, es igual a Vt – Vo. Las moléculas de la muestra se separan de la siguiente manera: • Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las moléculas que componen el gel y solo se extraen de la columna cuando ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total, Vt. • Las moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas de gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el volumen vacío, Vo, siendo las primeras en salir de la columna. • Las moléculas de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas fraccionadamente. Cuanto mayor es una molécula, menor es su capacidad para acceder al interior de las esferas del gel, y por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla de la columna. La separación en la cromatografía de exclusión por tamaño se realiza por las diferencias en el tamaño de las diferentes moléculas y su habilidad para penetrar los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños y se usa para separar macromoléculas de origen biológico y la purificación de polímeros orgánicos sintéticos. 1.6.5 cromatografia de afinidad Utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas del soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria, por ejemplo, la molécula inmovilizada puede ser un anticuerpo específico para una proteína determinada. Al pasar a través de la columna, una mezcla cruda que contiene varias proteínas, sólo una proteína reacciona con el anticuerpo unido a la columna; después se lavan los demás solutos y la proteína que se desea separar es desplazada del anticuerpo cambiando el pH, la fuerza iónica o la polaridad. 37 Son ejemplo de interacciones biológicas típicas en la cromatografía de afinidad, las siguientes: • Enzima – sustrato análogo, inhibidor, cofactor. • Anticuerpo – antígeno, virus, célula. • Lecitina – polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula. • Ácido nucléico – secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteína de unión al DNA. • Hormona, vitamina – receptor, proteína acarreadora. • Glutatión – glutatión -S-transferasa o proteínas de fusión GST. • Iones metálicos – proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina, residuos de cisteína y/o triptófano en sus superficies. La matriz es un soporte inerte al cual un ligando se acopla directa o indirectamente. El ligando es la molécula que se une en forma reversible a moléculas específicas o a un grupo de moléculas, permitiendo la purificación por cromatografía de afinidad. La selección del ligando está influenciada por dos factores: • Afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco. • Presencia de grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su capacidad de unión. La cromatografía de adsorción es adecuada para analizar moléculas ionizantes, insolubles en agua, hidrocarburos y compuestos polifuncionales polares. Esta cromatografía no se ve influenciada por el peso molecular de las sustancias sino por los grupos funcionales específicos. En la actualidad las técnicas de cromatografía son herramientas imprescindibles para la ciencia, la tecnología y la industria en general. Figura 35. Cromatografía de afinidad. 38 Resumen. Vamos a completar los conceptos fundamentales que se relacionan con la unidad de aprendizaje, al terminar confrontamos los conceptos que hemos dado con el Glosario; este ejercicio nos permitirá realizar aprehensión de los conceptos básicos relacionados con el método de cromatografía. Tabla 7. Cromatografía Conceptos Definiciones Figura 36. Cromatografía Figura 37. Fase estacionaria Figura 38. Fase móvil o eluyente 39 Figura 39. Adsorción Rf Distancia recorrida por el pigmento distancia recorrida por el eluyente =Figura 40. Factor de retardo 40 Glosario TÉRMINO DEFINICIÓN Adsorción Capacidad de las superficies para fijar moléculas. Cromatografía La cromatografía (del griego chroma = color y graphos = escritura), se relaciona con los pigmentos fotosintéticos. Comprende un conjunto de técnicas de separación de mezclas complejas en disolución, basadas en las diferentes velocidades con las que se mueven los componentes de la mezcla analizada, a través de una fase estacionaria en interacción con una fase móvil. La muestra analizada interacciona tanto con la fase estacionaria como con la fase móvil. La naturaleza de las interacciones depende de las propiedades de las sustancias analizadas, como de la composición de las fases estacionaria y móvil. Cromatografía de adsorción Tipo de cromatografía que se basa en el diferente grado de adsorción de cada compuesto orgánico sobre la superficie de una sustancia químicamente inerte, denominada adsorbente, de manera que la muestra analizada se ve atraída a zonas polares de la superficie del adsorbente por fuerzas electrostáticas, quedando reversiblemente ligado a la misma. Cromatografía de afinidad Este tipo de cromatografía, utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas del soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria, por ejemplo, la molécula inmovilizada puede ser un anticuerpo específico para una proteína determinada. Al pasar a través de la columna, una mezcla cruda que contiene varias proteínas, sólo una proteína reacciona con el anticuerpo unido a la columna; después se lavan los demás solutos y la proteína que se desea separar es desplazada del anticuerpo cambiando el pH, la fuerza iónica o la polaridad. Cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular por tamaño En este tipo de cromatografía, la separación de los componentes de la muestra se realiza por las diferencias en el tamaño de las diferentes moléculas y su habilidad para penetrar los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños y se usa para separar macromoléculas de origen biológico y la purificación de polímeros orgánicos sintéticos. Cromatografía de intercambio iónico Es un tipo de cromatografía que permite la separación de moléculas con base en sus propiedades de carga eléctrica. 