179214945007

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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios
ISSN: 1856-9161
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Fundación Instituto de Estudios Avanzados
Venezuela
Franco, Alicia Y.; Longart, Marinés
Aplicaciones de la proteína verde fluorescente (GFP) en la biología celular y en la visualización del
sistema nervioso
RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios, vol. 1, núm. 2, julio-diciembre, 2009, pp. 84-96
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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. Nº 2. Serie verde | Caracas, julio- diciembre 2009
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Aplicaciones de la proteína verde fluorescente 
(GFP) en la biología celular y en la 
visualización del sistema nervioso
Applications of Green Fluorescent Protein (GFP) in Cell Biology 
and Visualization of the Nervous System. 
Alicia Y. Franco,¹* Marinés Longart²*
La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una herramienta útil para la biología celular, una proteína que 
tiene la propiedad de emitir luz verde. La proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) ha sido modi-
ficada para emitir colores en muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con proteínas derivadas de otros 
organismos, ofrece nuevas variedades de proteínas fluorescentes. Entre otras características que la hacen, sin duda, 
especial, la proteína fluorescente destaca por no necesitar intermediarios para su expresión en cualquier organismo 
vivo, ser susceptible de modificación para mejorar su intensidad, cambiar colores de emisión, construir quimeras 
con otras proteínas y servir de gen reportero, sensor bioquímico y medidor sensible de pH intra e intercelular, etc. 
Desde su descubrimiento en 1962, la proteína ha sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las 
áreas de la biología. La neurociencia ha sido una de las más beneficiadas por los múltiples usos de la GFP. Uno de 
ellos ha sido marcar neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha permitido visualizar las redes de 
la arquitectura neural de un mismo organismo de una manera sin precedentes. La presente revisión bibliográfica 
se enfoca en la descripción de parte del descubrimiento de la proteína GFP, así como de sus variantes, principales 
aplicaciones y su actual utilización en la visualización de neuronas del sistema nervioso central.
Palabras clave
GFP, GFP supereclíptica, GFP fotoactivable, aquorina 
Keywords
GFP, supereclíptic GFP, fotoactivable GFP, aequorin.
 The bioluminiscent jelly fish Aequorea victoria provides a powerful tool to cell biology, a protein that fluo-
resces with the emission of green light. The green fluorescent protein (GFP) has been modified to emit in 
many different wavelengths. The GFP, together with other proteins derived from different organisms, of-
fers an immense variety of fluorescent proteins. This protein shows features that make it special; no other 
factors are needed for its expression in any living organism, it can be modified to improve its intensity, to 
change emission colors, to construct chimera with other proteins, it can also be used as a reporter gene, 
biochemical sensor, sensitive intra and intercellular pH meter, etc. Since the discovery of the protein in 
1962 it has experienced many changes and its applications extend to all areas in biology. Neuroscience is 
one of the areas more benefited with the application of GFP. One of these applications involves the in vivo 
labeling of neurons with multiple fluorescent colors which allow visualizing the neural network architecture 
as never seen before, up to 90 different colors in a same organism. In the present work, we performed a 
review that goes from the discovery of GFP, its variants, main applications and to its use in the visualiza-
tion of neurons in the central nervous system. 
¹ Universidad Simón Bolívar, Decanato de Estudios Profesionales. 
² Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados, Caracas, Venezuela
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINÉS LONGART. 
Historia de la GFP
En el año 1962, Shimomura, Johnson y Saiga publicaron 
sus hallazgos sobre el aislamiento de un extracto obteni-
do de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, del 
que lograron obtener a su vez dos proteínas: la aquorina 
(nombre derivado de la especie con que trabajaban) y 
la proteína verde (Shimomura et al., 1962; Shimomura, 
2005). 
Aunque el objetivo principal de esa investigación era la 
obtención de aquorina, proteína dependiente del calcio, 
estos investigadores identificaron de manera accidental 
una segunda proteína de color verde (Shimomura et al., 
1962; Shimomura, 2005). Se determinó que la proteína 
verde tenía un pico en el espectro de emisión a 508 nm, 
cercano al que emite el tejido vivo de la medusa, mien-
tras que la aquorina pura lo tenía a 470 nm en la zona 
azul del espectro visible; esto indicaba cierta interacción 
entre las dos proteínas. De estas observaciones se deter-
minó que la proteína verde convertía la emisión azul de 
la aquorina en verde brillante mediante un proceso de 
transferencia de energía, sin emisión y reabsorción de 
radiación (Tsien, 1998; Fernandez et al., 2006).
En 1969, Morin y Hastings (citado por Shimomura, 2005) 
la llamaron por primera vez proteína verde fluorescen-
te (GFP) por sus características luminiscentes emitidas 
en cierta longitud de onda. En 1974 esta proteína fue fi-
nalmente purificada y cristalizada (Morise et al., 1974; 
Tsien, 1998). En el año 1992 fue secuenciada por primera 
vez mediante técnicas de cDNA (Prasher et al., 1992); 
pero no fue hasta 1994 que Chalfie (Chalfie et al., 1994), 
por un lado, e Inouye y Tsuji (citado por Tsien, 1998), 
por otro, lograron conservar su fluorescencia en un cul-
tivo con otros organismos procarióticos y eucarióticos. 
Con ello demostraron que el gen de la GFP por sí solo 
contiene toda la información necesaria para sintetizar 
el cromóforo postraduccionalmente y que no requiere 
la acción de enzimas específicas de la medusa Aequorea 
victoria.
