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CONTINUACIÓN DE LOS ESTUDIOS DEL EXTRACTO HEXÁNICO
DE HOJAS DE LA PLANTA , PARA LACroton ciliatoglanduliferus ort.
OBTENCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS CON POSIBLE
ACTIVIDAD HERBICIDA
T E S I S
PARA OBTENER EL TITULO DE
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA
P R E S E N T A
AIDE AYAMAÍ QUEVEDO RODRÍGUEZ
MEXICO, D.F. 2010
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE:    Profesor: Dr. Blas Lotina Hennsen 
VOCAL:     Profesor: Dra. María Isabel Aguilar Laurents 
SECRETARIO:   Profesor: Dra. Marina Gavilanes Ruíz 
1er.  SUPLENTE:   Profesor: Dra. Vanessa Rebeca Maya Ampudia 
2° SUPLENTE:   Profesor: Dra. Mabel Clara Fragoso Serrano 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LAB.  115  DEL  DEPARTAMENTO  DE  BIOQUÍMICA  CONJUNTO  “E”,  DE  LA  FACULTAD  DE 
QUÍMICA, U.N.A.M, CD. UNIVERSITARIA. 
 
 
ASESOR DEL TEMA:                      _____________________ 
        DR. BLAS LOTINA HENNSEN. 
 
SUPERVISOR TÉCNICO:               ______________________ 
                                                         M. EN C. BEATRIZ KING DÍAZ 
 
SUSTENTANTE:                           ________________________ 
                                                   AIDÉ AYAMAÍ QUEVEDO RODRÍGUEZ 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Dr. Blas Lotina Henssen que me permitió ser parte de su equipo cuando aun no a 
completaba mis créditos, y solo era una simple estudiante de la clase de Bioquímica II que se 
acerco para pedirle trabajar en su laboratorio. Por sus consejos personales que me han 
ayudado mucho para madurar. 
 
A la Maestra Beatriz King que más que mi maestra es mi amiga, gracias por 
soportarme más de dos años, por haber estado a cargo de mí, y darme siempre su apoyo 
incondicional en el laboratorio y en lo personal. 
 
A la Dra Maria Isabel Laurents que me ayudo en toda la parte de fotoquímica de este 
trabajo, por sus palabras de aliento ayudaron a superarme a mi misma en este trabajo. 
Al Dr. Fausto, por haberme apoyado en la parte experimental de este trabajo 
 
A la profesora Alejandrina y su Alumno Omar por ayudarme en toda la parte de 
resonancia, que sin esa ayuda este trabajo no estaría terminado. 
 
Al personal que trabaja en el USAI de Espectrometría de masas a: Q. Georgina 
Duarte Lisci, Q.F.B. Margarita Guzmán Villanueva, en Infrarrojo a: Q.F.B.Marisela 
Gutiérrez, también a la profesora Q. Alejandrina Acosta por el apoyo recibido en lo que se 
refiere a espectros. 
A el proyecto PAPIIT DGAPA IN-211309. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Le doy gracias a Dios y a la Virgen que me fortalecieron para no desfallecer en el 
camino durante mi trayectoria académica así como en la realización de esta tesis, las cuales se 
complicaron un poco. 
 
A mi madre Elvira Rodríguez Arroyo que ha sido madre y padre a la vez, que ha 
estado conmigo en las buenas y en las malas, dándome el ejemplo y el apoyo necesario 
durante toda la carrera sin ella no seria lo que ahora soy, todos tus esfuerzos no fueron en 
vano. Gracias por creer en mí. 
 ¡Lo logramos equipo! 
A mi hermano Heri Alonso que ha sido mi estrella durante toda la vida, y que gracias 
a sus consejo, su apoyo moral y cariño he podido terminar esta etapa de mi vida importante 
también a mi hermana Aída que siempre ve mis triunfos como si fueran suyos igual que mi 
hermano Hector. 
A Braian Arturo mi amigo y compañero de carrera, ya que a su lado pase la parte mas 
dura de mi trayectoria académica, gracias por ser mi confidente en esas ocasiones difíciles 
A este Félix Morales F. que siempre hizo que todos los días en el laboratorio fueran 
amenos, que con su sencillez siempre me mostró que las cosas no son tan horribles como 
parecen y que si existen todavía personas buenas que te dan sin esperar pago por ello 
A todos los que han estado y están en el laboratorio 115 desde Kalu hasta May, a 
claro y como olvidarme de Gaby Cano gracias por tu apoyo y amistad; porque tú eres parte 
importante de este logro 
A Wilber Reyna que siempre estuvo apoyándome en todo momento en mis 
decisiones; lo que hizo posible que yo terminara mi tesis. ¡Gracias por estar conmigo¡ 
 
 
“A un mayor esfuerzo una mayor recompensa” 
CONTENIDO 
ÍNDICE 
Página
LISTA DE ABREVIATURAS 4-7
LISTA DE TABLAS Y DIAGRAMAS 8
LISTA DE FIGURAS 9-10
LISTA DE GRÁFICAS 11
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO 12-14
CAPITULO 2. MARCO TEORICO 14-27
2.1 Herbicidas 14-15
2.2 Características de la planta Crotón ciliatoglanduliferus Ort. 16-17
2.3 Fotosíntesis 17-23
2.3.1 El estudio de la fotosíntesis 19-20
2.3.2 Fotolisis del agua 20-21
2.3.3 Transporte de electrones fotosintético 21-22
2.3.4 Fotofosforilación 22-23
2.4 Fluorescencia de la Chl a 33-27
CAPÍTULO 3. DISEÑO EXPERIMENTAL 28-35
3.1 Obtención de metabolitos secundarios de Crotón 
ciliatoglanduliferus Ort. 
28
3.1.1 Obtención del material vegetal 28
3.1.2 Fraccionamiento primario del extracto hexánico de hojas 
de Crotón ciliatoglanduliferus Ort. 
28-29
3.1.3 Purificación de las fracciones 4, 10, y 19 obtenidas en el 
fraccionamiento primario 
29-30
 
 1 
CONTENIDO 
3.1.4 Fraccionamiento secundario de la fracción 8 30
3.2 Bioensayos in vitro 31-32
3.2.1 Aislamiento de cloroplastos 31-32
3.2.2 Medición de la síntesis de ATP 32
3.3 Bioensayos in vivo 33-35
3.3.1 Siembra de semillas de Lolium perenne (pasto) y Physalis 
ixocarpa (tomate) 
33
3.3.2 Medición de la fluorescencia de la Chl a del PSII 33-34
3.3.3 Medición de la clorofila relativa en plantas tratadas. 34-35
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36-47
4.1 Fraccionamiento biodirigido para la obtención de los 
metabolitos secundarios presentes en el extracto hexánico de 
hojas de Crotón ciliatoglanduliferus Ort. 
36-39
4.1.1 Fraccionamiento primario 36-37
4.1.2 Actividad inhibitoria en la síntesis de ATP (ensayo de 
cernimiento) de las fracciones totales obtenidas en el 
fraccionamiento primario. 
38-39
4.2 Purificación de las fracciones activas 40-47
4.2.1 Purificación y caracterización del compuesto 7,3´4´-
Trimetoxiflavona (Compuesto 1). 
40-42
4.2.2 Caracterización química del 8α-15-dihidroxi-labdano 
(Compuesto 2). 
42-44
4.2.3 Caracterización química de 5-hidroxi-3,7,3´,4´-
tetrametoxiflavona (Compuesto 3). 
44-45
4.2.4 Caracterización química de 15-O-acetil-8α-hidroxi-labadano 
(Compuesto 4). 
45-46
 
 2 
CONTENIDO 
 
4.3 Medición de la fluorescencia de la Chl a in vivo 47-63
4.3.1 Fluorescencia de la Chl a medida en hojas de Physalis 
ixocarpa tratadas con el Compuesto 3. 
48-53
4.3.2 Fluorescencia de la Chl a medida en hojas de Lolium 
perenne tratadas con el Compuesto 3. 
54-56
4.3.3 Fluorescencia de la Chl a medida en hojas de Physalis 
ixocarpa tratadas con la fracción 5. 
57-60
4.3.4 Fluorescencia de la Chl a medida en hojas de Lolium 
perenne tratadas con la fracción 5 
61-63
4.4 Concentración relativa de la clorofila en plantas de Physalis 
ixocarpa y Lolium perenne. 
64-73
4.4.1 Concentración relativa de la clorofilaen plantas de 
Physalis ixocarpa después del tratamiento con el Compuesto 3. 
64-66
4.4.2 Concentración relativa de la clorofila en plantas de Lolium 
perenne después del tratamiento con el Compuesto 3. 
66-68
4.4.3 Concentración relativa de la clorofila en plantas de 
Physalis ixocarpa después del tratamiento con la fracción 5. 
69-70
4.4.4 Concentración relativa de la clorofila en plantas de Lolium 
perenne después del tratamiento con la fracción 5. 
71-73
4.5 Biomasa 73
4.5.1 Biomasa (peso seco) de Physalis ixocarpa y Lolium 
perenne tratadas con el Compuesto 3 y la fracción 5. 
73-74
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES 75
CAPÍTULO 6. BILBIOGRAFÍA 76-77
CAPÍTULO 7. APÉNDICES 78-89
7.1 APENDICE A-Sustancias 78-79 
7.2. APENDICE B 80-97 
 
