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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA Carrera de Biología. Laboratorio de Química Vegetal y Biotransformaciones. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L. y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO PRESENTA: ANTONIO CHÁVEZ MONTERO. DIRECTORA DE TESIS: Dra. F. LEONORA SÁNCHEZ Y GARCÍA-FIGUEROA México D.F., a 20 de Octubre de 2015. PAPIME PE209015 http://132.248.60.110:8081/fesz_website_2011/wp-content/logos/logo_unam_negro.png UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Química Vegetal y Biotransformaciones de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza UNAM bajo la dirección de la Dra. F. Leonora Sánchez y García- Figueroa y fue financiado por la DGAPA a través del proyecto PAPIME PE209015. Agradecimientos. Gracias a Dios, por permitirme la dicha y gracia de poder vivir y realizar este sueño. A mi madre Eloisa, a mi padre Constantino y a mi hermano Oscar, porque siempre están conmigo, por impulsarme cada día, porque gracias a ustedes soy el hombre que soy, por todo el cariño y apoyo prodigados y por todas los pequeños y grandes sucesos que hemos pasado y los que vendrán. A la Universidad Nacional Autónoma de México, a la cual agradezco pertenecer, en donde tuve la oportunidad de formarme como profesionista y ser humano. A mi Facultad de Estudios Superiores Zaragoza y a la Carrera de Biología simplemente por ser las mejores. A la DGAPA, por su apoyo económico a través del proyecto PAPIME PE209015. A la Dra. Leonora Sánchez y García Figueroa, por toda la confianza depositada en mí, por toda la paciencia y dedicación a la dirección de este trabajo, por permitirme trabajar con la planta de mi elección, por darme un “jalón de orejas” cuando fue necesario, por todo lo que he aprendido, por brindarme un espacio de trabajo y darme la oportunidad de estar frente a grupo. No tengo palabras suficientes para expresarle todo mi agradecimiento. A tod@s mis profesoras y profesores que a lo largo de mi vida escolar han dejado en mí sus enseñanzas y consejos, los cuales han sido vitales para mi formación y la de muchos más. A los sinodales por su valiosa contribución en la mejora y corrección de este escrito. A Nicolás Lozano Jacinto “Chinto”, por todos estos años de amistad y compañerismo, por hacerme reír, por escucharme y respetar mi punto de vista, por creer en mí cuando me faltaba confianza, por darme ánimos cuando más lo necesitaba; has sido como un hermano. Sigue esforzándote y serás el mejor profe’ que exista. A todos mis amigos y amigas de la facultad, a los que iniciamos juntos este camino, los que encontré en el transcurso del mismo, los que lo dejaron inconcluso y los que están por culminarlo. Gracias por todos esos momentos de compañerismo, risas, lágrimas y apoyo. A mis compañer@s y amig@s del “Laboratorio de Química Vegetal y Biotransformaciones”: Paty, Adán, Osvan, Luis Alberto, Vicky, Karla, Frank y Eli, por todos los momentos de trabajo y diversión compartidos, por aceptar mis consejos y orientación. Agradecimiento especial a mi tío Domingo Montero Vega y a su familia por el apoyo prodigado. Y por último a los “equisetos” (cola de caballo) sin los cuales esta investigación, en la que he puesto todo mi esfuerzo y corazón, carecería de inspiración y sentido. Con cariño: Antonio. Dedicatoria. Este trabajo de tesis está dedicado a: Mi madre Eloisa Montero Vega. Por todo el amor y cariño incondicional hacia mi hermano y a mí. Por todos los sacrificios y trabajo realizados para sacarnos adelante, por cuidarnos de la mejor manera, por alentarnos siempre hacia la superación en lo personal y en lo profesional, porque siempre nos ha puesto antes que todo, por todo mami… un millón de gracias. Mi padre Constantino Chávez García. Por todo su apoyo y cariño incondicional, por heredarme el amor por la música y el canto, por todos sus consejos y enseñanzas de vida. Mi hermano Oscar Chávez Montero. Por ser el mejor hermano, por acompañarme siempre en las buenas y en las malas. Sigue adelante y serás uno de los mejores biólogos del mundo. Impresión fósil del tallo de un Equiseto Encontrado cerca del balneario los Ahuehuetes en Puebla. Equisetum myriochaetum Schltr & Cham. Fotografía tomada cerca del municipio de Molango, estado de Hidalgo. Los inicios de este sueño… ¿Has visto cuándo la luz del alba atraviesa sus tallos? Esos vivos fulgores esmeraldas y el suave matiz amarillo hacia sus nudos. Y cuando oscurece por la tarde, pareciera que guarda esa luz, la luz de la vida. Aún cuando anochece, representa el soplo de aliento que nos impulsa a continuar y el anhelo por vivir, por seguir sin importar los obstáculos y tristezas del camino. Se extiende y compite por su lugar en la Tierra. Se aferra a su existencia, al igual que el coraje, la furia, el valor, el cariño, el odio y el amor en los corazones de las personas. Nuestro amor, que al igual que los equisetos, se perfilará al infinito y se perpetuará en el tiempo… a través de los milenios. Antonio. Tomado de: “El rostro del anochecer”; De la serie: “El jardín de los helechos”. No doy flores ni semillas pero hervido en infusión te quito las pesadillas del problema del riñón.* D. Benavides *Para Equisetum hyemale L. El presente trabajo fue presentado por partes en: 1st BIOTECHNOLOGY WORLD SYMPOSIUM & 9º ENCUENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA DEL IPN. Atlihuetzia Tlaxcala, México. 13-16 de Octubre de 2014. Bajo el título: “Preliminary separation of allelochemicals and the allelopathic effect of Equisetum hyemale extracts on the germination of Lactuca sativa seeds”. XIII FORO DE INVESTIGACIÓN ESCOLAR EN BIOLOGÍA FES ZARAGOZA, UNAM. México D.F. 31 de Enero de 2014. Bajo el título: “Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y actividad alelopática de sus extractos”. XV FORO DE INVESTIGACIÓN ESCOLAR EN BIOLOGÍA FES ZARAGOZA, UNAM. México D.F. 30 de Enero de 2015. Bajo el título; “Actividad antimicrobiana de los extractos orgánicos de Equisetum hyemale L”. ÍNDICE. Página 1 RESUMEN.------------------------------------------------------------------------- 1 2 INTRODUCCIÓN.----------------------------------------------------------------- 2 3 MARCO TEÓRICO.--------------------------------------------------------------- 3 3.1 Etnobotánica de Equisetum sp.----------------------------------------------------- 4 3.2 Fitoquímica de Equisetum sp.------------------------------------------------------ 4 3.3 Actividad biológica de Equisetum sp.--------------------------------------------- 9 3.4 Descripción botánica de Equisetum hyemale L.--------------------------------- 11 3.5 Distribución de Equisetum hyemale L.-------------------------------------------- 14 3.6 Alelopatía.----------------------------------------------------------------------------- 15 3.7 Antibiogramas.-----------------------------------------------------------------------16 3.7.1 Características de las bacterias empleadas.--------------------------------------- 17 4 JUSTIFICACIÓN.------------------------------------------------------------------ 19 5 OBJETIVOS.------------------------------------------------------------------------ 20 6 HIPÓTESIS.------------------------------------------------------------------------- 21 7 MATERIALES Y MÉTODO.---------------------------------------------------- 22 7.1 Obtención y determinación del material vegetal.-------------------------------- 22 7.2 Obtención de los extractos orgánicos.--------------------------------------------- 22 7.3 Fraccionamiento de los extractos orgánicos.------------------------------------- 23 7.4 Obtención y saponificación del extracto CHCl3.--------------------------------- 23 7.5 Análisis por CG-masas de los extractos.------------------------------------------ 24 7.6 Evaluación de la actividad alelopática de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico.---------------------------------------------------------------- 25 7.7 Evaluación de la actividad bactericida de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico.---------------------------------------------------------------- 26 8 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.------------------------------------------------- 27 8.1 Rendimiento y fraccionamiento de los extractos orgánicos de Equisetum hyemale L.----------------------------------------------------------------------------- 27 8.2 Análisis mediante el sistema gases-masas.--------------------------------------- 29 8.2.1 Compuestos identificados por CG-M en el extracto hexánico de Equisetum hyemale L.----------------------------------------------------------------------------- 29 8.2.2 Compuestos identificados por CG-M de las fracciones 24-55 en el extracto de acetato de etilo de Equisetum hyemale L.-------------------------- 35 8.2.3 Compuestos identificados por CG-M de la fracción hexánica del extracto metanólico de Equisetum hyemale L.