Características de la GFP 
La proteína verde fluorescente presenta dos picos de 
excitación: el primero, cercano a los 395 nm; el segun-
do, de 475 nm, y también dos picos de emisión: si es 
excitada a los 395 nm su pico de emisión será a los 508 
nm, y si, por el contrario, es excitada a 475 nm, entonces 
la emisión ocurrirá a 503 nm (Tsien, 1998), cuando esto 
ocurre la proteína capta mayor luz fuera del espectro vi-
Introducción
La fluorescencia es la emisión de radiación electromag-
nética en la región visible por parte de una molécula o 
átomo luego de la absorción inicial de un fotón. (Chang, 
2002). El descubrimiento de proteínas que tienen capaci-
dad fluorescente (proteínas fluorescentes, en inglés, fluo-
rescent proteins o FP), nativas de organismos acuáticos 
que poseen bioluminiscencia, ha sido una revolución en 
la biología celular. Existen proteínas fluorescentes natu-
rales que emiten su fluorescencia en rangos de distintos 
colores, como verde y rojo; éste último proveniente del 
coral Discosoma sp. (Shaner et al., 2003). Otras proteínas 
verdes fluorescentes se atribuyen a organismos como el 
cnidario Renilla reniformis (Ward et al., 1979; Loening et 
al., 2007). 
Sin embargo, la proteína proveniente de la medusa 
Aequorea victoria,que han denominado proteína verde 
fluorescente nativa (Green Fluorescent Protein, GFP, 
por sus siglas en inglés), ha sido la que más impacto 
dentro de la comunidad científica ha tenido; de hecho, 
en octubre de 2008, los investigadores Osamu Shimo-
mura, Martin Chalfie y Roger Tsien fueron galardona-
dos con el Premio Nobel de Química por sus trabajos 
con la proteína verde fluorescente. El descubrimiento 
tuvo gran impacto cuando se observó que la GFP con-
servaba su propiedad fluorescente incluso dentro de or-
ganismos distintos al de la medusa, lo que representaba 
una gran ventaja respecto a otros tipos celulares (Chalfie 
et al., 1994; Shaner et al., 2007).
En la biología celular, estas proteínas permiten obtener 
datos sobre localización, dinámica y redes de interacción 
molecular con otras proteínas de gran resolución tem-
poral y espacial (Tsien, 1998). A estas proteínas se les 
considera marcadores de localización (genes reporteros) 
porque permiten el monitoreo de los cambios bioquí-
micos dentro y entre las células, o de cualquier otro fe-
nómeno dinámico que se desee observar sin necesidad 
de tinción o fijación de la célula. Para la neurociencia es 
relevante, entre muchas otras razones, porque favorece 
el estudio de las redes neuronales y de las conexiones 
sinápticas in vivo. 
El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar una 
breve historia de la proteína verde fluorescente y descri-
bir algunas de sus aplicaciones, especialmente las utili-
zadas para visualizar células del sistema nervioso.
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absorbancia y fluorescencia (Heim et al., 1994).
Al analizar la estructura cuaternaria se hizo patente que 
las altas concentraciones de GFP resultan de un fenó-
meno de agregación de subunidades de la misma proteí-
na y de otras proteínas de la membrana, conocido como 
dimerización, que inhibe la fluorescencia o la reduce 
por debajo de la intensidad mínima requerida para ser 
visible. Es necesario 1 μM (aproximadamente 105 copias 
en un volumen celular de 1-2 pL) de GFP correctamente 
plegada (Tsien, 1998) para que la proteína pueda emitir 
luz. 
En el año de 1996, Yang y sus colaboradores (Yang et al., 
1996) establecieron que en la formación de la interfase 
de dimerización intervienen residuos hidrofóbicos como 
Leu (206), Leu (221) y Phe (223), y residuos hidrofílicos 
como Tyr (39) y Glu (142), entre otros. El fenómeno de 
dimerización pudo ser solventado al crear una mutación 
en el residuo 206. En la figura 3 se muestran las imáge-
nes del GFP dimerizado y del GFP monómero (Zhang 
et al., 2002). 
Otra característica de capital importancia de la GFP fue 
la observada por Chalfie y colaboradores, quienes al in-
sertar ADN complementario en un vector de expresión 
en células procariotas (Escherichia coli) y eucarióticas 
(Caenorhabditis elegans), pudieron comprobar que la 
sible y la convierte en luz visible verdosa. La proteína 
está conformada por 238 aminoácidos, cuya secuencia, 
descifrada por Prasher y sus colaboradores (Prasher et 
al., 1992), se muestra en la figura 1.
La estructura terciaria de la proteína consiste en un ba-
rril beta de 40 Å, formado por once hojas β antiparalelas, 
acompañadas de una hélice α con el cromóforo al centro 
de dicha estructura, tal como se muestra en la Figura 2 
(Ormo et al., 1996).
La GFP presenta un cromóforo p-hidroxibenzilidenei-
midazolinona (Prasher et al., 1992), sujeto a la hélice 
dentro del barril. Dicho cromóforo se forma por la ci-
clización espontánea y la oxidación de los residuos 65 
– 67, correspondientes a los aminoácidos Ser 65– Tyr 66 
– Gly 67 (subrayados en la figura 1) de la proteína nativa, 
y es el responsable de la emisión de luz verde. Las se-
ries de residuos de aminoácidos están acompañados de 
grupos polares que propician la presencia de moléculas 
de agua, adyacentes al cromóforo (Heim et al., 1994). La 
síntesis del cromóforo comienza con el plegamiento de 
la proteína en su conformación inicial y la formación de 
imidazolina por un ataque nucleofílico del grupo amino 
de Gly-67 sobre el carbonilo del residuo 65, para produ-
cir deshidratación. Al final, el oxígeno molecular quita 
el hidrógeno del enlace Cα-Cβ del residuo Tyr 66 y crea 
un anillo fenólico con el imadazólico, el cual producirá 
!
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!FIGURA 1. Secuencia aminoacídica de la GFP nativa. Los aminoácidos 
subrayados son los que conforman el cromóforo 
(Tomado de Prasher et al., 1992).
FIGURA 2. Esquemas de la forma terciaria de la proteína nativa GFP: 
A) Esquema original tomado de Ormo et al., 1996, obsérvese la forma de 
barril (cilíndrica) de la proteína; B) Se observan las hojas β (color verde) 
dispuestas diagonalmente para formar la estructura cilíndrica y el cro-
móforo en el centro del barril (color naranja); C) Vista superior de la GFP 
donde se observa la hélice α (fucsia) y las hojas β (mostaza). Esquemas 
tomados de la página web del laboratorio del Dr. Tsien, disponible en: 
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINÉS LONGART. 
