Enzimas: Catalizadores Biológicos

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[PORTADA] 
TEMA 11: ENZIMAS
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 Catalizadores biológicos: 
- aumenta la velocidad de reacción sin consumirse. 
actúan en condiciones termodinámicamente favorable.
 No afecta el equilibrio de reacción
 -Son termolábiles
-Eficaces en cantidades pequeñas
-Alta especificidad
-Sujeto a controles celulares, genéticos y alostéricos
-PM de 13000 a 500.000 Dalton.
ASPECTOS GENERALES DE ENZIMAS 
MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS 
Disminuye la Ea al: 
(1) permitir que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca. 
(2) modificar las propiedades químicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos 
, aun mas que los catalizadores inorgánicos 
 Cuanto menor es la Ea más fácilmente transcurre la reacción 
 comprende: 
A) un sitio de unión formado por los AAs que están en contacto directo con el sustrato 
B) un sitio catalítico, formado por los AAs directamente implicados en el mecanismo de la reacción 
C) en la mayoría de las enzimas se encuentran serina, cisteína, histidina, tirosina, Lisina.
Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción 
centro activo: región del enzima, que se une al sustrato 
 Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción. 
cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad catalítica. 
Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son: pH, t°C, cofactores 
Perfil energético de una reacción catalizada 
la descomposición del (H2O2) para dar H2O y O2 puede ocurrir:
 sin catalizador:18Kcal/mol, con cat. Inorg. (platino):12Kcal/mol
 con un Enz (catalasa):6Kcal/mol 
Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima:
el modelo llave-cerradura y el modelo del ajuste inducido 
MODELO LLAVE-CERRADURA : supone que la estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura. Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto.
MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO 
En algunos casos, el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. Se desencadena un cambio conformación al que da lugar a la formación del producto.
NOMBRE SISTEMÁTICO 
consta de 3 partes: 
A)el sustrato preferente,
B) el tipo de reacción realizado, y
C) terminación "asa"
Ejemplo: glucosa fosfato isomeraza, que cataliza la isomerización de la gl-6-Pi en fructosa-6-fosfato.
Como la reacción es reversible también podría denominarse fructosa fosfato isomeraza.
NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS 
  formas mediante las cuales se asigna un nombre a una enzima:
nombres particulares: denominación antigua 
nombre sistemático 
código de la comisión enzimática (enzyme comission) EC 
CODIGO DE LA COMISIÓN ENZIMA 
 las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro números separados por puntos.
 El primer número indica a cual de las seis clases pertenece el enzima,
 El 2° se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, 
el 3° y el 4° se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción. 
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS 
En función de su acción catalítica específica, las enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases:
Clase 1: OXIDORREDUCTASAS 
Clase 2: TRANSFERASAS 
Clase 3: HIDROLASAS 
Clase 4: LIASAS 
Clase 5: ISOMERASAS 
Clase 6: LIGASAS 
Clase 1: OXIDORREDUCTASAS 
Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:
 AH2 + B == A + BH2
A red + Box==A ox + B red
 
Clase 2: TRANSFERASAS 
Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción: 
	A-B + C	===	A + C-B
Ej. glucoquinasa
	glucosa + ATP 	=	ADP + glucosa-6-fosfato 
Ej.: la ATP: glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) se define como EC 2.7.1.2.
 El nº: 2 indica que es una transferasa, el 7 que es una fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, 
y el último 2 indica que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato
Clase 3: HIDROLASAS 
Catalizan las reacciones de hidrólisis: 
A-B + H2O===AH + B-OH 
Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción: 
lactosa + agua===glucosa + galactosa 
Cuando la acción típica del enzima es la hidrólisis del sustrato, el segundo componente del nombre se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente lactasa.