---------------------------------------------- 40 Página 8.2.4 Compuestos identificados por CG-M de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de Equisetum hyemale L.----------------------------------- 46 8.2.5 Compuestos identificados por CG-M de la fracción insaponificable del extracto clorofórmico de Equisetum hyemale L.--------------------------------- 51 8.2.6 Análisis de espectroscopía en el infrarrojo del compuesto precipitado de la fracción metanólica del extracto metanólico.------------------------------------- 57 8.3 Evaluación de la actividad alelopática de los extractos orgánicos de Equisetum hyemale L.--------------------------------------------------------------- 58 8.3.1 Porcentaje de inhibición y velocidad de crecimiento.--------------------------- 58 8.3.2 Compuestos con posible actividad alelopática (aleloquímicos).--------------- 59 8.3.3 Análisis estadístico entre las concentraciones.----------------------------------- 61 8.4 Evaluación de la actividad bactericida de los extractos orgánicos de Equisetum hyemale L.--------------------------------------------------------------- 65 8.4.1 Inhibición del crecimiento bacteriano en Escherichia coli.-------------------- 66 8.4.2 Inhibición del crecimiento bacteriano en Bacillus cereus.---------------------- 68 8.4.3 Inhibición del crecimiento bacteriano en Staphylococcus aureus.------------ 69 8.4.4 Inhibición del crecimiento bacteriano en Staphylococcus epidermidis.------ 71 8.4.5 Inhibición del crecimiento bacteriano en las bacterias Gram-negativas Salmonella tiphy y Kleibsiella pneumoniae.----------------------------------- 73 8.4.6 Compuestos con posible actividad bactericida.---------------------------------- 74 9 CONCLUSIONES------------------------------------------------------------------ 75 10 SUGERENCIAS.-------------------------------------------------------------------- 76 11 BIBLIOGRAFÍA.------------------------------------------------------------------- 77 11.1 BIBLIOGRAFÍA DE INTERNET.-------------------------------------------- 87 12 ANEXOS.---------------------------------------------------------------------------- 88 12.1 Anexo I Ciclo de vida de los equisetos.------------------------------------------ 88 12.2 Anexo II Pruebas estadísticas.------------------------------------------------------ 89 12.3 Anexo III Cromatografía en capa fina (CCF) de las muestras analizadas mediante CG-masas, de los extractos de E. hyemale L.--- 99 12.4 Anexo IV Dispersión de aleloquímicos en el ambiente.----------------- 100 12.5 Anexo V Pared celular de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas.---------------------------------------------------------------------- 100 ÍNDICE DE CUADROS. Página Cuadro 1 Compuestos aislados en distintas especies del género Equisetum.----------- 6 Cuadro 2 Clasificación taxonómica de E. hyemale.---------------------------------------- 11 Cuadro 3 Fórmulas para calcular velocidad de crecimiento y porcentaje de inhibición.--------------------------------------------------------------------------- 25 Cuadro 4 Rendimiento de los extractos obtenidos a partir de 1 kg de Equisetum hyemale L. En el caso del extracto clorofórmico de 100g de planta.---------------------------------------------------------------------- 27 Cuadro 5 Fracciones obtenidas del extracto de acetato de etilo.----------------- 28 Cuadro 6 Fracciones obtenidas del extracto metanólico.-------------------------- 28 Cuadro 7 Compuestos identificados, mediante CG-M, del extracto hexánico de Equisetum hyemale L. -------------------------------------------------- 34 Cuadro 8 Compuestos identificados, mediante CG-M, de las fracciones 24- 55 en el extracto de acetato de etilo de Equisetum hyemale L.-------- 39 Cuadro 9 Compuestos identificados, mediante CG-M, de la fracción hexánica del extracto metanólico de Equisetum hyemale L.----------- 45 Cuadro 10 Compuestos identificados, mediante CG-M, de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de Equisetum hyemale L.--- 50 Cuadro 11 Compuestos identificados, mediante CG-M, de la fracción insaponificable del extracto clorofórmico de Equisetum hyemale L.- 56 Cuadro 12 Compuestos con posible actividad alelopática identificados por el análisis de cromatografía de gases masas.------------------------------- 60 Cuadro 13 Resultados de la determinación de la actividad bactericida por el método de difusión de discos.------------------------------------------------------------- 65 Cuadro 14 Compuestos con posible actividad bactericida, identificados por el análisis de cromatografía de gases masas.--------------------------------------- 74 ÍNDICE DE GRÁFICAS. Página Gráfica 1 Porcentaje de inhibición de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH), en concentraciones de 10. 50 y 100 mg/mL; en los días 1, 2, 7 y 8 sobre semillas de Lactuca sativa L.----------------------------------------------------------------------- 58 Gráfica 2 Velocidad promedio de germinación de semillas de Lactuca sativa L en los tratamientos de de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH), en concentraciones de 10. 50 y 100 mg/mL; en los días 1, 2, 7 y 8.--------------------------------- 59 Gráfica 3 Tamaño promedio de los halos de inhibición (mm) en E. coli por difusión de disco de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH).------------------------------------- 67 Gráfica 4 Tamaño promedio de los halos de inhibición (mm) en B. cereus por difusión de disco de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH).----------------------------------------------- 68Gráfica 5 Tamaño promedio de los halos de inhibición (mm) en S. aureus por difusión de disco de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH).------------------------------------- 70 Gráfica 6 Tamaño promedio de los halos de inhibición (mm) en S. epidermidis por difusión de disco de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH).-------------------- 72 Gráfica 7 Tamaño promedio de los halos de inhibición (mm) en S. tiphy por difusión de disco de los extractos hexánico (Hex), de acetato de etilo (AcOEt) y metanólico (MeOH).------------------------------------- 73 ÍNDICE DE FIGURAS. Página Figura 1 Morfología de Equisetum hyemale L.----------------------------------------------------- 12 Figura 2 Tallos estriados de Equisetum hyemale L.------------------------------------------------ 13 Figura 3 Estróbilos de Equisetum hyemale L.------------------------------------------------------ 13 Figura 4 Mapa de distribución mundial de Equisetum hyemale L.------------------------------ 14 Figura 5 Mapa de distribución en México de Equisetum hyemale L.--------------------------- 14 Figura 6 Diagrama de extracción con disolventes de E. hyemale L.----------------------------- 22 Figura 7 Diagrama que muestra el acomodo de los discos en las pruebas de actividad bactericida. Concentración en mg/d (miligramos por disco).-------------------------- 26 Figura 8 Estructura química y espectro de masas del ácido n-hexadecanoico.----------------- 30 Figura 9 Estructura química y espectro de masas de 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1- ol.----------------------------------------------------------------------------------------------- 30 Figura 10 Espectro de masas y estructura química de 11-deciltetracosano.---------------------- 31 Figura 11 Estructura química y espectro de masas de 3,5-dieno-estigmastano.----------------- 32 Figura 12 Cromatograma del extracto hexánico.---------------------------------------------------- 33 Figura 13 Estructura química y espectro de masas de 2-dodecenal.------------------------------ 36 Figuras 14 y 15 Estructura química de 1,2-bencendicarboxilato de mono (2-etilhexilo) y 1,3- bencendicarboxilato de bis (2-etilhexilo).------------------------------------------------ 36 Figura 16 Espectro de masas de 1,2-bencendicarboxilato de mono (2-etilhexilo).------------- 36 Figura 17 Espectro de masas de 1,3-bencendicarboxilato de bis (2-etilhexilo).----------------- 36 Figura 18 Estructura química y espectro de masas de 2,4-bis-(1,1-dimetiletil)-fenol.---------- 37 Figura 19 Cromatograma de las fracciones 24-55 del extracto de acetato de etilo.------------- 38 Figura 20 Estructura química y espectro de masas de (Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrien-1-ol.--- 40 Figura 21 Estructura química y espectro de masas de1 1,14,17-eicosatrienoato de metilo.--- 41 Figura 22 Estructura química y espectro de masas de tridecanoato de metilo.------------------ 42 Figura 23 Estructura química y espectro de masas de1,6-anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosan).------------------------------------------------------------------------------- 42 Figura 24 Estructura química y espectro de masas de fitol.---------------------------------------- 43 Figura 25 Cromatograma de la fracción extraida con hexano del extracto metanólico.-------- 44 Figura 26 Estructura química y espectro de masas de 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1- ol.