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permitiendo la determinación del metabolito del lactato, que es propio del infarto cerebral pero también del metabolismo isquémico post-mortem. Discusión general 259 El uso de la espectroscopía ex vivo HRMAS es una de las técnicas que en la actualidad ofrece mejor resolución para estudios metabolómicos en tejidos, permitiendo una resolución muy superior a los estudios in vivo. Mediante esta técnica se pueden detectar los compuestos que contienen colina que son indistinguibles directamente in vivo, por ese motivo in vivo se referencian como TCho (3,21 ppm) o también se puede diferenciar el lactato (1,33-1,35 ppm) de los LM2 (1,28 ppm). Una de las principales ventajas de la técnica HRMAS es que no necesita procesamiento previo de la muestra, con lo cual se evitan las pérdidas de metabolitos que se pueden dar en el proceso de la extracción y se mantiene la integridad del tejido (más similar a los estudio in vivo). Mediante el uso de esta técnica se han podido obtener espectros de alta resolución tanto de infarto como de las zonas subventriculares, donde se produce la proliferación de las CPNs. El HRMAS post-FMW puede ser una excelente técnica que actúe como paso intermedio entre los estudios de líneas celulares de células progenitoras y los estudios in vivo. Con el añadido que al no destruir la muestra permite su utilización posterior para estudios de inmunohistoquímica, genómicos, etc. Por otro lado, la aplicación de técnicas de reconocimiento de patrones permite de forma objetiva y matemática clasificaciones de espectros. Estas técnicas tienen mucho potencial a la hora del análisis espectroscópico. Así, permiten la detección de los metabolitos más característicos de una determinada patología o región cerebral. Especialmente los clasificadores no supervisados pueden suponer una herramienta muy útil a lo hora de analizar grandes cantidades de datos espectroscópicos en la espectroscopía multivóxel poniendo en relevancia regiones anómalas y metabolitos de interés como biomarcadores en una determinada patología. El uso combinado de estas distintas técnicas puede contribuir en un futuro a una mejor caracterización metabolómica de los cambios que tienen lugar en una determinada patología con capacidad para determinar biomarcadores de procesos de interés. En nuestro estudio se proponen 2 marcadores para distintos procesos que tienen lugar en el cerebro tras la isquemia: el marcador de los LMap (2,80 ppm) como biomarcador de apoptosis cumulativa en la región de infarto y la TCho (3,21 ppm) como la señal más adecuada para un posible biomarcador de proliferación celular. Este trabajo tiene sus limitaciones, que son fundamentalmente un bajo número de animales empleados, debido a una baja tasa de infartos que cumplieron las condiciones de inclusión predefinidas (15% del total de animales empleados), bajo número de animales en cada punto temporal y bajo número de puntos temporales analizados, que en caso de aumentarse, habrían permitido detectar mejor cinéticas de evolución de algunos de los metabolitos relevantes como el Lactato o los LMap. Otra de las principales limitaciones fue la magnitud del cambio de las CPNs en proliferación detectada en las ZSVs que no ha sido suficiente para determinar posibles biomarcadores in vivo que permitan diferenciar entre ambas zonas subventriculares. Sería necesario utilizar estímulos que permitieran un cambio en la proliferación de las CPNs de mayor magnitud. Por ejemplo mediante factores de crecimiento o en sentido contrario, mediante Ara-C que es un antimitótico que elimina las CPNs mientras es administrado y después vuelven a expandirse otra vez Las técnicas de reconocimiento de patrones, especialmente en el análisis de las ZSVs, sin mezclar datos a distintos tiempos ofrecerían una mejor caracterización del patrón espectral. Pero para ello sería necesario aumentar el número de casos, ya que la robustez es un compromiso entre el número de casos y el número de características que el sistema puede utilizar. En esta tesis el análisis de los metabolitos se ha hecho en base a intensidades relativas de las resonancias ya que así era aplicable a todas las técnicas propuestas HRMAS, reconocimiento de patrones, espectroscopía in