Clase 4: LIASAS 
Catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos: A-B=== A + B
 Un ejemplo es la acetoacetato descarboxilasa, que cataliza la reacción:
 ácido acetoacético===CO2 + acetona
Clase 5: ISOMERASAS 
Catalizan la Inter conversión de isómeros:
A=== B
Ej.: la fosfo triosa isomeraza y la fosfo glucosa isomeraza, 
Clase 6: LIGASAS 
Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.):
A + B + XTP===A-B + XDP + Pi 
Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reacción:
 piruvato + CO2 + ATP==oxaloacetato + ADP + Pi
 CINÉTICA ENZIMÁTICA 
la velocidad de las reacciones enzimáticas puede determinarse midiendo la aparición de productos o desaparición de sustratos, proporcionando:
A) información directa acerca del mecanismo de la reacción y 
B) de la especificidad del enzima 
La medida se realiza en condiciones óptimas de pH, t°C, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturadas de sustrato. 
En estas condiciones, la velocidad de reacción es máxima 
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o desaparición de sustrato) en f° del tiempo se obtiene cinética de reacción.
A medida que la reacción transcurre se consume sustrato y acumula producto disminuye la velocidad de reacción. 
Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial (Vo). 
En una reacción de orden cero, la V de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k
En una reacción de 1º orden la V de formación de productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: 
v = k [A]. 
Ej.: En reacción de 1° orden: sacarosa+agua==glucosa + fructosa 
La V de hidrólisis de la sacarosa es, proporcional a la concentración de sacarosa [A] a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. 
Una reacción de 2° orden es aquella en la que la V de formación de producto depende de la concentración de 2 sustratos (como en una reacción de condensación): 
v = k [A1] [A2] 
La Vi de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero.
La medida de Vo se realiza antes de que se consuma el 10% del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como constante a lo largo del experimento. 
En estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es pequeña .
 De esta forma se simplifican las ecuaciones de velocidad. 
EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
La velocidad de una reacción enzimática depende de:
la concentración de sustrato y enzima
 Condiciones de la reacción
presencia de productos finales, que puede hacer que la reacción sea + lenta, o incluso invertir su sentido .
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la Vi de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima cte. 
Cuando S es pequeña, la Vi es directamente proporcional a la [S], y por tanto, la reacción es de 1° orden.
 A altas [S], el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad no depende de [S]. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax). 
Concentracionde enzimas
constantes
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN 
Modelo del estado estacionario:
Para explicar la relación observada entre la Vi(Vo) y la concentración inicial de sustrato ([S]o) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones ocurren en 2 etapas:
 1º etapa se forma el complejo Enz-S 
en la 2º, el complejo Enz-S da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:
En el estado estacionario, la concentración del complejo /E-S/ es constante a lo largo de la reacción, por tanto, la velocidad de formación del complejo Enz-S (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3): v1 = v2 + v3
Y, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante: vfp = v3 = k3 [ES] = constante 
En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso 
v1 = k1 [E] [S], v2 = k2 [ES], v3 = k3 [ES] 
Tambien consideramos: Enz libre (El) y enzima unido al sustrato (ES), 
Asi la [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:
[ET] = [El] + [ES], y [El] = [ET] - [ES],
V.form ES=K1(Et-ES)(S)=k1(E.libre)(S) y V.desd ES=K2(ES) + K3(ES)
En régimen permanente V.form=V.desdob, K1(ET-ES)(S)=(K2+k3)(ES)
K2+K3= (ET-ES)(S) =Km 
K1 (ES)
Km= (ET)(S) - (ES)(S) Km= (ET)(S) - (S) 
 (ES) (ES) (ES)
 Km+(S)= (ET)(S)
 (ES)
(ES)= (ET)(S) y como Vfp=K3(ES), sustituyendo
 Km+(S)
Vfp=K3 (ET)(S) 
 Km+ (S)
Y como Vmax=K3(ET)
 ecuación de Michaelis-Menten
Como k3 y [ET] son constantes, definimos velocidad máxima de la reacción (Vi): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato. 
Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. 
A concentraciones de sustrato pequeñas 
([S] << KM) se desprecia y vi = (k3) [ET] [S]. 
 (KM)
Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, la expresión queda reducida a: v = Kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de 1° orden
A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), vi = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. 
KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo /ES/, mientras que la reacción 1 lo forma.
Si KM es grande, el complejo (ES) es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato). 