----------------------------------------------------------------------------------------------- 46 Figura 27 Estructura química y espectro de masas de 1,2-bencendicarboxilato de mono(2- etilhexilo).------------------------------------------------------------------------------------- 47 Figura 28 Estructura química y espectro de masas del ácido n-hexadecanoico.----------------- 47 Figura 29 Estructura química y estructura química y espectro de masas de 6,10-dimetil-2- undecanona.----------------------------------------------------------------------------------- 48 Figura 30 Cromatograma de la fracción extraida con acetato de etilo del extracto metanólico.------------------------------------------------------------------------------------ 49 Figura 31 Estructura química y espectro de masas de 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona.----- 51 Figura 32 Estructura química de 4,8,12,16-tetrametilheptadecan-4-ólido.----------------------- 52 Figura 33 Espectro de masas de 4,8,12,16-tetrametilheptadecan-4-ólido.----------------------- 53 Figura 34 Estructura química y espectro de masas de (Z)-9-octadecenamida.------------------ 53 Figura 35 Estructura química y espectro de masas de hentriacontano.--------------------------- 54 Página Figura 36 Estructura química y espectro de masas de 2-metilundecanal.------------------------ 54 Figura 37 Cromatograma de la fracción insaponificable del extracto clorofórmico.----------- 55 Figura 38 Espectro de IR del precipitado del extracto metanólico.------------------------------- 57 Figura39 Bioensayo alelopático con el extracto hexánico de E. hyemale L.----------- 62 Figura 40 Bioensayo alelopático con el extracto de acetato de etilo de E. hyemale L. 63 Figura 41 Bioensayo alelopático con el extracto metanólico de E. hyemale L.--------- 64 Figura 42 Antibiograma de E. coli frente al extracto MeOH.-------------------------------------- 67 Figura 43 Antibiograma de E. coli frente al extracto AcOEt.-------------------------------------- 67 Figura 44 Antibiograma de B. cereus frente al extracto MeOH.---------------------------------- 69 Figura 45 Antibiograma de S. aureus frente al extracto AcOEt.---------------------------------- 70 Figura 46 Antibiograma de S. aureus frente al extracto Hex.-------------------------------------- 70 Figura 47 Antibiograma de S. epidermidis frente al extracto Hex.-------------------------------- 72 Figura 48 Ciclo de vida de Equisetum arvense L.--------------------------------------------------- 88 Figura 49 CCF del extracto hexánico.----------------------------------------------------------------- 99 Figura 50 CCF de las fracciones 24 a 55 de la CCV del extracto AcOEt.----------------------- 99 Figura 51 CCF de la fracción hexánica del extracto MeOH.--------------------------------------- 99 Figura 52 CCF de la fracción AcOEt del extracto MeOH.----------------------------------------- 99 Figura 53 CCF de la fracción insaponificable del extracto clorofórmico.------------------------ 99 Figura 54 Vías a través de las cuales se liberan los agentes aleloquímicos al entorno.--------- 100 Figura 55 Esquema de las membranas celulares en bacterias Gram-positivas y Gram- negativas.-------------------------------------------------------------------------------------- 100 ABREVIATURAS. AcOEt Acetato de etilo. CCF Cromatografía en capa fina. CCV Cromatografía en columna al vacío (flash). CG-masas Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. CHCl3 Cloroformo. cm-1 Centímetros a la inversa. E. Equisetum. Fig. Figura. Hex Hexano. I.K. Índice de Kovats. IR Espectroscopía en el infrarrojo. KOH Hidróxido de potasio (potasa). L Linneo. MeOH Metanol. mg/d Miligramos por disco de difusión. mg/mL Miligramos por mililitro. T.R. (s) Tiempo de retención en segundos. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L. y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. Antonio Chávez Montero. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 1 Antonio Chávez Montero. 1 RESUMEN Equisetum hyemale L conocida como “cola de caballo”, es una planta que se reproduce mediante esporas y se encuentra ampliamente distribuida en México. Se comercializa en mercados y tiendas naturistas ya que tiene variasaplicaciones en medicina tradicional para tratar diversos malestares en el organismo (Gallardo, 2006). En los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico de Equisetum hyemale L, por medio de la cromatografía de gases-masas se identificaron compuestos como ácido n- hexadecanoico; tridecanoato de metilo; 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol; (Z)-9- octadecenamida, entre otros. Se evaluó el efecto alelopático y bactericida de los extractos de Equisetum hyemale L encontrando que inhibe la germinación de las semillas de Lactuca sativa L en concentraciones de 50 y 100 mg/mL y en concentración de 10 mg/mL, el desarrollo y crecimiento de las plántulas es raquítico. También presenta un efecto bactericida sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus y Escherichia coli en concentraciones de 2, 10 y 20 mg/d. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 2 Antonio Chávez Montero. 2 INTRODUCCIÓN. El género Equisetum conocido como cola de caballo, son plantas afines a las pteridophytas ampliamente distribuidas en el Hemisferio Norte. Se ha usado durante mucho tiempo en medicina tradicional en varios países. Se ha reportado que Equisetum arvense L y Equisetum variegatum Schl. inhiben el desarrollo de gametofitos de otras especies del mismo género e impiden la germinación de semillas de otras plantas (Radulovic et al., 2006; Husby, 2013). Así mismo se ha demostrado que los metabolitos secundarios de Equisetum arvense L también ejercen efecto antibiótico contra bacterias y hongos, lo cual le ha proporcionado al género Equisetum una ventaja competitiva y la supervivencia de sus especies. (Radulovic et al., 2006; García et al., 2013). En México Equisetum hyemale L es la especie más abundante y la población lo usa para contrarrestar enfermedades de los riñones y como antiinflamatorio. El presente trabajo pretende contribuir al conocimiento de los metabolitos secundarios de Equisetum hyemale L, que podrían ser responsables de las interacciones alelopática y bactericida, mediante el estudio de sus compuestos volátiles por cromatografía de gases, así como evaluar su efecto alelopático en semillas de Lactuca sativa L (lechuga) y su efecto bactericida en seis especies de bacterias. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 3 Antonio Chávez Montero. 3 MARCO TEÓRICO. El género Equisetum comprende alrededor de 15 especies (Hauke, 1993), crecen en lugares fríos y húmedos. Se caracterizan por su tallo hueco y estriado con presencia de sílice en forma cristalina sobre la epidermis del mismo. Se les conoce como “cola de caballo”, en referencia a las raíces en su rizoma, que recuerdan a la cola de dicho animal (Hauke, 1993) otros nombres comunes que se le dan son: “equiseto”, “carricillo”, “yerba del platero”, “cola de rata”, “limpia plata”, “cien nudillos”, “candalilo”. Tienen un gran interés botánico, ya que está entre los géneros de plantas vasculares vivientes más antiguos del mundo (Hauke, 1963). Son plantas altas, perennes, de apariencia primitiva, que se extienden desde el centro de México hasta el centro de Argentina y Chile. Una característica de las especies de Equisetum es la de absorber y acumular silicio en sus tejidos (5 - 10 % del peso seco de la planta), necesario para su crecimiento. El sílice (SiO2) se acumula en la epidermis de la planta, dándole una textura áspera (Parsons y Cuthbertson, 1992). Esta característica es importante en la explicación de la no interacción entre insectos, hongos y especies del género Equisetum (Hauke, 1969). Otra ventaja es que el óxido de silicio toma formas orgánicas fácilmente metabolizables por la planta. Los cuerpos silíceos tienen gran aplicación en la nanotecnología para microencapsulación debido a sus propiedades ópticas (Neethirajan y Wang, 2009). Las especies del género Equisetum están naturalmente distribuidas por casi todo el mundo, crecen en zonas húmedas, con baja incidencia en Australia y Nueva Zelanda donde son consideradas especies invasoras (Scagel et al, 1984). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 4 Antonio Chávez Montero. 3.1 Etnobotánica de Equisetum sp. Esta planta tiene uso ornamental, como estropajo en las comunidades rurales, bioindicadores de contaminación y aplicaciones medicinales. A manera de cocción se utiliza para aliviar daños renales y bajar de peso, lo que la ha llevado a su comercialización por diversas cadenas de productos naturistas, que lo ofrecen en cápsulas y comprimidos y en las yerberías, en las que se vende en trozos y seco (Gallardo, 2006). Además tiene aplicaciones entre la población como diurético, para aliviar cáncer de estómago, hemorragias internas, desórdenes de vejiga, riñón y estómago. Contra la diarrea, cálculos renales, como cicatrizante para el tratamiento de heridas y úlceras, lavado de ojos y piel, con efecto antiinflamatorio, contra la fatiga y como relajante (Ramírez et al., 2002; Gallardo 2006; Méndez et al., 2009). Diferentes estudios han demostrado algunas propiedades de esta planta. Como su efecto sedativo para sustituir ansiolíticos. También se encontró un efecto hipoglucemiante en ratas (Wiedelfeld et al, 2000). 