Biofsica-de-canales-ionicos--optimizacion-de-registros-automatizados-de-corrientes-ionicas-bajo-fijacion-de-voltaje

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1 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
BIOFÍSICA DE CANALES IÓNICOS: 
OPTIMIZACIÓN DE REGISTROS 
AUTOMATIZADOS DE CORRIENTES 
IÓNICAS BAJO FIJACIÓN DE VOLTAJE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 FÍSICO 
 P R E S E N T A : 
 CARLOS MAURICIO MATUS NÚÑEZ 
 
 
 
 
 
 DIRECTOR DE TESIS: DR. ARTURO PICONES MEDINA. 
2017 
 
 
 
 Ciudad Universitaria,Cd.,Mx, 2017 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
 
1. Datos del alumno 
Matus 
Núñez 
Carlos Mauricio 
56721052 
Universidad Nacional Autónoma de 
México 
Facultad de Ciencias 
Física 
306029422 
 
2. Datos del Tutor. 
Dr. 
Arturo 
Picones 
Medina 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dra. 
Gertrudis Hortensia 
González 
Gómez 
 
4. Datos del sinodal 2 
Dr. 
Froylán Miguel 
Gómez 
Lagunas 
 
5. Datos del sinodal 3 
Dra. 
Carolina 
Barriga 
Montoya 
 
6. Datos del sinodal 4 
Dr. 
Enoch 
Luis 
Baltazar 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Biofísica de canales iónicos: Optimización de registros automatizados de corrientes iónicas bajo fijación de 
voltaje 
44p 
2017 
 
3 
 
 Este trabajo se desarrolló bajo la dirección del Dr. Arturo Picones Medina 
En el Laboratorio Nacional de Canalopatías 
Del Instituto de Fisiología Celular-UNAM, Distrito Federal, México. 
 
 
 
Laboratorio Nacional de Canalopatías 
 
 
 
 
 
 
 
 
Investigación Financiada por la Secretaria de Ciencia, Tecnología e Innovación con 
el número de proyecto 039-2013 
 
 
http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjRpZno0fjTAhWFTSYKHVTKDXEQjRwIBw&url=http://smb.org.mx/transduccion-de-senales-trafico-vesicular/&psig=AFQjCNHw7U0T9-IYDYVdkQ1kkYSulPDVOA&ust=1495169294939687
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4 
 
Agradecimientos. 
 
Al Dr. Arturo Picones Medina, gracias por permitirme la oportunidad de realizar la tesis. 
Al Físico Cesar Oliver Lara Figueroa por la ayuda en la realización de los experimentos de fisiología 
automatizada en el equipo Qpatch en el Laboratorio Nacional de Canalopatías, Instituto de Fisiología 
Celular, UNAM. Gracias totales. 
 
A la Biol. Diana Millán Aldaco, gracias por el apoyo en la extracción y preparación de células cromafines en 
cultivo en el laboratorio AL-201, Instituto de Fisiología Celular,UNAM 
 
También quiero agradecer al resto de los compañeros del laboratorio, Dra. Arlet Loza Huerta, Dr. Enoch 
Luis, Dr. Pedro, Dra. Ruth Rincón, Bióloga Monserrat, Dra. Areli y a todo mi Jurado. 
Este trabajo fue financiado por la Secretaria de Ciencia, Tecnología e Innovación (SECITI) con el número de 
proyecto 039-2013. Y por el consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) bajo el proyecto 
Laboratorio Nacional de Canalopatías con el número de proyecto 279820. 
5 
 
 
Contenido 
 
 
Resumen ......................................................................................................................................................................... 6 
I Introducción. ............................................................................................................................................................... 7 
1. La Técnica de Control del Voltaje Transmembranal en Microáreas de Membranas Biológicas (“Patch-Clamp”) 7 
“Patch-clamp” Registro en Configuración Célula Completa (“Whole Cell”) ......................................................... 9 
Medición de Corriente Iónica bajo Fijación del Voltaje (“Voltage Clamp”) ........................................................ 11 
2. El Patch-Clamp Automatizado (APC). ............................................................................................................. 13 
El Sistema QPatch. ................................................................................................................................................ 14 
3. Preparación Biológica: Cultivo Primario de Células Cromafines de Bovino. ............................................... 16 
Características Eléctricas de las Células Cromafines ............................................................................................ 19 
a) Relevancia como Modelo Experimental ........................................................................................................... 19 
b) Impacto sobre el Desarrollo de la Tecnología de Electrofisiología Automatizada ........................................... 20 
II. Hipótesis Y Objetivo. ............................................................................................................................................. 21 
Hipótesis .................................................................................................................................................................... 21 
Objetivo ..................................................................................................................................................................... 22 
III. Materiales y Métodos. .......................................................................................................................................... 23 
a. Obtención, Disección y Aislación de células cromafines de bovinio. ................................................................... 23 
b. Sistema de Registro de patch-clamp Manual. ....................................................................................................... 26 
c.Sistema de Registro de QPatch 16X. ...................................................................................................................... 27 
IV Resultados. .............................................................................................................................................................. 29 
a) Corrientes Iónicas Salientes BK............................................................................................................................30 
b) Corrientes Iónicas Salientes SK. ........................................................................................................................... 35 
c) Corrientes Iónicas Entrantes: INa ........................................................................................................................... 37 
V DISCUSIÓN ............................................................................................................................................................. 39 
VI Bibliografía ............................................................................................................................................................. 42 
 
 
 
 
 
 
6 
 
Resumen 
 
La técnica de Patch-Clamp se encuentra bien establecida como “Técnica de Oro” para el estudio 
de todo tipo de canales iónicos. No obstante, su complejidad de análisis y requerimento de un alto 
grado de capacidad para realizar las operaciones experimentales, además del gran tiempo 
requerido, son inversamente proporcionales a la obtención de datos, sobre todo si el propósito es 
probar un número de compuestos químicos con fines farmacológicos. Recientemente se introdujo 
la instrumentación de patch-clamp automatizada (APC) que ha revolucionado la estrategia para el 
descubrimiento de nuevos medicamentos teniendo como blanco primario a canales iónicos. Los 
dos aspectos sobresalientes de la aplicación de APC es el incremento significativo en la 
producción de datos experimentales en un tiempo corto, y la alta calidad de registros eléctricos 
bajo fijación de voltaje obtenidos y mantenidos en condiciones de Giga-sello. Aunado a todo lo 
anterior, el presente trabajo de tesis se ha enfocado en extender el éxito del APC al estudio de 
canales iónicos endógenos, normalmente expresados en células nativas mantenidas en cultivo 
primario. 
 
 
7 
 
I Introducción. 
 
1. La Técnica de Control del Voltaje Transmembranal en Microáreas 
de Membranas Biológicas (“Patch-Clamp”) 
 
El arquetipo de la técnica de patch-clamp, desarrollada originalmente por Neher and Sakmann 
(1976), fue subsecuentemente depurado por estos mismos autores y sus colaboradores hasta 
alcanzar una alta resolución1. Se buscaba una forma de extender el registro electrofisiológico a la 
detección de la actividad de un solo canal iónico. Los canales iónicos forman vías de 
permeabilidad acuosa constituida por ciertas proteínas incrustadas en la membrana y cuyas 
estructuras, bajo ciertas condiciones físico-químicas, les permite ceder o no el paso a los iones por 
difusión simple a favor de sus gradientes de concentración2. 
El principio del método de patch-clamp se basa en aislar eléctricamente un sector de membrana 
celular (“patch”), produciendo un sellado de alta resistencia eléctrica con la misma3, mediante una 
micropipeta (micro-electrodo). Las micropipetas se fabrican estirando tubo capilar de vidrio, 
reblandecido por calor, se mantienen abiertas en su extremo terminal y contienen una solución 
electrolítica adecuada. De esta manera se registra la corriente iónica que fluye a través de la 
sección de membrana así circunscrita por el sello eléctrico. Esto se consigue presionando la 
micropipeta de vidrio, pulida previamente por calor, contra la superficie de una célula y aplicando 
en su interior presión negativa (succión) hasta obtener un sello cuya resistencia eléctrica sea 
mayor a 1GΩ (109 ). Bajo tales condiciones, la micropipeta de vidrio y la membrana celular se 
encontrarán a menos de 1 nm de separación. La descripción anterior es conocida como 
configuración “cell-attached”. Cabe resaltar que el parche de membrana es pequeño comparado 
con el tamaño total de la célula. Todo este sistema, a su vez, se conecta eléctricamente con un 
arreglo complejo de equipo electrónico: amplificador transductor corriente-voltaje, convertidor 
analógico-digital y un paquete de “software” instalado en una computadora, mediante el cual se 
controla todo el proceso de registro experimental. 
 
 
 
1 Hamill, Marty, Neher, Sakmann & Sigworth, 1981 
2 En biofísica a estas proteínas se les conoce cómo canales iónicos 
3 Entendido como parche 
 
8 
 
Se requiere un sello de alta resistencia por dos razones principales. Una, es la existencia de una 
equivalencia lineal entre la resistencia y el aislamiento eléctrico del pedazo de membrana 
seleccionado para el sello. La otra razón es minimizar el ruido eléctrico mediante la alta 
resistencia, permitiendo elevada resolución para el registro de la amplitud de las corrientes iónicas, 
ya que éstas pueden ser del orden de pA (10-12 Amperios). 
 