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA 
La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (Vo frente a [S]o) es una hipérbola . 
La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax 
KM UN PARÁMETRO CINÉTICO IMPORTANTE
KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la V.max/2
Si KM=[S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax./2 
El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: 
A < KM, > afinidad del enzima por el sustrato, y a > KM, < afinidad.
Representacion de Lineweaver-Burk: de doble reciproca
Se utiliza para determinar los valores de KM y Vmax representando (1/Vo frente a 1/[S]o). Es una recta en la cual:
La pendiente es KM/Vmax 
La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM 
La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax 
A partir de datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos 
1 = Km+S = Km + 1
v Vmax.S Vmax.S Vmax
Corresponde a la ecuación de una recta y=mx +b
Cuando x=0 => y=1/Vmax
Cuando y=0 => x=-1/Km
Efecto del pH
La forma de la curva de pH optima esta determinada por los siguientes factores:
1-desnaturalizacion de la Enz a valores extremos de pH
2-Efecto sobre el estado de carga de la enzima y el sustrato
Ej:Enz- + SH+-EnzH
A valores bajos de pH Enz- perdera su carga negativa Enz- + H+ EnzH 
A pH muy alto SH+ se ionizará y perderá
Su carga + SH+-- S + H+
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
En general, por cada 10ºC de ↑ de t°C, la velocidad de reacción se duplica. 
La t°C a la cual la actividad catalítica es máxima se llama t°C óptima. Por encima de esta t°C, se pierde actividad catalítica debida a la desnaturalización,
Ecuación Arrhenius:Se puede calcular el valor Ea comparando 
Los valores de Ea obtenidos para una misma reacción en presencia y ausencia de catalizador.
logK= logC – E a 
 2,3RT
R:Cte de los gases
C:una constante,
 se trata de la ecuación de una recta y la variable independiente es 1/T
(-Ea/2,3R)pendiente de la curva
Log Vmax
1/T
Cofactores enzimáticos:
Casi 1/3 de las enzimas conocidas requieren para su función la presencia de sustancias no proteicas, termoestables, que pueden encontrarse fuertemente o débilmente unido a la enzima 
se clasifican en: a)-Coenzimas, b)-Activadores 
C)-Grupo prostético (cuando se encuentra covalentemente unido a la enzima)
Los cofactores:
A) Actúan en la actividad catalítica, que al combinarse con la enzima altera su estructura 3° para dar una configuración activa. 
B) Como transportadores intermediarios de grupos funcionales, átomos específicos o e-.
 
Activadores: Metálicos, mono y divalentes
 Ej.: Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc., pueden estar débil o fuertemente unida a la enzima, probablemente por quelación con grupos fenol, amino, fosforico o carboxilo 
El Ion metálico puede actuar como
1-centro catalítico primario
2-como grupo puente para reunir el sustrato y la enzima
3-como agente estabilizante de la conformación 
Activadores aniónicos: 
Con efecto menos específicos, la enzima en su ausencia presenta actividad , pero aumenta con el agregado de esta
Ej: fosfato, sulfato, cloruro 
 Coenzima: 
molécula orgánica relativamente pequeña no proteica, termoestable y dializable 
Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas.
 Holoenzima= Enz-Coenzima
Apoenzima: enzima sin Coenzima
grupo prostético: fuertemente unido a la enzima.
 Actúan generalmente como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de átomos específicos o de e-, que son transferidos en la reacción enzimatica global
Ej.: porcion porfirinica de la hematoproteina peroxidasa, y FAD, no se disocian en ningún momento.
Coenzim ppales entidad transferida
NAD at. de H(e-)
FAD at. de H(e-)
FMN at de H(e-)
Coenz Q at de H(e-)
Pirof.tiamina Aldehidos
Coenzima A grupo Acilo
Lipoamida grupo acilo
Cobamidas grupo alquilo
Biocitina CO2
Piridoxal fosfato grupo amino
Folatos grupos metilos,metilenos, 
 formilos 
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
 Se define la Unidad de actividad enzimática (UI) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol/min de sustrato.