3 
CONTENIDO 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
Ao Aceptor de electrones primario de PSI 
ABS/RC Expresa el número total de fotones absorbidos por 
moléculas de Chl de todos los centros de reacción, 
divido por el número total de centros de reacción 
activos. 
ABS/CS0 Describe al número total de fotones absorbido por 
las moléculas de Chl por área de hoja analizada. 
AcOEt Acetato de etilo 
ADP Adenosin difosfato 
ATP Adenosin trifosfato 
CCF Cromatografía en capa fina 
CF0 Parte lipofílica del complejo CF1CF0 - ATPasa 
CF1 Parte hidrofílica del complejo CF1CF0 - ATPasa 
CG Cromatografía de gases 
Chl a Clorofila a 
Chl b Clorofila b 
Chl Clorofila 
CDCl3 Cloroformo deuterado 
Cyt b6/f Complejo citocromo b6/f 
DCMU 3-(3,4-diclorofenil)-1.1-dimetil urea 
DEPT Prueba de desacoplado de protones 
DMSO Dimetilsulfóxido 
δ Desplazamiento químico 
dV/dt0 Valor que indica el funcionamiento de OEC 
4 
CONTENIDO 
ET0/RC Parámetro que describe el transpOrte de electrones 
en un centro de reacción activo 
ET0/CS0 Parámetro que describe el transpOrte de electrones 
en el centro de reacción activo del PSII por área de 
hoja analizada. 
F0 Fluorescencia inicial 
Fm Fluorescencia máxima 
Fv Fluorescencia variable 
Hz Herz 
IR Espectroscopía infrarroja 
J Constante de acoplamiento 
Kp Constante de excitación vía no fotoquímica 
Kn Constante de excitación vía fotoquímica 
KD Constante de velocidad vía calor 
Kf Constante de velocidad vía fluorescencia 
KP Constante de velocidad de excitación vía fotoquímica 
MgCl2.6H2O Cloruro de Magnesio hexahidratado 
mM Milimolar 
MV 1, 1´-Dimetil-4,4´-bipiridinium dicloro”metilviológeno” 
μM Micromolar 
NADPH Nicotina adenina dinucleótido fosfato reducido 
NADP+ Nicotina adenina dinucleótido fosfato oxidado 
OEC Complejo productor de oxígeno 
PC Plastocianina 
Pi Fosfato inorgánico 
5 
CONTENIDO 
ppm Partes por millón 
PQ Plastoquinona 
PQH2 Plastoquinol 
PSI Fotosistema I 
PSII Fotosistema II 
P680 Centro de reacción de PSII 
P700 Centro de reacción del PSI 
PI(abs) Índice fotosintético 
PSI0 Indica la probabilidad de que un excitón atrapado por 
el centro de reacción del PSII, transpOrte un electrón 
mas allá de QA 
PHI(E0) Indica la probabilidad de que un fotón atrapado por 
el centro de reacción transpOrte un electrón más allá 
de QA 
PHI(P0) Indica la probabilidad de que un fotón absorbido por 
las clorofilas antena sea atrapado por el centro de 
reacción del PSII 
PHI(D0) Indica la probabilidad de que un fotón atrapado por 
el centro de reacción del PSII se disipe como calor. 
QA Aceptor de electrones de PSII 
QA- Aceptor de electrones reducido del PSII 
QB Aceptor de electrones del PSII 
RC/CS0 Indica la cantidad de centros de reacción del PSII 
activos por área de hoja analizada. 
RMN Resonancia magnética nuclear 
RMN13C Resonancia Magnética Nuclear de Carbono 13 
RMN1H Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno 
6 
CONTENIDO 
Sm Área normalizada de la parte superior de la curva y 
refleja el número de acarreadores de electrones por 
centro de reacción. 
Sum K Es Kn+Kp 
TR0/RC Describe la velocidad máxima a la cual un excitón es 
atrapado por un centro de reacción activo. 
TR0/CS0 Describe la velocidad máxima a la cual un excitón es 
atrapado por un centro de reacción activo del area 
de hoja analizada. 
UV Ultravioleta 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
CONTENIDO 
 
LISTA DE TABLAS Y DIAGRAMAS 
Pagina 
Tabla 1. Metabolitos secundarios aislados de Cróton ciliatoflanduliferus………...16 
Tabla 2. Fracciones obtenidas con diferentes sistemas de elución………............33 
Tabla 3.Valores de I50 de cada una de las fracciones activas en el bioensayo de 
cernimiento……………………………………………………………………..35 
Tabla 4 Resultados de biomasa en Physalis ixocarpa y Lolium perenne después 
de 15 días de haberlas tratado con el Compuesto 3 y la fracción 5 
.........………………………………………………………….........................66 
Diagrama 1. Reacción de acetilación de la fracción 19 ………………………….30 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
CONTENIDO 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Croton ciliatogladuliferus Ort……………………………………………….16 
Figura 2. (a) Esquema del cloroplasto indicando las partes importantes que lo 
constituyen, (b) imagen de microcopia de un cloroplasto……………..18 
Figura 3. Componentes de la membrana tilacoidal del cloroplasto……………….19 
Figura 4. Sistema del complejo productor de oxigeno……………………………...20 
Figura 5. Estructura de la ATP sintasa……………………………………………….22 
Figura 6. Diagramade niveles de energía para la clorofila………………………..23 
Figura 7. Curva típica de inducción de fluorescencia……………………………. 27 
Figura 8. Medidor de clorofila Marca KONICA MINOLTA.....................................35 
Figura 9. Gráfico de la absorbancia de la clorofila…………………………………35 
Figura 10. Estructura de la 7,3´,4´-trimetoxi-flavona (Compuesto 1)……………..37 
Figura 11. Cristales de la 7,3´4´-trimetoxi-flavona (Compuesto 1)………………..37 
Figura 12. Estructura química de 8α15-dihidroxi-labdano (Compuesto 2)………39 
Figura 13. Estructura química de 5-hidroxi-3,7,3´,4´-tetrametoxiflavona 
 (Compuesto 3)……………………………………………………………...40 
Figura 14. Estructura química de 15-O-acetil-8α-hidroxi-labdano 
 (Compuesto 4)………………………………………………..…………….41 
Figura 15. Estructura de los compuestos presentes en la fracción 5……………..42 
 
 
 
 
 
 
9 
CONTENIDO 
 
Figura 16. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa, 
después de 24 horas del tratamiento con el Compuesto 3...................45 
Figura 17. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa , 
después de 48 horas del tratamiento con el Compuesto 3………........46 
Figura 18. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa , 
después de 72 horas del tratamiento con el compuesto 3……………..47 
Figura 19. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en Lolium perenne, después de 
48 horas del tratamiento con el compuesto 3……………………………49 
Figura 20. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en Lolium perenne, después de 
72 horas del tratamiento con el Compuesto 3………………………….50 
Figura 21. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa, 
después de 24 horas del tratamiento con la fracción 5………………..52 
Figura 22. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa, 
después de 48 horas del tratamiento con la fracción 5………………..53 
Figura 23. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa, 
después de 72 horas del tratamiento con la fracción 5………………54 
Figura 24. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en Lolium perenne después de 
48 horas del tratamiento con la fracción 5……………………………..56 
Figura 25.Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de la 
fluorescencia de la clorofila a, medida en Lolium perenne después de 
72 horas del tratamiento con la fracción 5………………………………57 
10 
CONTENIDO 
 
LISTA DE GRÁFICAS 
Gráfica 1. Efecto de las fracciones primarias activas en la inhibición de la síntesis 
de ATP……………………………………………………………………….35 
Gráfica 2. Clorofila relativa en hojas de Physalis ixocarpa después de 24 h de 
tratamiento con el Compuesto 3……………………………………….....58 
Gráfica 3. Clorofila relativa en hojas de Physalis ixocarpa después de 48 h de 
tratamiento con el Compuesto 3…………………………………………..59 
Gráfica 4 Clorofila relativa en hojas de Physalis ixocarpa después de 72 h del 
tratamiento con Compuesto 3...............................................................59 
Gráfica 5. Clorofila relativa en Lolium perenne después de 24 h del tratamiento 
con el Compuesto 3.………………………….........................................60 
Gráfica 6. Clorofila relativa presente en Lolium perenne después de 48 h de ser 
tratado con el Compuesto 3)………………………………………………61 
Gráfica 7. Clorofila relativa en Lolium perenne después de 72 h de ser tratado con 
el Compuesto 3……..……………………………………………………....61 
Gráfica 8. Clorofila relativa en hojas de Physalis ixocarpa después de 24 h del 
tratamiento con la fracción 5……………...............................................62 
Gráfica 9. Clorofila relativa en hojas de Physalis ixocarpa después de 48 h de 
tratamiento con la fracción 5………………………………………………63 
Gráfica 10. Clorofila relativa en hojas de Physalis ixocarpa después de 72 h del 
tratamiento con la fracción 5………………….…………………………63 
Gráfica 11. Clorofila relativa en Lolium perenne después de 24 h del tratamiento 
con la fracción 5..................................................................................64 
Gráfica 12. Clorofila relativa en Lolium perenne después de 48 h del tratamiento 
con la fracción 5…………………………………………………………...65 
Gráfica 13. Clorofila relativa en Lolium perenne después de 72 h del tratamiento 
con la fracción 5…………………………………………………………...65 
11 
INTRODUCCIÓN 
 
CAPITULO 1. INTRODUCCIÒN Y OBJETIVO 
Antes del uso de los herbicidas, para aumentar la producción agrícola las 
malezas se eliminaban manualmente. Además, se empleaban otras técnicas 
como el sistema de barbecho (sistema en el cual la tierra no se siembra por un 
periodo para poder recuperar la materia orgánica y la humedad) y la rotación de 
cultivos [13]. La alelopatía es conocida por la existencia de una gran diversidad y 
cantidad de metabolitos secundarios que al ser liberados por las plantas, 
perjudican a otra planta para el beneficio de ella misma. En el campo los 
metabolitos secundarios son utilizados para beneficiar la productividad del cultivo 
ya que se utilizan como herbicidas [15]. La alelopatía: se refiere a los efectos 
perjudiciales o benéficos de plantas superiores (donadores) sobre la germinación, 
crecimiento o desarrollo de plantas de otras especies (receptoras) [13]. Los 
aleloquímicos son productos fitotóxicos naturales que tienen un fuerte potencial 
para la eliminación de malezas. Estos compuestos son generalmente no-tóxicos y 
benignos con el medio ambiente, ofrecen el potencial para descubrir nuevas 
moléculas que podrían ser utilizadas como herbicidas. Algunos son usados 
directamente como herbicidas, ejemplo de éstos son los compuestos como: La 
tentoxina que es un tetrapéptido cíclico del hongo Alternaria alternata, tiene 
excelente actividad al aplicarla en el suelo, ya que posee un amplio espectro en 
malezas. La hindantocidina es un nucleósido producido por Streptomyces 
higroscopicus, y el ácido pelargónico, el cual es un ácido graso natural. 
En la actualidad, los herbicidas son la principal herramienta para el control 
de malezas, y los aleloquímicos pueden ser usados como herbicidas [16]. 
El descubrimiento de nuevos aleloquímicos que actúen como posibles 
herbicidas se detecta mediante procesos biodirigidos de separación. El proceso 
de aislamiento de dichos aleloquímicos es parte de una matriz que contiene una 
mezcla de compuestos que presentan bioactividad; el procedimiento es separar 
mediante fraccionamiento en columna abierta, las fracciones en las que se 
presenta la actividad herbicida, separarlas para su siguiente refraccionamiento, 
12 
 
