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1 CICLO ESTRAL CANINO En las 2 últimas décadas el conocimiento de la fisiología reproductiva del perro doméstico, Canis familaris, se han incrementado marcadamente. Este hecho se explica no solo por un aumento de la cría de perros de raza con fines comerciales, sino también por la utilización del perro domestico como modelo experimental de contrapartes silvestres en vía de extinción. Comparada con otras hembras domésticas, la perra posee características particulares en su ciclo estral, lo que dificulta la extrapolación de conceptos de fisiología reproductiva de otras especies. De esta manera, la hembra canina es la única especie doméstica monoéstrica. A diferencia de su contraparte silvestre, en la perra doméstica, la influencia del fotoperíodo es leve, especialmente en perras criadas como mascotas en el interior de casas o departamentos. Por otro lado, las hembras que viven al aire libre y en colonias tienen una influencia del fotoperíodo mas importante. El ciclo estral en esta especie es normalmente bifásico, es decir toda fase folicular es seguida por una fase lútea a partir de una ovulación espontánea. Otras de sus características diferenciales son la evolución lenta de cada una de sus fases y cierto grado de superposición de las fases folicular y lútea debido a la luteinización preovulatoria de los folículos, la ovulación de un oocito inmaduro y la aceptación del macho hasta 6 días después de la ovulación con niveles muy elevados de progesterona en sangre. Los intervalos interestro, definidos como los periodos entre un proestro y el siguiente, pueden variar normalmente entre 4 y 11 meses, con un promedio de 7 meses. Existen importantes variaciones dentro de este rango entre las distintas razas, los diferentes individuos y también en cada individuo, estando influído por factores genéticos, ambientales y de manejo, entre otros. En un estudio se encontró un ligero alargamiento de los intervalos interestro luego de celos seguidos de gestación en relación a los que seguían ciclos sin gestación. Con la edad, los intervalos interestro también tienden a alargarse. Por otro lado, los intervalos fuera del rango mencionado están asociados con infertilidad o subfertilidad. La excepción es el perro africano Basenji que presenta un único ciclo estral por año durante el otoño. Los mecanismos que regulan la terminación del anestro y el inicio de un nuevo ciclo, en los caninos, son diferentes a los de las especies poliéstricas; en esta especie el inicio de la ciclicidad esta disociado de la fase lútea precedente. El mecanismo endocrinológico que desencadena un nuevo ciclo estral en la perra no se conoce en detalle, prueba de esto es la dificultad existente en la inducción de ciclos estrales fértiles en esta especie. La edad de la pubertad está estrechamente relacionada con el tamaño corporal adulto, alcanzándose normalmente dentro de los 2 -3 meses de haber terminado el crecimiento. Por lo tanto, las hembras de pequeña talla llegan a la 2 pubertad antes (5 ó 6 meses) que aquellas de gran talla, (10 a 12 meses o hasta 24 meses en razas gigantes) donde las curvas de crecimiento son mucho mas prologadas en el tiempo. Es importante tener en claro que la pubertad no es sinónimo de madurez sexual y que esta última se adquiere a partir del segundo o tercer ciclo estral. En la etapa post-puber, la cachorra puede normalmente presentar variaciones en su ciclo estral, como estros silentes o fragmentados, que son producto de la inmadurez del eje gonadal y que desaparecen con la madurez sexual. La madurez sexual es coincidente con máxima eficiencia reproductiva y se mantiene hasta los 5 años, aproximadamente. A partir de este momento, la fertilidad comienza a disminuir paulatinamente, aunque los ciclos estrales persisten durante toda la vida de la perra. Fase Folicular Proestro Es la fase que comprende desde el comienzo del desarrollo folicular hasta el día del pico de hormona luteinizante (LH). Definido clínicamente, comprende desde el momento en que comienza la descarga vulvar hemorrágica hasta la primera aceptación del macho. Su duración es extremadamente variable, de 2 a 29 días con un promedio de 11-13 días. Los folículos comienzan a crecer en el ovario, y segregan estrógenos, que desencadenan los signos clínicos y de comportamiento característicos de esta etapa. Hormonalmente, el proestro se caracteriza por un gran aumento en la concentración sérica de estrógenos que disminuyen antes de que comience la etapa de receptividad sexual. Los niveles de estrógenos son de unos 15 pg/ml justo antes del inicio del proestro y alcanzan a más de 60-70 pg/ml hacia el final del mismo. Los folículos también segregan foliculostatina responsable de una retroalimentación negativa sobre la hipófisis