Muchas otras FP que exhiben tonos desde el anaranjado 
hasta el rojo no derivan de la GFP de A. victoria, sino 
de una proteína fluorescente roja obtenida de un coral 
no bioluminiscente (Matz et al., 1999), por lo que no se 
desarrollarán en el presente trabajo.
De todas las variantes hasta ahora obtenidas, la de ma-
yor uso (actualmente producida por la casa comercial 
Clontech) es la EGFP (por sus iniciales en inglés, en-
hanced green fluorescent protein), la cual es una versión 
mejorada de la GFP nativa. Este fue el primer grupo de 
FP que combinaba un alto brillo con sólo un pico de 
excitación (Tsien, 1998). La mutación más común, que 
causa ionización del fenol en el fluoróforo, es el rempla-
zo de Ser 65 por Thr, también llamada S65T. El pico de 
absorbancia ocurre a 489 nm y el de emisión a 509 nm, 
de ahí su fluorescencia verde (Patersonn et al., 1997). Las 
variantes EGFP muestran un decremento paulatino del 
fotoblanqueamiento, en contraste con la GFP nativa que 
muestra un incremento inicial y luego un rápido descen-
so en la fluorescencia (Patterson et al., 1997). Dentro de 
las ventajas que presenta la variante EGFP, se encuen-
tran una oxidación cuatro veces más rápida que la de la 
GFP nativa, una formación del cromóforo mucho más 
rápida y una producción de fluorescencia también más 
rápida y con mayor estabilidad, cuando el plegado se ex-
presa a temperatura ambiente y a 37° C (Tsien, 1998). 
La proteína fluorescente azul BFP (del inglés, Blue 
Fluorescent Protein) fue la primera variante creada y re-
sultó de una mutación del aminoácido 66 Tyr por His 
(Y66H). Presenta un pico de excitación a los 384 nm y 
de emisión a los 448 nm. Esta variante inicialmente re-
portó problemas con la velocidad de plegamiento y bajo 
rendimiento cuántico (Sharner et al., 2007). Esta variante 
también tiene versiones mejoradas, como EBFP(del in-
glés, enhanced BFP), con mayor brillo y fotoestabilidad, 
obtenida por una mutación de la Y145F (Tsien, 1998), y 
SBFP2 (del inglés, strongly enhanced BFP), con aun me-
jor brillo y estabilidad que la EBFP, que, sin embargo, 
permite monitorear las células vivas durante un tiempo 
considerablemente mayor que el que ofrecen el resto de 
las proteínas (Shaner et al., 2007). Dentro de las ventajas 
que presenta esta familia de FP azules está su utilidad 
como marcadores dobles (Sharner et al., 2007).
La variante proteína fluorescente azul-verde CFP (del 
inglés, Cyan Fluorescent Protein) presenta un espectro 
de emisión de fluorescencia entre los 470 y los 500 nm, 
aproximadamente. Dentro de las mutaciones introduci-
das se encuentran N146I, M153T y V163A, como versio-
nes mejoradas (ECFP), con un pico de excitación a los 
452 nm y de emisión a los 505nm, las cuales presentan 
Aequorea victoria no requería sustratos exógenos ni co-
factores para producir fluorescencia. El trabajo de Chal-
fie y su equipo fue, además, el primero atribuir a esta 
proteína la cualidad de marcador genético y localizador 
de proteínas en organismos vivos (Chalfie et al., 1994).
Variantes de la GFP
Se conocen decenas de proteínas mutadas derivadas de 
la GFP de Aequorea victoria (nativa), cuyas alteraciones 
producen propiedades físico-químicas distintas a la ori-
ginal, y en las cuales se ha mejorado su expresión (ma-
yor fluorescencia, cambios en el rango de excitación y 
emisión; cinética de oxidación del cromóforo, fotoesta-
bilidad, etc), pero sin modificar el comportamiento ge-
neral de la proteína (Knee et al., 1998). La clasificación 
de las variantes de la GFP son diversas porque toman en 
cuenta distintas características, como la estructura del 
cromóforo (Zacharias et al., 2006), el rango de emisiones 
en el espectro visible (Sharner et al., 2007) y las aplicacio-
nes como sondas intracelulares (Miyawaki, 2003).
 La creación de estas mutantes fue originada por la ne-
cesidad de frenar la tendencia de la proteína a dimerizar, 
porque esa propensión limitaba sus aplicaciones in vivo 
(Fernandez et al., 2006). De esta manera, la GFP nativa 
fue modificada para obtener variantes con emisión en 
diferentes rangos espectrales y estabilidad en la forma 
cuaternaria de la proteína (Heim 1994; Ormo, 1996). A 
continuación se mencionan las mutantes más impor-
tantes y, en el Anexo 1, se muestra un cuadro resumen. 
FIGURA 3. El dímero de GFP se forma por altas concentraciones de 
dicha proteína y el monómero fue producido por una mutación en el 
aminoácido 206, que suprime la tendencia a dimerizar. Tomado y modi-
ficado de Zhang et al., 2002.
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nativa es poco sensible a los cambios de pH en el rango 
cercano al fisiológico (Ward, 1988, citado por Ashby et 
al., 2004) y que no desarrolla fluorescencia en organelas 
ácidas como lisosomas, endosomas o el aparato de Gol-
gi, si los valores de pKa son cercanos al 4,5 (Tsien, 1998). 
Las versiones mutadas de EGFP presentan mejorías con 
respecto al fotoblanqueado (disminución hasta de un 
50%), pero aún insuficientes para aquellos estudios que 
requieran mayor sensibilidad (Ashby et al., 2004)
El proceso de sensibilidad al pH por parte de la GFP fue 
propuesto y probado a finales de 1997 por dos grupos 
de investigadores (Kneen et al., 1998 y Palm et al., 1997, 
citado por Ashby, 2004), los cuales propusieron que la 
sensibilidad al pH es consecuencia de la protonación 
y desprotonación de importantes residuos aminoacídi-
cos en el centro del cromóforo, el cual es críticamente 
sensible y, en consecuencia, susceptible de emitir o no 
fluorescencia, incluso al variar un protón, sobre todo en 
condiciones acídicas (Ashby, 2004).