 
 
Figura 1. Relación entre la micro-pipeta/electrodo y la célula y su circuito equivalente durante un registro de PatchClamp. La apertura y cierre de canales es 
representada por un swicht en b. La resistencia de la pipeta y la resistencia de sellado están en serie entre el amplificador y la tierra (la solución externa) y el parche 
de células y resistencias están en paralelo con la resistencia de sellado4 
 
 
 
 
 
 
 
4 Imagen tomada de: Ogden, D. y Stanfield, P. (1994). Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording,in 
Microelectrode Techniques. The Plymouth workshop Handbook. Ogden, D, Ed. The Company of Biologist Limited. Cambridge. 
Chap. 4: 53-78. 
9 
 
 “Patch-clamp” Registro en Configuración Célula Completa (“Whole Cell”) 
 
Si se desea medir la corriente total en una célula completa debido a un cambio del voltaje 
artificialmente provocado a la misma se usa la configuración “Whole-Cell”. Por otro lado, esta 
configuración permite controlar el contenido y concentraciones de los iones en el interior celular, al 
ser éste substituido (dializado) por la solución contenida en la micropipeta de registro. 
 
 
 Figura 2 Distintas configuraciones de la Técnica de Patch-Clamp. En la imagen de la derecha si se omite el último 
paso, es decir, el jalón de abajo, se observa la configuración Whole -Cell (véase también figura 8). La diferencia fundamental entre la imagen de la 
izquierda es la solución que contiene la pipeta. En la configuración whole-Cell el medio interno de la célula es equivalente a la solución extra celular. 
Esto es necesario puesto que se mezclarán. El último jalón hace referencia a que se retira un pedazo de membrana celular, quedasndo un área 
menor de canales iónocos para su estudio. La configuración Outside-Out no se usará en el trabajo aquí presente. 5 
 
El procedimiento para obtener la configuración “Whole Cell” se inicia cuando se produce la ruptura 
del parche de membrana, el cual se encuentra aislado bajo la boca abierta del extremo de la 
pipeta. El proceso de registro es el siguiente. 
 
5 Imagen tomada de: ibid. 
10 
 
 
Antes de formar el giga-sello, el transitorio capacitivo de la corriente, producido por la capacitancia 
de la pipeta en el baño, es compensado por medio del amplificador diferencial. Este transitorio 
capacitivo vuelve a compensarse al lograrse el sello de alta resistencia al tocar la membrana con la 
pipeta y liberarse la presión positiva original y aplicarse la presión negativa (succión). A 
continuación, el potencial del interior de la pipeta Vp es ajustado a un valor similar al potencial de 
reposo de la célula. Después, la ruptura de la membrana es producida al aplicar un pulso de 
succión de mayor potencia, o un pulso eléctrico breve, pero de gran intensidad. El proceso es 
monitoreado aplicando una serie de pulsos de 5 mV de amplitud. La ruptura de la membrana se 
evidencia por un transiente de la corriente capacitiva con un curso temporal considerablemente 
mayor. La secuencia del proceso se muestra en la figura1-3(a). El circuito equivalente que 
representa el whole cell en condiciones de registro de corriente se muestraen la figura 1-3(b). 
 
 
 
 (a) Diagrama whole Cell (b) Circuito eléctrico equivalente 
 
 
Figura 3 (a) Procedimiento para obtener la configuración de célula entera (“whole-cell”). (b) Circuito equivalente del registro en configuración whole cell. La 
corriente im fluye en la resistencia celular Rc y la corriente ic en su capacitancia. La corriente en la pipeta esip = im + ic. Se muestra los cambios de Vc e ip con respecto 
del tiempo dados por la acción del pulso control Vp6.. 
 
 
 
 
6 ibídem, p. 71,73 
11 
 
Medición de Corriente Iónica bajo Fijación del Voltaje (“Voltage Clamp”) 
 
Un subconjunto de las proteínas transmembranales es sensible a cambios externos del voltaje de 
membrana, por lo cual se les denomina “dependientes de voltaje”. Esta superfamilia de canales 
son llevadas a cambios conformacionales de apertura-cierre (e inactivación en ciertos casos) al 
variar el voltaje de membrana. Además, muchos de este tipo de canales se encuentran sujetos a 
su interacción con factores químicos tales como neurotrasnmisores, hormonas o drogas 
exógenas. 
 
Se tiene bien establecido un modelo eléctrico para la membrana celular. Las diferencias de 
concentraciones, y por tanto de cargas, de cada especie iónica a ambos lados de la membrana 
constituyen la fuerza impulsora para cada ion. La fuerza impulsora para los iones es la diferencia 
entre el potencial de membrana y el potencial de equilibrio del ion, el valor de este último es 
determinado por el equilibrio electroquímico descrito por la Ecuación de Nernst. Además, la bicapa 
fosfolipídica membranal constituye un dieléctrico, de tal forma que se comporta como un capacitor, 
El circuito equivalente de toda membrana biológica es un circuito RC en paralelo. Usando la ley de 
Ohm y la relación de corriente capacitiva con respecto al voltaje tenemos que la corriente iónica 
total es7: 
 
 Im=CδV/δt+Σgi(Vm-Vi) (1) 
 
 Iion=gion(Vm-Vion) 
 
Donde el subíndice m se refiere a la membrana, i a las diferentes especies de iones y g es la 
conductancia (inverso de la resistencia). 
 
Si se pudiere controlar experimentalmente el voltaje de membrana para estudiar la dependencia 
con el voltaje de las características de un canal, y discriminar entre las corrientes iónicas y la 
corriente capacitiva sería posible describir y eventualmente explicar claramente propiedades 
electrogénicas de las proteínas de membrana, su cinética y las posibles interacciones con 
compuestos químicos que sobre ellos actuasen. Supongamos entonces que fijamos el voltaje a un 
 
7 Hodgkin y Huxley, A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve, J 
Physiol. 1952 Aug 28; 117(4): 500{544. 
12 
 
valor constante, es decir, el primer término en la ecuación 1 se anula (δV/δt=0). Al anularse la 
corriente capacitiva en la primera ecuación de 1, se manifiestan solamente las corrientes iónicas. 
 
En su versión inicial clásica, para llevar a cabo la fijación de voltaje, se hace uso dos electrodos 
intracelulares, uno es el sensor de registro de voltaje y el otro se encuentra a cargo de la inyección 
de corriente. La señal de salida del primero se compara con un valor de voltaje de referencia (valor 
comando, típicamente un pulso constante de voltaje) mediante un amplificador diferencial, cuya 
salida se conecta al electrodo de inyección de corriente. De esta manera, mediante el circuito de 
retroalimentación negativo así creado, se obliga al voltaje de membrana a seguir la amplitud y el 
curso temporal del voltaje comando de referencia. La corriente inyectada es directamente 
proporcional a la corriente transmembranal iónica8. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 Neher Y Sakmann, Premio nobel de Fisiología o Medicina,1991. Desarrollo de técnica de Pacth-Clamp. 
13 
 
2. El Patch-Clamp Automatizado (APC). 
 
Se reconoce a la técnica de patch-clamp como la máxima presición para el estudio de todo tipo de 
canales iónicos. No obstante, el requerimento de un alto grado de capacidad para realizar las 
operaciones experimentales, la complejidad de su análisis y el gran tiempo requerido, son 
inversamente proporcionales a la obtención de datos; sobre todo si el fin es probar diversos 
componentes químicos con fines farmacológicos. Recientemente se introdujo la instrumentación 
de patch clamp automatizado (APC), implementando la técnica de “Planar Patch-Clamping”9, la 
cual ha revolucionado las estrategias para el descubrimiento de nuevos compuestos medicinales 
relacionados con los canales iónicos. 
 
El aparato Planar Patch-Clamp consiste en un chip constituido por dos compartimentos separados 
por una placa plana en cuyo centro hay una apertura (~2 m) en donde se inserta una célula 
atraída por presión hidrostática negativa (succión) por pura aleatoriedad. Al aplicar pulsos más 
enérgicos de succión a la célula se rompe la porción de membrana (“patch”) sellada sobre el 
mencionado orificio, obteniéndose la configuración de célula entera (“whole-cell”, similar a la de 
patch clamp manual). Hay que recalcar que la única configuración que puede ser obtenida es la de 
whole-cell en el sistema automatizado que se empleó en este trabajo de tesis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. El precursor histórico de planar-patch-clamp. Una membrana de polietileno de espesor (d) 250-350 μm separa dos compartimentos electrolíticos. Una 
abertura central, cónica (D1, de 200-300 μm ; D2,25-80 μm) se muestra que contiene un solo soma neuronal de un diámetro de 
40 a 200 μm.10 
 
 
 
 
9 Esta técnica originalmente fue presentada como una solución al problema de perfusión interna. 
10 Imagen tomada de: Patch-Clamp Analysis,Advances Techniques,second Edition,Wolfgang Walz, Department of Physiology, 
University of Saskatchewan, 
Saskatoon, Canada p. 413 
14 
 
 
El Sistema QPatch. 
 
