histología microscopio

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Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
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TEMA 6.- EL MICROSCOPIO 
Introducción.
Estructura del microscopio.
Aumento visual.
Distancia de enfoque.
Campo visual.
Profundidad de enfoque.
Diafragma de campo y retículos.
Los oculares.
Apertura numérica.
Luminosidad.
Poder separador. 
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EL MICROSCOPIO
6.1.- Introducción
Microscopio: Instrumento óptico subjetivo para la observación
de objetos cercanos constituidos por detalles cuyas dimensiones
se sitúan por debajo del mínimo separable por el ojo.
En principio, una lupa de gran aumento visual entraría en esta
definición, sin embargo, en la práctica el valor del aumento de la
lupa está limitado, ya que para valores del aumento superiores a
Γ=20 la lente sería demasiado pequeña.
¿Qué solución aporta el Microscopio?
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El microscopio proporciona una imagen final muy aumentada
tras un proceso de doble etapa, mediante el acoplamiento de
dos elementos convergentes.
El objetivo proporciona una imagen intermedia real e invertida.
La imagen intermedia sufre un aumento adicional bajo la
acción del ocular.
El acoplamiento del objetivo y el ocular proporciona un
aumento máximo en torno a 2.000
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4 / 486.2.- Estructura del microscopio
Objetivo: En la práctica, los objetivos son siempre sistemas
convergentes muy complejos.
Ocular: En general, el ocular está constituido por:
Lente de campo
Lente de ojo
A la distancia, t, entre el foco imagen del objetivo y el foco
objeto del ocular se le denomina intervalo óptico o longitud
óptica del tubo.
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Práctica de laboratorio
Construcción del Microscopio
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6.3.- Aumento visual
Al igual que en el caso de la Lupa, se define el aumento normal
del microscopio como el cociente entre el tamaño angular aparente,
w’, de la imagen y el tamaño angular, wA, que tendría el objeto en el
caso de estar situado a -250mm del observador.
tan '
tan
Γ =
A
w
w
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ob oc
A oc
tan ' ' 0.25
tan '
βΓ = = = Γw y
w y f
El Microscopio proporciona valores altos del aumento visual en un 
proceso de doble etapa:
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oc oc
ob oc m m
0.25( ) 250( )0.25
' ' ' ( ) ' ( )
β −Γ = Γ = = =t m mm
f f f m f mm
El Microscopio se comporta como una Lupa de focal f ’m
El aumento visual del Microscopio es negativo
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Desde un punto de vista comercial el aumento del Microscopio se 
suele especificar de la forma
• Objetivo m x (entre 10 y 100)
• Ocular x n (máximo 20)
Los objetivos se diseñan (aumento y corrección de aberraciones ) 
para una determinada longitud óptica y, por tanto, no es conveniente 
utilizarlos en microscopios con diferente valor de t.
ob oc, donde y β× = = Γm n m n
2000 (máximo)Γ =
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6.4.- Distancia de enfoque
La distancia de enfoque o distancia de trabajo, de, es la distancia
desde el plano objeto hasta el vértice de la primera superficie del
objetivo.
Para el caso ideal de un objetivo constituido por una lente delgada
f ’obzob
'
' ob
ob
ob
e
fd f
β
= = +
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6.5.- Campo visual
Porción del objeto que es visible a través del Microscopio.
Cálculo del campo de iluminación media en el espacio óptico imagen:
El ocular y la pupila del ojo están en el espacio imagen.
Hay que calcular la posición del conjugado del objetivo en el espacio imagen.
La imagen final proporcionada por el microscopio está en el infinito.
En los microscopios la montura del objetivo actúa siempre como Diafragma 
de Apertura (y Pupila de Entrada) y, por tanto, su conjugado en el espacio 
imagen es la Pupila de Salida.