que frena la liberación de hormona folículo estimulante (FSH), la que mantiene bajo su nivel en esta etapa. La progesterona permanece basal hasta el final del proestro, momento en que comienza a elevarse, debido a una luteinización preovulatoria de las tecas de los folículos. La testosterona aumenta al fin del proestro alcanzando al final del mismo niveles similares a los de los machos adultos. El descenso de estrógenos y el aumento de la progesterona ejercen un proceso de retroalimentación positiva sobre la hipófisis, que responde con una liberación masiva de LH y FSH. Estos picos se producen alrededor del primer día del estro. Los síntomas clínicos característicos del proestro son reflejo de la acción de los estrógenos sobre los diferentes órganos: Ovarios: se produce el desarrollo y crecimiento folicular. 3 Utero: comienza a prepararse para la implantación. Los cuernos se alargan, la sensibilidad del miometrio aumenta y el cérvix se agranda. Se produce una importante hiperemia, el grosor del endometrio aumenta, las glándulas endometriales proliferan y hay pasaje activo de eritrocitos hacia la luz uterina, produciéndose de este modo una descarga sanguinolenta por la vulva. El color de la descarga en esta etapa es rojo intenso. Vulva: se produce un edema importante con aumento de tamaño y turgencia. Vagina: sus paredes, se edematizan en forma bastante brusca y esto hace que se formen pliegues gruesos, de superficie lisa y brillante. El epitelio de la mucosa aumenta de espesor ocultando la irrigación subyacente, y la mucosa toma un color pálido. Citología vaginal: se torna superficial y van desapareciendo los leucocitos. Conducta: la perra se torna atractiva para los machos. La conducta va cambiando a medida que transcurre el proestro: al principio hay una franca agresión hacia los machos que intentan aparearse. Si se sujeta una perra en esta etapa y se permite montar al macho, la hembra apretará la cola contra el periné tratando de impedir la penetración. A medida que avanza el proestro, las perras comienzan a juguetear e incitar a los machos si bien aun no permiten la monta. El rechazo va disminuyendo hasta el simple hecho de sentarse. Estro Es el período durante el cual la hembra acepta el apareamiento. Su duración en promedio es de unos 9 días. Hormonalmente comienza con el pico de LH que desencadena la ovulación 48 horas más tarde. La duración de este pico varía entre 24 y 96 horas. La progesterona que había alcanzado 2 ng/ml durante el mismo, continúa ascendiendo hasta la ovulación y luego de que esta se produce, aumenta bruscamente a valores superiores a 30 ng/ml. Un valor superior a 8 ng/ml indica que la ovulación ya ha ocurrido. Los estrógenos disminuyen después de la ovulación hasta llegar a niveles basales hacia el final del estro. Para que se manifieste conducta de receptividad en la perra es necesario que haya niveles decrecientes de estrógenos y crecientes de progesterona. La perra ovula los oocitos en estadío de oocito primario, los óvulos necesitan dos días para madurar y se mantienen viables dos días más, es decir que el período de fertilizaciónde la perra es de cuatro a seis días después del pico de LH y 2 a 4 días después de la ovulación. Durante ese período se forman los cuerpos lúteos y la concentración de progesterona se eleva. Es razonable que siendo el período de máxima fertilidad la perra acepte al macho durante esta etapa. Ovarios: los folículos completan su crecimiento y luego se produce la ovulación, con formación de los cuerpos lúteos. Utero: se prepara para la implantación y se completa el desarrollo glandular. 4 Vulva: continúa aumentada de tamaño, pero pierde turgencia progresivamente a causa del descenso de los estrógenos, que produce una menor retención de líquido. La descarga vulvar sanguinolenta es menos abundante y de color más claro, si bien está presente en casi todas las perras, siendo más copiosa en perras de razas grandes. Vagina: al igual que la vulva, pierde turgencia. Los pliegues de la mucosa se subdividen y su superficie se torna menos lisa y brillante. Primero se forman pequeñas estrías semejantes a huellas digitales, y cuando la disminución del edema es mayor, toma el aspecto de papel crepé o pasa de uva. El epitelio es todavía grueso, por lo cual el color de la mucosa es pálido. Citología vaginal: la cornificación y el índice eosinofílico llegan a su máximo; las células son casi todas superficiales, el fondo de los frotis se aclara y desaparecen los leucocitos. Su presencia en esta etapa es siempre índice de infección. Conducta: persiste la atracción hacia los machos y el comportamiento pasa del rechazo, a la aceptación pasiva primero y más adelante a la búsqueda activa del macho. Pueden observarse varios reflejos que facilitan la cópula: si se toca la piel del