INTRODUCCIÓN 
 
y así hasta obtener el o los compuestos responsables de la bioactividad. Esto 
asegura que no se pierda el compuesto que tiene la actividad herbicida [16].En la 
actualidad, los herbicidas son la principal herramienta para el control de malezas, 
y los aleloquímicos pueden ser usados como herbicidas [16]. 
Para determinar la bioactividad se realizan bioensayos; en este caso el 
ensayo de cernimiento empleado fue la determinación de la síntesis de ATP en 
cloroplastos aislados, por el método polarográfico. 
En estudios previos del extracto hexánico de hojas de la planta Croton 
ciliotogladuliferus Ort, se obtuvieron dos metabolitos secundarios por medio del 
fraccionamiento biodirigido que presentaron actividad inhibitoria en la fotosíntesis 
medida in vitro, estos son: el Retusin (5-hidroxi-3,7,3´,4´- tetrametoxiflavona)y el 
Paquipodol (5-4´-dihidroxi-3,7,3´-trimetoxiflavona) [5]; igualmente se reportaron 
otros metabolitos secundarios aislados del extracto hexánico de tallos de la planta 
Croton ciliotoglanduliferus Ort. El 15-O-acetil-8α-hidroxilabdano y el 8α,15-
dihidroxi-labdano [13]. Del extracto hexánico de hojas de Croton 
ciliotoglanduliferus Ort., sólo se estudiaron las fracciones primarias obtenidas con 
el gradiente hexano-acetato de etilo 80:20, donde los metabolitos Retusin y 
Paquipodol fueron encontrados, dejando las demás fracciones sin estudiar, 
aunque ellas resultaron activas en el ensayo de cernimiento. Por tanto, estas 
fracciones podían contener otros metabolitos secundarios responsables de la 
actividad inhibitoria en la fotosíntesis, presentada por el extracto hexánico de 
hojas de la planta Croton ciliutoglanduliferus Ort. 
Por esto, el objetivo de este trabajo es estudiar las fracciones no 
estudiadas en trabajos anteriores [5] en busca de metabolitos secundarios 
adicionales con posible actividad herbicida y así tener información completa de la 
actividad de este extracto. 
 
 
13 
MARCO TEÓRICO 
 
CAPITULO 2. MARCO TEÓRICO 
2.1 Herbicidas 
La palabra herbicida proviene del latín herba, significa planta, y cadere 
que significa matar. Así por su etimología, los herbicidas son productos químicos 
que se utilizan para alterar la fisiología de la planta por un periodo relativamente 
largo, afectando severamente su crecimiento u ocasionando su muerte. Los 
plaguicidas son compuestos químicos que se utilizan para controlar plagas, y los 
herbicidas son plaguicidas que se utilizan para controlar las malezas [9]. 
Los herbicidas están representados por una amplia gama de sustancias 
químicas, las cuales actúan en varios sitios moleculares afectando tanto la función 
metabólica como la transferencia de energía en las células de las plantas. A muy 
pocos herbicidas se les conoce su mecanismo de acción específico, porque es 
muy difícil predecirlo sólo conociendo su estructura química. Para determinar el 
mecanismo de acción de nuevos herbicidas se realizan ensayos fisiológicos y 
bioquímicos. Aquí se presentan algunos mecanismos y sitios de acción de los 
herbicidas [17]. 
SITIO Y MECANISMO DE ACCIÓN DE ALGUNOS HERBICIDAS 
 
1. Inhibición de la biosíntesis de aminoácidos: Su sitio de acción se enfoca 
en las enzimas que participan en la biosíntesis de aminoácidos, como son la 5- 
enopiruvil-shiquimato-3 fosfato sintasa (EPSP-sintasa). Esta enzima está 
involucrada en la síntesis de aminoácidos aromáticos como la fenilalanina. Aceto-
lactato sintasa (ALS) es una enzima que participa en la biosíntesis de leucina e 
isoleucina, y finalmente la enzima glutamina sintasa (GS) cuya función es fijar 
nitrógeno inorgánico para la síntesis de aminoácidos. 
 
 
 
 
14 
MARCO TEÓRICO 
 
2. En la fotosíntesis. Varios herbicidas comerciales tiene como sitio de 
acción el transporte de electrones del PSII, por ejemplo el DCMU (formula del 
DCMU), que inhibe la unión de QB a la proteína D1, impidiendo el transpOrte de 
electrones. 
3. En la biosíntesis de lípidos. Algunos herbicidas como la 
ciclohexanediona tienen como sitio de acción la acetil-CoA carboxilasa, enzima 
que participa en la biosíntesis de lípidos. 
4. En la división celular. Otros herbicidas se unen a la tubulina, la cual es 
una proteína que se encarga de la síntesis de microtubulos en la célula. Estos 
microtúbulos son necesarios para la división celular y la formación de nuevas 
células. Puede ser que los herbicidas también actúen directamente previniendo la 
mitosis. 
5. En la biosíntesis de carotenoides. Existen herbicidas que bloquean la 
síntesis de terpenoides dando como resultado la inhibición de la síntesis de 
carotenoides. Los carotenoides son muy importantes para la supervivencia de las 
plantas porque proporciona protección contra la fotooxidación. 
6. Foto blanqueado. Algunos herbicidas causan fotoblanqueado 
rápidamente en el tejido verde, debido a que son reducidos por el PSI, formando 
un radical que a su vez reduce el oxigeno molecular produciendo el radical 
superóxido. Así, el herbicida actúa en concordancia con el PSI generando 
grandes excesos de radical superóxido y causando la peroxidación de los lípidos. 
Son dos ejemplos el paracuat y el dicuat. Otros herbicidas que causan 
fotoblanqueamiento actúan por otros mecanismos diferentes, como es la 
inhibición de la protroporfirino oxidasa, resultando en la acumulación de 
protoporfirina IX en plantas [17]. 
 
 
 
 
 
15 
MARCO TEÓRICO 
 
2.2 Características de la planta Croton ciliatoglanduliferus Ort. 
 
Croton ciliatoglanduliferus ort. pertenece a la familia Euphorbiaceae, es 
una planta que se encuentra en México en los estados de Puebla y Guerrero. 
Esta planta es utilizada como repelente de insectos y para el dolor de estómago 
[7]. 
Croton ciliotoglanduliferus es un arbusto de 1 a 2 m de altura (Figura 1), 
cOrteza gris pálido, hojas verdes, tallos viejos, follaje con cierto olor a menta; 
hojas anchas, ovaladas y largamente pecioladas de 3 a 12 cm, de largo, flácidas y 
acuminadas con numerosas glandulitas, pediculadas (en los bordes y otras en la 
base del tallo; flores en racimos; fruto capsular de unos 7 mm de largo, y hojas 
muy fragantes. 
 
 Figura 1. Croton ciliotogladuliferus Ort. 
 
La composición química de la especie de C. ciliatoglanduliferus es de: 
grasa líquida, aceite esencial, un alcaloide, caucho, ácido orgánico especial, 
resina ácida soluble en alcohol, glucosa, materia colorante moreno-amarillenta, y 
clorofila [11]. 
 
16 
MARCO TEÓRICO 
 
En el 2006 se reporto [14] el aislamiento de otros metabolitos secundarios 
de la parte aérea de la planta Crotón ciliotogladuliferus (Tabla 1). 
 
Tabla 1. Metabolitos secundarios aislados de Crotón ciliatoflanduliferus 
Compuesto 1 12-O-[(2R)-N,N-Dimetil-3-metinilbutanoil]-4-
deoxyforbol-13 acetato 
Compuesto 2 12-O-[(2S)-N,N-dimetil-3-metilbutanoil]-4-
deoxiforbol-13 acetato 
Compuesto 3 12-O-[3-metil-2-butenoil]-4-deoxiforbol-13 acetato 
 
Compuesto 4 12-O-[(2R)-N,N-dimetil]-3metilbutanoilforbol-13 
acetato 
 
 
Todos los compuestos aislados de las hojas de Crotón ciliotaglanduliferus 
Ort. fueron aceites de color café. Estos fueron identificados por técnicas 
espectroscópicas de RMN1H, RMN13C 
 
2.3 Fotosíntesis 
La fotosíntesis se inicia con la captura de la energía solar hasta su 
transformación en energía química (reacciones de la fase luminosa), donde 
simultáneamente se libera O2 a la atmósfera, llegando hasta la formación de 
varios tipos de carbohidratos y compuestos orgánicos a partir de CO2 y H2O. La 
ecuación general de la fotosíntesis oxigénica, describe las reacciones de oxido-
reducción con el agua como donador de electrones y la reducción de CO2 para 
formar carbohidratos (CH2O). 
CO2+ H2O----------------O2 + CH2O 
17 
MARCO TEÓRICO 
 
La fotosíntesis es un proceso que se lleva a cabo en los cloroplastos, 
organelos de doble membrana que regulan el transporte de metabólitos y 
proteínas entre el interior del mismo y el citosol (Figura 2). El cloroplasto consta 
de una membrana externa permeable, y una membrana interna, separadas por un 
espacio intermembranal. En el interior del cloroplasto se encuentra el estroma, el 
cual es un fluido que contiene enzimas, ADN, RNA, y ribosomas que sintetizan las 
proteínas del cloroplasto. 
El estroma también contiene los tilacoides que son vesículas 
membranosas plegadas, que al estar apilados en forma de discos se les 
denomina grana. Estas granas están interconectadas por las lamelas (Figura 2). 
 