Nuevas mutaciones, con sensibilidad diferenciada al 
pH, pueden ser utilizadas para medir los ambientes in-
tracelulares, el tráfico de proteínas (tanto por comparti-
mentos subcelulares como en el citosol) y las cercanías 
de la membrana celular. De hecho, en el año 1998, fue-
ron creadas dos variantes de GFP, llamadas pHluorins 
(Miensenbock et al., 1998). La primera, denominada 
pHluorins radiométrica, muestra cambios reversibles de 
excitación entre pH 7.5 y 5.5, y la otra, pHluorins eclíp-
tica, decrece su absorbancia cuando el pH disminuye y, 
por debajo de 6.0, con el pico de excitación a 475 nm, no 
está presente y la proteína pierde su fluorescencia, mien-
tras que a pH 7,4 se observa el máximo de su fluorescen-
cia (Miensenbock et al., 1998). La pHluorin eclíptica está 
altos niveles de brillo, fotoestabilidad y poca sensibilidad 
a los cambio de pH, muy útiles para algunas estrategias 
de microscopia de fluorescencia, como FRET (que expli-
caremos más adelante) y marcajes dobles. (Tsien, 1998; 
Sharnert et al., 2007). 
La proteína fluorescente amarilla YFP (del inglés, Yellow 
Fluorescent Protein) fue diseñada luego de dilucidar la 
estructura cristalizada de la GFP, que reveló que el re-
siduo Thr 203 estaba cerca del cromóforo (Ormo et al., 
1996). La mutación de este residuo a Tyr otorgó mayor 
estabilidad al cromóforo en su estado excitado, con un 
pico a los 514 nm y un pico de emisión a los 527 nm 
(Patterson et al., 1997). Sin embargo, la YFP presenta 
sensibilidad a cambios de pH y a los haluros, por lo que 
las versiones más utilizadas de esas PF son la mCitrine, 
mVenus, SYFP y YPet (en inglés,Yellow fluorescent pro-
tein for energy transfer; en español, Proteína Fluores-
cente Amarilla para Transferencia de Energía), las cua-
les presentan más brillo que YFP y mayor resistencia a 
los ambientes ácidos (Patterson et al., 1997). 
Las variantes de la GFP no sólo establecen cambios en 
los espectros de emisión y absorción (al proporcionar 
distintos colores), o mejorías en la estructura del cromó-
foro para darle mayor estabilidad a la proteína, también 
aportan otras características físicas que permiten eva-
luar las actividades celulares, como sensibilidad al pH, 
concentraciones de calcio, etc. (Miyawaki, 2003). 
La GFP fotoactivable posee la particularidad que lue-
go de una radiación intensa a 413 nm, que le produce 
apagamiento, incrementa su fluorescencia 100 veces 
cuando es activada con luz a 488 nm y prolonga su es-
tabilidad por días bajo condiciones aeróbicas (Patterson 
et al., 2002). Al estudiar algunas variantes, como indica-
dores no invasivos de pH intracelular, Kneen y colabo-
radores, en 1998, observaron, por medio de mediciones 
con microscopios de fluorescencia acoplados a cámaras 
CCD, que la GFP es sensible a cambios en la acidez del 
medio en una unidad de pH, en aproximadamente el 
50% de las células. También observaron que la fluores-
cencia responde de forma reversible a cambios rápidos 
de pH tanto in vivo como in vitro, lo que constituye la 
única ventaja de las mutaciones estudiadas (GFP-S65T; 
Y66H; T203I; F64L). Comparada con otros indicadores 
químicos, la GFP fotoactivable tiene baja toxicidad para 
la célula por su inercia química y por su procedimiento 
no invasivo. 
Según estos autores, un indicador de pH fluorescente 
ideal debe tener alta sensibilidad, una respuesta rápida 
ante los cambios de pH y buenas propiedades ópticas 
(Kneen, et al., 1998). También se conoce que la GFP 
FIGURA 4. Espectro de pHluorins ecliptico a pH mayores y menores de 
6.0. Eje de las X, longitud de onda de excitación. Eje de las Y, intensidad 
de fluorescencia. Consultado en Enero del 2009, en World Wide Web: 
http://www.bristol.ac.uk
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINÉS LONGART. 
proteínas. Esta capacidad se ha denominado Transfe-
rencia de energía de resonancia fluorescente (del inglés, 
Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET. Zacco-
lo, 2004). El FRET es un fenómeno mecánico cuántico 
que ocurre cuando existe transferencia de energía entre 
dos fluoróforos próximos, generalmente a distancias 
menores de 100 Å, y el espectro de emisión de uno, el 
fluoróforo donador, se superponecon la emisión del 
segundo, que actúa como receptor. De esta manera, la 
excitación del donador produce la emisión del receptor 
con la transferencia de energía (Tsien, 1998), y la fluo-
rescencia del donador (molécula excitada) disminuye, 
mientras que la del receptor aumenta (Takanishi et al., 
2006). Otros autores proponen que la distancia para que 
se produzca la transferencia de energía puede variar en-
tre 2 a 6 nm, si los dos cromóforos están adecuadamente 
orientados en el espacio con una eficiencia mayor al 30% 
(Zaccolo, 2004). 
La eficiencia de esta técnica del FRET va a depender de 
la diferencia de energía entre los fluoróforos donante y 
receptor, lo que implica que la velocidad de la transferen-
cia de energía es proporcional al solapamiento entre el 
espectro de emisión del donante y el espectro de absor-
ción del receptor (Fernandez et al., 2006). Al medirlo, la 
eficiencia de la transferencia de energía es inversamente 
proporcional a la sexta potencia de la distancia entre los 
dos fluoróforos (Takanishi et al., 2006).