periné, la vulva se eleva; si el contacto es con uno de los labios de la vulva, esta se orienta hacia el mismo lado y la cola se desvía en sentido contrario. Estos reflejos comienzan a notarse al final del proestro y se acentúan durante el estro. Es importante destacar que el comportamiento de las perras varía muchísimo de un ejemplar a otro: hay perras que no aceptan el macho en ningún momento de su celo aunque su endocrinología y ovulación sean normales, mientras que otras lo aceptan desde 3-4 días antes del pico de LH hasta varios días después de comenzado el diestro. Es por esto que es preferible definir el comienzo del estro hormonalmente, coincidiendo con el pico de LH, y su finalización por los cambios observados en la citología vaginal (ver diestro). Fase Lútea Diestro Es la etapa en la que predomina la actividad luteal. Comienza 8-9 días después del pico de LH y finaliza cuando la concentración de progesterona desciende a valores inferiores a 1 ng/ml. La perra no tiene una prostaglandina cíclica, por lo cual el cuerpo lúteo permanece activo durante un lapso similar en las perras preñadas, no preñadas e histerectomizadas. En las demás especies domésticas, se denomina metaestro al período durante el cual se forma el cuerpo lúteo y se elevan las concentraciones de progesterona; sin embargo, en la perra, durante este fenómeno, continúa la conducta de receptividad que define al estro, por lo cual decimos que la perra pasa directamente 5 del estro al diestro, que es la etapa de en la cual el cuerpo lúteo desarrolla su máxima actividad. Hormonalmente, los niveles de progesterona llegan a valores de entre 15 y 90 ng/ml durante el primer mes, alcanzando su máximo durante las 2-3 primeras semanas; luego se produce una meseta de una o dos semanas más y finalmente comienzan a declinar lentamente hasta volver a niveles basales alrededor de 70 - 90 días después del pico de LH. La acción luteotrófica es ejercida principalmente por la LH durante la primera mitad del diestro y por la prolactina, sola o en conjunto con la LH durante la segunda mitad. No se conoce la causa de la disminución de los niveles de progesterona, ya que tanto la LH como la prolactina aumentan en este momento. Utero: el útero permanece estimulado por la progesterona durante los dos meses de permanencia de los cuerpos lúteos, el endometrio tiene sus glándulas plenamente desarrolladas y activas. Esta condición predispone a la especie al desarrollo de la hiperplasia endometrial quística y la piómetra, patologías características de esta etapa del ciclo. Vulva: vuelve al aspecto típico del anestro, desaparece el edema y recupera su tamaño, forma y consistencia normales. Vagina: las paredes se adelgazan, y desaparecen los pliegues. Al comenzar el diestro, hay una descamación brusca del epitelio vaginal en colgajos que hace que la mucosa aparezca moteada, con parches rosados y más pálidos. El pliegue dorsal de la vagina, se torna reactivo y se contrae ante cualquier contacto, tomando forma de roseta que asemeja la imagen del cérvix de otras especies domésticas. Más adelante el aspecto es el mismo que encontramos durante el anestro. Citología vaginal: El primer día de diestro puede determinarse con mucha precisión por medio de la citología vaginal, que presenta cambios notables y repentinos respecto del aspecto que encontramos durante el estro: el porcentaje de células superficiales disminuye bruscamente y aparece una abundante cantidad de leucocitos. Esto ocurre con mucha regularidad entre 8 y 9 días después del pico de LH, permitiendo de este modo predecir el momento del parto y otros eventos que ocurren durante la gestación con mucha más precisión que basándonos en el cambio de la conducta de receptividad de la perra. Al descamarse el epitelio bruscamente, los primeros días del diestro coexisten todos los tipos de células: parabasales, intermediarias, superficiales y queratinizadas, y aparecen abundantes cantidades de leucocitos. Varios días más tarde las células son predominantemente parabasales persistiendo grandes cantidades de leucocitos. Luego de la primera semana de diestro, es imposible distinguirlo del anestro por citología vaginal. Conducta: La perra deja de atraer a los machos y aceptar el apareamiento. 