 
 El sistema QPacth 16X, desarrollado por la compañía Sophion Biolin Scientific, utiliza placas, 
denominadas comercialmente “QPlates”, con 16 pozos de registro. Este sistema se basa en un 
chip que contiene una membrana de SiO2 (dióxido de silicio) de 15 micrómetros (m) 11 de 
espesor separando dos compartimientos, con un electrodo cada uno, y llenados a su vez con 
soluciones electrolíticas conteniendo concentraciones conocidas de los iones fisiológicamente 
relevantes. En el centro de la membrana de SiO2 hay una apertura (~2 m) en donde se inserta 
una célula atraída por presión hidrostática negativa (succión) de manera totalmente aleatoria 
(véanse las figuras 5 y 6). De tal manera que en cada pozo se puede tener un registro, dando un 
total de hasta 16 mediciones simultáneas posibles. Estas placas son ingresadas dentro del QPacth 
junto con otra microplaca, la cual contiene las substancias a ser probadas diluidas en la solución 
extracelular. La aplicación más común al utilizar el QPatch y otros sistemas de registro 
automatizado semejantes es el tamizaje (“screening”) de diferentes compuestos químicos con el 
objetivo de encontrar posibles interacciones con los canales iónicos en estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. (a) Vista de un QPlate con 16 pozos. Arriba parte inferior del chip. Abajo parte superior.12. (b)Diagrama que muestra un pozo y cómo las células por 
aleatoriedad caen en la apertura, donde se tiene configuración análoga al patch manual en la modalidad whole-cell13.En el conducto 1 ingresan las células con medio 
extracelular. En el conducto 2 ingresa la solución interna. En 3 está el electrodo de trabajo. En 4 está el electrodo de referencia. (también véase figura 8)11 Este espesor es variable 
12 Es una placa con múltiples pocillos. 
 
 
a) b) 
1 2 
Células 
3 
4 
15 
 
 
Grosso modo, el QPacth a es un robot que, por medio de un brazo mecanizado, portador de cuatro 
pipetas metálicas con las cuales van ingresando tanto las soluciones como las células al QPlate de 
registro, el cual se coloca sobre una base conectando el circuito electrónico de 16 amplificadores 
con cada uno de los 16 pozos (microchips). La solución interna ingresa primero y luego la externa. 
A continuación, mientras las células se encuentran en suspensión o en centrifugación, el brazo de 
manejo de fluidos las succiona y las deposita en los pozos de registro del QPlate. Una vez que las 
células se depositan en los orificios de registro se inician los procedimientos de sellado y obtención 
de la configuración whole cell. 
 
 
 
Figura 6. A) Vista del instrumento QPatch. B) Vista de la plataforma de trabajo. Ocultos a la vista, por debajo de la plataforma de trabajo, se encuentran los sistemas 
de control electrónico y el sistema microfluídico de presión hidrostática, así como los compartimentos de almacén y deshecho de las placas QPlate y las de los 
compuestos a probar.14 
 
13 Figura tomada de: Automated Patch Clamping, Kohei Sawada and Takashi Yoshinaga, p. 325 
14 Electrophysiological Studies of Voltage-Gated Sodium Channels UsingQPatch HT, an Automated Patch-Clamp System. Yi Liu,p. Neuroscience Discovery, 
Janssen Research & Development, LLC, San Diego, California, p.65 
Placa de Componentes 
activa Placa de componentes usados 
16 
 
Se ha reportado que líneas celulares tales como HEK 293, CHO, LTK, RBL, NIH 3T3, y Jurkat son 
rutinariamente usadas por esta nueva técnica. 
Varias plataformas instrumentales han sido desarrolladas, tal es el caso de: NPC-16 Patchliner ® y 
SyncroPatch® 96 (Nanion Technologies GmbH, Munich), CytoPatchTM(Cytocentrics AG, Rostock), 
PatchXpress ® 7000A, IonWorks ® Quattro and IonWorks BarracudaTM (Molecular Devices, 
Sunnyvale, USA); Dynaflow ® HT (Cellectricon AB, Mölndal, Suecia)), QPatch HT y QPacth 16X 
(Sophion-Biolin Scientific, Copenhagen), IonFlux HT (Fluxion Bioscience Inc, South San 
Francisco, USA). Estos aparatos han demostrado tener la capacidad de generar registros 
similares en calidad al patch-clamp convencional además de aumentar sensiblemente el número 
de células registradas y minimizar el tiempo de experimento. En esta tesis se usará el QPacth 16X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
3. Preparación Biológica: Cultivo Primario de Células Cromafines de 
Bovino. 
 
¿Qué es un cultivo celular? 
 
Cuando se pretenden hacer experimentos electrofisiológicos en células se necesita tener un buen 
control de la producción y mantenimiento de las muestras a investigar. El proceso usado de 
manera cotidiana para estos propósitos es aquel llamado cultivo celular. 
 
Un cultivo celular consiste en retirar células de un animal o planta y mantenerlas separadas del 
tejido de origen en un medio liquido con las condiciones y los nutrientes para mantenerlas 
fisiológicamente viables, además de permanecer en un ambiente artificial termodinámico 
controlado. Las células pueden ser removidas directamente de un tejido y disgregadas por medios 
enzimáticos o mecánicos antes de su mantenimiento en cultivo primario, también pueden ser 
derivadas de una línea celular o cepa celular que ya haya sido previamente establecida. 
 
Cultivo Celular Primario 
El cultivo celular primario se refiere a la etapa subsiguiente al aislamiento celular del tejido, en 
donde los elementos celulares permaneces en condiciones adecuadas hasta el momento de ser 
sometidas al procedimiento experimental de estudio. 
 
Condiciones de Cultivo 
Las condiciones de cultivo varían ampliamente dependiendo del tipo celular con el que se esté 
trabajando; grosso modo, el ambiente artificial en donde se encuentran las células en cultivo 
consiste de un recipiente adecuado que contiene un sustrato y un medio con los nutrientes 
esenciales: aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales, hormonas y gases (CO2, O2), y 
reguladores de ambiente fisiológico (pH, presión osmótica y temperatura); todo en condiciones 
estériles. 
 
La Célula Cromafín 
El aspecto nominal de “célula cromafin” sobreviene por la inclinación prominente que tienen sus 
gránulos de catecolaminas para teñirse con sales de cromo. Embriológicamente derivan del 
18 
 
neuroectodermo, presentan inervación simpática preganglionar 15 y tienen capacidad para 
sintetizar, almacenar y secretar catecolaminas16. 
 
En los mamíferos, las células cromafines se encuentran dentro de las glándulas suprarenales, las 
cuales son estructuras de forma piramidal, retroperitoneales localizadas encima de los riñones 
(véase figura 7) y conforman con el SNC 17 el sistema simpatoadrenal 18 . La glándula está 
circundada por una gragea de tejido conectivo la cual permite la unión con el riñón; también está 
revestida por tejido adiposo y presenta una de las tasas más altas de flujo sanguíneo. La función 
principal de la glándula es producir las señales de estrés en el organismo . 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7 (a) Un dibujo estilizado de una célula cromafín, con un proceso nervioso (en amarillo) que viene de lo alto, y productos de secreción (adrenalina, etc.) 
siendo secretada en el torrente sanguíneo en la parte inferior izquierda. (b) Vista de laubicación de las glándulas suprarenales 
 
Las células cromafines están reguladas a través de terminales nerviosas preganglionares 
colinérgicas del Sistema Nervioso Simpático (SNS)19 que proviene de los nervios esplácnicos20. 
Esta inervación penetra hacia la médula formando varios haces, que en su interior se ramifican y 
forman al menos tres contactos sinápticos con cada célula cromafín21. 
 
 
15 Es decir, son células que derivan de la cresta neuronal 
16 Neurotransmisores que se vierten al torrente sanguíneo incluyen a la adrenalina, la noradrenalina y la dopamina 
17 Sistema Nerviosos Simpático 
18 Landsberg y Young, 1992 
19 ibídem 
 
20 Los nervios esplácnicos son una parte importante de la inervación de las vísceras abdominales. Van desde el tronco simpatico o 
ganglios simpaticos relacionados con el tronco, al plexo prevertebral y ganglios anteriores de la aorta abdominal. 
21 Kajiwara y cols, 1997 
19 
 
Embriológicamente estas células derivan del neuroectodermo22, por lo cual tienen características 
similares a las neuronas, y es por esto que las células cromafines son muy importantes como 
modelo neuronal. Se clasifican en adrenérgicas (80-85%) y noradrenérgicas (15-20%)23, esto 
debido a la catecolamina que sintetizan, almacenan y secretan. 
 
Morfológicamente, al visualizarlas bajo el microscopio electrónico, las células cromafines se 
diferencian por el tamaño de sus gránulos de secreción los que, en las adrenérgicas, miden entre 
50 y 350 nm de diámetro y muestran una moderada densidad en su núcleo. Por otro lado, las 
noradrenérgicas presentan gránulos de entre 185 y 495 nm de diámetro con núcleos de mayor 
densidad 24 . La importancia de sus gránulos reside en su función de almacenar y liberar 
catecolaminas. 
 