 La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).
 katal (kat): El Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol/s de sustrato. 
Como 1 mol son 1x106 µmoles y 1 minuto= 60 segundos,
Entonces: 1 katal equivale a 60 x 106 U.
 Esta unidad es muy grande, entonces se utilizan lossubmúltiplos como el micro katal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Especificidad enzimática:
 se considera bajo dos aspectos:
-la especificidad frente al sustrato: Un enzima sólo puede actuar sobre un sustrato dado o un grupo de sustratos .
-la especificidad de la reacción: Un enzima sólo puede realizar un tipo de reacción: hidrólisis, transferencia de grupos metilo...etc.
La especificidad enzimática depende de distintos factores: que intervienen en la unión E-S
A) de grupos cargados de la enzima
B) interacciones hidrofóbicas con la enzima
C) enlaces H con la enzima
D) interacciones con grupos prostéticos de la enzima
Clasificación de la especificidad enzimatica
A) especificidad escasa o de reacción
Ej hidrolasas: AB+H2O=AOH+BH Ej.: las proteasas digestivas como la quimotripsina, rompe los enlaces amida de proteínas y péptidos de muy diverso tipo.
B) Especificidad de grupo: para uno de los sustratos: Ej.: Específica para NAD Ej. Alcohol deshidrogenasa
Alcohol+NAD+== Aldehído +NADH+H+ 
C) Especificidad absoluta: sobre un sustrato determinado o un par de sustratos·
Ej.: sacaras rompe el enlace β-glucosídico, la sacarosa es su sustrato natural. , Ureasa
D) estéreo especificidad; la enzima actúa específicamente sobre uno de los isómeros: sí se toma el acido tartárico racémico, un enzima oxida la forma D o la forma L, pero no las 2.
 una oxidasa: AAL + Enz-FAD+H2O = ceto acido + Enz-FADH2
Mecanismos de acción enzimática
Para comprenderlo se deben conocer al menos tres puntos
A) Curso químico de la reacción
B) Restos de AA de la enzima participante
D) ordenación espacial de estos residuos en relación al sustrato
E) Explicación racional de cómo contribuyen estos residuos a disminuir la energía de activación
Mecanismos de catálisis en el sitio activo
1-Aproximación y orientación
2-Catálisis covalente
3-Catálisis acido básica
4-provocar tensión en el enlace susceptible del sustrato
PROCESOS ENZIMÁTICOS SON IMPORTANTES EN LA ELABORACIÓN DE ALIMENTOS. 
Existen fenómenos importantes en la tecnología actual, en reacciones que interviene enzimas.
Ej.: Pardeamiento enzimático (frutas), Rancidez (grasas y aceites), Coloración (vegetales verdes), de textura (salsa de tomate)
Enz. catalizadoras de procesos vitales pueden presentarse activas durante periodo posterior a la cosecha y los cambios que ellas determinan pueden influir sobre los caracteres organolépticos, textura y presentación del producto terminado.
Hay enzimas perjudiciales que deben ser inactivadas en el momento oportuno, mientras que otras se utiliza para una mejor preparación del alimento, como lo son:
 las enzimas de clarificación
 las enzimas proteolíticas 
la glucosa-oxidasa, permite eliminar la glucosa de ciertos alimentos, para evitar su pardea miento posterior.
Es importante conocer la distribución que tienen algunas enzimas en los alimentos.
POR EJEMPLO:
FOSFATASA: de la leche adsorbida por sus glóbulos grasos
LIPASAS: disueltas en el alimento como es el caso de las en grasas y aceites. 
ENZIMAS PECTOLÍTICAS adsorbidas en las partículas sólidas 
AMILASAS En el trigo, las están ubicadas en el germen, no encontrándoselas ni en la capa de aleurona ni en el salvado
 CATEPSINAS están localizadas en el lisosoma de las células.
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA PUEDE SER DETERMINADA DE DOS MANERAS:
a) MIDIENDO LA VELOCIDAD DE DESAPARICIÓN DE SUSTRATO
b) MIDIENDO LA VELOCIDAD DE FORMACIÓN DE PRODUCTO