6 Glándulas mamarias: se completa el desarrollo mamario y sobre el final de esta etapa se puede producir secreción láctea, coincidiendo con el descenso de la progesterona y la elevación de la prolactina. Diestro en la perra gestante En la perra gestante, los fetos estimulan la síntesis y secreción de prostaglandinas que lisan el cuerpo lúteo y producen un descenso brusco de la progesterona a niveles inferiores a 2 ng/ml que desencadena el parto 65 ± 1 día después del pico de LH. Por lo tanto en la especie canina, el cuerpo lúteo permanece activo durante más tiempo en la hembra vacía que en la preñada. En la perra la progesterona producida por el cuerpo lúteo es la única responsable del mantenimiento de la preñez. Esta se interrumpe inmediatamente si desaparece el cuerpo lúteo, ya sea a consecuencia de una luteólisis o de una ovariectomía. Los niveles iniciales son semejantes a los de las perras vacías; desde el día 30 hasta el parto, la secreción de progesterona es ligeramente mayor en las perras preñadas que en las vacías, probablemente debido al incremento en la secreción de prolactina que es luteotrófica. Un aumento simultáneo en el metabolismo y excreción fecal de la progesterona hace que sus concentraciones séricas no sean mucho más altas que en las perras no preñadas, además del efecto causado por la hemodilución en este período. Al final de la gestación, se produce un agudo aumento de prostaglandinas que alcanzan concentraciones luteolíticas y una rápida disminución de la concentración de la progesterona que desciende por debajo de 2 ng/ml durante las 24 horas previas al parto desencadenándolo. La prolactina sigue un perfil opuesto al de la progesterona: se eleva en el último tercio de la gestación y asciende bruscamente 1-2 días antes del parto, coincidiendo con la rápida disminución de la progesterona. Uno a dos días después del parto, las concentraciones de prolactina caen bruscamente paraluego elevarse en grados variables en respuesta a la succión. Los niveles de relaxina son inferiores a 0,25 ng/ml en las perras vacías, mientras que en las preñadas comienzan a aumentar a los 24-28 días de gestación, alcanzando un máximo de 3 ng/ml alrededor de las 6-7 semanas. La relaxina es de origen placentario y solo alcanza estos niveles en perras gestantes. Los estrógenos que descendieron a niveles basales hacia el final del estro, se mantienen bajos al principio del diestro. Durante las dos últimas semanas de gestación, aumentan ligeramente, sin llegar a producir signos clínicos. Los embriones ingresan al útero alrededor del día 11 y la implantación se produce a los 22-23 días. Alrededor del día 30-35 aparece una anemia normocítica fisiológica evidente que alcanza su máximo (con un hematócrito reducido a menos de 30-35%) al final de la gestación. 7 Pseudopreñez Durante la gestación se produce un desarrollo mamario fisiológico normal de las glándulas mamarias, que desencadena en una lactación normal luego del parto. En la perra vacía donde la situación hormonal es muy similar a la preñada, hay siempre un desarrollo mamario durante el diestro y descenso de la progesterona, liberación de prolactina y elevación de los estrógenos al terminar el mismo. En algunas perras, esta situación puede traer aumento del apetito, aumento de peso, agrandamiento abdominal. En casos más severos, lactación, signos de parto inminente, conducta de nidación, crianza de objetos inanimados y a veces hasta contracciones abdominales. Se desconoce la causa por la cual estos signos se desarrollan solo en algunos animales y no en otros, pero parece haber una relación estrecha con el ambiente en el que vive la perra, generalmente se ve muy poco en animales que viven en caniles o en el campo sueltos y mucho más en animales de departamento muy mimados o en contacto estrecho con sus propietarios. Si bien la falsa preñez es un estado fisiológico que habitualmente no requiere tratamiento, se ha reportado una correlación entre la aparición de pseudopreñeces clínicas y de tumores mamarios, que sugiere la conveniencia de tratarlas. Se han propuesto tratamientos a base de esteroides sexuales (andrógenos naturales y sintéticos, estrógenos y progestágenos), pero actualmente se recomienda la utilización de sustancias antiprolactínicas que dan un excelente resultado, ya que eliminan directamente la causa de su aparición: la elevación de la prolactina. La droga de elección es la cabergolina a una dosis de 5 µg/día durante 5 a 7 días por vía oral. Los preparados comerciales son Dostinex o Lactamax de medicina humana, (cada comprimido contiene 0,5 mg de droga, suficiente para 100 kg de peso, así que es necesario fraccionar adecuadamente los comprimidos para su administración) y Relay (Holliday) de uso veterinario. Anestro El anestro se define como el período comprendido entre el momento en que la progesteronemia decrece a valores basales (< 1-2 ng/ml [3 nmol/L]), lo que generalmente ocurre alrededor del día 90-100 del ciclo anterior, hasta el comienzo del siguiente proestro. La duración del anestro tiene un rango de uno a 9 meses. Las variaciones inter e intra- individuales en su duración son, consecuentemente, responsables de la diferencias de los intervalos interestro. Durante el anestro la perra no manifiesta cambios físicos característicos ni conducta sexual alguna. La vulva se halla pequeña y