Para determinar con más precisión algunos de estos cambios in vivo se procedió a caracterizar los cambios con la técnica de HRMAS a alta resolución...

Para determinar con más precisión algunos de estos cambios in vivo se procedió a caracterizar los cambios con la técnica de HRMAS a alta resolución de biopsias de tejido. 5.1.1.5. Análisis del patrón metabolómico por HRMAS ex vivo Como se comentó en la sección1.6.5.1 la técnica de HRMAS permite una mayor resolución espectroscópica debido a las características de la propia técnica así como a la posibilidad de trabajar a mayor campo magnético, aunque requiere el uso de biopsias, y por lo tanto, ex vivo. Para la obtención de muestras para el análisis ex vivo se utilizó un subgrupo de animales no isquémicos-F (n=3), a 1 día-F (n=3) y a 7 días-F (n=3) post-isquemia, que se sacrificaron utilizando la técnica de la irradiación por FMW (-F). En este subgrupo de animales el volumen de infarto a 1 día fue de 198± 116mm3 y en el grupo de 7 días de 213 ± 110 mm3. Todos los animales fueron sometidos a exploraciones de ERM in vivo antes del sacrifico para poder establecer comparaciones entre ambos patrones espectroscópicos, in vivo y ex vivo. 5.1.1.5.1. Validación de la técnica Para poner a punto la técnica, en cuanto a la preservación del patrón metabolómico ex vivo, se determinó mediante la evaluación del cociente PCr/Cr (3,95/3,93 ppm)que debería ser similar lo descrito in vivo. Ya que en los espectros obtenidos para los animales investigados in vivo a 7 Teslas no se puede diferenciar la PCr de la Cr, se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica de artículos donde indicaban cocientes PCr/Cr o datos de concentraciones individuales que los permitieran calcular. Para intentar minimizar la variabilidad que pudiera haber entre los trabajos encontrados y nuestros experimentos, solo se seleccionaron resultados de los trabajos que cumplieron las siguientes características: 1) ratas sanas (ya que no se ha encontrado ningún artículo con ratas isquémicas) y 2) datos de PCr/Cr provenientes de ERM, ya que las cuantificaciones por otras metodologías también son post-mortem y pueden tener la variabilidad intrínseca causada por la técnica de sacrificio escogida ( Tabla 8). Referencia Cociente PCr/Cr Medida Técnica Rata PROMEDIO 1 (Pfeuffer et al. 1999)# 0,83 Concentración ERM in vivo Sprague Dawley 0,89 ± 0,05 2 (Lei et al. 2009) 0,9±0,1 Concentración ERM in vivo Sprague Dawley 3 (Tkac et al. 2001)# 0,93 Concentración ERM in vivo Fischer 4 (Detour et al. 2011) 0,30 Concentraciones calculadas respecto a phantom de Lac. HRMAS ex vivo Wistar Tabla 8: Tabla resumen de artículos que han determinado los valores de PCr y Cr mediante técnicas de ERM. Los datos corresponden a ERM in vivo a excepción del artículo 4 (marcado en gris) que da información sobre el cociente PCr/Cr en espectros de HRMAS de rata sana sacrificada con la metodología de irradiación FMW. El símbolo (#) indica que no daban información sobre el cociente de interés y fue calculado a partir de los valores de metabolitos promedio que ofrecían en el trabajo. En el artículo 4, las “concentraciones calculadas respecto a phantom de Lac” significa que el phantom contenía una concentración conocida de Lac a partir de la cual se infirió la cuantificación del Lac de las biopsias. Sin embargo, al ser el cociente significativamente distinto (según el test de Grubbs) al cociente de la literatura in vivo, no se tuvo en cuenta para calcular el promedio que se muestra en la última columna. Para la comparación de los resultados obtenidos en nuestro estudio, ya que tanto el metabolito de la PCr como el de la Cr son singuletes y permiten una integración relativamente sencilla se hizo un cálculo del cociente PCr/Cr en áreas, en lugar de intensidades normalizadas, ya que así es más similar a los datos in vivo que obtienen las concentraciones a partir de las áreas de los metabolitos que contrib