 
Figura 2. (a) Esquema de la estructura del cloroplasto indicando las partes importantes 
que lo constituyen, (b) imagen de microscopía electrónica de un cloroplasto (Leningher, 
2008) 
 
 
18 
MARCO TEÓRICO 
 
2.3.1 El estudio de la fotosíntesis 
La fotosíntesis para estudiarsese divide en dos fases: 
A) Las reacciones de la fase luminosa: Donde se producen NADPH y ATP, en 
la membrana del tilacoide 
B) Las reacciones de la fase obscura: Aquí se utilizan los productos de la fase 
luminosa para sintetizar carbohidratos a partir de la fijación de CO2 y la entrada 
H2O, en el estroma. 
El inicio de la fotosíntesis es la absorción de la energía luminosa, a través 
de pigmentos accesorios como los carotenoides y clorofilas antenas, que al estar 
excitados por el fotón de luz transfieren su energía a los centros de reacción, 
mediante la transferencia de la energía en forma de excitón. 
Los centros de reacción son proteínas transmembranales que contienen 
varios cromóforos. 
Las plantas llevan a cabo la fotosíntesis mediante dos centros de reacción 
que se encuentran conectados en serie por un complejo citocromo b6f. Por lo que 
en el transpOrte de electrones desde H2O hasta NADP+ participan 3 importantes 
complejos proteicos: PSII, citocromo y PSI (Figura 3). 
 
El Fotosistema I (PSI) produce un reductor fuerte capaz de reducir a 
NADP+ a NADPH 
El Fotosistema II (PSII) produce un oxidante fuerte capaz de oxidar al H2O 
y formar O2. 
El citocromo b6f genera un gradiente de protones hacia el interior del 
tilacoide, el cual es utilizado para sintetizar ATP al translocarse los protones a 
través del canal de protones CF0 de la ATP-sintasa (Figura 3). 
19 
MARCO TEÓRICO 
 
 
Figura 3. Componentes de la membrana tilacoidal del cloroplasto (Voet, 2008) 
 
2.3.2 Fotolisis del agua 
En la fotosíntesis, la oxidación de dos moléculas de H2O forma una 
molécula de O2 requiriendo cuatro electrones. Estos cuatro electrones se obtienen 
de una reacción redox de cinco fases [desde el estado S0 hasta el estado S4] 
impulsada por un fotón. Para que ocurra la oxidación de las dos moléculas de H2O 
primeramente se unen al complejo productor de oxígeno (OEC). Que es un 
complejo con actividad catalítica (Proteína - Mn) formado por 4 iones de Mn 
contenidos en el PSII. Las cinco etapas o fases de reacción liberan un total de 
cuatro protones del agua en la parte interna del tilacoide (Figura 4). 
 
 
20 
MARCO TEORICO 
 
 
 Figura 4. Sistema del complejo productor de oxigeno (Lehninger 2008) 
 
2.3.3 Transporte de electrones fotosintético 
La siguiente etapa es el paso de los electrones desde el complejo 
proteína-Mn al centro de reacción oxidado del PSII (P680+), mediante la sustancia 
Z, la cual deriva su nombre a su espectro transitorio en EPR (técnica que muestra 
los espines nucleares de los átomos con los que interaccionan los electrones 
desapareados) en cloroplastos iluminados. Después, el centro de reacción P680 se 
excita por la luz generándose P680* excitado. P680* transfiere un electrón a una 
molécula de feofitina (Pheo) que es una clorofila a en donde el ión Mg2+ es 
sustituido por dos protones. Posteriormente, el electrón pasa a la Quinona A y 
después a la Quinona B (QA y QB) y después al pool de plastoquinonas 
reduciéndololas a plastoquinol (QH2), éstas a su vez reducen al citocromo b6-f, y 
enseguida el citocromo b6-f transfiere el electrón a la plastocianina (PC). El centro 
de reacción de PSI foto-oxidado (P700+) inmediatamente acepta el electrón de la 
PC (Figura 4). 
 
21 
MARCO TEÓRICO 
 
Ya en el PSI los electrones pueden seguir dos rutas diferentes: 
1. Ruta No cíclica: Ruta que la mayor parte de los electrones sigue, en la 
cual pasan por una ferredoxina (Fd) soluble que contiene un grupo fierro-azufre 
[2Fe-2S], y se encuentra en el estroma, la Fd reducida, a su vez reduce el NADP+, 
ésto esta mediado por la enzima ferrodoxina-NADP+ reductasa obteniendo como 
producto final NADPH. 
2. Ruta Cíclica: Algunos electrones regresan desde el PSI, a través del 
citocromo b6f, al conjunto de plastoquinonas, a través de un ciclo Q, translocando 
protones a través de la membrana tilacoidal, desde el exterior hasta el interior de 
la membrana, generando así una buena parte del gradiente de protones que 
impulsa la síntesis de ATP. Dos protones se translocan a través de la membrana 
tilacoidal por cada electrón transportado (Figura 3). 
 
2.3.4 Fotofosforilación: 
La fotofosforilación en plantas se realiza en la membrana tilacoidal a 
cargo de la ATP- sintetasa (Figura 3). La síntesis de ATP a partir de ADP y Pi 
utiliza el gradiente electroquímico producido en el interior del tilacoide (lumen), 
asociado al transporte de electrones y a la fotolisis del agua. 
La ATP-sintetasa es un complejo proteico con una parte hidrofílica (CF1) 
que es el sitio catalítico, y otra lipofílica (CF0), que transloca protones hacia el 
exterior del espacio tilacoidal (Figura 5). 
 
 
22 
MARCO TEÓRICO 
 
 
Figura 5. Estructura de la ATP sintasa (Lehninger 2008) 
2.4 Fluorescencia de la Chl a 
De toda la energía absorbida en el proceso fotosintético, una parte se 
pierde como calor o por re-emisión como fluorescencia. La otra parte de la 
energía es transferida como energía de excitación y atrapada por el centro de 
reacción. Estas tres formas de distribución de energía ocurren al mismo tiempo de 
tal manera que el aumento en la eficiencia de uno, provoca la disminución de los 
otros dos, por lo tanto mediante la medición del rendimiento de la emisión de 
fluorescencia se obtiene información de la disipación térmica y la eficiencia 
fotoquímica de la energía absorbida [12]. 
 
 
 
23 
MARCO TEÓRICO 
 
Un fotón de luz roja (670 nm) contiene suficiente energía para excitar una 
molécula de clorofila a, a su primer estado de excitación, llamado singulete 
(Figura 5). La diferencia de energía entre los dos niveles es la energía de fotón 
absorbido. La molécula de clorofila a excitada libera esta energía y regresa a su 
estado basal, lo que sucede cerca a 10-8 s (Figura 6). Durante este periodo de 
tiempo, ocurre una separación de carga en el centro de reacción, es decir el 
electrón en el nivel de alta energía puede ser transferido a un aceptor I, formando 
un aceptor reducido I-, lo que comprende el primer paso de la fotosíntesis. Si la 
separación de carga no se lleva a cabo, la energía absorbida es liberada como 
calor y/o fluorescencia cuando el electrón excitado regresa al estado basal. La 
relación entre los tres procesos, fotoquímicos (P), fluorescencia (F) y calor 
(desactivación por la radiación (D), es expresada matemáticamente usando 
constantes de velocidad, de excitación vía fotoquímica, KP; vía fluorescencia, Kf; 
y vía calor, KD. El número total de excitaciones por segundo es 
(kP+ kF+ kD)n 
en donde: n= número de moléculas de clorofila 
 
 
 
 
 
 
24 
MARCO TEÓRICO 
 
 
Figura 6. Diagrama de niveles de energía para la clorofila; espectro de fluorescencia , F; 
espectro de absorbancia, A; fotón rojo, r; conversión interna (Kd) 1; fluorescencia ( Kf) , 2; 
cruzamiento inter-sistema, 3; separación de carga (kP), 4; aceptor de electrones 
intermediario de PSII, I-; estados singulete: S1, S2; estado triplete, t; donador de 
electrones desde el sistema de fotolisis de agua del PSII, Z+. 
 
La fluorescencia de la clorofila es roja debido a la diferencia de energía 
entre el nivel basal y el primer nivel excitado y es igual a la energía de un fotón 
de luz roja [2]. 
El análisis de la emisión de la fluorescencia de la clorofila a del PSII hace 
posible caracterizar los efectos y modos de acción del estrés ambiental, y de los 
herbicidas [18]. La curva de inducción de fluorescencia de la clorofila a conocida 
como curva de Kautsky (Figura 7), es un sensible indicador de lo que sucede en 
el proceso del transpOrte de electrones en la fotosíntesis. El rendimiento de la 
fluorescencia de la Chl a (dependiente de la luz) está determinado por los 
cambios del estado redox de la QA. 
25 
MARCO TEÓRICO 
 
Al mismo tiempo se ha demostrado que la curva de inducción de 
fluorescencia (OJIP) refleja la reducciónde la cadena transpOrtadora de 
electrones fotosintética. La fase O-J es la parte que está controlada por la 
separación de carga, esta cinética depende fuertemente de la intensidad de la luz. 
La Fase J-I muestra la reducción del pool de plastoquinonas (PQ). La fase I-P 
depende de la actividad del PSI, representando la reducción del pool de 
ferrodoxinas (Fd) en la presencia de la inactiva ferredoxina-NADP+- reductasa 
[18]. 
La medición de la fluorescencia de la clorofila a del PSII y el análisis del 
“ensayo-JIP” es una de la técnica usada para observar el comportamiento de la 
fotosíntesis en condiciones de estrés para plantas; esta es una técnica que tiene 
diversas ventajas como [4]: 
1) Es un método fácil y rápido. 
2) Es una técnica no invasiva. 
3) Hay posibilidad de obtener datos robustos. 
4) Es fácil de repetir. 
5) Es fácil procesar los datos. 
6) El instrumento de medición no es tan caro en el mercado, y el 
procedimiento para medir es económico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
MARCO TEÓRICO 
 
 
Figura 7.Una curva típica de inducción de fluorescencia (O-J-I-P). Donde las señales 
son: FO (a 50μs), FJ (a 2 ms), FI (a 30 ms), y la fluorescencia máxima FP = FM (a tiempo 
máximo de fluorescencia tFmax) 
 
 El test JIP es un análisis matemático de la curva de inducción de la 
fluorescencia de la Chl a, con base en este marco matemático se deriva un gran 
número de parámetros fotosintéticos, que graficados mediante una gráfica de 
radar, es posible llegar a tener claro qué parámetros son afectados; por esto, el 
test JIP es utilizado en investigaciones para el seguimiento in vivo del aparato 
fotosintético [1]. 
 