normalmente sin descargas, por su parte las mamas, generalmente han involucionado, aunque pueden aún persistir signos de pseudopreñez. Sin embargo, ni el ovario ni la pituitaria canina están inactivos durante el anestro y durante este largo periodo ocurren numerosos 8 cambios endócrinos. Esto último ha provocado la necesidad de subdividir al anestro en temprano, medio y tardío en estudios recientes. También, durante el anestro se completa, alrededor del día 120- 130, la regeneración del endometrio del ciclo anterior luego del largo estímulo de progesterona recibido durante la fase lútea. Esto adquiere especial importancia en perras que presentan intervalos interestrales anormalmente cortos (menores a 4 meses) los que pueden cursar con infertilidad. Desafortunadamente, la endocrinología de este período del ciclo estral canino, ha sido insuficientemente descrpita, quedando aún por dilucidar numerosos aspectos. Por ejemplo, la transición del anestro al proestro es aún un punto de controversia que limita, en gran medida, el control exógeno del ciclo estral canino. El anestro está caracterizado por una paulatina declinación de las concentraciones de progesterona. Los estrógenos, por su parte, fluctúan durante gran parte del anestro para aumentar sus concentraciones un mes antes del pico de LH y luego descender previo del comienzo del nuevo proestro. En la transición del anestro temprano al tardío se produce un aumento de la liberación de GnRH por el hipotálamo, de la sensibilidad de la pituitaria a esta hormona y de la respuesta ovárica a las gonadotrofinas. La LH y especialmente la FSH se incrementan a medida que progresa el anestro. En algunos trabajos se encontró que las concentraciones y la pulsatilidad de la LH aumentan antes del comienzo de un nuevo ciclo reproductivo. Por otro lado, recientemente se ha demostrado que la progresión del anestro temprano al tardío está asociada con un aumento de la FSH sin un ascenso concomitante de la LH. Esto indicaría que la FSH sería crítica para el inicio de la foliculogénesis ovárica y terminación del anestro. Finalmente, las concentraciones de prolactina disminuyen lentamente a través del anestro para alcanzar valores basales alrededor del comienzo del nuevo ciclo estral. Se ha postulado sobre el papel causal de la acción antigonadotrófica de la prolactina en el mantenimiento del largo intervalo interestro. No obstante, se demostró recientemente que es posible acortar el intervalo interestro con dosis bajas del agonista dopaminérgico, bromocriptina, sin provocar el descenso de las concentraciones de prolactina. Este hallazgo minimiza el papel del descenso de la prolactina en el comienzo de un nuevo ciclo. Conclusiones finales Resumiendo las principales características diferenciales del ciclo estral de la perra doméstica son: monoéstrico, estacionalidad variable, anestro obligatorio y prolongado, luteinización preovulatoria, ovulación espontánea de ovocitos primarios, conducta estral en presencia de concentraciones elevadas de progesterona, fase lútea prolongada con luteólisis progresiva y endocrinología similar entre ciclos con gestación y aquellos sin gestación. 9 ANESTRO TARDIO PRO ESTRO ESTRO DIESTRO DIESTRO TARDIO ANESTRO TEMPRANO MITAD DEL ANESTRO ANDROSTENEDIONA TESTOSTERONA PROGESTERONA Posible aparición de pseudopreñez ESTROGENOS PRE PROESTRO LH FSH Ovulación FOLICULOS CUERPOS LUTEOS GLANDULA MAMARIAS FASE FOLICULAR FASE LUTEAL -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Representación esquemática de los cambios endócrinos típicos que se producen durante el ciclo ovárico de las perras y su relación con las etapas observables y funcionales del ciclo.(Concannon). PROLACTINA ANESTRO TARDIO PRO ESTRO ESTRO DIESTRO DE GESTACIÒN LACTANCIA ANESTRO ANDROSTENEDIONA TESTOSTERONA PROGESTERONA ESTROGENOS LH Ovulaciones Maduración NIDACION PALPACIONES DE PREÑEZ RADIOGRAFIA FETAL PROLACTINA destete Anemia de preñez Hto < 40% Servicios fértiles Servicio temprano Servicio típico Servicio tardío Duración de la gestación 68 días 63 días 57 días FERTILIZACION -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 CICLO OVARICO CANINO GESTACION CANINA Representación esquemática de loscambios endócrinos típicos que se producen en el transcurso de un ciclo ovárico canino fértil incluyendo preñez y lactancia. (Concannon). 10 DETERMINACIÓN DEL MOMENTO DE OVULACIÓN Dr., Cuándo la sirvo? Esta suele ser una pregunta muy común entre los propietarios inexpertos de perras de cría. Generalmente el propietario que ha tenido algo de experiencia o contacto con criadores ya tiene algunas repuestas al respecto, que llamamos mitos, en los que cree firmemente. 1. El día XX (que puede ser desde 9 hasta 13 en la generalidad de las personas), contando desde que empezó la pérdida. Desmitificación: algunas perras deben servirse en el día 5 y otras en el 29. 