015 EXTRACCION Y CROMATOGRAFIA (1)

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GESTIÓN DE LABORATORIOS 
CÓDIGO: P-QB-GU-10.002.015 
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OBJETIVO 
 
Aprender las técnicas de separación y purificación de compuestos y su 
identificación posterior. Separación de pigmentos como clorofilas, carotenos y 
xantófilas en plantas usando la cromatografía en capa fina. 
 
ALCANCE 
 
El estudiante iniciará conociendo algunas de las técnicas de extracción de 
compuestos en el laboratorio y al finalizar podrá realizar la separación de 
compuestos por medio de la cromatografía. 
 
GENERALIDADES 
 
 
EXTRACCIÓN 
 
La extracción es una operación que tiene por objeto separar una sustancia del 
material sólido o líquido que la contiene, con el fin de purificarlo utilizando un 
disolvente inmiscible con el material y miscible con las sustancias a separar. Los 
disolventes más comunes son: Agua, Éter de Petróleo, Éter Etílico, Etanol, 
Tolueno, Metanol. 
 
Se trata el material en bruto con el solvente apropiado que trate de disolver sólo el 
componente deseado. Por filtración se separa el líquido del material sin disolver, y 
luego por evaporación del disolvente en el extracto se aísla el componente 
deseado. Para obtener el producto puro se hace la repetición del proceso. Por 
extracción se aíslan y se purifican numerosos productos naturales como vitaminas, 
alcaloides, grasas, hormonas, colorantes, etc. 
 
La extracción puede ser: discontinua, cuando se utiliza un embudo de separación; 
o continúa como en el caso de un extractor soxhlet, (utilizado en la determinación 
de grasa de una muestra). 
 
En soluciones acuosas, los compuestos orgánicos se extraen utilizando un 
solvente orgánico inmiscible en el agua y dejando que las dos capas se separen. 
Se separa por decantación la capa orgánica que contiene el compuesto, y luego 
se evapora el disolvente a una determinada temperatura. 
 
En una extracción líquido-líquido, el compuesto se encuentra disuelto inicialmente 
en un solvente A, y para extraerlo se emplea un disolvente B, los que deben ser 
inmiscibles. A y B se agitan y el compuesto se distribuye entre ambos solventes de 
acuerdo a la solubilidad. La cantidad de gramos de soluto por unidad de volumen 
 
 
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en el solvente A es la concentración CA. La cantidad de gramos de soluto por 
unidad de volumen en el solvente B es la concentración CB. La relación de estas 
concentraciones permanece constante CA/CB=k. El valor de k se denomina 
coeficiente de reparto entre los líquidos y es característico del compuesto. Por 
ejemplo, si k=4 el soluto es cuatro veces mas soluble en el solvente A que en el B. 
 
 
CROMATOGRAFÍA 
 
Se designa con el nombre de cromatografía un grupo de métodos de separación 
de mezclas complejas aplicables también a la determinación de las cantidades de 
los constituyentes de éstas. Constituye uno de los métodos más importantes en el 
análisis químico y encuentra gran aplicación tanto en la química inorgánica, 
orgánica, bioquímica y las áreas relacionadas con ellos. 
 
La cromatografía del griego Chroma=color, graphos=escritura, es un 
procedimiento físico-químico que permite separar los componentes o sustancias 
integrantes de una mezcla en movimiento por adsorción o separación diferencial 
de estos componentes sobre una superficie estacionaria o inmóvil. La 
cromatografía fue adoptada por el botánico ruso Mikhail Tswett, quien desarrolló 
en el año 1905, consiguiendo la separación de materias colorantes de las hojas 
verdes: las clorofilas (verdes), los carotenos (rojos) y las xantófilas (amarillas). 
 
Los componentes esenciales de un sistema cromatográfico son los siguientes: una 
fase fija o estacionaria, constituida por un sólido granular finamente dividido, una 
fase móvil, que puede ser un gas, un líquido y sustratos o solutos, dos o más 
sustancias que hay que separar. 
 
Los sustratos se disuelven previamente en un disolvente, o son introducidos 
directamente en fase de vapor. Cuando entran en contacto con la fase 
estacionaria, se distribuyen entre las dos fases, móvil y la estacionaria. Sus 
moléculas se mueven rápidamente, pasando y volviendo a pasar de una fase a 
otra. Cuanto mayor es el lapso de tiempo que pasan en la fase estacionaria, tanto 
mas es la retención. Si no son retenidos en absoluto por la fase estacionaria, 
avanzan simultáneamente con la fase móvil, a la misma velocidad. 
 
La distancia recorrida por una sustancia particular, en un tiempo fijo y en 
condiciones especificas, es función de la resultante de la fuerza impulsadora del 
disolvente de desarrollo. 
 
 
 
 
 
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Si el disolvente y el soluto empiezan a moverse al mismo tiempo, la relación 
anterior puede expresarse en términos de las distancias recorridas por cada uno. 
 
 
 
 
El conjunto de zonas o bandas que aparecen en una placa o papel se denomina 
cromatograma, y el grado de separación de dos sustancias contiguas se llama 
resolución. 
 