Los primeros pares de fluoróforos usados para estudiar 
la transferencia de energía entre proteínas pertenecen a 
las familias de las GFP y a las de BFP; sin embargo, las 
BFP tienen poca duración ya que presentan blanquea-
miento (Zaccolo, 2004). Actualmente, la pareja que pre-
senta mayores ventajas para este tipo de análisis son las 
mutantes de las familias de las CFP y las YFP, mucho 
más estables que las BFP (Heim et al., 1994). 
La fuerte dependencia con la distancia y la ventaja que 
presenta el poder utilizar el sistema de medición en or-
ganismos in vivo y en tiempo real han hecho de FRET 
una herramienta muy útil en estudios biológicos de 
proximidad molecular y de cambios conformacionales 
(Takanishi et al., 2006). También ofrece una alta resolu-
ción temporal y espacial en el seguimiento de la interac-
ción proteína-proteína, en cualquier lugar de la célula, 
y la cuantificación del grado de disociación o de asocia-
ción in situ (Tsien, 1998). Entre las desventajas, podemos 
mencionar la necesidad de la correcta orientación espa-
cial de los fluoróforos para que sea eficiente la transfe-
rencia de energía, y la necesidad de controles positivos y 
negativos (Tsien, 1998).
Para cuantificar FRET se han descrito varias estrategias. 
fusionada a un receptor N-terminal de glutamato que 
le permite eliminar su fluorescencia al encontrarse con 
un pH menor de 6.0 (dentro de vesículas intracelulares, 
por ejemplo), mientras que si la proteína se acerca a la 
membrana celular, el pH aumenta y se observa una gran 
fluorescencia (Miensenbock et al., 1998). 
Aplicaciones de las Proteínas Fluorescentes (FP)
Son múltiples las aplicaciones de las FP en la ciencia. 
Dentro de las más comunes está su utilización como 
marcador fusionado a polipéptidos o como indicador 
de estados químicos-fisiológicos intracelulares, en todo 
tipo de células, subcompartimentos celulares y organis-
mos, desde procariotas hasta mamíferos. La FP también 
es útil a diversas disciplinas de la biología y la medicina. 
Esto se puede verificar simplemente mediante un bus-
cador de artículos científicos reconocido, en donde con 
sólo introducir GFP en la palabra clave, miles de publi-
caciones saldrán a la vista.
Si la FP es usada como marcador fusionada a otra proteí-
na, Tsien la clasifica como una aplicación pasiva que sólo 
refleja los niveles de expresión de la proteína diana o la 
ubicación subcelular de dicha proteína. Se debe recordar 
que la FP, al no ser una enzima, resulta un excelente 
indicador porque no interfiere con el mecanismo fisioló-
gico de la célula (Tsien, 1998; Fernández et al., 2006).
Si la FP es unida a otras proteínas, en donde la fluores-
cencia depende de las condiciones del medio, se pueden 
crear sensores capaces de monitorear procesos comple-
jos intracelulares, como actividad y visualización de las 
señales en cascadas, cambios de pH, calcio, voltaje, po-
tasio, dinámica de segundos mensajeros, activación en-
zimática, interacción proteína-proteína y cambios con-
formacionales, por lo cual, entonces, serían clasificados 
como indicadores activos (Tsien, 1998; Miyawaki, 2003; 
Zaccolo, 2004). 
 Aplicaciones más avanzadas son posibles si se unen las 
propiedades de las FP a otras técnicas, como las de mi-
croscopia de fluorescencia para los estudios en células 
vivas. Estas técnicas confieren acertadas ventajas sobre 
los estudios en tejidos fijados, en los que no se aprecia la 
dinámica del sistema que se desea estudiar.
Aplicaciones de las FP en la microscopia 
de fluorescencia
De todas las aplicaciones mencionadas, la más frecuen-
temente utilizada es la de sensor bioquímico, que mues-
tra la transferencia de energía por resonancia entre dos 
90
RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. Nº 2. Serie verde | Caracas, julio- diciembre 2009
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métodos cuantitativos o cualitativos de FRAP. Si se de-
sea determinar el coeficiente de difusión de la proteí-
na, la cantidad de movimiento aleatorio de la moléculas 
no blanqueadas, la capacidad de recuperación mole-
cular en una fracción determinada o la viscosidad del 
microambiente en donde está la proteína se utilizan los 
métodos cuantitativos de FRAP; pero si lo que se desea 
observar es el proceso de difusión de la proteína en una 
única célula, o si la proteína de interés es parte de un 
gran complejo proteico, se utilizan los métodos cualita-
tivos, que requieren imágenes de alta calidad. (Snapp et 
al., 2003)
La técnica del FLIP (del inglés, Fluorescence Loss In 
Photobleaching) está estrechamente relacionada con el 
FRAP, con la diferencia que FLIP sigue la ruta del fluo-
róforo fotoblanqueado, mientras que el FRAP sigue la 
recuperación de la fluorescencia en la región fotoblan-
queada. Esta técnica puede ser utilizada para examinar 
el movimiento o difusión de moléculas dentro de las 
células o membranas. Típicamente, una membrana ce-
lular está marcada con un marcador fluorescente (pue-
de ser expresión de una proteína de fusión con GFP), 
y un área específica de la membrana es fotoblanquea-
da con el láser del microscopio confocal. La intensidad 
de la fluorescencia de esa región se mide a lo largo del 
tiempo. Ocurre un movimiento de moléculas fluores-
centes dentro del área fotoblanqueada, la cual restaura 
lentamente la fluorescencia en dicha área mientras se 
extingue la fluorescencia en otras regiones. En estas úl-
timas regiones se calcula la pérdida de fluorescencia a 
lo largo del tiempo, a través de la medición de la inten-
sidad de fluorescencia (Lippincott-Schwartz et al., 2001). 
Esta técnica revela principalmente las conexiones entre 
diferentes regiones y compartimentos celulares y el es-
tudio de flujo proteico entre ellos (Snapp, 2003). Para los 
análisis con FLIP es necesario obtener imágenes antes 
e inmediatamente después del primer blanqueado, y así 
sucesivamente con los blanqueados posteriores, hasta 
que desaparece la fluorescencia (Snapp et al., 2003). 
