7.-mutagénesis específica de sitio. Ella es posible, mediante varias técnicas, que presente una o más alteraciones de nucleótidos de conocida compo...

7.-mutagénesis específica de sitio. Ella es posible, mediante varias técnicas, que presente una o más alteraciones de nucleótidos de conocida composición y ubicación en genes específicos o secuencias reguladoras. Por ejemplo (Fig. 13-12), aplasmid que lleva un gen de interés puede ser mellado en una posición con una endonucleasa. El ADN plásmido es a continuación, los círculos de cadena sencilla desnaturalizados e intactos son aislados. Cortos (13-30 bases) oligonucleótidos de conocida estructura complementaria (ya sea sintetizado de novo o de la escisión por una enzima de restricción) se puede hacer para tener una base mutante en un sitio deseado en el gen. Este oligonucleótido se renaturalizó Ihen con los círculos de cadena simple intactas para servir como cebador para la in vitro la replicación de una hebra que no es completamente complementaria a la de la hebra de plásmido. Los círculos replicados se sellan con DNA ligasa. Los círculos cerrados covalentemente se aíslan y se utilizan para transformar bacterias. Durante in vivo replicación, cada hebra del plásmido sirve como una plantilla para la producción de una hebra progenie. Así, algunos plásmidos son producido con los de tipo salvaje secuencias de genes y algunas de ellas con una sola mutación par de bases en un sitio conocido. Después del aislamiento, estos mutantes se pueden evaluar por sus efectos sobre el funcionamiento del gen o reguladora secuencia.