Características Eléctricas de las Células Cromafines 
 
Las células cromafines presentan principalmente 2 tipos de corrientes iónicas salientes y 2 de 
corrientes entrantes, todas ellas dependientes de voltaje. Las corrientes salientes se dividen en 
dos familias diferentes por su valor de conductancia en respuesta a una despolarización 
membranal. Así tenemos el tipo BK (“big conductance”) y el SK (“small conductance”), ambas 
corrientes se activan por la concentración del ion calcio intracelular25.En cuanto a las corrientes 
entrantes se presentan de sodio y de calcio, las cuales son muy similares a las reportadas en 
células nerviosas y musculares. El voltaje de reposo de las células cromafines es de ~ -60 mV26. 
 
 
a) Relevancia como Modelo Experimental 
 
A pesar del hecho de que la técnica de patch-clamp es, con mucho, la mejor herramienta para el 
estudio de canales iónicos, ha sufrido de haber sido ser excluida de la industria farmacéutica 
moderna, específicamente en el descubrimiento y desarrollo de agentes terapéuticos que 
interactúen con canales iónicos y pudiesen regular el funcionamiento de los mismos. ¿A qué se 
debe esta relegación de la técnica de patch-clamp en las referidas áreas? No es difícil contestar la 
 
22 Landsberg y Young; Guyton y Hall,2011 
23 Hillarp y Hookfelt;guytony Hall,2011 
24 Díaz-Flores y cols, 2008 
25 Marty, A. and Neher, E. (1985). Potassium Channels in Cultured Bovine Adrenal Cells. J. Physiol. p. 138 
26 Fenwick, M., Marty, A. and E. Neher, E. (1982). Sodium and Calcium Channels in Bovine Chromaffin Cells. J. Physiol. . p.118 
20 
 
pregunta si examinamos las necesidades que la farmacología requiere en cuanto tiempo y 
cantidad de información (experimentos realizados). Si bien, haciendo electrofisiología en su forma 
estándar se adquiere datos muy precisos y de alta calidad, el tiempo requerido para lograr tal fin 
puede ser muy largo y la cantidad, en número, de datos obtenidos es poco en comparación a los 
requeridos por las industrias farmacéutica y biotecnológica. Es aquí donde las tecnologías APC 
sobresalen por encima de las técnicas manuales, es decir, la instrumentación APC aumenta 
considerablemente el número de datos experimentales y se reduce el tiempo necesario para 
obtenerlos, sin detrimento de la calidad de información lograda mediante la técnica manual clásica. 
Todo lo anterior facilita la capacidad de probar muchas y diversas condiciones experimentales que 
pueden dar paso a descubrimientos de nuevos compuestos con acción sobre canales iónicos. Más 
aun, con la implementación optimizada del registro de cultivos primarios es posible estudiar células 
nativas expresando canales iónicos endógenos (células cromafines adrenales de bovino, en el 
caso de la presente tesis) expandiendo así la capacidad de estudio y análisis de las tecnologías 
automatizadas. 
 
 
b) Impacto sobre el Desarrollo de la Tecnología de Electrofisiología 
Automatizada 
 
Implementar una metodología que permita realizar experimentos con cultivos primarios en un 
aparato APC es de gran relevancia para el estudio de corrientes endógenas en células nativas. El 
número de publicaciones, referidas al uso de APC en líneas celulares, que han salido en los 
recientes años tiene una tendencia exponencial. Si a esto se le anexa una producción de 
investigación afiliada a los cultivos primarios en pruebas de búsqueda de agentes farmacológicos, 
claramente la tendencia de publicaciones aumentará. Asimismo, se revoluciona la electrofisiología 
la cual había quedado históricamente relegada en la búsqueda de nuevos agentes farmacológicos 
con fines terapéuticos en el ámbito de las industrias farmacéutica y biotecnológica. Y de aquí que 
forme parte de la completitud de las técnicas biofarmacológicas, las cuales son: Radiometría, 
espectrometría, fluorometría y eléctrica. Naturalmente a ésta última pertenecen las APC, las 
cuales resultan particularmente útiles gracias al hecho de que son una medida directa de la 
actividad de los canales iónicos. 
 
 
 
21 
 
 
II. Hipótesis Y Objetivo. 
 
La técnica electrofisiológica, Patch-clamp, es el instrumento óptimo para estudiar las proteínas 
transmembranales formadoras de canales iónicos por medio del flujo de iones que los atraviesan, 
y recientemente ha transfigurado para alcanzar en la automatización. Esta metodología 
automatizada ha permitido estudiar líneas celulares de forma copiosa y profusa, sin perderse la 
elegancia y precisión de su antecesora, la técnica manual clásica. 
 
De manera sobresaliente, queda aún una porción importante de investigación que no ha sido 
explotada suficientemente por esta nueva tecnología, aquella que se refiere a células nativas en 
cultivos primarios. Estandarizar un método para poder llevar a la práctica estudios farmacológicos 
en los tipos celulares mencionados, es una faena a la que se aboca el presente trabajo de tesis. 
 
El trabajo experimental de esta tesis consiste en el registro de corrientes iónicas de membrana, 
bajo fijación de voltaje transmembranal, usando la técnica electrofisiológica de patch-clamp, 
comparando la calidad de registros obtenidos en forma manual con aquellos logrados de manera 
automatizada en células cromafines, aisladas de glándulas adrenales de bovino. 
 
Hipótesis 
 
Mediante una metodología adecuada en el tratamiento de cultivos celulares primarios (disección, 
disgregación enzimática, eliminación de fragmentos residuales, elección de condiciones para la 
obtención de giga-sellos), particularmente en células cromafines de bovino, será viable el registro 
electrofisiológico de aquellas mediante instrumentación automatizada. Este resultado facilitará la 
búsqueda de compuestos químicos con fines medicinales. 
 
 
 
 
 
 
22 
 
Objetivo 
 
Optimizar y estandarizar el registro de corrientes iónicas transmembranales en cultivos primarios 
de células cromafines, mediante instrumentación de patch-clam automatizado y su validación, 
comparándolas con registros obtenidos mediante técnicas de patch-clamp manual clásico en las 
mismas condiciones experimentales. 
 
23 
 
III. Materiales y Métodos. 
 
a. Obtención, Disección y Aislación de células cromafines de bovinio. 
 
Material. 
Glándulas Adrenales de Bovino 
 
Reactivos. 
 
 
DMEM-F12 
 
PBS con Antibiótico 
 
 PBS con Antimicótico 
 
 Alcohol al 70% 
 
 Enzimas con colagenasa y D-neasa 
 
Equipo 
 
Centrífuga 
Mini Baño Húmedo 
Pipetas Motorizadas 
Campana estéril para cultivo celular con flujo laminar vertical 
Microscopio invertido 
Incubadora de cultivo celular (37° C, 5% CO_2) 
Unidad de Filtradoción 
Frascos estériles 
Cajas para Cultivo Celular 
24 
 
Guantes 
 
Procedimiento. 
Cotidianamente en el laboratorio se obtenían células cromafines. Una técnico del laboratorio 
recibía las glándulas de bovino y separaba las células cromafinaes en un proceso que dura 5 
horas. A continuación Grosso modo describiré el procedimiento de obtención de las células 
cromafines. 
 
Las glándulas suprarrenales de bovino de machos adultos se obtenían de un matadero local y se 
transportaban al laboratorio en un frasco enfriado con hielo d-PBS (Sigma-Aldrich) suplementado 
con 2% de penicilina/estreptomicina en solución de 2%. Una vez en el laboratorio, las glándulas 
suprarrenales se aclimataban con d-PBS suplementado con solución de antibiótico-antimicótico 
2%. El aislamiento de cromafines se obtuvo mediante un procedimiento modificado al ya descrito 
en la literatura: Las glándulas suprarrenales gradualmente se sumergían en etanol al 70% para 
eliminar el tejido conectivo, para después lavárseles varias veces con D-PBS a través de la vena 
central para eliminar la sangre restante. Después de la perfusión con 0,3% colagenasa tipo II 
(Sigma-Aldrich) y 30 unidades/ml de DNasa I (Sigma-Aldrich) que se inyectaba a través de la vena 
central, el tejido se incubó a 37 °C durante 40 min seguido de una nueva inyección y la incubación 
durante 20 min. Las células de la médula suprarrenal se separaron mediante disociación 
mecánica, se filtraban a través de una gasa de 300 m, posteriormente de 100 y finalmente 70 m, 
de forma secuencial y dos veces cada una (Becton Dickson) Lavádose con d-PBS en cada 
transferencia. Las células fueron cultivadas en DMEM -F12 (Gibco) suplementado con 10% 
FBS-Libre de esteroides (carbón-dextrano tratada, Hyclone)y solución de 
penicilina-estreptomicina al 1% a 37° C en un ambiente humidificado (95% de aire, 5% de CO2) 
,puestas en cajas de cultivo de 6 cm de diámetro ,durante 48 horas27. El número de células por caja 
de petri oscilaba entre 2 y 3 millones. 
 
 
 
 
 
 
27 El protocolo de cultivo celular utilizado para la obtención de células cromafines fue descrito previamente por Ehrhart-Bornstein 
et al., 2012; Chung et al, 2009;. Vukicevik et al, 2012;. Santana et al, 2012 
25 
 
Preparación de células para su uso en el Qpacth 
 
Materiales 
Cajas de cultivo con células cromafines en medio DMEM –F12 (10% FBS y 1%penicilina) 
 
Reactivos 
 
PBS sin calcio estéril 
TrypLE Express 
Solución Extracelular para Células Cromafines (véase página 22) 
 
Equipo 
 
Mini Baño Húmedo 
Pipetas estériles 
Campana para cultivo celular con flujo laminar vertical 
Microscopio invertido 
Incubadora de cultivo celular (37° C, 5% CO_2) 
Vaso de precipitados 
Guantes 
 
Procedimiento 
 
Una vez obtenidos los cultivos primarios en la incubadora se necesita recuperar las células de las 
cajas de petri en las mejores condiciones. La obtención de células en las mejores condiciones 
fisiológicas es crucial para el éxito del experimento28. 
Para tal fin se retiró el medio DMEM-F12 de la caja de petri y posteriormente se lavó con medio 
PBS sin calcio. A continuación, se agregó 0.5 ml de TripLE Express y se dejó reposar dentro de la 
incubadora por 3 minutos. Después de esto se añaden 2 ml de PBS sin calcio y con una pipeta 
estéril se retiran con cuidado las células que se encuentra pegadas en el fondo de la caja. Se 
transfieren las células a un tubo Falcon de 15 ml con fondo cónico y se trituran mecánicamente 5 
 
28 Aún no hay reportado un protocolo específico para cultivos primarios en aparatos automatizados en general y menos todavía 
para células cromafines. 
26 
 
veces29. Se centrifugan a 420 g por 3 minutos; se retira el pelet y se agregan 1.5 ml de solución 
externa, se resulpende el pelet y nuevamente se trituran mecánicamente, ahora 15 veces. La 
densidad celular final a obtener es de ~ 3 millones en 1.5 ml. 
 
b. Sistema de Registro de patch-clamp Manual. 
 