Por último, en iFRAP (FRAP inversa) toda la región de 
fluorescencia, por lo general toda la célula, excepto la 
zona de interés, es blanqueada. En las imágenes post-
blanqueamiento se mide la disminución de la fluo-
rescencia de la región no blanqueada (Goldman et al., 
2004).
Una de ellas consiste en la medición de la disminución 
de la fluorescencia del donante respecto al aumento de 
la fluorescencia del receptor (con mediciones basadas 
en el aumento de la emisión del donante si se destru-
ye el aceptor; por ejemplo, por fotoblanqueamiento). Tal 
cuantificación permite determinar la eficiencia absoluta 
de FRET, método que se conoce como “acceptor photo-
bleaching”. Otra estrategia contempla la medición de 
la separación espectral de las imágenes del donante de 
energía (en el caso de CFP) y la de la emisión del aceptor 
(en el caso de YFP), mediante algoritmos establecidos 
por la contribución de cada proteína en los dos canales 
de detección (emisión y recepción); a este método se le 
conocecomo emisión sensibilizada (Fernández et al., 
2006). 
La cantidad de fluorescencia que emite el donador y la 
velocidad con la que las proteínas se unen y se separan 
(reacción que generalmente es muy rápida) también 
pueden ser medidas por medio de la microscopia. La 
técnica FLIM (por las siglas en inglés, Fluorescence Li-
fetime Imaging Microscopy) permite saber la vida media 
de la fluorescencia de un cromóforo. (Bastiaens, 2006). 
La imagen microscópica es capaz, entre otras cosas, de 
evaluar FRET en tiempo real, al medir la intensidad de 
la fluorescencia que la señal emite y estudiar las reaccio-
nes bioquímicas que ocurren en una localización parti-
cular dentro de una célula (Bastiaens et al., 1999).
Otro conjunto de técnicas avanzadas, que unidas a las 
FPs presentan múltiples aplicaciones, son las técnicas 
de fotoblanqueado. El fotoblanqueamiento es una alte-
ración fotoinducida que destruye la fluorescencia de un 
cromóforo (Snapp, 2003). Estas técnicas difieren por el 
tamaño de la región a blanquear, el número de even-
tos blanqueadores y la forma de analizar la fluorescen-
cia. Las técnicas de blanqueamiento más comunes son 
FRAP, FLIP e iFRAP (Goldman et al., 2004)
FRAP es una técnica que permite la recuperación de la 
fluorescencia después del fotoblanqueamiento (FRAP, 
del inglés Fluorescence Recovery After Photobleaching). 
Cuando se aplica un rayo láser de alta intensidad sobre 
cierta zona celular, que presenta una proteína unida a 
una FP, la fluorescencia desaparece de la zona y es ne-
cesario recurrir a la microscopia confocal para seguir el 
movimiento de las moléculas no blanqueadas hacia la 
zona blanqueada. Con el uso de una luz de menor in-
tensidad como la que provee el microscopio, es posible 
observar la recuperación paulatina de la fluorescencia, 
que se había perdido debido a la migración lateral de los 
fluoróforos no blanqueados (Snapp et al., 2003).
Dependiendo de lo que se desee estudiar, se utilizarán 
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ALICIA Y. FRANCO Y MARINÉS LONGART. 
guieron, además, crear un ratón doble transgénico que 
expresaba dos PF simultáneamente (YFP y CFP o GFP y 
RFP) (Feng et al., 2000).
Los ratones transgénicos fueron generados por DNA pu-
rificado del complejo Thy 1, asociado a cada variante de 
la FP (específicamente EGFP, EYFP, ECFP y DsRed1 de 
clontech), dentro de oocitos fertilizados. Para seleccio-
nar los ratones positivos visualizaron las uniones mus-
culares in vivo y con estos ratones positivos estabilizaron 
la línea de animales transgénicos (Feng et al., 2000). El 
gen thy1 es un miembro de la superfamilia de las in-
munoglobulinas y codifica una glicoproteína de la su-
perficie celular, que se expresa en varios tipos celulares 
que incluyen fibroblastos, células de cáncer de ovario, 
células endoteliales, células hematopoyéticas, linfocitos 
T y neuronas (Rege y Hagood, 2006; Lewis, 2008).
Feng y colaboradores (2000) lograron expresar las FP 
en uniones neuromusculares (mostradas en la figu-
ra 5) y probaron la no toxicidad de las proteínas GFP, 
YFP y CFP en sus experimentos. La RFP mostró me-
nor porcentaje de efectividad en la producción de ra-
tones transgénicos (14% vs 84% de las otras tres FP).
El marcaje con dos colores en neuronas fue posible en 
un mismo ratón al cruzar thy1-CFP con thy1-YFP o 
thy1-GFP con thy1-RFP. Los colores muestran algunas 
zonas del sistema nervioso periférico (SNP) y central 
(SNC), en donde las neuronas expresan las FP en pares 
(figura 6).
La desventaja de la aplicación del marcaje con dos colo-
res fue que en algunas zonas del sistema nervioso que 
debieron colorearse y mostrar la actividad de la zona no 
lo hicieron. Aunque lograron marcar selectivamente 
neuronas, estos marcajes no se expresaron en todo el 
sistema nervioso (Feng et al., 2000).
En un estudio realizado en el 2005, que utilizó métodos 
Expresión de proteínas fluorescentes 
en el sistema nervioso
Desde hace más de un siglo, el estudio del sistema ner-
vioso ha atraído a un gran número de investigadores 
ansiosos de dilucidar su arquitectura y dinámica, para 
lo cual se hizo necesario poder visualizar la disposición 
de las neuronas. Hasta finales del siglo XIX no existían 
técnicas que lo permitieran. Golgi planteó entonces la 
técnica “reazione nera” (reacción negra), que permitió 
observar por primera vez una preparación histológi-
ca del Sistema Nervioso al teñir varias células a la vez. 