vivo…ya que los sistemas de cuantificación mediante post-procesamiento no están disponibles (de momento) para HRMAS o reconocimiento de patrones. Sin embargo, especialmente in vivo, sería necesario usar técnicas de cuantificación de los metabolitos por deconvolución y ajuste de datos espectrales, como podría ser el LC modelo para determinar de una forma más precisa la magnitud de los cambios que ocurren. troscópicos. Conclusiones 263 7. CONCLUSIONES 1) Se ha puesto a punto un protocolo de ERM in vivo para la caracterización del patrón espectral de la zona de infarto y las zonas subventriculares en un modelo de isquemia cerebral en rata. 2) La irradiación con microondas focalizadas (FMW) detiene el metabolismo post-mortem en el modelo animal de infarto cerebral manteniendo un cociente PCr/Cr similar a datos descritos in vivo. 3) Con los animales sacrificados mediante FMW se pueden realizar estudios de espectroscopia ex vivo a alto campo mediante HRMAS pudiendo cuantificar el metabolito del lactato en un modelo de infarto cerebral sin la interferencia de la isquemia post-sacrificio. 4) El uso combinado de espectroscopía in vivo y ex vivo post-irradiación permite una mejor caracterización metabolómica de los tejidos especialmente por la resolución que se obtiene en la separación de los compuestos de colina (centrados a 3,21 ppm) y de las señales de lactato y lípidos móviles (centradas a 1,30 ppm). 5) Para el estudio de la evolución del infarto a nivel crónico las señales lipídicas son las únicas que muestran variación a lo largo del tiempo y tienen potencial como biomarcadores indirectos de evolución del infarto. Es especialmente destacable la señal correspondiente a lípidos móviles apoptóticos (LMap) a 2,80 ppm, que únicamente aparece en las etapas avanzadas del infarto. 6) En el análisis de la proliferación en las zonas subventriculares in vivo el metabolito de Colina total (3,21 ppm), un biomarcador establecido de proliferación en tumores, es el único que muestra una tendencia a la significación con el número de células progenitoras en proliferación detectables mediante inmunohistoquímica. 7) No se ha encontrado correlación entre la resonancia a 1,28 ppm y la proliferación celular aunque mediante HRMAS se detectó un aumento del Lactato (1,33-1,35 pm) en las zonas subventriculares a 1 día post-isquemia, aunque no se puede descartar que sea por difusión desde la zona de infarto. 8) El uso de técnicas de reconocimiento de patrones mejora al análisis del patrón metabólico individual para determinar diferencias entre ambas zonas subventriculares, de cara a una discriminación automatizada de interés para futuros estudios de segmentación de imagen molecular basada en el metaboloma. 9) La administración del fármaco Citicolina reduce la apoptosis cuantificada mediante inmunohistoquímica en la zona de infarto a 7 días post-isquemia, produciendo una disminución (aunque no significativa) de las señales de Lactato (1,30 ppm) y lípidos móviles apoptóticos (2,80 ppm) detectables in vivo, con posible efecto modulador de la proliferación en las zonas subventriculares. 10) La espectroscopía de resonancia magnética tiene potencial como fuente de biomarcadores no invasivos fácilmente traslacionable a la práctica clínica. Bibliografía 265 8. BIBLIOGRAFIA Adibhatla, R. M., and J. F. Hatcher. 2003. Citicoline decreases phospholipase A2 stimulation and hydroxyl radical generation in transient cerebral ischemia. J Neurosci Res 73 (3):308-315. Adibhatla, R. M., J. F. Hatcher, and R. J. Dempsey. 2001. Effects of citicoline on phospholipid and glutathione levels in transient cerebral ischemia. Stroke 32 (10):2376-2381. Albers, G. W., L. R. Caplan, J. D. Easton, P. B. Fayad, J. P. Mohr, J. L. Saver, and D. G. Sherman. 2002. Transient ischemic attack--proposal for a new definition. N Engl J Med 347 (21):1713-1716. Alf, M. F., H. Lei, C. Berthet, L. Hirt, R. Gruetter, and V. Mlynarik. 2012. High-resolution spatial mapping of changes in the neurochemical profile after focal ischemia in mice. NMR Biomed 25 (2):247-254. Altman, D. G., Y. Vergouwe, P. Royston, and K. G. Moons. 2009. Prognosis and prognostic research: validating a prognostic model. BMJ 338:b605. Altman, J. 1963. 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