Se registró corriente total, (componentes salientes y entrantes) por fijación de voltaje usando la 
técnica Patch-Clamp en modalidad whole-cell. Para adquirir los registros se usó un equipo que 
constaba de un amplificador Axopach200B, un convertidor analógico-digital Axon Digidata 1550 y 
el software p-Clamp (todo lo anterior de Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Los datos 
obtenidos se almacenaron en una computadora y el análisis, en la misma, con el software Clampfit 
(p-Clamp). Los registros analógicos fueron filtrados a 2 kHz (Filtro Bessel) y se adquirieron a una 
frecuencia de muestreo de 5 kHz. 
Las micropipetas a utilizar como microelectrodos fueron fabricadas con tubos capilares Pto. 
Ebull.100 de borosilicato (08-1.10x100 mm) de Kimble Chase, New Jersey, en un estirador de 
capilares Sutter Instruments modelo P-97 (Novato, California, USA). La resistencia de entrada de 
los microelectrodos fue de ~ 5 MΩ30. 
Los micropipetas se llenaron con solución intracelular (en mM): 140 KCl, 5 NaCl, 5 EGTA y 10 
HEPES (con una osmolaridad de 310 miliosmoles y pH 7.2 ajustado con KOH). Por otro lado la 
solución externa que se deposita en la cámara de registro contiene: (en mM) 135 NaCl, 4.7 KCl, 
1.2 KH2PO4, 1.2 MgCl2, 2.5 CaCl2, 10 Glucosa y 15 HEPES (osmolaridad 315 mOsm y pH 7.3 
ajustado con NaOH). Para inhibir corrientes salientes de potasio con una baja concentración de 
Tetraetilamonio (TEA), se cambió 135 (mM) NaCl de la solución externa por 45 (mM) TEA y 90 
(mM) NaCl; para inhibir con alta concentración de TEA a se sustituyó 135 NaCl por 135 TEA. 
Para el caso de inhibir corrientes entrantes de sodio se agrega a la solución externa 100 nM de 
TTX. 
Las células se depositaron en la cámara de registro colocada en la platina de un microscopio 
invertido (Nikon Eclipse Ti). Después de 5 minutos las células se pegan en el fondo de vidrio de la 
cámara. Usando un objetivo de 40x se selecciona una célula en buen estado.31 . Ya identificada 
una célula, se acerca hacia ella el microelectrodo por medio de un micromanipulador. Al entrar la 
 
29 Es decir, por medio de una pipeta se succiona (pipetea) las células gentilmente para dispersarlas en el medio. Ya que se 
encuentran conglomeradas por la centrifugación. 
30 Una vez formadas las puntas, éstas no son suavizadas con calor. 
31 Por buen estado se entenderemos aquí como aquella célula que su membrana no tenga asperezas , salientes o arrugas. 
27 
 
pipeta al medio la resistencia típica fue de 3-5 MΩ. Cuando la pipeta se acerca lo suficiente a la 
membrana, la resistencia aumenta un poco, inmediatamente se aplica presión negativa (succión) 
por medio de una manguera conectada al soporte del electrodo obteniéndose así un sello de alta 
resistencia entre el sistema electrodo-parche de membrana, de al menos 1 GΩ. Una vez obtenido 
este valor del sello, se aplica nuevamente una succión hasta que se rompe la superficie de 
membrana celular que se encuentra delimitada bajo el área de la boca de la pipeta. De esta 
manera se obtiene la configuración “whole-cell” (ver Fig 2). A continuación, se inició el protocolo de 
voltaje para obtener la curva corriente-voltaje (I-V) control. Posteriormente, mediante un sistema 
de perfusión, se intercambiaba la solución externa por aquella conteniendo TEA a baja 
concentración y se inició de nuevo el protocolo de voltaje. Este proceso se repetía con la solución 
de TEA a alta concentración y finalmente con la de TTX. Por último, se lavaba el sistema con 
solución externa para observar en qué medida las corrientes originales se recuperaban a sus 
valores originales aplicando nuevamente el protocolo de la serie con pulsos de voltaje. 
 
c.Sistema de Registro de QPatch 16X. 
 
El QPacth 16X inicia su operación realizando pruebas de presión hidrostática negativa (succión) 
al sistema de pipetas internas32. A la par, se programa al robot con los parámetros que se 
quisiesen manipular, es decir, protocolos de presión hidrostática, de voltaje y de soluciones 
(toxinas y otros posibles compuestos que puedan interactuar con los canales iónicos).33 Se coloca 
la placa de registro “QPlate” (placa constituida de 16 pozos independientes donde se integran los 
“microchips” y los sistemas de micro-perfusión, “micro-fluidics”) La suspensión de células se 
deposita en un sistema, situado a un costado dentro del aparato QPatch, especialmente diseñado 
para mantenerlas en suspensión mediante un agitador y posteriormente prepararlas mediante una 
micro-centrifuga (para el caso de las células cromafines se decidió depositarlas directamente en 
esta última). En una placa de microtitulación (“microtiter plate) de 96 pozos se colocaron 500 μl de 
cada una de las soluciones conteniendo los compuestos a probar y aquella a su vez se coloca en 
la posición de la placa de compuestos. En el recipiente contenedor salino se ingresan las 
soluciones interna y externa. Cuando todo lo anterior se encuentra listo, en la pantalla del robot se 
 
32 Son las pipetas que se encuentran en la figura 6 B 
33 Ya que en un cultivo primario el buen estado de las células es más difícil de obtener; en comparación a una línea celular estable, 
se implementó un sistema de prueba de viabilidad. Antes de ingresar las células al QPatch ese mismo día se realizaban tres intentos 
de registro en el Set Up modo manual, si por lo menos una célula era registrada se procedía a usar el Qpatch. Esto en razón de tener 
una mayor certeza del estado de las células cromafines y garantizar una mayor eficiencia del experimento. 
28 
 
controlanlas opciones de arranque del experimento. Al iniciar su funcionamiento, la pantalla del 
QPacth muestra el número de células correctamente posicionadas y sus resistencias eléctricas 
correspondientes. 
 
d. Protocolos Experimentales. 
 
Para poder graficar la relación (I-V) fue necesario aplicar el siguiente protocolo. Se daban pulsos 
despolarizantes de -60mV a +80mV que duraban 200 ms en pasos de 10mV cada 5 s, con un 
voltaje de mantenimiento de -80 mV. 
 
Figura 8 Microfotografía de una célula cromafin siendo eléctricamente registrada en la modalidad “patch-clamp whole-cell (izquierda). Diagrama del sistema 
“microchip” del QPatch mostrando la integración de los sistemas de microperfusión y de registro de patch-clamp plano. 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
IV Resultados. 
 
Todos los experimentos, tanto en el patch-clamp manual como en el Qpacth16X, se realizaron 
bajo las mismas condiciones de registro, durante los mismos días, utilizando las mismas 
soluciones y con células provenientes del mismo cultivo. Esto se hizo así para evaluar la 
capacidad del QPatch para reproducir los registros obtenidos mediante el patch-clamp manual, al 
cual se le considera como el estándar de referencia (“gold stardard”) para todo estudio de canales 
iónicos. 
 
Sellos 
Totales 
Resistencia 
de 
sellos(GΩ). 
Whole Cell Porcentaje 
de Whole 
cell(%) 
Experimentos 
Terminados 
Porcentaje de 
Experimentos 
Terminados(%) 
205 2.4±1.4 112 54 107 52 
 
 
Tabla 1. Estadística básica de parámetros electrofisiológicos de los resultados experimentales obtenidos con el equipo automatizado Qpatch 16 X: 
 
 
La tabla 1 muestra la información estadística del éxito del equipo automatizado. Fueron 205 sellos 
y en 112 de ellos se logró la configuración de whole-cell, es decir, el 54%. La resistencia de los 
mismos fue en promedio de 2.4GΩ. Ahora bien, aunque el sistema Qpach 16x obtenga un sello del 
orden de GΩ, no implica necesariamente que se obtenga la configuración de “Whole cell “. En las 
columnas 4 y 5, de la tabla 1, se muestran el número y respectivo porcentaje de” Whole cell” 
obtenidos. Las columnas 6 y 7 muestran el número y porcentaje de experimentos terminados, el 
número es menor que la columna 4 puesto que a veces se pierde el sello durante el experiento, en 
nuestro caso un 2%. Se debe resaltar el hecho de que, en el caso de líneas celulares, el porcentaje 
de éxito de experimentos terminados es de aproximadamente 70%34, lo que hace particularmente 
relevante el resultado obtenido en esta tesis de 52% para el porcentaje de éxito terminal 
(experimentos llevados a buen término con resultados válidos y analizables) del registro 
automatizado de canales iónicos endógenos expresados sus células nativas en cultivo primario. 
Además, se satisface la condición de resistencia del sello del orden de 1 G, indicativo de la alta 
calidad exigida para registros de patch-clamp. 
 