 
 
27 
DISEÑO EXPERIMENTAL 
 
CAPÍTULO 3. DISEÑO EXPERIMENTAL 
3.1 Obtención de metabolitos secundarios de Croton ciliotoglanduliferus 
Ort. mediante el ensayo biodirigido 
3.1.1 Obtención del material vegetal 
La planta Croton ciliotglanduliferus. Ort. fue recolectada en el Estado de 
Guerrero el 25 de Febrero del 2004. La identificación de la especie fue realizada 
por la M.C. N. Diego y el M.C. J.R de Santiago, del Laboratorio de plantas 
vasculares de la Facultad de Ciencias, UNAM, con voucher depositado en el 
Herbario la Facultad de Ciencias, UNAM, No. 95711. 
3.1.2 Fraccionamiento primario del extracto hexánico de hojas de 
Croton ciliotoglanduliferus Ort. 
El extracto hexánico fue obtenido previamente por maceración exhaustiva 
de 429.5 g de hojas y semillas de C. ciliotogladuliferus Ort. obteniendose 52.12 g 
de extracto, del cual se tomaron 18 g para realizar este trabajo. 
Los 18 g de extracto hexánico se fraccionaron mediante cromatografía en 
columna abierta utilizando gel de sílice marca Merck, con un tamaño de malla de 
0.0063-0.200mm, y un sistema de elución con gradiente de polaridad ascendente 
hexano–AcOEt, y finalmente acetona; las fracciones recolectadas fueron de un 
volumen de 100 mL. 
Las fracciones obtenidas se analizaron por cromatografía en capa fina 
(CCF) utilizándose placas de aluminio recubiertas de gel de sílice de 0.25 mm de 
espesor (sílice gel 60 F254, Merck); se visualizaron con luz UV (onda cOrta 254 
nm y onda larga 366 nm) y se revelaron utilizando sulfato cérico amoniacal 
(Apéndice A) como agente cromógeno, desarrollando el color de las placas por 
calentamiento en una parrilla eléctrica (100°C, 5 min). 
28 
DISEÑO EXPERIMENTAL 
 
Las fracciones similares en composición de acuerdo al análisis de CCF se 
reunieron. 
3.1.3 Purificación de las Fracciones 4, 10 y 19 obtenidas en el 
fraccionamiento primario. 
 En la fracción 4 (F-4) precipitó una pequeña cantidad (2 mg) de 
cristales de color amarillo, que en el análisis por CCF presentaban un compuesto 
mayoritario en una mezcla de compuestos en baja abundancia, por lo que la F-4 
se analizo espectrométricamente con RMN1H, IR, identificándose un primer 
compuesto. (Compuesto 1). 
De la fracción 10 (F-10) del fraccionamiento primario, se precipitó un polvo 
amarillo, que al analizarlo con CCF mostró la mezcla de dos compuestos que se 
separaron empleando cromatografía en placa preparativa. Esta placa se eluyó 
tres veces en un fase móvil de Hexano-AcOEt 70:30 (v:v), y se eluyó una última 
vez en una fase móvil de Hexano-AcOEt 70:30 (v/v) con 5 gotas de MeOH de la 
cual se obtuvo (8 mg) de un polvo amarillo. Posteriormente se realizo el análisis 
espectroscópicos de RNM13C, RNM1H, IR, y CG/EM, mismos que se realizaron en 
la Unidad de Servicios Analíticos y de Investigación (USAI), Facultad de Química, 
UNAM, encontrándose un segundo compuesto (Compuesto 3). 
La fracción 19 se purificó mediante una reacción de acetilación (Diagrama 
1), después de la acetilación se realizó un fraccionamiento, utilizándose un 
sistema de elución con un gradiente de polaridad ascendente con Hexano–AcOEt, 
obteniéndose un total de 101 fracciones. 
 
 
 
29 
DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
La fracción 52-69 (19.8 mg) fue analizada mediante CCF; observándose en dicho 
análisis la presencia de un compuesto puro aceitoso de un color café claro el cual 
se analizó espectroscópicos con RNM13C, RMN1H, IR, y CG/EM (Compuesto 4). 
 
Diagrama 1. Reacción de acetilación de la fracción 19. 
3.1.4 Fraccionamiento secundario de la fracción 8 
Con la fracción 8, se procedió a realizar un fraccionamiento secundario, 
obteniéndose 7 fracciones (de FF-1 a FF-7) de las cuales, se obtuvieron en la 
fracción 3 (FF-3) 319.5 mg de un compuesto homogéneo. El análisis en CCF, 
revelo la presencia de un sólo compuesto, que se analizó por espectroscopía con 
IR, RMN1H, RMN13C (Compuesto 2). 
30 
DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
3.2 Bioensayos in vitro. 
3.2.1 Aislamiento de cloroplastos. 
Se aislaron cloroplastos de hojas de espinaca (Spinecea olereaceae L.), 
para lo cual se escogieron aproximadamente 40 g de hojas frescas y turgentes, 
que no estuvieran maltratadas o rotas, las hojas se lavaron y secaron 
cuidadosamente, se separó la nervadura y la punta de las hojas, en donde se 
encuentran los cloroplastos viejos, se cOrtaron en trozos pequeños y se molieron 
en una licuadora ( Osterizer, Mod. L-12), con aproximadamente 250 mL de medio 
de aislamiento (Apéndice A) a 4°C. La molienda se realizó cuidadosamente para 
no causar daño mecánico a los cloroplastos. Una vez molidas las hojas de 
espinacas se procedió a filtrarlas a través de ocho capas de gasa, recibiendo el 
filtrado en tubos de centrífuga, que previamente se mantuvieron en baño de hielo. 
Los cloroplastos se sedimentaron por centrifugación a 400 rpm a 4 °C en una 
centrifuga Sorval, Modelo Super T21, DUPONT, durante 5 min, posteriormente se 
resuspendierón en 1.5 mL del mismo medio y la suspensión se guardó en 
obscuridad a 4 °C. 
3.2.2Cuantificación de clorofila según el método Arnon [3]. 
Este método consiste en aforar con acetona a un volumen de 5 mL una 
alícuota de 20 µL de cloroplastos resuspendidos, después se incuban en la 
obscuridad a 0 °C por 5 min y se centrifugan 5 min a 400 rpm en una centrífuga 
clínica modelo EBA 8S, Hettich, para eliminar las membranas y proteínas 
precipitadas. El contenido de clorofila se cuantificó midiendo la absorbancia del 
sobrenadante a dos longitudes de onda, 663 y 645 nm en un espectrofotómetro 
Beckman, modelo DU650, la concentración de la clorofila se calculó con la 
siguiente fórmula: 
 
31 
DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
[Chl] = 8.05(A663) + 20.29(A645) 
En donde: 
[Chl] = µg de clorofila por mL 
8.05 y 20.29 son constantes experimentalmente establecidas a partir de los 
coeficientes de extinción experimentales para cada una de las longitudes de onda. 
A = Absorbancia a las longitudes de onda indicadas. 
 
3.2.2 Medición de la síntesis de ATP 
La medición se realizó con un micro electrodo Orion, (Mod 8103 Ross) 
conectado aun potenciómetro Corning (Modelo 12), con escala expandida. Los 
cambios de pH observados se registraron en un aparato Kipp & Zonen. 
En la cubeta de reacción seagregaron 3 mL de medio bomba (Apéndice 
A), 30 µL de ADP 30 mM, 30 µL de fosfato inorgánico (Pi) 30 mM, se ajusto el pH 
a 8.0 y se agregaron 60 μg Chl. Se ilumino por 1 min, resultando en el consumo 
escalar de H+ por ATP, como se observa en la siguiente reacción: 
[Mg.ADP]- + PO4 2+ + H+ = [Mg-ATP.H]2- 
Éste es un método simple que provee una medida real de la síntesis de 
ATP. La técnica es por lo tanto, la ideal para determinar la velocidad de hidrólisis 
de ATP y para efectuar estudios cinéticos de este proceso [6]. 
 
 
 
32 
DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
3.3. Bioensayos in Vivo 
3.3.1. Siembra de semillas de Lolium perenne (pasto), Physalis 
ixocarpa (tomate) 
Se sembraron 200 semillas de dos especies de planta mono y 
eudicotiledoneas Lolium perenne (pasto) y Physalis ixocarpa (tomate) 
respectivamente, en macetas de la misma profundidad y mismo tamaño. Éstas se 
regaron cada tercer día y se mantuvieron en el invernadero a una temperatura 
aproximada de 30°C, con iluminación normal día/noche. 
3.3.2. Medición de la fluorescencia de la Chl a del PSII 
Después de haber asperjado las plantas, se midió la emisión de la 
fluorescencia de la clorofila a en las hojas a las 24, 48, 72 h, con un fluorómetro 
marca Hanstech, modelo Handy PEA. Previamente a cada medición se adaptaron 
las hojas a la oscuridad por un periodo de 30 minutos para asegurar que los 
componentes de la maquinaria fotosintética estuvieran oxidados. Mediante una 
fuente de 3 fotodiodos, se aplicó luz de longitud de onda de 680 nm con una 
densidad de flujo de 300 µM m-2s-1, la duración del pulso de luz fue de dos 
segundos y simultáneamente se registró la fluorescencia con un fotodetector, 
obteniéndose una curva de inducción de la cinética de la fluorescencia de la 
clorofila a, también llamada curva de Kautsky (Figura 6). A partir de los datos de 
la cinética de la fluorescencia, se obtuvieron los siguientes parámetros: 
- Fluorescencia mínima (Fo): Es la mínima fluorescencia, cuando todos 
los centros de reacción del PSII están abiertos, es decir las QA están oxidadas (a 
tiempo = 0) 
- Fluorescencia máxima (Fm): Muestra la cantidad de centros de reacción 
del PSII que permanecen cerrados y las QA están reducidas. 
33 
DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
- Fluorescencia variable (Fv): Se obtiene por la diferencia de dos 
parámetros (Fv = Fm-Fo). 
- Eficiencia (Fv/Fm): Es la eficiencia de la fotoquímica primaria, 
independiente al área sobre la curva O-J-I-P de fluorescencia entre Fo y Fm es 
proporcional al tamaño del pool de quinonas en el lado aceptor de electrones. 
Finalmente se realizó el análisis de los datos de fluorescencia de la Chl a 
con el programa Biolyzer. 
 