3.2 Fitoquímica de Equisetum sp. Se le llama metabolismo secundario al conjunto de procesos en el que participan compuestos de una distribución mucho más limitada y específica según el ser vivo. Los compuestos participantes en este metabolismo se denominan como metabolitos secundarios y su formación es a través del metabolismo primario. Son específicos según la especie y Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 5 Antonio Chávez Montero. también se pueden definir como productos naturales. Los metabolitos secundarios pueden ser considerados como productos para la adaptación de un organismo para sobrevivir en un ecosistema particular (Ravelo y Braun, 2009). Las características de los metabolitos secundarios son: no tener funciones directas con el desarrollo vegetativo de la planta. Presentar una distribución restringida y diferente en el reino vegetal. (Lock, 1994). Pueden ser divididos en tres grupos según la ruta biosintética que los origina: terpenos, compuestos fenólicos y alcaloides (Kuklinski, 2000). En los diferentes estudios fitoquímicos realizados en el género Equisetum se han encontrado alcaloides, fenoles, taninos, saponinas, terpenos, fitoesteroles y aminoácidos (Navdeep, 2010). Entre los compuestos que se han identificado están: ácido cafeíco, ácido tartárico, ácido poliénico (Neda, 2008), tiaminasa (Gallardo, 2006), colecalciferol, rutina, ácido clorogénico, isoquercitrina, isovitexina, orientina, homoorientina (Stoliar, 2009) y ácidos grasos de cadena larga (Lytle y Server, 1976; Rezanka, 1998). También está el ácido equisetólico, que se encuentra en los conos y esporas de la planta, incluso se ha extraído de los fósiles de estas plantas (Bonnet et al, 1972). En el cuadro 1 se muestran las estructuras de algunos compuestos identificados en diferentes especies del género. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 6 Antonio Chávez Montero. Cuadro 1. Compuestos aislados en distintas especies del género Equisetum. Nombre del compuesto Estructura química Especie Referencia Ácido cafeíco E. arvense E. giganteum Canadanovic- Brunet et al., 2009 Stoliar,2009 Ácido equisetólico E. arvense E. temalteia Bonnett et al., 1972 Ácido ascórbico E. arvense Mello y Budel, 2014 Ácido clorogénico E. giganteum Stoliar, 2009 Ácido poliénico E. giganteum Stoliar, 2009 Ácido tartárico E. giganteum Stoliar, 2009 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 7 Antonio Chávez Montero. Palustrina E. palustre Phillipson y Melville, 1960 Nicotina E. palustre E. arvense Phillipson y Melville, 1960 Rodoxantina E. hyemale E. arvense Cyronak et al, 1977 26- hidroxicolesterol E. giganteum Guerra et al., 2010 Ergosta-4,7,22- trien-3-ona E. giganteum Guerra et al., 2010 Gorgost-5-en-3β- ol E. giganteum Guerra et al., 2010 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 8 Antonio Chávez Montero. 3,14-dihidroxi- bufa-20,22- dienolido E. giganteum Guerra et al., 2010 Rutina E. giganteum Stoliar, 2009 Orientina E. giganteum Stoliar, 2009 Quercetina E. arvense Neda, 2008 Isoquercetina E. giganteum Stoliar, 2009 Kaemferol E. myriochaetum Wiedenfeld et al, 2000 Isovitexina E. giganteum Stoliar, 2009 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 9 Antonio Chávez Montero. Apigenina E. giganteum Neda, 2008 3,7-diglucósido- kaemferol E. variegatum E. hyemale Saleh et al, 1972 3-O-(6"-O- malonilglucósido) -kaemferol E. fluviatile Veit et al, 1996 3-O-(6"-O- acetilglucósido)- 7-O-rhamnósido- kaemferol E. temalteia Veit et al, 1996 3.3 Actividad biológica de Equisetum sp. Existen numerosos ensayos sobre la actividad antibacteriana de E. giganteum L, se encontró sólo una débil actividad de sus extractos en las siguientes bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa (Paz et al., 1995). El extracto acuoso de E. giganteum L registró una débil actividad antiviral contra el virus VIH (Abdel et al., 1996). Los extractos de acetato de etilo y metanólicos de esta Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 10 Antonio Chávez Montero. misma especie mostraron actividad en el factor de crecimiento nervioso y actividad débil, en estudios utilizando cultivos de células (PC12) (Li y Ohizumi., 1999). El aceite esencial de Equisetum arvense L mostró actividad bactericida sobre Escherichia coli, Salmonella enteriditis, Staphylococcus aureus, Kleibsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa. También presentó actividad antifúngica sobre Candida albicans, y Aspergillus niger (Radulovic et al., 2006). Los extractos hidroalcohólicos de E. arvense L, E. sylvaticum L, E. fluviatile L, E. palustre L, E. temalteia M. (Hau). Inhibieron el crecimiento bacteriano de Escherichia coli, Salmonella enteriditis, Staphylococcus aureus, Kleibsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa (Milovanović et al., 2007). Los extractos butanólicos de E. giganteum L fueron muy activos como relajantes musculares suaves en pruebas realizadas en conejos y una actividad moderada con los extractos acuosos (Matsunaga et al., 1997). El extracto hexánico de E. hyemale L inhibió el crecimiento de Staphylococcus aureus (Canales et al., 2005). En cuanto a la alelopatía se ha demostrado que los esporofitos de E. silvatycum L inhiben el desarrollo de gametofitos de otras especies de Equisetum (Milton y Duckett, 1985). Los extractos acuosos impiden la germinación de semillas y desarrollo de las plántulas de pasto. E. arvense L y E. palustre L ejercieron efecto alelopático sobre E. variegatum Schl. (Husby, 2013). Los extractos acuoso y butanólico de las partes aéreas de Equisetum myriochaetum Schltr & Cham tuvieron efecto hipoglucémico en ratas diabéticas (Andrade et al., 2000). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 11 Antonio Chávez Montero. 3.4 Descripción botánica de Equisetum hyemale L. Cuadro 2. Clasificación taxonómica de E. hyemale (CONABIO,2005) Reino Plantae División Equisetophyta Subdivisión Sphenophyta Clase Equisetópsida Orden Equisetales Familia Equisetaceae Género Equisetum Especie Equisetum hyemale Presenta tallos erectos en general no ramificados, 1.5 a 2 m de alto, 0.2 a 1.5 cm de diámetro, con 15 a 40 costillas, ligeramente rugosos (Fig. 1). Estomas dispuestos en una línea a cada lado de los surcos. Vainas desde la base del tallo hasta el ápice, casi tan largas como anchas, con 2 bandas pardo oscuras, una en el margen superior y la otra en la parte media, de color cenizo entre las dos bandas, dientes apiculados usualmente persistentes. Ramas de tallos viejos más delgadas que los tallos principales, con estróbilos, por lo demás similares (Fig. 2). Estróbilos ovoides, terminales en tallos y ramas, amarillos a negros, apículo prominente negro (Fig. 3). Esporas normales. Número cromosómico 2n = 216. (Riba, 1996; Mickel y Smith, 2004) Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 12 Antonio Chávez Montero. Fig. 1 Morfología de Equisetum hyemale L (Tomada de http://plants.ifas.ufl.edu/node/153) Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 13 Antonio Chávez Montero. Fig. 2 Tallos estriados de Equisetum hyemale L. (Tomada de http://brilliantbotany.com) Fig. 3 Estróbilos de Equisetum hyemale L. (Tomada de http://brilliantbotany.com) Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 14 Antonio Chávez Montero. 3.5 Distribución de Equisetum hyemale L. Distribución: De Alaska a Guatemala en América, Europa y en el este de Asia (Fig. 4). En México se encuentra ampliamente distribuido por toda la república (Fig. 5). (Mickel y Smith, 2004). Hábitat: En sitios húmedos cerca de arroyos o filtraciones. En elevaciones de 1900-2000 msnm. Fig. 4 Mapa de distribución mundial de Equisetum hyemale L. (Tomado de www.discoverlife.org) Fig. 5 Mapa de distribución en México de Equisetum hyemale L. (Tomado de Mickel y Smith, 2004). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 15 Antonio Chávez Montero. 3.6 Alelopatía. La alelopatía es un proceso por el cual las plantas se proporcionan una ventaja competitiva a sí mismas. Consiste en la deposición de metabolitos secundarios que actúan como fitotoxinas. Se define como: “Cualquier efecto directo o indirecto dañino o beneficioso que ejerce una planta sobre otra a través de la producción de compuestos químicos que escapan al ambiente” (Birkett et al., 2001). La planta que tiene potencial alelopático se define como donadora, mientras que la planta receptora es la que resulta afectada por dichos compuestos los cuales se denominan aleloquímicos (Ver Anexo IV) (Bai et al., 2012). Los bioensayos en alelopatía evalúan la bioactividad por efecto en la germinación, crecimiento y posterior desarrollo de la plántula. Estos parámetros son aceptados como medidas indirectas de otros procesos fisiológicos afectados mediante la interacción química. De esta manera es posible seleccionar compuestos que se pueden evaluar en estudios posteriores (Zamorano, 2006). Las semillas de lechuga (Lactuca sativa L) son uno de los organismos más utilizados en la alelopatía, ya que presentanuna germinación rápida y uniforme, presentan gran sensibilidad a gran variedad de aleloquímicos especialmente a bajas concentraciones de los mismos; son accesibles en cuanto a disponibilidad y costos (Sampietro, 2002). 