 
34 Automated Patch clamping Using the QPatch, Kenneth A. Jones, Nicoletta Garbati, Hong Zhang, and Charles H. Large,2009, 
Springer. 
30 
 
Manualmente se tenía en promedio un sello por cada 3 intentos (la estadística del procedimiento 
manual no se muestra en la tabla y una vez tenido el sello la posibilidad de lograr un whole-Cell 
era del 80%. 
 
 
a) Corrientes Iónicas Salientes BK. 
 
Las corrientes salientes más comunes en las células cromafines son las de tipo BK (“Big 
Conductance Potassium Channel”)35. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9-- Corrientes salientes de potasio BK representativas en respuesta al protocolo de voltaje mostrado. A la izquierda registros obtenidos con patch-clamp 
manual y a la derecha ejemplos de los obtenidos con el sistema automatizado QPatch. 
 
 
En la figura (9) la corriente de potasio, se observa en la parte superior el curso temporal de la 
corriente, inducida por una despolarización, es rápido (en 50 ms alcanza su máximo) y se sostiene 
 
35 TETRAETHYLAMMONIUM BLOCKADE OF APAMIN-SENSITIVE ANDINSENSITIVE Ca2l-ACTIVATED K+ 
CHANNELS IN A PITUITARY 
CELL LINE, DANIEL G. LANG AND AILEEN K. RITCHIE, Journal of Physiology (1990), 425, pp. 117-132 
 
60 mv 
-70 mv 
PATCH MANUAL QPATCH 
31 
 
la amplitud, sin inhibición aparente, por el tiempo de duración del pulso de voltaje (~200ms). Es de 
hacerse notar el hecho de que ambos trazos representativos muestran similitudes y tienen el 
requisito del Giga sello, asegurando un fuerte aislante eléctrico del medio externo con respecto de 
la pipeta. 
 
Se requiere analizar cuantitativamente los resultados para demostrar que el desempeño del 
sistema QPatch es equivalente a lo obtenido con técnica clásica de Patch-Clamp Manual. Para tal 
propósito, se hizo lo siguiente: En el intervalo 100-200 ms se tomó el promedio de la corriente en 
respuesta cada pulso de voltaje. Esto es, graficado con respecto al valor del voltaje al cual fue 
inducida la corriente iónica. A lo anterior se le conoce como curva Corriente vs Voltaje (I-V). Es 
usual normalizar la amplitud de la corriente por la capacitancia total de la membrana celular, y así 
poder comparar corrientes obtenidas de células con tamaños distintos. Sabido es que esta 
capacitancia es directamente proporcional al área de la membrana celular, por lo que de esta 
forma se obtiene una gráfica asemejándose a una de Densidad de Corriente vs Voltaje. 
Asumiendo el bien establecido valor de 1 uF/cm2 para la capacidad por unidad de superficie en 
una membrana biológica típica, en el caso ilustrado la capacitancia membranal total fue de ~17 pF. 
Se muestran en la figura 10 las respectivas inhibiciones con TEA, un muy usado bloqueador 
inespecífico de una diversidad de canales de potasio, y su lavado para registrar la posible 
recuperación de esta corriente. 
 
En la figura 10 se exhiben las curvas I-V (I normalizada por capacitancia total de cada célula 
individual, en pF). Se observa que al aumentar la concentración de TEA en ambos casos hay una 
inhibición exclusivamente de la corriente saliente, y esta inhibición es dependiente de la 
concentración de TEA. También es evidente que la célula se logra recuperar en considerable 
medida, al lavar con solución control. Para el “Qpatch” la recuperación siempre fue de mayor 
estabilidad, esto es consecuencia de que el sistema del microchip mantiene a la célula 
verticalmente con respecto a la presión a diferencia del sistema manual, véase figura 8, esto 
mantiene a la célula en una posición de buena estabilidad cuando se cambian los medios a 
diferencia del sistema manual. Se realizaron dos pruebas ANOVA, una para los registros 
manuales y otra para los registros automatizados, con el fin para saber si existe una diferencia 
estadísticamente significancia entre los valores controles y aquellos reducidos por la inhibición 
farmacológica. El valor obtenido, para ambas pruebas, de fue p< 0.05 ,por lo tanto, los 
32 
 
valores reducidos por las inhibiciones son significativas estadísticamente, como la literatura lo 
afirma36. 
Hay que destacar la diferencia en el número de muestras obtenidas. El QPatch permitió obtener 
una cantidad sensiblemente mayor de registros válidos y en un tiempo considerablemente menor. 
 
 
 
36 Kuhn, M., & Johnson, K. (2013). Applied Predictive Modeling [Hardcover]. http://doi.org/10.1007/978-1-4614-6849-3, p. 
273-285 
33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Corrientes BK. Comparación de curvas I-V, normalizando I por la capacitancia total de membrana Relaciones obtenidas con un “set up” manual de patch 
clamp (izquierda) y con el QPatch 16X (derecha). Se muestra la inhibición farmacológica inducida por Tetraetilamonio (TEA). 
 
 
 
 Patch Manual Qpatch 
D
ensi
da
d 
de
 C
or
rie
nt
e 
D
en
si
da
d 
de
 C
or
rie
nt
e 
Voltaje Voltaje 
Lavado 
Control 
TEA 45 
TEA 135 
Lavado 
Pulsos de voltaje 
5
0
0
 p
A
 
25 ms 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Ajuste de la distribución/ecuación de Boltzmann a la curva de conductancia normalizada (g/gmax) vs voltaje para el caso manual (izquierda) y 
automatizado (derecha). 
 
 
 
Otro medio cuantitativo de evaluar y validar la equivalencia de la tecnología automatizada frente a 
la técnica manual para esta preparación celular, es el valor de voltaje de activación media de la 
conductancia con el voltaje de los canales BK. Aquel se realizó calculando de una 
distribución de Boltzmann ajustada a la relación entre la conductancia normalizada por su 
valor máximo (g/gmax) con respecto al voltaje, es decir, = gnorm véase figura 
11). De este ajuste encontramos que V1/2 = -2.2 0.3 mV y V1/2 = -2.6±0.3 mV, para el caso 
manual y automatizado(QPatch), respectivamente. Es notable la similitud y se expone con mayor 
peso la validez el uso del instrumento QPatch para cultivos primarios de células cromafines. 
Además, las constantes de Boltzmann (k) ajustadas para el caso manual y para el QPatch 
resultaron, igualmente, muy semejantes: k =11.8±0.2 y k =13.5±0.2, respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-6 0 -4 0 -2 0 0 2 0 4 0 6 0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
Q p a tc h B K
V o lta je (m V )
(g
/g
m
a
x
)
A ju s te B o ltzm a n n
-6 0 -4 0 -2 0 0 2 0 4 0 6 0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
M a n u a l B K
V o lta je (m V )
(g
/g
m
a
x
)
A ju s te B o ltzm a n n
35 
 
b) Corrientes Iónicas Salientes SK. 
 
Las corrientes salientes SK (Small Conductance Potassium Channel) se encontraron con menor 
frecuencia a lo largo de todo el desarrollo experimental de esta tesis. Hay que resaltar que no hay 
control sobre el tipo de corriente BK y SK es decir salen aleatoriamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12 Corrientes salientes de potasio SK representativas y su protocolo de voltaje. A la izquierda trazos obtenidos por patch-clamp manual y a la izquierda 
obtenidos por el QPatch 
 
 
 
 
 
60 mv 
Patch Manual 
36 
 
En la figura 12 es evidente que la cinética del canal sigue un curso temporal de activación e inicio 
de inactivación en intervalo no mayor a 50 ms. Es de notar que su cinética difiere ostensiblemente 
de aquella presentada por corrientes BK. Como en el caso de los registros presentados en la 
sección anterior, las resistencias del sello, en todos los casos considerados para el análisis en 
ambas técnicas, son mayores de 1 G. Análogamente, se construyeron las curvas I-V utilizando la 
corriente normalizada por la capacitancia (en pF) de cada célula registrada. 
 
 
 
 
 Manual QPatch 
 n= 7 n=15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Corrientes de canales SK. Comparación de las curvas de corriente normalizada por capacitancia total vs Voltaje Relaciones obtenidas con un set up 
manual de patch clamp (izquierda) y con el QPatch 16X (derecha). Se muestra la ausencia de una inhibición causada por Tetraetilamonio (TEA). 
 
 
 
Al construir las curvas I-V haciendo uso de la corriente normalizada por el valor de capacitancia 
total (en pA/pF, véase figura 13) se corroboró que, a aun con una alta concentración de TEA (135 
Mm), no hay inhibición de la corriente observada con ambas técnicas de registro, mostrando 
nuevamente la equivalencia del sistema QPatch con la metodología manual clásica. 
Esto confirma los estudios publicados con anterioridad en células cromafines de bovino 37 . 
 