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6.5.- Campo visual
Posición y tamaño de la Pupila de Salida del Microscopio
p oc p' ' '= +a f z
Para una observación óptima la pupila del ojo ha de 
situarse sobre la Pupila de Salida del Microscopio
2
oc
p oc
ob
'' '
'
= +
+
fa f
f t
oc
PS p ob ob
ob
'
'
φ β φ φ= =
+
f
f t
Emergencia pupilar
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Cálculo del campo de iluminación media en el espacio óptico imagen
El semicampo imagen de iluminación media es
el ángulo subtendido por la montura del ocular 
desde el centro de la pupila del ojo
'
'tan 2
φ
= ocm
p
w
a
' '
'2
φρ = ocm oc
p
f
a
Campo de iluminación media en 
el espacio óptico intermedio
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' '
'2
φρ = ocm oc
p
f
a
Campo de iluminación media en 
el espacio óptico intermedio
' '
' '
0.252 φ φρ = =
Γ
ob oc oc oc
m
p p
f f
t a a
Campo de iluminación media en 
el espacio objeto (Campo visual)
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' '
' '
0.252 φ φρ = =
Γ
ob oc oc oc
m
p p
f f
t a a
Campo de iluminación media en el espacio objeto (Campo visual)
'2 es inversamente proporcional a y m paρ Γ
Se utilizan oculares compuestos para aumentar el campo
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6.6.- Profundidad de enfoque
' En general: la longitud óptica 
 
La posición de la P.S Plano focal imagen del Microscopio
 
obt f
⇓
≅
 ⇓
2
m m'e f AΔ =
20.25⎛ ⎞Δ = ⎜ ⎟Γ⎝ ⎠e m
A (Expresada en m)
Microscopio de 100 Aumentos
0.025 25
Observador de 4
μ
⎧ ⎫
⇒ Δ = =⎨ ⎬=⎩ ⎭
e
m
mm m
A D
La profundidad de enfoque de un Microscopio es reducida.
El mecanismo de enfoque ha de ser muy preciso.
El Microscopio permite medir distancias axiales con gran precisión. 
Ejemplo
El Microscopio trabaja en condiciones de AUMENTO NORMAL
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6.7.- Diafragma de campo y retículos
El Microscopio compuesto presenta frente a la Lupa la ventaja 
adicional de la existencia de una imagen intermedia real.
Sobre el plano de la imagen intermedia pueden situarse los 
siguientes elementos :
• Diafragma de campo:
• Retículo: Elemento transparente, con dibujo de líneas o escala.
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Práctica de laboratorio
Determinación de la posición y tamaño de la Pupila de Salida
Para una observación óptima la pupila del ojo ha de 
situarse sobre la Pupila de Salida del Microscopio
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Medida del Aumento lateral del 
objetivo y del campo visual
3.2
2 5.6
ob
m mm
β
ρ
= −
ob
y' 2.2y= 0.7
3 2
 
.
mm mm
β
=
Medición de objetos
Escala de 20 mm 1 div = 0.2 mm
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6.8.- Los oculares
El campo visual de un microscopio es inversamente proporcional
al aumento visual del mismo. Como consecuencia de ello el
campo visual de los microscopios de gran aumento es muy
reducido. Para aminorar este problema, los microscopios, y en
general todos los instrumentos ópticos visuales, incorporan
oculares compuestos por dos lentes.
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F E
F E
oc E
' '
' '
' 'f f
f f
f f
e
= =
+ −
( )F
F
E
oc
E
F
' '
'
0
'
f e f
f f e
H F
−
= =
+ −
( )E F
F
2
E
E oc E
FE
''
' '
'
'
'
'
'
f f e
f f
fH F f
fe
−
= =
+ −
−
Hoc
H’oc
1 2 1 2
1 2
' ' ' ''
( ' ' )
f f f ff
t f f e
= =
− + −
( )1 2
1
1 2
' '
' '
f e f
H F
f f e
−
=
+ −
( )2 1
2
1 2
' '
' '
' '
f f e
H F
f f e
−
=
+ −
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p E oc p' ' ' 'a H F z= +
E
m
p
2502
'a
φ
ρ =
Γ
El campo aumenta al utilizar oculares compuestos
2
E
p p
F
'' '
'
fa a
f
= −
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Huygens Ramsdem
F E' 3 '=f f F E' '=f f
El ocular analizado constituye la forma más simple de un ocular doble. No es
conveniente, sin embargo, situar la lente de campo sobre la imagen intermedia
proporcionada por el objetivo, ya que:
• Es preciso evitar que posibles ralladuras o motas de polvo presentes en la
lente de campo aparezcan superpuestas con la imagen final.