2. Cuando deja de perder (cuando cesa la descarga sanguinolenta). Desmitificación: Es el peor de los mitos ya que se cumple pocas veces. La mayoría de las perras presentan una descarga sanguinolenta a partir del comienzo del proestro. Algunas (pocas) dejan de perder al principio del estro, otras pierden menos, pero en su gran mayoría continúan perdiendo durante toda esta fase, entonces si siguen este mito, el servicio será siempre tardío, generalmente en diestro. 3. Cuando se deja servir. Desmitificación: hay perras en las cuales el estro (conducta de receptividad al macho), coincide con el momento apropiado para la fertilización, pero otras aceptan al macho durante períodos prolongados (20 días o más) o no lo aceptan en ningún momento a pesar de ser fértiles. En general en las que aceptan al macho durante un período breve, este coincide con el de mayor fertilidad, pero hay casos en los que la receptividad se produce en un momento diferente (antes o después) del período fértil. 4. Cuando la pérdida se aclara, es decir cambia de rojo intenso a aguachento o pajizo. Desmitificación: hay perras en las que la pérdida es muy escasa y no puede identificarse el color, otras pierden abundante sangre roja todo el celo y otras no tienen pérdida hemorrágica en lo absoluto. Qué es un mito? Es una historia que se perpetúa por transmisión oral, que tiene generalmente su origen en algo real que luego se va transformando a través de la fantasía hasta convertirse en algo irreal. Todos nuestros mitos de servicio, tienen algo de real, su origen está fundado en hechos ciertos, la mayoría de las perras están para servir el día 11, o entre el 11 y el 13, en muchas la pérdida se aclara en esos días y en general se dejan servir. 11 Solo algunas perras de razas pequeñas dejan de perder durante el estro. Sin embargo, la perra que el día 11 aclara su pérdida, se deja servir y queda preñada, no concurre al consultorio para ver cuando es necesario servirla. Sabemos que la perra ovula oocitos inmaduros que necesitan 48 horas para madurar y estos óvulos pueden ser fertilizados durante las siguientes 48 hs. También sabemos que la ovulación ocurre 48 horas después del pico de LH. De este modo si pudiésemos detectar este pico podríamos determinar con precisión el momento óptimo para el servicio. Si bien hay un test para detectar LH, es costoso y hay que realizarlo a diario ya que el pico de esta hormona es muy breve. Hay otros métodos que nos permiten estimar cuando ocurre este fenómeno. Las otras hormonas relacionadas con el evento, son los estrógenos y la progesterona. Durante el pico de LH, la progesterona tiene su primer aumento preovulatorio y los estrógenos comienzan a descender. La progesterona se puede determinar fácilmente en sangre y los estrógenos pueden estimarse indirectamente mediante sus efectos sobre el epitelio y las paredes de la vagina. CITOLOGIA VAGINAL Consiste en la recolección de células de la superficie del epitelio vaginal, su tinción coloración y observación. Técnica de recolección: Se humedece un hisopo largo en solución fisiológica. Se dilata el vestíbulo vaginal mediante un dilatador nasal de medicina humana, y se introduce el hisopo hasta la vagina tratando de evitar tocar las paredes del vestíbulo vaginal. Se gira el hisopo, recogiendo material celular de las paredes de la vagina, y finalmente se extrae. Confección del frotis: Se apoya el hisopo sobre un portaobjetos y se lo hace girar sobre su superficie, dejando de este modo las células sobre el vidrio. Fijación: Debe hacerse una fijación húmeda. Como fijadores pueden utilizarse spray fijador de células, fijador para el cabello marca roby (etiqueta negra), una solución de alcohol éter en partes iguales durante dos minutos, o alcohol de 96 hasta el momento de la tinción. Es muy importante que las células no se sequen antes de ser fijadas, ya que de otro modo la coloración no se realiza adecuadamente. Coloración: Utilizamos la técnica de tinción de Shorr modificada por Schütte. 12 Coloración de Shorr modificada por Schütte: Preparación de los colorantes: Hematoxilina ácida de Erlich 1. Disolver 8 g de hematoxilina en 400 ml de alcohol 96 2. Disolver 12 g de sulfato de potasio y aluminio en 400 ml de agua destilada 3. Mezclar 1 y 2 4. Agregar 400 ml de glicerina más 400 ml de ácido acético glacial. Escarlata de Biebrich. 1. Escarlata de Biebrich 5 g 2. Orange G 2 g 3. Acido acético 5 ml 4. Agua destilada 500 ml Solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico 1. Acido fosfomolíbdico 10 g 2. Acido fosfotúngstico 10 g 3. Agua destilada 400 ml Solución de Fast green. 