37 (Lang & Ritchie, 1990)PP.118 
-6 0 -4 0 -2 0 2 0 4 0 6 0
5 0
1 0 0
V o lta g e (m V )
C
u
rr
e
n
t
d
e
n
si
ty
(p
A
/p
F
)
-6 0 -4 0 -2 0 2 0 4 0 6 0
5 0
1 0 0
S K
V o lta g e (m V )
C
u
rr
e
n
t
d
e
n
si
ty
(p
A
/p
F
)
T E A 1 3 5 m M
 Patch Manual QPatch 
D
en
si
da
d 
de
 C
or
rie
nt
e 
D
en
si
da
d 
de
 C
or
rie
nt
e 
Voltaje Voltaje 
37 
 
Aplicando una prueba estadística de tstudent pareada38 se reafirma lo anterior, es decir, el valor de p 
<<< 05. Por lo tanto, la diferencia entre los registros control y aquellos obtenidos en presencia de 
TEA no es estadísticamente significativa. También para este tipo de corriente SK el número de 
datos válidos obtenidos con el equipo QPatch es mayor que el número de resultados obtenidos 
con la técnica y metodología manuales, como ya se ha mostrado repetidamente en esta tesis. 
 
 
 
 
 
c) Corrientes Iónicas Entrantes: INa 
 
Hay dos tipos de corrientes entrantes presentes en las células cromafines. Una es la de sodio, y 
otra es la de calcio. De ambas, esta tesis solamente se prestó atención a las corrientes entrantes 
de Na. Al igual que lo hecho para las corrientes salientes de K, a fin de comparar las metodologías 
manual y automatizada, evaluando la validación de la segunda, tomando como referencia a la 
primera, lo esencial es mantener en todos los casos las mismas condiciones experimentales y así 
poder comparar las tecnologías y los métodos. 
 
En la figura 14 se muestran trazos representativos de la corriente total, saliente y entrante, con 
ambas metodologías. Al intercambiar la solución externa con otra conteniendo Tetrodotoxina 
(TTX, 100 nM) las curvas I-V, utilizando la corriente normalizada por la capacitancia membranal 
total (en pA/pF), muestran la inhibición exclusiva de la corriente entrante. Ya que el TTX es un 
inhibidor especifico de una gran diversidad de corrientes de Na, este resultado implica que las así 
inhibidas corresponden a aquellas generadas por canales selectivamente permeables a ese ion, lo 
cual corrobora lo publicado en la literatura del tema39. 
 
 
38 Ya que calcula la diferencia dentro de cada par de mediciones de antes y después , determina la media de estos cambios e 
informa si la media de la diferencia es estadísticamente significativa. 
39 SODIUM AND CALCIUM CHANNELS IN BOVINE CHROMAFFIN CELLS, ELIZABETH M. FENWICK, A. MARTY 
AND E. NEHER, J. Physiol. (1982), 331, pp. 599-635 
38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Corrientes entrantes. Comparación de la relación (I vs V) entre el sistema Manual y el automatizado. 
 
 
 
-6 0 -4 0 -2 0 2 0 4 0 6 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
5 0
V o lta g e (m V )
C
u
rr
e
nt
de
n
si
ty
(p
A
/p
F
)
-6 0 -4 0 -2 0 2 0 4 0 6 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
5 0
V o lta g e (m V )
C
ur
re
nt
de
ns
ity
(p
A
/p
F)
T T X 1 0 0 nM
C o n tro l S o d io
Patch Manual 
D
en
si
da
d 
de
 C
or
rie
nt
e 
(p
A
/p
F)
 
 QPatch 
Voltaje mv Voltaje mv 
D
en
si
da
d 
de
 C
or
rie
nt
e 
(p
A
/p
F)
 
-70 mv 
40 mv 
20 ms 
39 
 
V DISCUSIÓN 
 
Desde su inicio, la ejecución de la técnica de Patch-Clamp Manual requiere de una alta destreza 
experimental, necesitándose un tiempo prolongado de entrenamiento en una metodología 
experimental caracterizada por un trabajo laborioso, detallado, lento y hasta cierta medida tedioso 
para llegar a obtener registros de suficiente calidad y validez. Todo esto, tiene como consecuencia 
una lenta producción de datos, constituyéndose en una seria limitante para el caso específico del 
descubrimiento de nuevos agentes farmacológicos que actúen sobre canales iónicos, es decir 
medicamentos, tanto en el ámbito académico y, sobre todo y con mucho, en el de las industrias 
farmacéutica y biotecnológica, donde las exigencias económicas de producción acelerada y 
eficiente son emblemáticas. 
La tecnología e instrumentación de Parch-Calmp Automatizado se originó y se ha venido 
desarrollando para resolver esa exigencia, aumentandode manera significativa, en por lo menos 
un orden de magnitud, la generación de datos válidos, es decir, comparables en calidad de 
contenido de información a aquellos generados con la técnica manual clásica. 
Es importante enfatizar que la tecnología automatizada no mejora en modo alguno la calidad de 
los registros electrofisiológicos, y que el Patch-Clamp Manual sigue ofreciendo ciertas ventajas 
experimentales, hasta ahora todavía insustituibles, por sobre aquellas obtenidas con el uso de los 
“robots” existentes en la actualidad. 
Como se puede apreciar en los resultados de esta tesis, existe una evidente y clara paridad entre 
los obtenidos por el sistema automatizado QPatch y los paralelamente generados mediante la 
metodología manual. 
El resultado fundamental de esta tesis es la optimización exitosa del registro de corrientes 
eléctricas, generadas por canales iónicos endógenos, fisiológicamente presentes en células 
nativas aisladas y mantenidas en cultivo primario, es decir: corrientes entrantes de Na y salientes 
de K en células neurosecretoras cromafines de bovino. Para tal tipo celular, este resultado es el 
primero en su género, cumpliendo asimismo con el objetivo amplio y general de introducir por 
primera vez esta tecnología instrumental en México. 
De forma específica, por primera vez en nuestro medio, América Latina, se cuenta con un 
instrumento de registro múltiple automatizado QPatch. De esta manera se posiciona a nuestro 
país como un pionero en la experimentación automatizada, particularmente en el estudio 
electrofisiológico de células nativas mantenidas en cultivo primario, facilitando las campañas de 
40 
 
tamizaje (“screening”) enfocadas a la identificación de compuestos químicos de manera masiva. 
En términos cuantitativos, los resultados centrales de este estudio experimental se resumen 
compactadamente en la tabla 1, donde se muestra que, cumpliéndose con el requerimiento 
fundamental de obtener y mantener sellos eléctricos de al menos 1 G de resistencia, el 
porcentaje de éxito en los experimentos usando el QPatch es de 54%. Esta eficacia terminal, es 
decir, de experimento llevado a término exitosamente, resulta altamente significativo, tratándose 
de células nativas, adultas mantenidas en cultivo primario. Aquí habrá que resaltar el hecho de 
haber identificado y seleccionado un tipo celular, de gran relevancia como modelo neuronal, capaz 
de producir las cantidades necesarias para el adecuado funcionamiento de un aparato 
automatizado de patch-clamp. Si bien para el caso de canales iónicos recombinantes, expresados 
heterologamente en líneas celulares bien establecidas y haciendo uso de sistemas automatizados 
de patch-clamp, se han reportado eficiencias del orden de 80%40, los resultados publicados para 
canales endógenos en células nativas en cultivo primario son semejantes o aun menores en su 
porcentaje de éxito terminal a los producidos en esta tesis 35-37. 
 
De todo lo anterior, es posible concluir que el sistema automatizado QPatch es una robusta, 
consistente y confiable fuente de adquisición de datos electrofisiológicos en la modalidad de célula 
completa (“Whole-Cell”). Esta metodología aplicada y optimizada para un cultivo primario permite 
a futuro diseñar y ejecutar el tamizaje de un número considerablemente alto de diferentes 
compuestos químicos, y en un tiempo significativamente reducido, caracterizando sus acciones 
biológicas y farmacológicas sobre corrientes de canales iónicos en células cromafines. 
 
¿Esta metodología es aplicable a diferentes cultivos primarios? Es posible, siempre y cuando se 
cumplan las siguientes condiciones requeridas para un adecuado registro electrofisiológico: 
 
 
40 Li J, Sukumar P, Milligan CJ, Kumar B, Ma ZY, Munsch CM, Jiang LH, Porter KE, Beech DJ. (2008). Interactions, functions, 
and independence of plasma membrane STIM1 and TRPC1 in vascular smooth muscle cells. Circ Res.103(8): e97-104. 
36 Milligan, C. J., Li, J., Sukumar, P., Majeed, Y., Dallas, M. L., English, A., … Beech, D. J. (2009). Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nature Protocols, 
4(2), 244–55. http://doi.org/10.1038/nprot.2008.230. 
37 Naylor J, Li J, Milligan CJ, Zeng F, Sukumar P, Hou B, Sedo A, Yuldasheva N, Majeed Y, Beri D, Jiang S, Seymour VA, McKeown L, Kumar B, Harteneck C, O'Regan D, Wheatcroft SB, Kearney 
MT, Jones C, Porter KE, Beech DJ. (2010)Pregnenolone sulphate- and cholesterol-regulated TRPM3 channels coupled to vascular smooth muscle secretion and contraction. Circ Res. 
106(9):1507-15. 
 
http://doi.org/10.1038/nprot.2008.230
41 
 
 
1.- Requisito de Densidad. 
 Aquella exigencia referida al número de células por unidad de volumen. 
 Es posible trabajar con un cultivo primario si se satisface la condición: 
 Células en suspensión ≥ 2 millones por 1 ml. 
 