 
 
MATERIALES 
 
Material Vegetal: 
 
50 gramos de espinaca u otro material vegetal. 
 
 
REACTIVOS: 
 
Metanol, Sulfato de Sodio Anhidro, Éter de Petróleo p.e 40oC - 60 oC, Cloruro de 
Sodio. 
 
 
EQUIPOS: 
 
Cromatoplaca 
Micropipetas de 10 y 100 µL (capilar) 
Mortero 
Lana de vidrio - Gasa 
Erlenmeyers de 125 ml y 250 ml 
Probeta de 50 ml 
Soporte y aro pequeño 
Cubeta para cromatografía 
Baño maría 
Embudo de vidrio mediano 
Embudo de separación 
Papel filtro 
Vaso de precipitados de 100 ml. 
 
 
 
 
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PARTE EXPERIMENTAL 
 
1. En un mortero triturar 30 g de material vegetal con 30 ml de Metanol. 
 
2. Extraiga la solución metanólica presionando el material, tratando de sacar la 
mayor cantidad posible. Descarte esta solución. Esta operación extraerá la 
mayor cantidad de agua y compuestos polares. 
 
3. Agregar al mortero 20 ml de Éter de Petróleo y triturar el material 
nuevamente. 
 
4. Filtre en un embudo tapado con lana de vidrio o algodón. Recoja el filtrado 
en un vaso de precipitados. 
 
5. Vierta el filtrado en un embudo de separación y agregue 30 ml de agua. 
Tape el embudo y agite. Deje reposar durante algunos minutos hasta que 
las capas se separen. Si no hay separación buena, agregue unos cristales 
de Cloruro de Sodio. Agite y deje reposar. 
 
6. Saque la capa inferior y descártela. 
 
7. Vierta la solución de Éter de Petróleo en un erlenmeyer y séquela 
agregando un poco de Sulfato de Sodio Anhidro o agitando por algunos 
minutos. 
 
8. Decante la solución y recójala en un vaso de precipitados. Agregue una 
perla de vidrio y evapore el solvente en un baño maría hasta que el 
volumen sea aproximadamente de 1.0 ml. Guarde este extracto para la 
cromatografía. 
 
 
 
PARTE CROMATOGRÁFICA 
 
Se usan placas de Sílica Gel o Alúmina con soporte de vidrio o aluminio. Como 
eluyente se emplea: Hexano: Acetona: Cloroformo 6:2:2 
 
1. Vierta en la cubeta el eluyente de tal forma que no suba más de 1 cm. Tape 
la cubeta y déjela saturar por espacio de 20-30 minutos. 
 
2. Introduzca un capilar, por el extremo más fino, al extracto que contiene los 
pigmentos. Cuando la solución haya ascendido en el capilar, retírelo. 
 
 
 
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3. En una placa y a una distancia de 1.0 – 1.5 cm del borde inferior, coloque 
con suavidad la punta del capilar, hasta que se forme una pequeña 
mancha. Retire el capilar y deje secar el solvente en la placa. Aplique varias 
veces para concentrar la muestra. 
 
4. Destape la cubeta e introduzca cuidadosamente la placa verticalmente 
evitando que el solvente quede por encima de la mancha. Tape la cubeta. 
 
5. Deje que el solventeascienda hasta unos 2 cm por debajo del borde 
superior de la placa. Saque la placa y con un lápiz en forma suave marque 
la altura del solvente. Determine los bordes de las manchas, con un lápiz. 
 
 
 
 
INFORME 
 
 
1. Entregue un dibujo del cromatograma lo más exacto posible. 
 
2. Tome los Rf de cada uno de los compuestos que se separan de la muestra. 
 
3. Dé las estructuras del Beta-caroteno, Licopeno, Clorofila. Explique a qué se 
debe que sean coloreados. 
 
4. Identifique los compuestos que separó de acuerdo a su coloración. 
 
 
 
 
CUESTIONARIO 
 
 
1. ¿Qué importancia tienen los pigmentos en la planta? 
 
2. ¿Qué clase de compuestos polares extrae el Metanol? 
 
3. Si se necesita evaporar un solvente que contenga un punto de ebullición 
mayor que el del agua. ¿Qué medio de calentamiento utilizaría? 
 
4. Explique brevemente otras clases de cromatografía. 
 
 
 
 
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5. Cuando las separaciones de compuestos en la cromatoplaca no son 
coloreadas. ¿Qué métodos utilizaría para reconocer las manchas? 
 
6. Hay algunos compuestos que absorben la luz ultravioleta. ¿Cómo se 
podrían identificar en la cromatoplaca? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELABORÓ: 
Manuel E. Palomino R. 
Carmen E. Mier B. 
 
REVISÓ: 
Adriana Valencia C. 
Johannes Delgado O. 
APROBÓ: 
Carmen Elena 
Mier Barona 
 
CARGO: 
Profesores Asociados 
 
CARGO: 
Auxiliares de 
Laboratorio 
 
CARGO: 
Coordinadora de 
Laboratorio 
 
FECHA: 
2010 
 
FECHA: 
2010 
 
FECHA: 
2010