3.3.3. Medición relativa de la clorofila en plantas tratadas. 
La medición de clorofila en las hojas de Lolium perenne (pasto) y Physalis 
ixocarpa (tomate) de plantas control, así como de plantas tratadas con los 
compuestos, se realizó a las 24, 48 y 72 h después de asperjar los compuestos, 
utilizando un medidor de clorofila Marca KONICA MINOLTA, modelo SPAD-502 
(Figura 8), que mide la clorofila total relativa en hojas aproximadamente en una 
área de 2 X 3 mm de la misma y calcula el valor numérico proporcional a la 
cantidad de clorofila presente en la hoja, basandose en medir la absorbencia de la 
hoja en dos longitud de onda diferentes y tomando como parámetro de referencia 
la absorbencia que se obtiene en las hojas control (Figura 9). 
 
 
 
 
 
34 
DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
Figura 8. Medidor de clorofila Marca KONICA MINOLTA, modelo SPAD-502. Para medir 
se coloca la hoja en la cabeza abierta del SPAND-502, cerrándola después, 
obteniendose un valor en la pantalla que está debajo de la cabeza, que indica el valor de 
la absorbencia relativa. (http://.konicaminolta.com/content/download/.../spad502_e12.pdf) 
 
 
Figura 9. Gráfico de la absorbencia de la clorofila con dos picos en las regiones: azul 
(400-500 nm) y roja (600-700 nm), sin transmitancia en el infrarrojo cercano. Las dos 
longitudes de onda corresponden a la absorbancia de la clorofila extraída de hojas con 
acetona al 80%. A) Hojas Control, B) Hojas tratadas. 
35 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
4.1 Fraccionamiento biodirigido para la obtención de los metabolitos 
secundarios presentes en el extracto hexánico de hojas de Croton 
ciliatoglanduliferous. 
4.1.1 Fraccionamiento primario. 
El extracto hexánico se sometió a un tratamiento cromatográfico en columna 
abierta de gel de sílice y se obtuvieron 306 fracciones, cada una de 100 mL, que 
por su similitud en análisis de CCF, se reunieron obteniendo 40 fracciones totales 
(Tabla 2). 
Tabla 2. Fracciones obtenidas con diferentes sistemas de elución 
GRADIENTE (v:v) 
Hexano/Acetato de etilo 
 
FRACCION 
 
ELUATOS 
100 hexano 1 1-7 
 
90:10 
2 8-9 
3 10 
 
 
 
 
 
 
80:20 
4 11-16 
5 17-33 
6 34-42 
7 43-44 
8 45-56 
9 57-75 
10 76 
11 77-81 
12 82-88 
13 89-93 
14 94-126 
15 127-157 
16 158-163 
36 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 17 164-176 
 
 
 
 
70:30 
 
18 177-198 
19 199-219 
20 220 
21 221-226 
22 227 
23 232-233 
 
 
 
 
60:40 
 
24 234-241 
25 242-244 
26 245-248 
27 249 
28 250-256 
29 257 
30 258 
 
 
50:50 
 
31 259-265 
32 266-278 
33 279-282 
34 283-288 
 
 
 
40:60 
 
35 289-296 
36 297 
37 298-300 
38 301-303 
39 304 
40 305-306 
 
 
 
37 
38 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.1.2 Actividad inhibitoria de las fracciones totales obtenidas en el 
fraccionamiento primario en la síntesis de ATP (ensayo de cernimiento). 
 De las 40 fracciones, sólo se seleccionaron aquellas que no presentaron un 
análisis de CCF complejo y que tuvieran una cantidad sustanciosa con la cual 
trabajar para los ensayos biológicos posteriores. Así, se seleccionaron las 
fracciones F-4, F-5, F-8, F-10 y F-19 que mostraron inhibición en el ensayo de 
cernimiento, como se muestra en la Gráfica 1. 
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
%
 S
ín
te
si
s 
de
 A
TP
Concentración [ppm]
 F-5
 F-8
 F-10
 F-19
 
Gráfica 1. Efecto de las fracciones primarias activas en la inhibición de la síntesis de 
ATP. 
 
 
 
39 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Para cada fracción, se determinó su valor de I50, y los resultados se muestran en 
la Tabla 3. 
 
Tabla 3. Valores de I50 de cada una de las fracciones activas en el bioensayo de 
cernimiento. 
FRACCIÓN I50 [ppm] 
F-5 17.35 
F-8 19 
F-10 21.3 
F-19 15.07 
F4 _______ 
 
La fracción F-4 mostró un comportamiento particular, ya que presentó una 
disminución en la síntesis de ATP a 100 y 25 ppm, sin embargo, a 50 ppm se 
observó un aumento de ésta. Por esta razón, en la gráfica correspondiente, no se 
pudo determinar el I50, pero se llevó a cabo la caracterización química de su 
componente mayoritario, a pesar de estar en la mezcla. 
 
4.2. Purificación de las fracciones activas 
 
4.2.1 Purificación y caracterización química del Compuesto 1, 7,3´,4´-
Trimetoxi-flavona (Compuesto 1). 
 
De la fracción F-4, precipitó un polvo amarillo que al recristalizarse con 
AcOEt-hexano, precipitaron cristales color amarillo (Figura. 11), de los cuales; por 
análisis de CCF, se mostró un compuesto mayoritario, que se caracterizó por 
análisis espectroscópicos de infrarrojo (IR) y RNM1H (Apéndice B). 
40 
40 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Este compuesto purificado presentó gran absorción a la luz ultravioleta en 
la CCF, sugiriendo la presencia en la molécula de grupos cromofóricos 
importantes. El análisis infrarrojo mostró bandas para grupo hidroxilo en 3426 cm-
1, para metilos en 2936 cm-1, para vibración carbono-hidrógeno alifático en 2972 
cm-1 y carbono-hidrógeno aromáticos en 3001 cm-1. Igualmente mostró absorción 
para el enlace carbono-oxígeno de grupo carbonilo en 1655 y para la vibración 
carbono-oxígeno en 1206 y 1155 cm-1 (Espectro 1). 
En el análisis de resonancia magnética nuclearde hidrógeno, el espectro 
mostró tres señales singulete en 3.86, 3.88, y 3.98 ppm, que integraron en 
conjunto para nueve átomos de hidrógeno y fueron asignadas a tres grupos 
metoxilo aromáticos. De 7.662 a 7.712 ppm, se apreciaron señales para 
hidrógenos aromáticos que integraron para dos hidrógenos, asignados a la parte 
BX de un sistema aromático ABX; la parte A de este sistema está conformada por 
un doblete en 7.049 ppm con constante de acoplamiento de 8.1 Hz e integró para 
un hidrógeno. En 6.00 ppm se observó una señal singulete que integró para un 
hidrógeno y se asignó a un hidrógeno de tipo vinílico, desplazado a campo bajo. 
Otras señales fueron observadas en 6.36 y 6.45 como dobletes con constante de 
acoplamiento de 2.1 Hz ambas y asignadas a hidrógenos aromáticos dispuestos 
en un anillo bencénico en posición meta entre sí. 
La integración en una estructura química de las señales de este espectro, 
sugirió la presencia de un sistema aromático sustituido en las posiciones 1, 3, y 4, 
y éste unido al esqueleto de una cromona, dadas las características de intensa 
absorción en el ultravioleta y de las señales en el espectro en el infrarrojo. La 
presencia de una señal ancha para un hidrógeno a campo bajo en 12.64 ppm 
confirmó el esqueleto de un flavonoide tri metoxilado, correspondiente a la 7,3´,4´-
trimetoxi-flavona (Figura 10 y Espectro 2). 
 
 
41 
41 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
O
OOH
MeO
OMe
OMe  
Figura 10. Estructura de 7,3´,4´-trimetoxi-flavona (Compuesto1). 
 
 
 
Figura 11. Fotografía de cristales de la 7,3´4´-trimetoxi-flavona (Compuesto 1), realizada 
con un microscopio MOTIC con filtro blanco (A), fotografía tomada con el mismo 
microscopio pero con un filtro obscuro (B). 
 
4.2.2 Caracterización química del 8α,15-dihidroxi-labdano (Compuesto 2). 
Este compuesto fue purificado mediante un fraccionamiento secundario por 
cromatografía de columna abierta de gel de sílice de la fracción 19; obteniéndose 
7 fracciones (FF-1 hasta FF-7), de las cuales la fracción 3 (FF-3) se obtuvo con 
mayor pureza y cantidad, lo que fue constatado por el análisis de la CCF. 
42 
42 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
El espectro en el infrarrojo (Espectro 3) de este compuesto mostró bandas 
con las siguientes asignaciones: 3381 cm-1 una banda muy intensa de grupos 
oxhidrilo, en 2924 cm-1 y 2869 cm-1 y bandas en 1462 cm-1 y 1387 cm-1 para 
grupos metilo, metileno y metino de tipo alifático. En 1058 cm-1 y 1130 se 
observarón bandas anchas de vibración de C-O y una banda en 1712 cm-1 de 
grupo carbonilo. 
El espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno mostró señales 
para hidrógenos alifáticos solamente (Espectro 4). 
El espectro de RNM 13C mostró señales para 20 carbonos característico de 
un compuesto diterpenoide (Espectro 5). 
La cromatografía de gases sólo mostró un pico (Espectro 6) indicando la 
presencia de un sólo compuesto. Con los datos arrojados del espectro de masas 
por impacto electrónico (Espectro 7) se encontraron las siguientes 
fragmentaciones: m/z 69, 83, 95, 123, 137, 157, 177, 191, 277, y 292, con un ión 
molecular de 310 m/z que ajusta para una fórmula molecular de C20H38O2, que 
indica la presencia de dos insaturaciones en la estructura del compuesto. Al no 
encontrarse en los espectros señales para carbonos de tipo sp2, sp3 o grupos 
carbonilo, las mencionadas insaturaciones debían estar incluidas en dos 
carbociclos. La señal múltiple en 3.6 ppm, integró para dos hidrógenos y se 
correlacionó con la de 62.5 ppm en 13C y se asignó a un alcohol secundario. En 
74 ppm se observa una señal para carbono cuaternario base de un oxígeno. De 
0.75 a 0.8 ppm se encuentran cuatro señales singulete asignadas a 4 metilos 
angulares y un singulete desplazado a campo más bajo, en 1.1 ppm, para un 
metilo unido a un carbono base de un átomo de oxígeno. 
La integración de los resultados, sugirió la estructura de un diterpenoide de 
tipo labdano en donde las dos insaturaciones encontradas en la fórmula molecular 
corresponden a los dos carbociclos de los anillos A y B. La comparación de estos 
datos con los encontrados en la literatura [13], confirmaron la estructura del 8α-
15-dihidroxi-labdano (Compuesto 2) (Figura 12). 
43 
43 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
OH
OH
 
Figura 12. Estructura química de 8α,15-dihidroxi-labdano (Compuesto 2). 
 