2.- Requisito de Viabilidad (Punto de inflexión crítico). 
 Exigencia referida a la separación enzimática, mantenimiento del cultivo y levantamiento de 
células, es decir, calidad del cultivo primario 
 Es posible usar cultivo primario si se satisface la condición: 
 │ 3 intentos en el Patch manual (del cultivo primario en cuestión│≥ 1 registro obtenido. 
 
 Lo que denomino como “punto de inflexión crítico” hace referencia a la inestabilidad de un cultivo 
primario en comparación a una línea celular, y a la importancia que tiene el tratamiento previo 
antes de ser usadas las células al QPatch. La forma más confiable es llevar a cabo tres registros 
en modo manual, para asegurar la estabilidad y buenas respuestas de las células. En caso de no 
conseguirlo es posible argüir que el estado fisiológico de la preparación (células) no es el óptimo, y 
entonces habrá un alto riesgo (asumiendo que la persona que registra es considerada altamente 
capaz para tal tarea) al proceder con el QPatch de no superar el 50% de eficiencia por 
experimento. 
 
Es de relevancia hacer notar que, en el caso de corrientes entrantes, no fue perceptible una 
corriente de calcio. Una razón para suponer que no se pudo registrar una corriente de calcio es 
que, las corrientes salientes de potasio siempre resultaron suficientemente grandes (y no 
completamente bloqueadas al usar TEA) para enmascarar las entrantes de calcio. 
 
Aunque la técnica de Patch-Clamp se ha utilizado en el descubrimiento de fármacos desde la 
década de 1970, la 
 tenido un crecimiento exponencial41. 
 
 
41 Picones, 2015 
42 
 
VI Bibliografía 
 Arning, K. (2009). Mathematical Modelling and Simulation of Ion Channels, 1–139. Retrieved from 
https://wwwmath.uni-muenster.de/num/burger/teaching/.../thesisArning.pdf 
Axon Instruments. (1999). Axopatch 200B Manual, 1(2500), 137. 
Balderas, E., Ateaga-Tlecuitl, R., Rivera, M., Gomora, J. C., & Darszon, A. (2012). Niflumic acid blocks 
native and recombinant T-type channels. Journal of Cellular Physiology, 227(6), 2542–2555. 
http://doi.org/10.1002/jcp.22992 
Bierbower, S. M., & Shapiro, M. S. (2013). Förster resonance energy transfer-based imaging at the cell 
surface of live cells. Methods Mol Biol (Vol. 998). http://doi.org/10.1007/978-1-62703-351-0_16 
Brady, J., Heine, P., Shivakumar, R., Viley, A., Peshwa, M., Donato, K., & Steger, K. (2012). Rapid 
generation of cells for ion channel assays : efficient , large-scale transfection using the MaxCyte ® STX 
TM system , convenient cell culture using Corning ® HYPERFlask TM vessels , and robust target activity 
assayed by the Sophion QPatch ., 100. 
Brito, L. (n.d.). Aspectos basicos sobre el manejo y prservacion de los cultivos celulares. Retrieved from 
http://www.paho.org/hq/dmdocuments/2010/L Brito INHRR.pdf 
Dronne, M. A., Boissel, J. P., & Grenier, E. (2006). A mathematical model of ion movements in grey matter 
during a stroke. Journal of Theoretical Biology, 240(4),599–615. 
http://doi.org/10.1016/j.jtbi.2005.10.023 
Fenwick, B. Y. E. M., Martyt, A., & Nehert, E. (1982). Fa&8berg, 599–635. 
Hollins, B., & Ikeda, S. R. (1996). Inward currents underlying action potentials in rat adrenal chromaffin 
cells. Journal of Neurophysiology, 76(2), 1195–1211. Retrieved from <Go to 
ISI>://A1996VD97200042 
Invitrogen. (2010). Cell Culture Basics Handbook. ThermoFisher Scientific Inc., 1–61. 
http://doi.org/10.1093/chemse/bjt099 
Islas-Suarez, L., Gomez-Chavarin, M., Drucker-Colin, R., & Hernandez-Cruz, A. (1994). Properties of the 
sodium current in rat chromaffin cells exposed to nerve growth factor in vitro. J Neurophysiol, 72(4), 
1938–1948. Retrieved from 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids
=7823110 
Janzen, W. P. (2002). High Throughput Screening. Moleculare Biomethods Handbook, 190(5), 1097–1118. 
http://doi.org/10.1385/1592591809 
Jenkins, D. P., Yu, W., Brown, B. M., Løjkner, L. D., & Wulff, H. (2013). Development of a QPatch 
automated electrophysiology assay for identifying KCa3.1 inhibitors and activators. Assay and Drug 
Development Technologies, 11(9–10), 551–60. http://doi.org/10.1089/adt.2013.543 
43 
 
Lang, B. Y. D. G., & Ritchie, A. K. (1990). Branch, Galveston, 117–132. 
Liu, Y. (2014). Electrophysiological studies of voltage-gated sodium channels using QPatch HT, an 
automated patch-clamp system. Current Protocols in Pharmacology. 
http://doi.org/10.1002/0471141755.ph1114s65 
Marban, E., Yamagishi, T., & Tomaselli, G. F. (1998). Structure and function of voltage-gated sodium 
channels. The Journal of Physiology, 508 ( Pt 3, 647–657. 
Marty, A., & Neher, E. (1985). Potassium channels in cultured bovine adrenal chromaffin cells. The Journal 
of Physiology, 367, 117–41. http://doi.org/10.1113/jphysiol.1985.sp015817 
Miękisz, J., Gomułkiewicz, J., & Miękisz, S. (2014). Mathematical models of ion transport through cell 
membrane channels. Mathematica Applicanda, 42(1), 39–62. http://doi.org/10.14708/ma.v42i1.469 
Milligan, C. J., Li, J., Sukumar, P., Majeed, Y., Dallas, M. L., English, A., … Beech, D. J. (2009). Robotic 
multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nature Protocols, 4(2), 244–55. 
http://doi.org/10.1038/nprot.2008.230 
Neumaier, F., Dibué-Adjei, M., Hescheler, J., & Schneider, T. (2015). Voltage-gated calcium channels: 
Determinants of channel function and modulation by inorganic cations. Progress in Neurobiology, 129, 
1–36. http://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2014.12.003 
Ogden, D., & Stanfield, P. (1981). Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. 
Currents, 2(7), 53–78. Retrieved from 
http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch04.pdf 
Picones, A. (2015). Ion channels as medicinal targets of biological toxins: the impact of automated 
patch-clamp electrophysiology. Curr Top Med Chem. 15(7):631-7. 
Recordings, P., & Dendrites, N. (2012). Patch Clamp Techniques. Control, 1991, 159–170. 
http://doi.org/10.1007/978-4-431-53993-3 
Scott, R. S., Bustillo, D., Olivos-Or, L. A., Cuchillo-Ibañez, I., Barahona, M. V., Carbone, E., & Artalejo, A. 
R. (2011). Contribution of BK channels to action potential repolarisation at minimal cytosolic Ca 2+ 
concentration in chromaffin cells. Pflugers Archiv European Journal of Physiology, 462(4), 545–557. 
http://doi.org/10.1007/s00424-011-0991-9 
Sher, A. A., Wang, K., Wathen, A., Maybank, P. J., Mirams, G. R., Abramson, D., … Gavaghan, D. J. 
(2013). A local sensitivity analysis method for developing biological models with identifiable 
parameters: Application to cardiac ionic channel modelling. Future Generation Computer Systems, 
29(2), 591–598. http://doi.org/10.1016/j.future.2011.09.006 
Specifications, P. (n.d.). QCells Primary Rat Brain Microglia on QPatch, 2–3. 
Stein, W. D., & Litman, T. (2015). Ion Channels Across Cell Membranes. Channels, Carriers, and Pumps. 
http://doi.org/10.1016/B978-0-12-416579-3.00003-4 
44 
 
Vukicevic, V., Schmid, J., Hermann, A., Lange, S., Qin, N., Gebauer, L., … Ehrhart-Bornstein, M. (2012). 
Differentiation of chromaffin progenitor cells to dopaminergic neurons. Cell Transplantation, 21(11), 
2471–2486. http://doi.org/10.3727/096368912X638874 
Walz, W., Behrends, J. C., & Fertig, N. (2007). Patch-Clamp Analysis Advanced Techniques, Second 
Edition. Neuromethods, 38, 411. http://doi.org/10.1007/978-1-59745-492-6 
Wilders, R. (n.d.). M SC PL O E – C EO M SC PL O E – C EO. 
Yang, W., & Jiang, L. (2013). Ion Channels, 998, 257–266. http://doi.org/10.1007/978-1-62703-351-0 
Kuhn, M., & Johnson, K. (2013). Applied Predictive Modeling [Hardcover]. 
http://doi.org/10.1007/978-1-4614-6849-3 
Hille, B. (1978). Ionic Channels in Excitable membranes. Biophysical Journal (Vol. 22). 
http://doi.org/10.1149/1.2100457 
Bretschneider, F., & Jan R. de Weille. (2006). Introduction to Electrophysiological Methods and 
Instrumentation. Book. http://doi.org/10.1201/9781439823798 
 
 
 
 
 
 
	Portada
	Contenido
	Resumen
	I. Introducción
	II. Hipótesis y Objetivo
	III. Materiales y Métodos
	IV. Resultados
	V. Discusión
	VI. Bibliografía