41 Cromatografía de partición líquido - líquido En este tipo de cromatografía los solutos se reparten entre una fase móvil líquida y otra fase estacionaria líquida soportada sobre un sólido inerte que no se mezclan entre sí, es decir son inmiscibles, por consiguiente los solutos se separan por su solubilidad Cromatograma Representación gráfica de los resultados obtenidos en la cromatografía. Desorción Emisión de un fluido previamente absorbido por un material. Disolvente Es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, recibe este nombre la fase líquida móvil en cromatografía de líquidos. Factor de retención Relaciona la distancia recorrida por cada pigmento y la del eluyente, según la ecuación: Rf Distancia recorrida por el pigmento distancia recorrida por el eluyente = Fase estacionaria Puede ser un sólido o líquido que se queda fijo en la misma posición. También se conoce con el nombre de fase inmovilizada. Fase móvil Puede ser un líquido o gas que corre a través de una superficie y de la fase estacionaria. También se conoce con el nombre de eluyente. Intercambiadores aniónicos Son portadores de grupos con cargas positivas que unen aniones de forma reversible. Intercambiadores catiónicos Son portadores de grupos con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Ligando Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas o grupos de moléculas. Matriz Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado. Muestra Es la mezcla que va a ser analizada mediante la técnica de cromatografía. Soluto Es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado. Tiempo de retención Es el tiempo característico que tarda una sustancia particular en pasar a través del sistema cromatográfico. 42 Tarea. Vamos a elaborar por grupos de trabajo, un video o presentación que incluya: • El análisis de la cromatografía sobre papel como método para realizar la separación de los pigmentos vegetales, utilizando las imágenes o videos de la práctica de laboratorio, los hallazgos que realizamos en la práctica, y la consulta sobre los pigmentos vegetales. • La indagación de un ejemplo a nivel científico, tecnológico, industrial o cotidiano, en los que se aplique la técnica cromatográfica asignada por el docente a cada grupo. La sustentación de los trabajos se realizará en la siguiente clase y se seleccionarán los mejores trabajos, los cuales serán publicados en el sitio web del colegio y en las redes sociales. 43 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Microscopio. Pixabay. (s.f.). Pixabay. Recuperado el 04 de Mayo de 2015, de Pixabay: http://pixabay. com/en/microscope-slide-research-close-up-275984/ Figura 2. Cromatografía sobre papel. Machado, N. (12 de 02 de 2012). YouTube. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de YouTube: https://www.youtube.com/watch?v=ztCDpu83mec Figura 3. El solvente sube por el papel. Machado, N. (12 de 02 de 2012). YouTube. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de YouTube: https://www.youtube.com/watch?v=ztCDpu83mec Figura 4. Separación de componentes. Machado, N. (12 de 02 de 2012). YouTube. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de YouTube: https://www.youtube.com/watch?v=ztCDpu83mec Figura 5. Cromatograma pigmentos vegetales. Machado, N. (12 de 02 de 2012). YouTube. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de YouTube: https://www.youtube.com/watch?v=ztCDpu83mec Figura 6. Variedad de pigmentos en las plantas Metros Cúbicos. (25 de Marzo de 2013). Metros Cúbicos. Recuperado el 21 de Mayo de 2015, de Metros Cúbicos: http://www.metroscubicos.com/articulo/decoracion-y- hogar/2012/08/20/trucos-caseros-para-tener-un-jardn-sano. Figura 7. Clorofilas a y b. Recursos CNICE. (s.f.). Recursos CNICE. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Recursos CNICE: http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/Fisiologia_ celular/contenidos8. Figura 8. Carotenoides. Interempresas. (s.f.). Interempresas. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Interempresas: http://www.interempresas.net/Horticola/Articulos/108217-Sustancias-fitoquimicas- de-frutas-y-hortalizas-su-posible-papel-benficioso-para-la-salud.html 44 Figura 9. Variedad de pigmentos en los frutos. Recetas de cocina. (18 de Agosto de 2010). Recetas de cocina. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Recetas de cocina: http://recetasdecocina.info/tag/frutos-secos/ Figura 10. Quimio Taxonomía. Palimpalen. (s.f.). Palimpalen. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Palimpalen: http:// www.palimpalem.com/4/InfoMicro/ Figura 11. Alga azul verdosa. Ejemplo de. (s.f.). Ejemplo de. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Ejemplo de: http:// www.ejemplode.com/36-biologia/1017-las_algas_verdeazules.html Figura 12. Bosque de algas pardas. Garzón, J. (s.f.). Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de http://www.granadasubmarina. org/art.php?id=Jorge%20Garz%F3n%20Guti%E9rrez&idMedio=2401 Figura 13. Jardín de algas rojas. Wallpaper Stock. (s.f.). Wallpaper Stock. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Wallpaper Stock: http://wallpaperstock.net/bosque-de-algas-marinas_ wallpapers_3285_1600x1200_1.html Figura 14. Algas verdes. Acuariofilia Madrid. (Febrero de 2013). Acuariofilia Madrid. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Acuariofilia Madrid: http://acuariofiliamadrid.org/Thread-ALGAS- FILAMENTOSAS Figura 15. Euglena. Biología I. (s.f.). Biología I. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Biología I: http:// cienciasnaturalesyexperimentales.mex.tl/965874_RESUMEN-BLOQUE-V- BIODIVERSIDAD.html Figura 16. Diatomeas. Ministerio de Educación España. (s.f.). Ministerio de Educación España. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Ministerio de Educación España: http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/micro/contenidos8.htm Figura 17. Algas pardas. Ministerio de Educación España. (s.f.). Ministerio de Educación España. Recuperado el 45 4 de Mayo de 2015, de Ministerio de Educación España: http://recursos.cnice.mec.es/ biosfera/alumno/2bachillerato/micro/contenidos8.htm Figura 18. Algas rojas. Ministerio de Educación España. (s.f.). Ministerio de Educación España. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Ministerio de Educación España: http://recursos.cnice.mec.es/ biosfera/alumno/2bachillerato/micro/contenidos8.htm Figura 19. Remolacha. Salud Viva. (s.f.). Salud Viva. Recuperado el 4 de Mayo de 2015, de Salud Viva: http:// www.saludviva.es/home/137-remolacha-en-polvo.html Figura 20. Frambuesa. Pixabay. (2015). Pixabay. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de Pixabay: http://pixabay. com/en/raspberry-berry-fruit-red-close-up-582834/ Figura 21. Algas verdes. Pixabay. (2015). Pixabay. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de Pixabay: http://pixabay. com/en/green-stone-trough-chao-gou-672984/ Figura 22. Girasol. Flickr. (26 de Febrero de 2009). Flickr. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de Flickr: https://www.flickr.com/photos/mamjodh/3311477776/galleries/ Figura 23. Papaya. Pixabay. (2015). Pixabay. Recuperado el 26 de Abril de 2015, de Pixabay: http://pixabay. com/en/fruit-papaya-food-653553/ Figura 24. Características de la fase estacionario o adsorbente. Creación propia. Figura 25. Características de la Fase móvil o disolvente. Creación propia. Figura 26. Interacción triple: muestra, disolvente, adsorbente. Creación propia. Figura 27. Detección de componentes de la muestra analizada. Creación propia. 46 Figura 28. Cromatografía de partición. Creación propia. Figura 29. Cromatografía de partición en fase normal y fase reversa. Creación propia. Figura 30. Fase estacionaria adsorbida. Creación propia. Figura 31. Fase estacionaria ligada. Creación propia. Figura 32. Cromatografía de intercambio iónico. Creación propia. Figura 33. Cromatografía de filtración en gel. Creación propia. Figura 34. Volúmenes columna cromatográfica. Alvarez, C., Díaz Zegarra, G., Hollman, L., & Maccuso, S. (s.f.). Educación Argentina. Recuperado el 7 de Mayo de 2015, de Educación Argentina: http://ufq.unq.edu.ar/ Docencia-Virtual/BQblog/Cromatografia%20de%20intercambio%20ionico.pdf Figura 35. Cromatografía de afinidad. Creación propia. Figura 36. Cromatografía. Química Recreativa. (s.f.). Química Recreativa. Recuperado el 21 de Mayo de 2015, de Química Recreativa: http://www.quimicarecreativa.org/cromatintas1.html Figura 37. Fase estacionaria. Educamix. (s.f.). Educamix. Recuperado el 21 de Mayo de 2015, de Educamix: http://www. educamix.com/educacion/3_eso_materiales/b_ii/actividades/act_cromatografia.htm Figura 38. Fase móvil o eluyente. El Bibliote. (s.f.). El Bibliote. Recuperado el 21 de Mayo de 2015, de El Bibliote: http:// elbibliote.com/resources/Temas/html/49.php 47 Figura 39. Adsorción. Creación propia. Figura 40. Factor de retardo. Creación propia. LISTAS DE TABLAS Tabla 1. Características de los pigmentos. Creación propia. Tabla 2. Pigmentos en Procariotas. Reol, E. M. (2003). Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la captación de luz para la fotosíntesis. Revista Ecosistemas 12(1)., 45-51. Tabla 3. Pigmentos en Eucariotas. Reol, E. M. (2003). Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la captación de luz para la fotosíntesis. Revista Ecosistemas 12(1)., 45-51. Tabla 4. Ejemplos de Quimio taxonomía. Creación propia. Tabla 5. Identifiquemos pigmentos en las plantas. Creación propia. Tabla 6. Cromatografía de partición. Romero, A. (2002). Cromatografía. México: Instituto de Biotecnología UNAM. Tabla 7. Cromatografía. Creación propia.
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