 
4.2.3 Caracterización química de 5-hidroxi-3,7,3´,4´-tetrametoxiflavona 
(Compuesto 3). 
En el análisis del espectro infrarrojo se encontraron bandas de absorción 
de metilos en 2922, 2852, 1456, 1376 cm-1; también se presentó una banda de 
absorción en 1655 cm-1 debido a la vibración carbono-carbono con doble ligadura 
de un compuesto aromático. La banda en 1309 cm-1 se asignó a un carbono 
aromático unido a un grupo oxhidrilo; en 1731 cm-1 se observo una señal intensa 
para un grupo carbonilo y otra poco intensa en 2956 cm-1 de grupos oxhidrilos 
presentes (Espectro 8). 
El espectro de RNM1H mostró señales de hidrógenos aromáticos en campo 
bajo entre 6 y 8 ppm, que integraron para 5 hidrógenos aromáticos en dos grupos, 
los cuales corresponden a un sistema ABX, con un benceno trisubstituído: en 6.99 
se observa un doblete (J = 8.7) acoplado con un doble de dobles en 7.74 ppm (J = 
8.6, 2.1Hz) y otro doblete en 7.69 (J = 2.1 Hz). Los otros dos hidrógenos se 
localizaron en 6.45 y 6.35 ppm como dos dobletes acoplados entre sí en posición 
meta (J = 2.1 Hz). Por otra parte, entre 3.86 y 3.99 aparecieron tres señales 
singulete que integraron para 12 hidrógenos asignadas a 4 grupos metoxilo 
aromáticos; a campo bajo (12.6 ppm) se aprecia una señal ancha que integra 
para un hidrógeno, perteneciente a un grupo hidroxilo quelatado con un oxígeno a 
través del espacio (Espectro 9) (Apéndice B). 
44 
44 
 
RESULTADOS YDISCUSIÓN 
 
En el análisis del espectro de masas obtuvimos el peso molecular que fue 
de 358 correspondiente a una fórmula condensada de C19H18O7 que demuestra 
un índice de insaturación de 11(Espectro 10). Tomando en cuenta dos grupos 
aromáticos bencénicos por sus señales en RMN y un grupo carbonilo evidente en 
el IR, suman 9 insaturaciones, por lo que las otras dos deben pertenecer a otro 
ciclo y a un doble enlace. La estructura de un flavonoide para este compuesto se 
manifiesta en la gran absorción observada con luz UV (amarillo en las 
cromatoplacas) e integrando todos estos resultados y mediante la comparación de 
los mismos con los encontrados en la literatura, se confirmó la estructura de la 5-
hidroxi-3,7,3´,4´-tetrametoxiflavona (Retusin) la cual se muestra en la Figura 13 
[5]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Estructura química de 5-hidroxi-3,7,3´,4´-tetrametoxiflavona (Compuesto 3). 
 
4.2.4 Caracterización química del 15-O-acetil-8α-hidroxi-labdano (Compuesto 
4). 
El espectro infrarrojo mostró señales en 3436 cm-1 de grupos hidroxilo; en 
2924 y 2854 cm-1, señales para metilos metilenos y metinos (elongación y 
estrechamiento), en 1740 cm-1 una banda para carboxilato, en 1462, 1387 y 1366 
cm-1 señales para metilos, metilenos y metinos (“bamboleo,”) en 1242 cm y 1032 
cm-1 bandas para la vibración del enlace C-O (Espectro 11). 
 
 
45 
O
OOH
MeO
OMe
OMe
OMe
45 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
El espectro de RNM 1H mostró señales para hidrógenos alifáticos 
(Espectro 12) como cinco señales singulete en 2.04 (metilo de acetilo), 1.32, 
1.14, 0.86, y 0.78 ppm que integraron para tres hidrógenos cada una; en 0.91 
ppm, un doblete que fue asignado a un metilo base de un grupo metino; en 4.11 
ppm, una señal múltiple que integró para 2 hidrógenos, asignada a un metileno 
base de un grupo acetoxilo, por su desplazamiento a campo bajo. El espectro de 
RNM 13C presentó 22 señales, donde en δ171.3 se observó un carbonilo de éster, 
observado anteriormente en el espectro IR (Espectro 13). El análisis del espectro 
DEPT (Espectro 14) mostró 8 señales para metilenos en δ62.9, 44.3, 41.0, 39.7,35.3, 22.8,20.5, 18.4, tres señales para carbonos cuaternarios en δ 74.3, 39.1, 
33.2 y tres para metinos en δ 62.4, 56.1, y 30.7; además también se observaron 
seis señales para grupos metilo en δ 33.3, 23.9, 21.4, 21.0, 19.4, y 15.4 
(Espectro 15). 
Integrando toda la información, se logró identificar al 15-O-acetil-8α-hidroxi-
labdano cuya estructura se muestra en la Figura 14. 
 
 
O
O
OH
 
Figura 14. Estructura química de 15-O-acetil-8α-hidroxi-labdano (Compuesto 4). 
 
 
 
 
46 
46 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.2.5 Análisis espectroscópico de la fracción 5 del fraccionamiento primario. 
El análisis por CCF de la fracción 5 presentó una complejidad en su 
composición debido a que contienia al menos cinco compuestos con un factor de 
retención muy similar entre ellos. 
En CG presentó varios picos en tiempos de retención diferentes indicando 
que hay una mezcla de compuestos, donde el compuesto mayoritario tiene un 
pico mayor de relativa abundancia en 10.94 min (Espectro 16). 
Este pico demuestra un espectro de masas por impacto electrónico 
(Espectro 17) correspondiente al de una mezcla de alcanos de cadena larga, ya 
que las rupturas que presenta son de 14 umas y otras de 15 (pérdida de metilos), 
además de que los picos presentan dentro del diagrama de masas una tendencia 
gaussiana, corroborando lo anterior. 
Estos compuestos tienen la posible estructura que se muestra en la Figura 15. 
 
CH3-CH2-(CH2) n-CH2-CH3 
Figura 15. Estructura de los compuestos presentes en la fracción 5. 
 
 
4.3 Medición de la Fluorescencia de la clorofila a in vivo. 
En este ensayo biológico se probó el Compuesto 3, 5-hidroxi-3,7,3´,4´-
tetrametoxiflavona (Retusin) y la fracción 5 (F-5), ambos presentaron una 
inhibición significante en la síntesis de ATP (Gráfica1); además la fracción F-5 
está muy próxima a la fracción donde se caracterizó el compuesto (1), que se 
obtuvo en una cantidad mínima (2 mg); por lo que no se probó en este bioensayo. 
 
 
 
 
 