3.6.1 Lactuca sativa L. Es una hortaliza típica de climas frescos. Los rangos de temperatura donde la planta crece en forma óptima, están entre los 15 °C y 18° C, con temperatura máximas de 21°C - Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 16 Antonio Chávez Montero. 24 °C y mínima de 7° C, es una planta anual. Las temperaturas altas aceleran el desarrollo del tallo floral y la calidad de la lechuga se deteriora rápidamente, debido a la acumulación de látex amargo en su sistema vascular. La raíz, que no sobrepasa los 25 cm de profundidad, es pivotante, corta y con ramificaciones (FAO, 2006). 3.7 Antibiogramas. Un antibiograma es el resultado de las pruebas de susceptibilidad in vitro llevadas a cabo para conocer el comportamiento de un microorganismo frente a determinados antibióticos o productos naturales, sus resultados se expresan en términos de sensibilidad y resistencia (Hernández, 2013). Se dice que el microorganismo es sensible cuando su crecimiento es inhibido por una concentración de antimicrobiano y resistente cuando no hay inhibición en su crecimiento por el agente antimicrobiano (Cantón, 2010). Su importancia radica en el hecho de poder llevar a cabo una terapia antibiótica correcta en pacientes con infecciones bacterianas (Sánchez y Feris, 1998). No todas las bacterias tienen la misma sensibilidad a los principios activos, por lo que es importante realizar distintas determinaciones y buscar metabolitos secundarios que representen una alternativa donde los tratamientos con fármacos generaron resistencia bacteriana. Según lo reportado en la literatura, los metabolitos secundarios que presentan un efecto bactericida son: terpenos (Meyer et al., 2002; Radulovic et al., 2006; Raman et al., 1995), Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 17 Antonio Chávez Montero. ésteres (Agoramoorthy et al., 2007), flavonoides (Cushnie y Lamb, 2005; Shelef, 1984) y alcaloides (Reza y Abbas., 2007; Urban et al., 1999). 3.7.1 Características de las bacterias empleadas. 3.7.2 Escherichia coli. Bacilo Gram-positivo con forma de bastón, móvil, anaerobio, capaz de crecer a 44°C; pertenece a la familia de las enterobacteriaceas, habita comúnmente en el intestino de los mamíferos, aunque no siempre es inofensivo en este sitio pues puede producir gastroenteritis, además de infecciones en vías urinarias y es el principal patógeno de la diarrea del viajero (Stainer et al., 1981; Duerden et al., 1993; Koneman, 2003). 3.7.3 Bacillus cereus. Prototipo de la familia bacillaceae, bacilo Gram positivo, esporulado, aerobio o anaerobio facultativo, generalmente son móviles con flagelos perítricos. Su temperatura de crecimiento se encuentra en un rango de 5°C a 55°C, el rango de pH va de 4.5 a 9.3. Produce dos tipos de infecciones alimentarias: la forma diarreica y la forma emética produce vómitos y náuseas (Koneman et al., 1992). 3.7.4 Staphylococcus aureus. Microorganismos Gram-positivos de forma esférica con diámetro de 0.7 a 1µm, que se disponen en racimos; localizados en la mucosa nasal anterior, en la garganta del 40 al 50%; en las heces están en un 20% y en la piel de un 5 al 10% de los adultos sanos. Destruye las Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 18 Antonio Chávez Montero. células fagocíticas, constriñe los músculos lisos, paraliza las paredes de los vasos sanguíneos, y es dermonecrótica (Carpenter, 1979; Duerden et al., 1993) 3.7.5 Staphylococcus epidermis. Especie del género Staphylococcus, consistente en bacterias con forma de cocos, Gram positivos, arreglados en grupos. Es la causa más frecuente de infecciones en cuerpos extraños implantados (catéteres intravasculares, catéter de la diálisis peritoneal ambulatoria). Ocasiona las siguientes infecciones: cistitis, septicemia, endocarditis, endoftalmitis (Granados y Villa Verde, 1996: Koneman et al., 1992). 3.7.6 Salmonella tiphy. Son Gram negativas, de forma bacilar. Puede causar infecciones con carácter entérico, tipo fiebres tifoideas o paratiroideas que pueden originar en casos más graves septicemias, además de infecciones tipo gastroenteritis o enterocolitis, además de la muy conocida fiebre tifoidea, transmitida al hombre vía oral por alimentos crudos, mal conservados que llevan mucho tiempo preparados, así como aguas que contengan a dicho patógeno (Granados y Villa Verde, 1996). 3.7.7 Klebsiella pneumoniae. Bacilo Gram-negativo, es el agente causal de infecciones del tracto urinario, neumonías, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirúrgica. Son especialmente susceptibles los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos, neonatos y pacientes con diabetes mellitus o alcohólicos. Causa Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 19 Antonio Chávez Montero. alrededor del 1% de las neumonías bacterianas y puede causar condensación hemorrágica extensa del pulmón. Además, en ocasiones provoca infección del aparato urinario y bacteriemia a partir de lesiones focales en pacientes debilitados que puede terminar con la vida del paciente. Algunas de las complicaciones más frecuentes son el absceso pulmonar y el empiema (Orrego et al., 2007). 4 JUSTIFICACIÓN. Equisetum hyemale L conocida como “cola de caballo” es la especie predominante en México y la población la utiliza con fines medicinales. La especie comercial a nivel mundial es Equisetum arvense L. de la cual existen numerosos estudios biológicos y fitoquímicos. En este trabajo se pretende contribuir al conocimiento de Equisetum hyemale L con la identificación de los compuestos volátiles y la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 20 Antonio Chávez Montero. 5 OBJETIVOS. 5.1 Objetivos generales. -Separar e identificar por cromatografía de gases-masas los compuestos presentes en los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico de Equisetum hyemale L. -Evaluar la actividad alelopática y bactericida de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico de Equisetum hyemale L. 5.2 Objetivos particulares. -Obtener los extractos orgánicos de Equisetum hyemale L, así como su rendimiento. -Evaluar el efecto alelopático de los extractos crudos de Equisetum hyemale L sobre la germinación de semillas de Lactuca sativa L. -Evaluar el efecto antimicrobiano de sus extractos crudos hexánico, de acetato de etilo y metanólico frente a las bacterias: Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella tiphy y Klebsiella pneumoniae. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 21 Antonio Chávez Montero. 6 HIPÓTESIS. En especies del género Equisetum se han identificado metabolitos secundarios (ácidos grasos, alcanos, alcaloides, fitoesteroles, flavonoides y saponinas); algunos de ellos presentan actividad alelopática y bactericida, por lo tanto se espera que algunos de estos metabolitos estén presentes en Equisetum hyemale L y tengan los mismos efectos biológicos.Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 22 Antonio Chávez Montero. 7 MATERIALES Y MÉTODO. 7.1 Obtención y determinación del material vegetal. Se compró 1 kg de planta seca en el mercado Sonora del D.F. y se separaron las estructuras adecuadas para su determinación taxonómica (tallos, estróbilos y rizoma) la cual estuvo a cargo del Dr. Eloy Solano Camacho del herbario FEZA de la FES Zaragoza. 7.2 Obtención de los extractos orgánicos. 1 kg de tallos aéreos de la planta se molió en un molino de aspas y se maceró en disolventes orgánicos: hexano, acetato de etilo y metanol, por espacio de tres semanas en cada uno. Los extractos hexánico y metanólico fueron concentrados en un rotavapor Yamato 3000, el extracto metanólico se concentró en rotavapor Büchi RII. Los extractos se pesaron para calcular el rendimiento de cada uno. Fig. 6 Diagrama de extracción con disolventes de E. hyemale L. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 23 Antonio Chávez Montero. 7.3 Fraccionamiento de los extractos orgánicos. Los extractos hexánico y de acetato de etilo fueron empacados en una columna para cromatografía, con sílica gel para capa fina G-60. Se realizó la cromatografía en columna al vacío (CCV). Las fracciones se evaluaron por cromatografía de capa fina (CCF) y se recristalizaron mediante par de disolventes. 7. 3. 1 Fraccionamiento del extracto de acetato de etilo. Del extracto de acetato de etilo se tomaron 8 g, los cuales fueron separados por cromatografía en columna al vacío en una columna empacada con 48 g de gel de sílice y eluída con mezclas de disolventes de polaridad creciente. Se obtuvieron un total de 182 fracciones de 50 mL cada una. 7. 