Luego, Santiago Ramón y Cajal, al utilizar esta técnica 
y otras que desarrolló en sus estudios, dilucidó la teoría 
de la conexión nerviosa y descubrió que la neurona es la 
unidad anatómico-funcional del sistema nervioso, teoría 
que aún es válida en nuestros días. Otras técnicas que 
desarrolló fueron la tinción de las células del sistema 
nervioso con azul de metileno y con plata, que tuvo ma-
yor acogida que la realizada con azul. (Cajal, 1907 citado 
por Jones, 2007).
 Aunque estas técnicas de tinción fueron muy útiles, la 
información obtenida resultaba bastante limitada. Con 
la llegada de las FP, algunos investigadores comenzaron 
a marcar neuronas de diversas formas, con el fin de es-
tudiar la arquitectura del SNC con más detalle, e incluso 
lograron obtener imágenes de células in vivo (Niel et al., 
2004). Dentro de las estrategias de marcado, se encuen-
tran aquellas que involucran la expresión permanente 
de proteínas fluorescentes en mamíferos, con la cons-
trucción de animales quiméricos. Entre los mamíferos, 
el ratón es el que se ha usado de manera más extensiva 
como modelo experimental, debido a que sus genes son 
homologables a los de los humanos, y porque los rato-
nes representan un organismo único como modelo para 
el estudio de la organogénesis, inmunología, neurobio-
logía y reproducción (Branda et al., 2004).
En el año 2000, un grupo de investigadores (entre ellos 
Feng, Mellor, Berstein, entre otros) logró marcar selec-
tivamente, con varias proteínas fluorescentes, neuronas 
en el ratón. Posteriormente, generaron ratones transgé-
nicos que expresaban GFP, RFP, YFP y CFP, y con ello 
alcanzaron a etiquetar la totalidad de la morfología de 
algunas neuronas, como los axones, y de las termina-
ciones nerviosas, dendritas y espinas dendríticas. Estos 
investigadores lograron que cada una de las variantes 
de las FP mencionadas se expresara en neuronas in vivo 
y demostraron que la expresión de todas estas proteí-
nas fluorescentes no afecta la función de la neurona ni 
presenta toxicidad en las estructuras sinápticas. Consi-
!
FIGURA 5. Uniones Neuromusculares en ratones transgénicos que 
expresan diversas PFs. a) Expresando thy1-YFP, b) Expresando thy1-GFP, 
c) Expresando thy1-CFP y d) Expresando thy1-RFP. (Tomado de Feng et 
al., 2000).
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DNA para catalizar su recombinación. La técnica tiene la 
particularidad de que la expresión de Cre está controlada 
por un promotor específico de la célula diana. Sólo en el 
momento y en el lugar donde el promotor esté activo, 
la enzima Cre también lo estará. (Lodish et al., 2005). 
Los resultados de la investigación se muestran en la 
figura 7. 
Basados en las investigaciones hasta ahora comenta-
das, científicos de la Universidad de Harvard, a finales 
de 2007, lograron obtener imágenes sin precedentes al 
marcar diferencialmente neuronas hasta con 90 colores, 
con una técnica a la cual denominaron Brainbow (Livet 
et al., 2007). Brainbow (juego de palabras que combina 
brain, cerebro, y rainbow, arco iris) es un transgén crea-
do con métodos de clonación estándar que usan XFPs y 
el sistema de recombinación Cre/lox. Las XFP son poli-
péptidos compuestos por 3 o más FP, entre las cuales se 
encuentran las EGFP, EYFP, CFP y otras FP derivadas 
del coral Discosoma sp. (Livet et al., 2007). Estos autores 
también usaron recombinación aleatoria por medio de 
sitios Lox (loxN, loxp y lox2272) e incorporaron secuen-
cias de algunas FP, ya mencionadas, con lo cualsólo una 
genéticos de mosaico, Zong y otros colaboradores gene-
raron y marcaron, por recombinación de cromosomas 
homólogos de células somáticas de ratón, a las células 
progenitoras de los gránulos cerebelares de la capa mo-
lecular de la corteza cerebelar. Con una, dos y hasta tres 
proteínas fluorescentes lograron marcar diferencial-
mente parte del sistema nervioso de los ratones genéti-
camente modificados. Estos investigadores modificaron 
un sistema de gen knockout condicional al utilizar la 
estrategia Cre – loxP (Zong et al., 2005). A esta modifica-
ción metodológica la denominaron MADM (Análisis de 
mosaico con marcadores doble) y básicamente consis-
tió en introducir dos genes quiméricos, cada uno con-
teniendo el extremo N terminal de un marcador (GFP, 
color verde) y el C Terminal del otro marcador (ds Red, 
rojo), interrumpidos por un intrón conteniendo el sitio 
loxP. De esta manera es posible obtener los dos colores 
en las neuronas de los ratones.
La estrategia Cre-loxP, que permite inactivar genes dia-
na en tipos específicos de células somáticas, o en mo-
mentos particulares de su desarrollo, consiste en la apli-
cación de la enzima llamada Cre en sitios específicos del 
!!!
FIGURA 6. Doble marcaje de PF en un mismo ratón transgénico. Izq.: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) provenientes del cruce entre rato-
nes thy1-GFP y thy1-RFP. Centro: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) que expresan thy1-CFP con thy1-YFP. Der.: Neuronas de la corteza (SNC) 
provenientes del cruce entre ratones thy1-GFP y thy1-RFP (Tomado de Feng et al., 2000).
FIGURA 7. Izquierda. Corte sagital de cerebro de ratón adulto que muestra la expresión de la GFP uniforme (1mm). Centro. Corteza cerebral de ratón 
adulto que muestra distinción entre neuronas verdes, rojas y con el doble coloreado (50 μm). Derecha. Grupo de células de los gránulos cerebelares que 
expresan la GFP y la RFP, pero no su combinación (100 μm). (Tomado de Zong et al., 2005)
! ! !
92 93
ALICIA Y. FRANCO Y MARINÉS LONGART. 
de las proteínas podía expresarse. Construyeron 4 tipos 
de constructos que denominaron Brainbow 1.0; 1.1; 2.0; 
y 2.1. Por ejemplo, Brainbow 1.0 posee EGFP, EYFP 
y M-CFP, los cuales, al expresarse en cada célula, per-
mite sólo uno de los eventos. Incorporaron también al 
constructo el gen Cre, que invierte el segmento de ADN 
independientemente en cada célula, y cuando este gen 
es usado, se obtienen múltiples expresiones de las XFP 
(Livet et al., 2007).