 
47 
47 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.3.1. Fluorescencia de la Chl a medida en hojas Physalis ixocarpa tratadas 
con el Compuesto 3. 
De acuerdo a los resultados obtenidos con los parámetros calculados a 
partir de la fluorescencia de la Chl a, medida después de 24 h de tratamiento, se 
observó que 25 μM del Compuesto 3 afectó significativamente la fotosíntesis de 
las plantas de Physalis ixocarpa, ya que el índice fotosintético PI(abs) disminuyó 
en un 50%; este efecto no se debió a la disminución de los centros de reacción 
activos, ya que los valores de RC/CSo (centros de reacción activos del PSII por 
área medida) del control y del tratamiento fueron similares; igualmente, la 
probabilidad de que los centros de reacción activos del PSII absorban fotones 
(ABS/RC) aumentó un 30%, comparando el valor del parámetro dV/dt0 en las 
muestras control y tratadas, sugerimos que el Compuesto 3 afecta a la enzima 
que fotolisa el agua; esto se corroboro con los valores del parámetro PHI(Do) 
(probabilidad de que la energía absorbida que no se utiliza en la separación de 
carga se disipe como calor) que aumentaron en las hojas tratadas con el 
Compuesto 3, este dato es congruente con el aumento del parámetro Kn, ya que 
la energía del fotón absorbido se pierde en forma de calor en un proceso no 
fotosintético, ver Figura 16A. 
En el caso de los tratamientos con las concentraciones 50 μM y 75 μM del 
Compuesto 3 (Figura 16B, y 16C respectivamente) no hubo variación en los 
parámetros con respecto al control, excepto en el parámetro PI(abs), donde hay 
un aumento de 10% en 50 μM y una disminución de 10% a 75 μM, valores no 
significativos, es decir, el Compuesto 3 a estas concentraciones no tuvo efecto a 
las 24 h. 
Las plantas tratadas con DCMU 50 μM (Figura 16D) muestraron una ligera 
disminución en la cantidad de centros de reacción activos, pero ésto no fue 
significativo; sin embargo, los parámetros ABS/CSo, ABS/RC, TRo/RC, TRo/CSo, 
ETo/RC, y ETo/CSo aumentaron representativamente, en algunos casos hasta un 
30 y 50% (Fig. 16D). Estos datos sugieren que el DCMU no penetró del todo en 
48 
48 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
las hojas, y la pequeña porción que sí penetró alertó a la planta para que 
aumentara su actividad fotosintética como una respuesta al estrés sometido, 
razón por la cual los parámetros arriba mencionados tuvieron ese 
comportamiento. 
A las 48 h después del tratamiento con 25 μM del Compuesto 3 se nota 
que el índice fotosintético se recuperó (Figura 17A), y se observó una 
disminución de los centros de reacción activos del PSII del área analizada de la 
hoja del 10%, y disminución de los valores de los parámetros ABS/CSo, TRo/CSo, 
y ETo/CSo; Sin embargo, los parámetros Kp, Kn y Sum K aumentaron, lo que 
indica que la planta se estaba recuperando. Para el caso de 50 μM del 
Compuesto 3 (Figura 17B) se observó una disminución de aproximadamente un 
50% en los parámetros ETo/CSo, TRo/CSo, ABS/CSo y RC/CSo; mientras que 
Kp, Kn y Sum K aumentaron casi un 50%. A 75 μM (Figura 17C) PI(abs) 
disminuyó un 10%, y los parámetros restantes muestrarón una mínima variación, 
lo que nos indica que dicho compuesto no tiene un efecto significativo en la planta 
a esa concentración en este tiempo de exposición. El efecto de 50 μM de DCMU 
en Physalis ixocarpa ya fue muy notable, ya que afectó casi todos los parámetros, 
a excepción del transporte de electrones por área medida y los centros de 
reacción activos. Lo anterior correspondió a la actividad típica del DCMU por su 
efecto inhibitorio en el lado aceptor del PSII, más específicamente inhibiendo el 
sitio de unión de QB en la proteína D1. Por lo tanto se puede decir que en este 
tiempo el DCMU ya penetró la hoja (Figura 17D). 
A las 72 h después del tratamiento con 25 μM del Compuesto 3 (Figura 
18A) observamos que los valores de PI (abs), (ETo/CSo) y de los centros de 
reacción activos (RC/CSo) disminuyeron drásticamente, aumentando a su vez la 
absorción de fotones por las clorofilas antena del centro de reacción (ABS/RC) y 
la energía obtenida de los fotones absorbidos disipándose en forma de calor 
PHI(Do). También hay daño muy marcado en la enzima que lleva a cabo la 
fotolisis del agua (dV/dt0). Y aunque a las 48 h la planta trató de recuperarse, se 
49 
49 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
observo que no lo logro (Figura 17A), para las 72 h el compuesto está afectando 
la fotosíntesis (Figura 18A). A las concentraciones de 50 y 75 μM del Compuesto 
3 (Figura 18B y Figura 18C) se observó la misma tendencia en los parámetros 
mencionados arriba, en este caso la disminución de estos valores fue menor, por 
ejemplo: PI(abs) disminuyó 40 y 60% respectivamente; mientras que la actividad 
de las clorofilas antena del centro reacción del PSII (ABS/RC), al igual que el 
atrapamiento de la energía por centro de reacción (TRo/RC) aumentó en ambos 
casos 10%, sin embargo, este exceso de energía atrapada se pierde como calor, 
razón por la cual el parámetro PHI(Do) aumentó 10% también. 
A las 72 h el DCMU 50 μM (Figura 18D), ha afectado casi todos los 
parámetros mostrados, a excepción de Kn, en un comportamiento inhibitorio típico 
de este herbicida, lo que indica que en este tiempo transcurrido la planta no lo ha 
metabolizado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
50 
50 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
A 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
B 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
C 
0.5
0.7
0.9
1.1
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
D 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSoPI(abs)
Figura 16. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de las determinaciones 
de la fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa, después de 24 h 
del tratamiento con el Compuesto 3. A) 25µM, B) 50μM, C) 75μM, y D) DCMU 50μM 
 
 
 
 
51 
51 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
A 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
B 
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
C 
0.5
0.7
0.9
1.1
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
D 
0
0.5
1
1.5
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
Figura 17. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de las determinaciones 
de la fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa , después de 48 h 
del tratamiento con el Compuesto 3. A) 25µM, B) 50μM, C) 75μM, y D) DCMU 50μM 
 
 
 
 
52 
52 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
A 
0
0.5
1
1.5
2
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
B 
0
0.5
1
1.5
2
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
C 
-0.2
0.3
0.8
1.3
1.8
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
D 
0
0.5
1
1.5
2
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
Figura 18. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de las determinaciones 
de la fluorescencia de la clorofila a, medida en hojas de Physalis ixocarpa , después de 72 h 
del tratamiento con el compuesto 3. A) 25µM, B) 50μM, C) 75μM, y D) DCMU 50μM 
 
 
 
 
 
53 
53 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.3.2. Fluorescencia de la Chl a medida en hojas de Lolium perenne tratadas 
con el Compuesto 3. 
Al medir la fluorescencia de la clorofila a en hojas de Lolium perenne a las 24 
h del tratamiento, no se observaron diferencias en las curvas OJIP y en los 
parámetros calculados entre las plantas control y las plantas tratadas (datos no 
mostrados), revelando que en este periodo de tiempo el compuesto probablemente 
no había penetrado la hoja. 
Para el caso del tratamiento después de 48 h, observamos que a la 
concentración de 25 μM del Compuesto 3 (Figura 19A), hay una disminución del 
10% de los centros de reacción activos del PSII, pero esto no afectó el índice 
fotosintético PI (abs), ni el trabajo que realizado por los centros de reacción 
restantes; no se observaron cambios en los valores de ETo/RC, TRo/RC, ABS /RC; 
sin embargo estos mismos valores por área medida disminuyerón entre un 10 y un 
20% y los parámetros de Kn, Kp, y Sum K aumentarón más del 10%. Aunque estas 
disminuciones y aumentos no fueron tan significativos, cabe mencionar que en este 
tiempo se empiezo a ver la pérdida de los centros de reacción activos y por eso se 
observarónn los cambios en los otros parámetros. Para el tratamiento con 50 μM del 
Compuesto 3, se observó el mismo comportamiento que con la concentración de 25 
μM del mismo, con la excepción de que hubo una ligera pérdida de la energía como 
calor, 15 % aproximadamente (Figura 19B). Para la concentración de 75 μM, hay 
una disminución insignificante del 10%; en algunos parámetros como son: ETo/CSo, 
TRo/CSo, ABS/CSo; además la actividad de la OEC igualmente se afectó un 10% 
(Figura 19C), estos efectos al no ser significativos indican que el Compuesto 3 a 75 
μM no afecta significativamente la fotosíntesis de las plantas de L. perenne a 48 h 
después del tratamiento. La gráfica radar del efecto del DCMU 50 μM (Figura 19D) 
en Lolium perenne, muestra una notable disminución en el transporte de electrones y 
un aumento en la pérdida de energía por disipación de calor. 
Después de 72 h de tratamiento con el Compuesto 3, el efecto observado a 
las 48 h en las tres diferentes concentraciones se ve incrementado (Figura 20A, 20B 
y 20C): 
54
54 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
comparando el efecto del DCMU 50μM en los parámetros mostrados, con el efecto 
del Compuesto 3 a 75 μM, el efecto de ambos es similar, por lo que se puede sugerir 
que 3 inhibe de la misma forma que el DCMU, pero requiere más tiempo para 
penetrar la hoja, por lo que se esperaría que a mayor tiempo de tratamiento con el 
Compuesto 3, su efecto se parecería más al efecto del DCMU. 
A 
0.5
0.7
0.9
1.1
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
B 
0
0.5
1
1.5
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
C 
0.5
0.7
0.9
1.1
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
D 
0
0.5
1
1.5
2
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
Figura 19. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de las determinaciones 
de la fluorescencia de la clorofila a, medida en Lolium perenne, después de 48 h del 
tratamiento con el compuesto 3. A) 25µM, B) 50μM, C) 75μM, y D) DCMU 50μM 
55 
55 
 
RESULATDOS Y DISCUSIÓN 
 
A 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
B 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
C 
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
 
D 
0
0.5
1
1.5
2
dV/dto
PHI(Po)
PSIo
PHI(Eo)
PHI(Do)
Sm
Sum K
Kn
KpABS/RC
TRo/RC
ETo/RC
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
PI(abs)
Figura 20. Gráficas de radar de los parámetros calculados a partir de las determinaciones 
de la fluorescencia de la clorofila a, medida en Lolium perenne , después de 72 h del 
tratamiento con el compuesto 3. A) 25µM, B) 50μM, C) 75μM, y D) DCMU 50μM 
 
 
 
 
 
 
56 
56 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.3.3. Fluorescencia de la Chl a de Physalis ixocarpa tratada con la fracción 
5. 
A las 24 h después del tratamiento de Physalis ixocarpa con la fracción 5 
(F-5) a una concentración de 25 ppm, se observó la disminución de PI (abs) del 
50% con respecto al control y un aumento significativo en el parámetro dV/dto 
(Figura 21A), de la misma manera que se observó con el DCMU (Figura. 21D). 
Para las concentraciones de 50 y 100 ppm, el valor de PI (abs) aumentó 
más de un 30%, también aumentó en un 20% PHI(Eo) (la probabilidad de que un 
fotón atrapado por el centro de reacción del PSII transporte un electrón mas allá 
de QA) y la disipación de energía en forma de calor disminuyó, aumentando la 
utilización de energía para el transporte de electrones o para procesos 
fotoquímicos (aumento de Kp) (Figuras 21B y 21C). Estos resultados en conjunto 
indican que el sistema en respuesta al estrés sometido con 50 y 100 ppm (F-5), 
trata de mejorar su eficiencia fotosintética. Sin embargo, aunque la planta 
respondió al estrés mejorando su eficiencia, después de 48 h de tratamiento con 
F-5, se afectó desde 25 ppm hasta 100 ppm (Figuras 22A, B y C) en una forma 
similar pero en menor proporción a cómo afecta el DCMU (Figura 22D). 
A las 72 h y 25 y 100 ppm (Figura 23A y 23C) la planta se vio afectada de 
la misma forma que a las 48 h, pero a la concentración de 50 ppm (Figura 23B) 
aunque