3. 2 Fraccionamiento del extracto metanólico. 25 g del extracto metanólico se extrajeron con hexano, luego con acetato de etilo. El resto del extracto, al disolverse en metanol, dio un precipitado de color blanco, el cual se lavó con isopropanol y después con butanol, el compuesto es soluble en agua y se analizó por espectroscopía de infrarrojo (IR). 7.4 Obtención y saponificación del extracto clorofórmico (CHCl3). 100 g de planta seca se maceraron en CHCl3, el extracto se concentró en rotavapor Büchi R II. El extracto crudo se disolvió en KOH en MeOH 0.5 N y se calentó a reflujo durante 2 horas. La fracción insaponificable se obtuvo mediante extracción líquido-líquido con hexano y se concentró en el rotavapor. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 24 Antonio Chávez Montero. 7.5 Análisis por cromatografía de gases acoplada a masas (CG-masas) de los extractos. Las muestras analizadas mediante CG-masas fueron: extracto crudo hexánico, fracciones 24-55 de la columna cromatográfica del extracto AcOEt, fracción hexánica del extracto MeOH, fracción AcOEt del extracto MeOH y la fracción insaponificable del extracto clorofórmico. El análisis se realizó en un cromatógrafo de gases Agilent 6890N con un detector de masas marca LECO, modelo Pegasus 4D, con analizador tiempo de vuelo. Con gas acarreador helio, Praxair, grado 5.0 (ultra alta pureza). Tipo de inyección split con división de flujo 1:20. La temperatura del inyector fue de 300° C. El programa de temperatura del horno fue de 40° C durante 3 minutos, luego una rampa de 20° C/min hasta 300 ºC en una columna capilar HP-5MS (DB5) de 10 m x 0.18 mm x 0.18 µm. Los compuestos se identificaron comparando los espectros obtenidos con los datos espectrales de la biblioteca NIST del detector de masas. Se tomaron los tiempos de retención de los compuestos y se calcularon los índices Kovats para cada uno de ellos. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 25 Antonio Chávez Montero. 7.6 Evaluación de la actividad alelopática de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico. Los bioensayos se realizaron sobre semillas de Lactuca sativa L las cuáles se adquirieron en la tienda “Semillas Tinajero” en la delegación Xochimilco. Se prepararon tres disoluciones en agua de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico, en concentraciones distintas (10, 50 y 100 mg/mL). En cajas Petri con papel filtro en el fondo, se adicionaron 5 mL de disolución para los tratamientos y 5 mL de agua para el blanco. Se colocaron 15 semillas de Lactuca sativa en cada caja Petri y fueron incubadas a temperatura ambiente en la obscuridad. Los experimentos se realizaron por triplicado Durante 8 días, se contó el número de semillas germinadas. Para el análisis estadístico se empleó el análisis de varianza, usando el programa Excel 2010 y la prueba de Tukey en el programa SPSS Statistics Version 2, también se calculó el porcentaje de inhibición y la velocidad de germinación de acuerdo al trabajo de Bai et al., 2012. Cuadro 3. Fórmulas para calcular velocidad de crecimiento y porcentaje de inhibición (Bai et al., 2012). Porcentaje de inhibición. Velocidad de germinación. % de inhibición= (100-(muestra extracto/control) 100) En donde: Muestra extracto: semillas germinadas en los extractos Control: semillas germinadas en el testigo. (n/d)= ΣNt/ Dt En donde: Nt = semillas germinadas en el día t Dt = Número de día correspondiente (n/d) = semillas germinadas por día Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 26 Antonio Chávez Montero. 7.7 Evaluación de la actividad bactericida de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico. Los extractos se probaron sobre las bacterias Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella tiphy y Klebsiella pneumoniae, las cuales se obtuvieron del cepario de Campus I de la FES Zaragoza. Se prepararon tres disoluciones de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico, en tres concentraciones: 10, 50 y 100 mg/mL en agua y se impregnaron en discos de papel filtro de 5 mm de diámetro en volúmenes de 20 µL, quedando las concentraciones finales de 2, 10 y 20 mg/disco. En medio de cultivo agar Mueller-Hinton se inocularon las bacterias, en volumen de 250 µL a una concentración de 0.5 de la escala de Mc Farland. Se colocaron tres discos, con cada una de las concentraciones, más un control positivo con ciprofloxacina a una concentración de 5 mg/disco y un control negativo con agua estéril. Se incubaron a 35° C por 24 horas y se midieron los halos de inhibición. Para el análisis estadístico se usó el análisis de varianza en Excel 2010 y prueba de Tukey en SPSS Statistics Version 2. Fig. 7 Diagrama que muestra el acomodo de los discos en las pruebas de actividad bactericida. Concentración en mg/d (miligramos por disco). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 27 Antonio Chávez Montero. 8 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 8.1 Rendimiento y fraccionamiento de los extractos orgánicos de Equisetum hyemale L. El porcentaje del extracto permite conocer la cantidad de material vegetal necesaria a macerar para obtener la cantidad de extracto deseado en peso seco. Los rendimientos de los extractos hexánico, de acetato de etilo, metanólico y clorofórmico de los tallos aéreos de la planta se muestran en el Cuadro 4. En el Cuadro 5 se muestran el número de fracciones obtenidas de la columna cromatográfica del extracto AcOEt, así como los disolventes utilizados para su elución. Y en el cuadro 6 semuestran los rendimientos de los fraccionamientos del extracto metanólico. Cuadro 4. Rendimiento de los extractos obtenidos a partir de 1 kg de Equisetum hyemale L. En el caso del extracto clorofórmico se obtuvo a partir de de 100 g de planta. Extracto Peso (g) Rendimiento (%) Hexánico 15.5 1.55 Acetato de Etilo (AcOEt) 12.5 1.25 Metanólico (MeOH) 25 2.1 Clorofórmico (CHCl3) 3.4 0.34 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 28 Antonio Chávez Montero. Cuadro 5. Fracciones obtenidas del extracto de acetato de etilo. Fracciones Disolvente 1 – 8 Hexano 9 – 49 Hexano-AcOEt 9:1 50 – 81 Hexano-AcOEt 8:2 82 – 95 Hexano-AcOEt 7:3 96 – 103 Hexano-AcOEt 6:4 104 – 118 Hexano-AcOEt 1:1 119 – 126 Hexano- AcOEt 4:6 127 – 132 Hexano-AcOEt 3:7 133 – 139 Hexano-AcOEt 2:8 140 – 143 Hexano-AcOEt 1:9 144 – 150 AcOEt 151 – 157 AcOEt-MeOH 9:1 158 – 162 AcOEt-MeOH 8:2 163 – 169 AcOEt-MeOH 7:3 170 – 174 AcOEt-MeOH 6:4 175 – 177 AcOEt-MeOH 1:1 178 – 182 MeOH En la columna cromatográfica, al recristalizar las fracciones por par de disolvente no se obtuvieron suficientes rendimientos en cuanto a los compuestos precipitados para analizar mediante espectroscopía. Esto posiblemente se debe a la cantidad de ceras presentes en los extractos, las cuales dificultan la purificación de los compuestos (Brune y Haas, 2011). Cuadro 6. Fracciones obtenidas del extracto metanólico. Peso (g) Rendimiento (%) Extracto metanólico 21 2.1 Fracción hexánica 5.12 24.38 Fracción AcOEt 0.56 2.66 Sólido precipitado 0.72 3.42 Fracción MeOH 14.59 69.47 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 29 Antonio Chávez Montero. 8.2 Análisis mediante el sistema gases-masas (CG-masas). Se analizaron, mediante esta técnica, el extracto hexánico, las fracciones 24 a 55 de la columna del extracto de acetato de etilo, la fracción hexánica del extracto metanólico, la fracción de acetato de etilo de etilo del extracto metanólico y la fracción insaponificable del extracto clorofórmico. Se tomaron los tiempos de retención y se calcularon los índices de Kovats. Los espectros de masas y cromatogramas mostrados de la figura 8 a la figura 36 se obtuvieron a partir de las muestras anteriormente mencionadas, las estructuras químicas de las mismas figuras se tomaron de la biblioteca NIST (webbooknist). 8.2.1 Compuestos identificados por CG-masas en el extracto hexánico de Equisetum hyemale L. En el Cuadro 7 se muestran los compuestos identificados en el extracto hexánico de los tallos de Equisetum hyemale L. Los 22 componentes principales representan el 76.85% del extracto (Fig. 12). El componente mayoritario es el ácido n-hexadecanoico (ácido palmítico) con un 23.787% del área (Fig. 8), es un ácido graso el cual ha sido anteriormente reportado como componente del aceite esencial del helecho Adiantum flabellulatum (Kang y Wang, 2009), en tres especies del género Phylanthus (Xiangrong et al., 2008), en el extracto hexánico y aceite esencial de Citrus sinensis L (Benelli et al., 2010), en el extracto etanólico de Buchanania axillaries (Sakthivel et al., 2010); formando parte de los compuestos volátiles de tres especies de Pholmis sp (Zhang y Wang, 2008) y en los componentes volátiles de la miel de las regiones de Kenia en África (Ng’ang’a et al., 2012). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 30 Antonio Chávez Montero. Fig. 8 Estructura química y espectro de masas del ácido n-hexadecanoico. El segundo compuesto mayoritario del extracto hexánico, con un porcentaje de área de 10.719, es el terpeno 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol, un estereoisómero del fitol (Fig. 9). Se ha reportado como parte de los compuestos volátiles de los extractos hexánico, de acetato de etilo y clorofórmico de Azadiracta indica, una planta de India conocida como neem (Hossain et al., 2013). Se encontró también en el extracto etanólico de Buchanania axillaries (Sakthivel et al., 2010), así como en el aceite esencial Phlomis umbrosa, P. meglantha y P. szechuanensis (Zhang y Wang, 2008). Fig. 9 Estructura química y espectro de masas de 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 31 Antonio Chávez Montero. Con un 6.58% del área se encuentra el 11-deciltetracosano (Fig. 10), que se ha reportado en los aceites esenciales de Cedrus atlántica (Boudarene et al., 2004) y Ornithogalum cuspidatum (Nazifi et al., 2010) y en el extracto hexánico de Gongronema latifolium (Ezekwe et al., 2014). Fig. 10 Estructura química y espectro de masas de 11-deciltetracosano Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 32 Antonio Chávez Montero. El 3,5-dieno-estigmastano (Fig. 11) con un 4.20% del área se ha reportado como uno de los esteroles de Eucalyptus globulus (del Río et al., 1998) y en el aceite de oliva (Leon- Camacho et al., 2004). También ha sido encontrado en la pulpa de la fibra de lino Linumu sitatissimum (Gutiérrez y del Río, 2003) y fue extraído de las raíces de aguacate Persea americana donde ha mostrado actividad inhibitoria frente al oomiceto P. cinnamomi (Sánchez, 2007). En las oleorresinas de Equisetum giganteum se reportó un compuesto de estructura similar, el 4,22-dieno-estigmastano (Michielin et al, 2005). Fig. 11 Estructura química y espectro de masas de 3,5-dieno estigmastano. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 33 Antonio Chávez Montero. Fig. 12 Cromatograma del extracto hexánico. 1) Ácido n-hexadecanoico; 2) 3,7,11,16-tetrametil-2-hexadecen-1-ol; 3) Ácido (Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrienoico; 4) 11-decil-tetracosano; 5) 3,5-dieno-estigmastano; 6) 7-hexil-eicosano; 7) 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona; 8) Octadecanal; 9) Tetracosano; 10) Tridecanoato de metilo. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 34 Antonio Chávez Montero. T.R. (S) tiempo de retención en segundos. I.K. índice de Kovats. Cuadro 7. Compuestos identificados, mediante CG-M, del extracto hexánico de Equisetum hyemale L. Pico Nombre del compuesto Fórmula Fragmentos Área % T.R. (s) I.K. 6 24 31 Aldehídos 2-metilundecanal (787) Cis, cis, cis-7,10,13-hexadecatrienal (848) Octadecanal (918) C12H24O C16H26O C18H36O 58, 71, 95, 126 79, 91, 149, 191 82, 152, 194, 222, 250 0.25381 1.2044 6.1349 706.147 891.047 980.497 2066.6 2781.7 3133.2 1 3 11 Cetonas 5,6,7,7a-tetrahidro-4,4,7a-trimetil 2(4H)benzofuranona (907) 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona (925) 2(2-octenil)-ciclopentanona (783) C11H16O2 C18H36O C13H22O 67, 95, 111, 137, 152, 180 43, 71, 95, 124, 165, 210, 250 67, 84, 110, 152, 194 1.0135 3.1078 0.26289 596.597 684.897 772.497 1703.1 1990.6 2315.9 23 25 27 29 Alcanos Tetracosano (726) 7-hexileicosano (923) Pentadecano (927) 11-deciltetracosano (951) C24H50 C26H54 C15H32 C34H70 57, 71, 99, 133, 191, 221, 387 43, 57, 71, 99, 127, 155, 183 57, 71, 99, 127, 155 57, 71, 99, 127, 155, 183 1.2652 3.9913 1.2951 3.5149 883.547 905.997 927.347 978.747 2752.3 2840.5 2924.4 3176.8 8 17 Ésteres Tridecanoato de metilo (900) Dodecanoato de2-butoxietilo (788) C18H34O2C18H36O3 67, 74, 82, 95, 183 71, 79, 85, 100, 160, 239 0.010437 1.136 833.347 848.597 2555 2614.9 10 26 38 Alcoholes 3,6,6-trimetil-2-norpinanol (775) 1-hexadecanol (769) 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol (899) C10H18O C16H34O C20H40O 71, 85, 95 66, 69, 97, 111, 139 68, 81, 95, 123, 179, 278 0.88024 1.2951 10.719 760.597 927.097 1155.55 2269.2 2923.4 3821 9 12 Ácidos orgánicos Ácido n-hexadecanoico (916) Ácido (Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrienoico (930) C16H32O2 C18H30O2 43, 73, 87, 129, 157, 185, 213, 256 67, 79, 93, 135, 222 23.787 9.4157 730.547 779.747 2154.9 2344.4 30 34 Esteroles Acetato de ergost-5-en-3-ol, (835) 3,5-dieno-estigmastano (802) C30H50O2 C29H48 81, 105, 147, 213, 255, 293, 382 43, 79, 91, 119, 145, 185, 213, 255, 303, 343, 396 1.6943 4.2055 978.747 999.297 3126.3 3207.1 16 Lactonas 4,8,12,16,-tetrametilheptadecan-4-ólido (894) C21H40O2 71, 99, 114, 151, 184 1.0771 828.347 2535.4 35 Otros Vitamina E (890) C29H50O2 107, 136, 165, 205, 430 0.58567 1007.25 3238.3 (#): Similitud del espectro de masas en relación con la biblioteca NIST. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 35 Antonio Chávez Montero. 8.2.2 Compuestos identificados por CG-masas de las fracciones 24-55 en el extracto de acetato de etilo de Equisetum hyemale L. En el Cuadro 8 se muestran los compuestos identificados en las fracciones 24-55 de la de la columna cromatográfica del extracto de acetato de etilo de los tallos de Equisetum hyemale L. Los 13 compuestos reportados comprenden el 99.06% del extracto (Fig. 19). El compuesto mayoritario en esta porción del extracto fue el 3,7,11,15-tetrametil-2- hexadecen-1-ol (Fig. 13) con un 51.70% del área total, que aparece en varios picos en distintos porcentajes de área con índices de retención muy cercanos entre sí. Este compuesto es soluble en acetato de etilo, pues fue reportado en el extracto de éste disolvente de las semillas de Azadiracta indica (Hossain et al., 2013). También fue identificado en el extracto hexánico de Equisetum hyemale L. El aldehído 2-dodecenal con un 5.05% de área ha sido reportado en el aceite esencial de Eryingium foetidum (Martins et al., 2003) y Coriandrum sativum (Msaada et al., 2007). Está presente en los compuestos responsables del sabor de la soya (Gremli, 1974). Fig. 13 Estructura química y espectro de masas de 2-dodecenal. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 36 Antonio Chávez Montero. Los compuestos 1,2-bencendicarboxilato de mono (2-etilhexilo) (Fig. 14) con un 5.43% y 1,3-bencendicarboxilato de bis (2-etilhexilo) (Fig. 15) con 1.96 % del área son ftalatos, compuestos sintéticos que se encuentran en el ambiente como contaminantes; los cuales pueden ser dañinos para la salud humana (Latini, 2005). En algunos trabajos han sido reportados como componentes del aceite esencial de Limonium aureum (Yu et al., 2007) y en los extractos de Triticum durum L (Bai et al., 2012). Figs. 14 y 15 Estructura química de 1,2-bencendicarboxilato de mono(2-etilhexilo) y 1,3- bencendicarboxilato de bis(2-etilhexilo). Fig. 16 Espectro de masas de 1,2-bencendicarboxilato de mono(2-etilhexilo). Fig. 17 Espectro de masas de 1,3-bencendicarboxilato de bis (2-etilhexilo). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 37 Antonio Chávez Montero. Otro compuesto presente es el 2,4-bis (1,1-dimetiletil)-fenol (Fig. 18) con un 1.78% del área. Se caracteriza por ser contaminante de cuerpos de agua al provenir de productos de limpieza y detergentes (Davi y Gnudi, 1999). La presencia de estos químicos se debe, principalmente a la capacidad de absorción y de retención en los tallos de Equisetum sp lo cual hace práctico su uso en humedales artificiales para el tratamiento de aguas residuales (Neralla et al., 1999). Fig. 18 Estructura química y espectro de masas de 2,4-bis (1,1-dimetiletil)-fenol. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 38 Antonio Chávez Montero. Fig. 19 Cromatograma de las fracciones 24-55 del extracto de acetato de etilo. 1) 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1- ol; 2) 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol; 2) 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol; 3) 1,2-bencenodicarboxilato de bis (2-etilhexilo); 4) 1,2-bencenodicarboxilato de mono (2-etilhexilo); 5) 2-dodecenal; 6) 3,7,11,15-tetrametil-1- hexadecin-3-ol; 7) 2,4-bis (1,1-dimetil)-fenol; 8) 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona; 9) Clorohidrato de o- bencilhidroxiamina; 10) 1,2-bencendicarboxilato de butil-2-metilpropilo; 11)Eicosano; 12) Eicosano; 13) Tetrahidropiranil éter de citronelol. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 39 Antonio Chávez Montero. Cuadro 8. Compuestos identificados, mediante CG-M, de las fracciones 24-55 en el extracto de acetato de etilo de Equisetum hyemale L. T.R. (S) tiempo de retención en segundos. I.K. índice de Kovats. (#): Similitud del espectro de masas en relación con la biblioteca NIST. Pico Nombre del compuesto Fórmula Fragmentos Área % T.R. (s) I.K. 7 AldehÍdos 2-dodecenal (790) C12H22O 71, 84, 97, 125 5.0599 708.647 2075.7 3 Cetonas 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona (907) C18H36O 43, 71, 85, 109, 165 1.4611 685.147 1991.4 10 11 Alcanos Eicosano (918) Eicosano (931) C20H42 C20H42 57, 71, 85, 113, 144, 221 57, 71, 85, 113, 147, 221 0.4819 0.55205 811.047 835.997 2467.4 2565.4 2 4 5 9 Terpenos 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol (898) 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol (894) 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol (895) 3,7,11,15-tetrametil-1-hexadecin-3-ol (794) C20H40O C20H40O C20H40O C20H38O 68, 95, 123, 151, 179 68, 81, 95, 127, 151, 179, 278 68, 81, 95, 127, 151, 179, 278 71, 84, 89, 97, 140 51.702 10.206 17.37 2.0559 680.847 688.447 694.347 772.997 1977.2 2002.5 2023.9 2317.9 1 6 8 12 13 14 Otros 2,4-bis (1,1-dimetil)-fenol (926) 1,2-bencendicarboxilato de butil-2-metilpropilo (865) Tetrahidropiranil éter de citronelol (800) Clorohidrato de o-bencilhidroxiamina (787) 1,2-Bencendicarboxilato de mono (2-etilhexilo) (940) 1,3-Bencendicarboxilato de bis (2-etilhexilo) (719) C14H22O C16H22O4 C15H28O2 C7H9NOCl C16H22O4 C24H38O4 74, 107, 163, 191, 206 76, 104, 149, 167, 223 75, 85, 95 65, 91, 107 71, 104, 149, 167, 279 70, .83, 112, 149, 167, 261 1.7833 0.86809 0.12437 0.94407 5.4318 1.96 580.947 696.59 760.847 856.497 871.297 918.997 1653.7 2032 2270.1 2646 2704.1 2891.6 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 40 Antonio Chávez Montero. 8.2.3 Compuestos identificados por CG-masas de la fracción hexánica del extracto metanólico de Equisetum hyemale L. En el Cuadro 9 se muestran los compuestos identificados en la fracción hexánica del extracto metanólico de los tallos de Equisetum hyemale L. Los 19 componentes aquí reportados representan el 86.77% de la fracción del extracto (Fig. 25). En esta fracción del extracto metanólico el compuesto mayoritario, con un 32.60% de área, fue el ácido n-hexadecanoico, el cual también fue el compuesto mayoritario en el extracto hexánico. Con un 27.25% del área, el segundo compuestomayoritario es el (Z,Z,Z)-9,12,15- octadecatrien-1-ol (Fig. 20) que ha sido reportado como constituyente en los aceites esenciales de Phlomis umbrosa, P. meglanta, P. szchuanensis (Zhang y Wang, 2008), Tussilago fárfara (Liu et al., 2006) y en el extracto metanólico de Labisia pumila (Karimi y Jaafar, 2011). Fig. 20 Estructura química y espectro de masas de (Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrien-1-ol. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 41 Antonio Chávez Montero. El siguiente compuesto, el 11,14,17-eicosatrienoato de metilo (Fig. 21) abarca un 6.82% del área y ha sido reportado anteriormente como compuesto de los aceites esenciales de Melissa officinalis de la República de Eslovaquia (Hollá et al., 1997), Clematis obscura (Tao et al, 2005) y Osmanthus fragans (Hu et al., 2010). Fig. 21 Estructura química y espectro de masas de11,14,17-eicosatrienoato de metilo. Otro éster metílico identificado es el tridecanoato de metilo (Fig. 22) con un 6.09% de área, el cual no se encuentra reportado en la bibliografía de componentes volátiles de aroma y aceites esenciales en plantas. Este compuesto por primera vez se reporta como componente volátil en plantas, en este caso en Equisetum hyemale L. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 42 Antonio Chávez Montero. Fig. 22 Estructura química y espectro de masas de tridecanoato de metilo. El azúcar 1,6-anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosan) (Fig. 23) se identificó con 3.374% del área. Ha sido reportado anteriormente en el extracto etanólico de Delonix regia (Jancy et al., 2011), en la fracción fenólica de Cynodon dactylon en donde presenta un efecto antioxidante (Shabi et al., 2010). Fig. 23 Estructura química y espectro de masas de 1,6-anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosan). Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 43 Antonio Chávez Montero. El terpeno fitol (Fig. 24) aparece con un área de 1.18%, menor que su estereoisómero 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol que aparece en los demás extractos y en esta misma fracción del extracto metanólico con amplios porcentajes de área. Este compuesto tiene aplicaciones en la industria cosmetológica (McGynty et al., 2012). Se ha encontrado en el aceite esencial del pasto Antoxanthum odoratum (Tava, 2001). Ha sido reportado en su forma trans en el aceite esencial de Equisetum arvense (Radulovic et al., 2006). Se reportó su presencia en los extractos hexánico, de acetato de etilo y clorofórmico de Azadiracta indica (Hossain et al., 2013), así como en el extracto metanólico de Labisia pumila (Karimi y Jaafar, 2011) y en el aceite obtenido con éter de petróleo de las semillas de Camptotheca acuminate (Wang et al., 2011), en el extracto hidroalcohólico de Cynodon dactylon (Shabi et al., 2010) y en el extracto etanólico de Delonix regia (Jancy et al., 2011), entre otras. Fig. 24 Estructura química y espectro de masas de fitol. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 44 Antonio Chávez Montero. Fig. 25 Cromatograma de la fracción extraida con hexano del extracto metanólico. 1) Ácido n-hexadecanoico; 2) Ácido (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoico; 3) 11,14,17-eicosatrienoato de metilo; 4) Tridecanoato de metilo; 5) 3,7,11,16-tetrametil-2-hexadecen-1-ol; 6) 1,6-anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosan); 7) 3,7,11,15-tetrametil-2- hexadecen-1-ol; 8) (Z)-7-hexadecenoato de metilo. Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 45 Antonio Chávez Montero. Cuadro 9. Compuestos identificados, mediante CG-M, de la fracción hexánica del extracto metanólico de Equisetum hyemale L. T.R. (S) tiempo de retención en segundos. I.K. índice de Kovats. (#): Similitud del espectro de masas en relación con la biblioteca NIST. Pico Nombre del compuesto Fórmula Fragmentos Área % T.R. (s) I.K. 4 17 19 Terpenos 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol (892) Fitol (908) (Z,Z,Z)-9,12,15-octadecatrien-1-ol (936) C20H40O2 C20H40O C18H32O 68, 71, 81, 123, 151, 179, 278 71, 95, 123 67, 79, 93, 135, 222 5.5076 1.1868 27.253 680.612 764.512 781.312 1977.1 2284.5 2350.6 27 Alcanos 11-decil-tetracosano (926) C34H70 57, 71, 85, 99, 127, 169, 197, 261 0.38744 948.412 3007.1 2 16 Alquenos 3,7,11,tetrametil-2-hexadeceno, (827) 1-cloro-7-heptadeceno(824) C20H40 C17H33Cl 70, 83, 125, 280 69, 111, 140, 174 0.2644 0.505669 678.012 762.016 1967.8 2274.7 5 21 Cetonas 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona (904) 2-dodecilciclobutanona (705) C18H36O C16H30O 43, 71, 95, 124, 179, 250 84, 98, 143, 185, 239 0.82099 0.27373 648.262 813.162 1988.5 2475.7 3 9 10 13 14 26 Ésteres Heptadecanoato de metilo (715) 11,14,17-eicosatrienoato de metilo (894) Tridecanoato de metilo (938) 9,12-octadecadienoato de metilo (935) (Z)-7-hexadecenoato de metilo (888) Tridecanoato de metilo (916) C8H16O2 C21H36O2 C14H28O2 C19H34O2 C21H36O2 C14H28O2 74, 87, 103, 143, 213, 256, 347 67, 79, 93, 135, 264 74, 87, 101, 143, 185, 227, 270 67, 81, 95, 150, 178, 263, 294 74, 97, 180, 222, 264 74, 87, 101, 143, 199, 255 0.22 1.2267 6.0946 1.7983 1.6239 0.38083 678.912 701.912 709.312 758.112 759.712 766.562 1970.8 2051,3 2078.1 2259.4 2265.7 2292.6 28 30 Esteroides Acetato de ergost-5-en-3-ol (822) 3,5-dieno-estigmastano (833) C30H50O2 C29H48 67, 81, 105, 147, 213, 255, 340, 382 81, 105, 147, 213, 255, 288, 354, 396 1.0908 1.364 978.512 998.912 3125.4 3205.6 11 Ácidos orgánicos Ácido n-hexadecanoico (909) C16H32O2 73, 87, 129, 157, 185, 213, 256 32.608 731.212 2157.3 1 23 Otros 1,6-Anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosan) (873) 3-bencil-5-cloro-1,2,3-triazo-1-óxido (733) C6H10O5 C9H8ClN3O 60, 73, 101 65, 91, 130, 209 3.374 0.78598 608.812 855.062 1741.6 2640.3 Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 46 Antonio Chávez Montero. 8.2.4 Compuestos identificados por CG-masas de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de Equisetum hyemale L. En el Cuadro 10 se muestran los compuestos identificados en la fracción soluble en acetato de etilo del extracto metanólico de los tallos de Equisetum hyemale L. Los 12 componentes aquí reportados representan el 99.9% de la fracción del extracto (Fig. 30). El compuesto mayoritario en esta fracción del extracto metanólico es el 3,7,11,15- tetrametil-2-hexadecen-1-ol (Fig. 26) con 30.54% del área, el cual también fue identificado en el extracto hexánico, en las fracciones del extracto de acetato de etilo y en la fracción hexánica del extracto metanólico. Fig. 26 Estructura química y espectro de masas de 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol. El segundo compuesto mayoritario es el 1,2-bencendicarboxilato de mono(2-etilhexilo) (Fig. 27) con un 26.33% del área, el cual puede ser una impureza, debido a su origen Análisis fitoquímico de Equisetum hyemale L y evaluación de la actividad alelopática y bactericida de sus extractos. 47 Antonio Chávez Montero. sintético, que ya venía en el disolvente o un compuesto que la planta absorbió y retuvo en sus tejidos, ya que los ftalatos son compuestos persistentes en el ambiente (Latini, 2005). Fig. 27 Estructura química y espectro
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