• En muchas ocasiones, es necesario colocar sobre esta imagen intermedia
un retículo para poder efectuar mediciones del objeto.
En general, el diseño de los oculares es bastante complejo ya que se ha de
tener en cuenta, además, la compensación de aberraciones.
(3,2,1) (3,2,3)
Símbolo del Doblete
1 2( ' , , ' )f e f
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Estudio de la influencia de la Lente de campo:
• Posición y tamaño de la Pupila de salida:
• La emergencia pupilar disminuye.
• El diámetro de la PS no cambia.
• Campo visual: Aumenta.
• Aumento visual: No varía.
Construcción de un Microscopio con ocular doble.
Práctica de laboratorio
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Medida del Aumento visual del Microscopio 
con ocular simple y con ocular doble.
'
'tan 'tan '
tan
tan
250
r
A
A
A
yw
w f
w yw
⎧ ⎫
=⎪ ⎪⎪ ⎪Γ = ⎨ ⎬
⎪ ⎪=⎪ ⎪⎩ ⎭
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6.9.- Apertura numérica del objetivo
Para caracterizar la apertura del haz útil en un microscopio se utiliza la
denominada apertura numérica. Esta magnitud juega un papel decisivo
tanto en la luminosidad como en el poder separador del microscopio.
σ= sinnAN
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σ= sinnAN
PS oc2 ' sin 'fφ = − σ
PS
AN AN0.5 500m mmφ = =
Γ Γ
ob ob
sin ANsin ' n σσ = =
β β
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AN sinn= σ
PS
AN AN0.5 500m mmφ = =
Γ Γ
Ejemplo
AN 0.50=
4001040 =×=Γ
PS
0.50500 0.625
400
mmφ = =
ob 40β = × oc 10Γ = ×
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6.10.- Luminosidad
Para el caso de objetos extensos, se define la luminosidad como el
cociente entre la iluminación retiniana en visión a través del instrumento
óptico, y la obtenida en visión directa.
2
A
PS
A
r
e '
'
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
φ
φ
τ==
ef
E
EC
En la práctica totalidad de los casos las pupila de salida del microscopio
constituye la pupila de salida efectiva del acoplamiento.
2 22
e
A oc A ob
500AN 500 ANC
⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎛ ⎞
= τ = τ⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟Γ φ Γ φ β⎝ ⎠ ⎝ ⎠ ⎝ ⎠
Ej
em
pl
o 0.50AN =
4001040 =×=Γ
mm4A =φ
( )
2
e
500 0.500.75 0.02
400 4
C ×⎛ ⎞= ≈⎜ ⎟×⎝ ⎠
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En el caso en que, sobre un fondo oscuro, el objeto observado es
puntual, o sus dimensiones tan reducidas que su imagen impresiona un
único fotorreceptor, la luminosidad vale
2
A
PE
2
eA
r
p
250
'
'
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
φ
φ
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
τ=
Φ
Φ
=
ef
d
C
2
A
PE
2
A
r
p '
'
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
φ
φ
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛τ=
Φ
Φ
=
ef
x
aC
Observación 
con instrumento
Observación directaMicroscopio
Observación directa
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2
P
2
o Aoc
S
p
b
250
' ' /
ef
f f t
C
⎛ ⎞
= ⎜ ⎟
⎝ ⎠
⎛ ⎞φ
τ⎜ ⎟⎜ ⎟φ⎝ ⎠
ep
2C C= Γ
Ej
em
pl
o AN 0.50=
4001040 =×=Γ
mm4A =φ
2 2
p e 400 0.02 3200C C= Γ = × =
2
e
p
c :contrasteen Ganancia Γ== C
C
G
2
A
PE
2
eA
r
p
250
'
'
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
φ
φ
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
τ=
Φ
Φ
=
ef
d
C
PS oc oc
p
PE obp
' '
'
f f
f tz
φ
= β = =
φ +
( )
t
ftfd obobe
'' +=
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
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6.11 Poder separador
El poder separador es la cualidad esencial de un microscopio ya que su
finalidad es proporcionar al ojo imágenes discernibles de los detalles
más finos de los objetos.