1. Fast green 3 g 2. Acido acético 3 ml 3. Agua destilada 400 ml Tinción 1. Fijar el preparado húmedo inmediatamente con spray fijador para células, o sumergiendo el preparado en una solución de partes iguales de alcohol y éter etílico para anestesia durante dos minutos o con sumergiéndolo en alcohol de 96 hasta el momento de la tinción. 2. Sumergir en alcohol 70 3. Sumergir en agua destilada 4. Teñir con hematoxilina ácida de Erlich durante 2 minutos 5. Sumergir en agua de canilla 6. Teñir con escarlata de Biebrich durante 2 minutos 7. Sumergir en agua de canilla 8. Colocar en ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico durante 2 minutos 9. Sumergir en agua de canilla durante 2 minutos 10. Sumergir en fast green durante 2 minutos 11. Sumergir en agua de canilla 12. Pasar el preparado por distintas diluciones de alcohol (96 – 100) y xilol 13. Montar en bálsamo de Canadá. 13 Aplicaciones: ?? Determinar la etapa aproximada del ciclo estral. ?? Diferenciar entre celo y endometritis. ?? Determinar el anestro para la administración de progestágenos. ?? Determinar con aproximación el momento óptimo para el servicio. ?? Comprobación de servicios no deseados. ?? Diagnóstico de infecciones subclínicas. ?? Diagnóstico de tumores. Determinación de la etapa del ciclo. Durante el anestro, el epitelio vaginal tiene muy pocas capas celulares: un estrato basal, uno espinoso y uno superficial. Todas las capas celulares están próximas al suministro sanguíneo que se encuentra bajo la capa germinal. Este epitelio es muy frágil y no podría soportar un acoplamiento. Los crecientes niveles de estrógenos durante el proestro, preparan el epitelio para el servicio. El aumento de capas celulares, hace que las células se alejen del suministro sanguíneo, degeneren y mueran. En estas células aparecen algunos precursores de la queratina, que hacen al epitelio más resistente. Epitelio vaginal durante el anestro Epitelio vaginal durante el estro También el endometrio cambia durante la estimulación estrogénica; hay un cambio en el espesor de la pared y en la actividad glandular, que al principio se asocia con un pasaje activo de eritrocitos a la luz uterina, y a la aparición del sangrado vaginal. Tipos de células. Las descripciones de los colores de las células, se refieren a la tinción de Shorr. 14 Son las células más sanas y pequeñas, redondeadas o ligeramente ovales, con núcleos grandes y cantidades relativamente pequeñas de citoplasma. Son célulasde la capa germinal. Se tiñen intensamente de verde. Varían en tamaño desde el de las parabasales hasta el doble de tamaño. Comienzan a presentar los primeros signos de degeneración: pierden su froma redonda, se vuelven más grandes con citoplasma mayor y núcleo más pequeño. Los bordes son un poco más irregulares, con uno o más ángulos. Superficiales. Son más grandes, más angulosas, con bordes doblados, y se tiñen de un color más pálido. Pueden tomar coloración roja o verde. El núcleo puede ser de diferentes tamaños: grande (intermediarias superficiales), pequeño (superficiales), o no existir (escamas anucleares). Intermediarias superficiales Escamas anucleares Parabasales Intermediarias 15 Son células vaginales intermediarias grandes con leucocitos polimorfonucleares en su interior. Aparecen en gran número al principio del diestro. Células con vacuolas en su interior. Se ven en diestro y anestro. Otras células que pueden observarse en los frotis vaginales son: Espermatozoides, eritrocitos, leucocitos, bacterias, levaduras y células tumorales. Cuadros celulares. Ya se han descripto en las diferentes etapas del ciclo, repetimos los conceptos principales. Morfología típicamente redondeada. Predominio de células basales e intermediarias pequeñas. Algunos leucocitos. Metaestrales Espumosas Anestro 16 Proestro Aumenta el número de células superficiales, aparecen eritrocitos y van desapareciendo los neutrófilos y las células parabasales. En el fondo suelen presentarse detritus. Solo aparecen células superficiales y comienzan a aparecer células queratinizadas que cambian de coloración. El porcentaje de estas células va aumentando hasta el momento de la ovulación, y luego disminuye. La aparición de leucocitos durante este período es siempre indicativa de un proceso infeccioso. El fondo aparece limpio. Luego de un servicio pueden observarse espermatozoides. Se produce una descamación brusca del endometrio y aparecen de repente gran cantidad de células parabasales y leucocitos. En los primeros días es característica la coexistencia de todos los tipos celulares: células parabasales, intermediarias, superficiales y queratinizadas, junto con leucocitos. En los días siguientes, el cuadro se parece más a un anestro con predominancia de células parabasales, pero con muchísimos leucocitos, cuyo número va disminuyendo con el correr de los días. Luego es imposible distinguir el diestro del anestro por medio de citología. Indice eosinofílico (IE): es el porcentaje de células que toman la tinción roja proporcionada por el escarlata de Biebrich. Se recorre el preparado en forma de guarda griega, como si fuera un frotis de sangre, y se cuentan las células rojas y verdes. Luego de contar por lo menos 100 células, el IE es el porcentaje de células rojas y se calcula así: Fin de proestro/estro. Diestro. 