Inicialmente, para probar sus constructos, utilizaron cé-
lulas HeK 293 y luego transfectaron estos mismos trans-
genes en neuronas (Figura 9) y en glias (Fig. 10). Estos 
autores probaron que Brainbow es una técnica muy pro-
misoria con múltiples ventajas, no sólo en el trazado de 
mapas entre conexiones neurales, sino también con las 
glias y con las células postsinápticas musculares (Livet 
et al., 2007).
Conclusiones y Perspectivas
- Para expresar GFP no es necesaria la acción de cofac-
tores de la medusa A. victoria. Con tan sólo oxígeno (ne-
cesario para sintetizar el cromóforo) se puede expresar 
esta proteína en cualquier organismo eucarionte o pro-
carionte.
- La GFP está formada por 238 aminoácidos y posee un 
cromóforo constituido por 3 residuos aminoacídicos. Su 
estructura cuaternaria es de barril b.
- Se crearon variantes (modificadas por unos pocos ami-
noácidos) que logran expresar longitud de ondas dife-
rentes y que proporcionan así varios tonos de fluores-
cencia y características en su intensidad (fotoactivable) 
y sensibilidad al pH (pHluorins).
- Una de sus grandes ventajas es que la GFP no presen-
ta toxicidad para la célula y permite su observación con 
una mínima alteración del sistema in vivo.
- Aplicado a la microscopía de fluorescencia, la GFP y 
sus variantes pueden ser utilizadas en técnicas como 
FRET, FRAP, FLIM y FLIP.
- En su aplicación a estudios en el Sistema Nervioso, téc-
nicas como Brainbow pueden utilizarse para descifrar el 
diagrama de conexiones del sistema nervioso, no sólo en 
personas sanas, sino también en enfermas, pues es útil 
para observar los cambios anatómicos y fisiológicos que 
sufre el cerebro en estados de enfermedad. 
Sin duda, las PF tienen un amplio futuro como indica-
dores lumínicos que permiten aplicar sus potenciales 
fotoquímicos a la biología celular, estructural, medici-
na, diagnóstico, embriología, biotecnología, botánica y 
muchas otras áreas de la ciencia. A pesar de que son 
muchos los investigadores que estudian y utilizan estas 
proteínas actualmente, podríamos afirmar, sin temor a 
equivocarnos, que son muchas las aplicaciones que aún 
no se han descubierto, pero que en un futuro próximo 
nos sorprenderán.
!
FIGURA 8. Brainbow 1.0 aplicado a células Hek 293 donde se muestra 
la expresión de las XFP bajo efectos de Cre. Tomado y modificado de 
Levit et al., 2007.
FIGURA 9. Se muestran a la izquierda fibras musgosas del hipocampo 
que expresan Brainbow 1.1. A la derecha, el giro dentado del hipocampo 
que expresa Brainbow 1.1. Tomado de Levit et al., 2007.
FIGURA 10. Expresión de Brainbow 1.1 en astrocitos. 
Tomado de Levit et al., 2007.
! !
!
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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. Nº 2. Serie verde | Caracas, julio- diciembre 2009
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Anexo 1
Nombre 
común 
Según la 
estructura 
del 
cromóforo 
Color de 
fluorescencia 
en el 
espectro 
Pico de 
excitación 
(nm) 
Pico de 
emisión 
(nm) 
Ventajas / Desventajas 
GFP nativa Clase I: 
Equilibrio 
fenol-
fenolato 
Verde Presenta 2 
picos 
395-397/ 
475 
508 / 503 Aunque requiere uso de filtro, la excitación 
con UV es conveniente porque es 
invisible; sin embargo, hay que tomar en 
cuenta que la autofluorescencia y la 
posibilidad de fotodegradación de los 
tejidos son más severas con excitación 
por UV. 
EGFP Clase II: 
Cromóforo 
fenolato 
Verde 488 507-509 La oxidación del fluoróforo es cuatro veces 
más rápida que en la proteína salvaje. Es 
estable cuando se expresa a temperatura 
ambiente y el plegado fue mejorado a 37º 
C, pero tiende a plegarse mal y producir 
agregados no fluorescentes a 
temperaturas mayores 
H9 clase III: 
Fenol en el 
cromóforo 
Verde 399 511 Estas mutantes poseen la ventaja de ser 
fotoquímicamente más simples, carecen 
del pico de excitación a 479-490 nm, por 
lo que pueden emplearse junto con las 
GFP clase II para un doble marcaje. 
EYFP / 
Topaz 
Clase IV: 
Fenolato 
en sistema 
electrónico 
! apilado 
amarillo 508-512 518-529 Algunas de estas mutantes exhiben un 
decaimiento en el rendimiento cuántico 
con pérdidas de fluorescencia superiores 
al 90%, por cortos períodos de vida. Otras 
versiones provenientes de PF de coral han 
sido mejoradas. 
ECFP Clase V: 
Indol en el 
cromóforo 
Turquesa 
(Cyan) 
434-452 476-505 Muy útiles para FRET y marcajes dobles. 
Una versión mejorada mTFP1 introduce 
una variante monomérica a esta familia 
con alto brillo y fotoestabilidad, pero esta 
mutación no es derivada de Aequorea 
victoria. 
BFP /EBFP Clase VI: 
Imidazol en 
el 
cromóforo 
Azul 380-384 440-448 Son útiles para marcajes dobles. A pesar 
de que mediante mutaciones se ha 
mejorado su velocidad de plegamiento, las 
BFP tenían bajo rendimiento cuántico, 
pero nuevas versiones han sido 
mejoradas (SBFP2). 
 
TABLA I. Se muestra la clasificación por familias de las variantes derivadas de GFP de Aequorea Victoria. Tomado y modificado de Tsien 1998 
y Sharnet et al., 2007.