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
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Según se establece en el Tema 3, y supuesto que las aberraciones han
sido convenientemente corregidas, el poder separador está limitado por
el fenómeno de la difracción y por la estructura discreta de la retina.
A los efectos de la difracción, y asumiendo que la Pupila de Salida del
Microscopio es menor que la Pupila de Entrada del ojo, el límite de
resolución vale:
AN
61.0
dif
λ
=η
Con respecto a la influencia de la estructura de la retina, al igual que
en el caso de la Lupa, el límite de resolución vale:
( ) m100mm
10
1tan250 Aret μΓ
=
Γ
≈
Γ
α
=η
mμ≈λ 55.0
m
AN
33.0
dif μ=η
A 80''α =
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
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Si consideramos conjuntamente ambos factores: mic máx ,
1000.61
AN
λη
⎧ ⎫⎪ ⎪= ⎨ ⎬
⎪ Γ ⎪⎩ ⎭
La intersección de las dos curvas define el aumento útil o superresolvente:
λ
=Γ
61.0
AN100util AN300util =Γ
mμ≈λ 55.0
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oc oc0.5 10 10AN mm= Γ = φ =
ob 15β = − ⇒
Ejemplo
util 150Γ =
mic
100 100 0.67
150
m mη = = μ = μ
Γ
2 2
e
A
500AN 500 0.50.75 0.13
150 4
C
⎛ ⎞ ×⎛ ⎞= τ = =⎜ ⎟ ⎜ ⎟Γ φ ×⎝⎠⎝ ⎠
oc oc
m
p
250 250 250 102 0.67
' ' 150 25oc
mm
a f
φ φ ×
ρ = ≈ = =
Γ Γ ×
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oc oc0.5 10 10AN mm= Γ = φ =
ob 30β = − ⇒ 300Γ =
mic 0.67 mη = μ
2 2
e
A
500AN 500 0.50.75 0.033
300 4
C
⎛ ⎞ ×⎛ ⎞= τ = =⎜ ⎟ ⎜ ⎟Γ φ ×⎝ ⎠⎝ ⎠
oc oc
m
p
250 250 250 102 0.33
' ' 300 25oc
mm
a f
φ φ ×
ρ = ≈ = =
Γ Γ ×
mic 0.67 mη = μ
e 0.13C =
m2 0.67mmρ =
util 150Γ =
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6.12 Objetivos de microscopio
Los objetivos de microscopio se diseñan para proyectar sobre el plano
focal objeto del ocular una imagen aumentada del objeto. El diseño de
los objetivos busca la corrección óptima de las aberraciones para
valores de la AN lo más altos que sea posible.
Cuanto mejor es la corrección de aberraciones y más alta la AN, mayor
es la dificultad de diseño y, por tanto, el precio del objetivo.
• Objetivos acromáticos: Son los más baratos (y comunes). Corrigen
la aberración cromática axial para dos λ (rojo y azul) y la aberración
esférica para el verde.
• Objetivos semi-apocromáticos –fluorita (Ph): Corrigen la aberración
cromática axial para dos λ (rojo y azul) y la aberración esférica también
para dos λ.
• Objetivos apocromáticos: Corrigen la aberración cromática axial
para tres λ (rojo, verde y azul) y la aberración esférica para dos λ.
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Objetivos de inmersión
σ= sinnAN
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http://www.microscopyu.com/tutorials/java/objectives/nuaperture/index.html
Apertura Numérica y distancia de enfoque
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http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/specialobjectives.html
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Objetivo 
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