1. Método enzimático. El primer método rápido para determinar las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN fue desarrollado en 1975 por F. Sangerand AR Coulson (Fig. 13-13). Este procedimiento, conocido como el método de enzima, también se conoce como un método de síntesis imprimado o los métodos más y menos. Los siguientes pasos preliminares son comunes a ambos los sistemas más y menos. Un cebador debe ser recocida a la sola hebra Molde de ADN. Un cebador de este tipo puede obtenerse por digestión del fragmento con una restricción diferente, la actividad sintética de la ADN polimerasa predomina sobre su actividad exonucleasa. Por lo tanto, el A se mantendrá en el extremo de esa hebra. Cada longitud de cebado Por lo tanto, la cadena terminará en su extremo 3 'con una A. El mismo proceso se repite en los otros tres sistemas, añadiendo un dNTP diferente en cada caso. Los productos de extensión se separan de la plantilla (Por ejemplo, por calentamiento en formamida), seguido por electroforesis simultánea de los cuatro sistemas de (Él mismo gel de acrilamida en condiciones de desnaturalización. El menor de los fragmentos, más rápido viajar a lo largo del gel durante electrophorcsis. La autorradiografía del gel permite la visualización de la bandas formadas por largas cadenas de diferentes longitudes. Los fragmentos que difieren en longitud por una sola nucleótidos de este modo se puede diferenciar. (B) Técnica Minus. En la técnica de menos [Fig. 13-13 (FC)) cuatro reacciones separadas se realizan menos, cada uno falta uno diferente de los cuatro dNTP. Se tratan en todos los demás aspectos, la mismas como en la técnica plus. La enzima se extiende la cadena marcada hasta que se requiera el dNTP desaparecidos, a la que extensión de punto se detiene. Por ejemplo, si le falta la adenina (- A), la extensión a largo arbitrario productos tendrán su 3 'terminar inmediatamente antes de un residuo A. (R) De terminación de cadena Análogos. Una variación popular de la enzima método implica el uso de cadena-terminación de análogos de la norma de dNTP. Dos clases de inhibidores de la extensión de la cadena están disponibles (Fig. 13-14). Un tipo consta de trifosfatos de 2'3'-dideoxyribonucleoside (por ejemplo, didesoxiguanosina trifosfato. ddGTP simbolizado) que tiene un grupo hidroxilo no 3 'con la que formar internucleótidos 3'-5 'enlaces fosfodiéster. El otro tipo contiene arabinosa en lugar de ribosa como azúcar componente. La arabinosa es un estereoisómero de la ribosa en la posición 3 ', con lo que su grupo hidroxilo disponible para la formación de enlaces fosfodiéster. No se requiere ninguna extensión preliminar de la imprimación. En cambio, los cuatro dNTPs (uno de los cuales está marcado radiactivamente) más uno de los cuatro cadena-específica análogos de terminación se suman. Una proporción de analógico (por ejemplo, ddGTP) para dNTP normal (por ejemplo, dGTP) se elige de modo que sólo incorporación parcial del análogo se produce durante la extensión. Una diferente analógica de terminación de cadena se utiliza en cada uno de los cuatro sistemas.