17 IE = número de células queratinizadas (rojas) X 100 número de células contadas Si se cuentan exactamente 100 células, el IE será igual al número de células queratinizadas. VAGINOSCOPÍA Si observamos las paredes vaginales mediante un proctoscopio pediátrico, podremos ver que durante el proestro, no existen pliegues de la pared, y la mucosa es rosada debido a que el fino epitelio que la recubre en esta etapa permite ver la vascularización subyacente. Durante el proestro, las paredes vaginales se edematizan en respuesta a los estrógenos y aumentan notablemente su grosor, se observan pliegues muy gruesos de superficie lisa y brillante, y la mucosa se torna más pálida debido al aumento de grosor del epitelio. Al descender los estrógenos alrededor del momento del pico de LH, las paredes comienzan a perder turgencia, y la superficie de los pliegues comienza primero a perder su brillo y es surcada por pequeñas arrugas semejantes a huellas digitales; más adelante los pliegues se subdividen y la mucosa se arruga mucho, tomando la apariencia de pasa de uva o papel crepé. Al comenzar el diestro, los pliegues desaparecen, y la mucosa toma durante unos días una apariencia moteada, debido a la descamación no uniforme del epitelio que presenta diferentes grosores según la zona dando diferentes coloraciones. Anestro Proestro Estro 18 DETERMINACIÓN DE PROGESTERONEMIA Es un excelente método, ya que si nos encontramos cerca del pico de LH nos permite estimar con precisión el momento en que se produjo y de lo contrario nos dice si la ovulación ya ocurrió o no. Sabemos que la progesterona comienza a subir alrededor momento del pico de LH (2 ng/ml), y que cuando llega a 6-7 ng indica ovulación. Valores altos de progesterona de 15 o más ng/ml, indican que la ovulación ya pasó y debemos hacer un control citológico para asegurarnos que no estamos en diestro. Existe en el mercado un test de ELISA semicuantitativo que se puede realizar en el consultorio. Tiene un alto porcentaje de error y además en este momento debido al cambio desfavorable resulta muy caro. Se puede realizar el estudio por quimiolumniscencia obteniéndose los resultados en el día, con la ventaja adicional de que el método es cuantitativo. A pesar de lo tentador que parezca basarnos solamente en la determinación de progesterona sérica, es conveniente combinar todos los métodos (citología vaginal, progesteronemia, vaginoscopía y observación clínica y del comportamiento) para diagnosticar correctamente el momento óptimo para el servicio. Siempre hay que tener en cuenta qué nos indica cada parámetro: La vaginoscopía nos aporta datos de que la perra está en proestro temprano (hormonalmente hablando) cuando encontramos pliegues grandes y brillantes y que es temprano para hacer una determinación de progesterona aunque hayan pasado muchos días desde que empezó la descarga hemorrágica. La progesteronemia, es la más precisa, ya que antes del momento de servicio se encuentra baja, si bien cuando es menor de 2 ng/ml no nos dice nada además de que todavía faltan más de 4 días, y si está alta nos dice que la ovulación ya pasó, pero no sabemos cuándo. La curva de índice eosinofílico tiene forma de campana, con lo cual un solo frotis no nos va a indicar nada más que la etapa del ciclo en la que nos encontramos: estrogénica o no estrogénica. Sin embargo es útil para determinar que la perra ya está en diestro. Una citología seriada nos dará más datos al poder observar la evolución del ciclo. Es importante saber combinar la utilización de los métodos, teniendo encuentra si están disponibles y los costos de cada uno, para llegar a un diagnóstico lo más certero posible, tratando de ocasionar la menor cantidad de gastos a los propietarios de las perras. 19 Bibliografía ?? “Endocrinología y reproducción canina y felina”. Feldman y Nelson. Editorial Intermédica. Tercera Edicion (2007). ?? “Reproducción en caninos y felinos domésticos. M.Wanke.- C. Gobello. Editorial Intermedica. (2006). ?? “Temas de reproducción de caninos y felinos por autores latinoamericanos.” C. Gobello. Editorial Intervet. (2004). ?? “Reproducción y cuidados de la periperturienta”. Clínica Veterinarias de Norteamérica, práctica en Pequeños Animales. Editorial Inter-vet.(1990) ?? “Reproducción en el perro y en el gato” J. Christiansen. Editorial Inter- vet.(1989). ?? “Problemas clínicos de reproducción canina”. Joshua. 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