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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA ESTUDIOS CRISTALOGRÁFICOS EN LAS ALDEHÍDO DESHIDROGENASAS T E S I N A TRABAJO ESCRITO VÍA CURSOS DE EDUCACIÓN CONTINUA QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO P R E S E N T A: LUIS GONZÁLEZ OCEGUERA MÉXICO, D.F. AÑO 2014 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Profesor: Rogelio Rodríguez Sotres VOCAL: Profesora: Mireya Rodríguez Penagos SECRETARIO: Profesora: Lilian González Segura 1ER. SUPLENTE: Profesora: Laura Carmona Salazar 2° SUPLENTE: Profesor: Jorge Rafael Martínez Peniche SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO 102. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, CONJUNTO E, FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. ASESOR DEL TEMA: DRA. LILIAN GONZÁLEZ SEGURA SUSTENTANTE: LUIS GONZÁLEZ OCEGUERA ÍNDICE 1. Resumen………………………………………………………………….……………1 2. Introducción………………………………………………………………….…………2 2.1. Cristalografía de proteínas ……………………………………….……………..2 2.1.1. Historia y propiedades de los rayos X……..……………………………3 2.1.2. Cristalización de una proteína……………………………………………6 2.1.2.1. Método de difusión de vapor………………………………….….8 2.1.2.2. Método de diálisis ………………………………………………..10 2.1.2.3. Método de “microbatch”………………………………………….10 2.1.2.4. Método de co-cristalización……………………………………..11 2.1.2.5. Método de soaking “remojado” ………………….…………….11 2.1.3. Difracción de rayos X……………………………………….……………12 2.1.4. Uso de temperaturas criogénicas …………………….………………..13 2.1.5. Colecta de datos …………………………………………………………15 2.1.6. Resolución del problema de las fases……...…………………………15 2.1.6.1. Reemplazo molecular (MR)……………………………………..16 2.1.6.2. Difracción anómala múltiple (MAD)…………………………….16 2.1.6.3. Reemplazo isomórfico múltiple (MIR) …………………………18 2.1.7. Construcción y afinamiento ……………………….………………….19 2.1.8. Validación del modelo estructural ……………………………………..19 2.1.9. Diagrama de Ramachandran…………………………………………...20 2.2. Aldehído deshidrogenasas…………………………………………………..21 2.2.1. Mecanismo químico y cinético de las ALDHs ……………………….22 2.2.2. Estructura tridimensional de las aldehído deshidrogenasas ………23 3. Objetivos ……………………………………………………………………………..24 3.1. Objetivos generales ………………………………………………………….…24 3.2. Objetivos Particulares …………………………………………………….…....24 4. Justificación …………………………………………………………………….……25 5. Importancia de estudio ……………………………………………………………..25 6. Metodología…………………………………………………………………………..25 7. Resultados y discusión ……………………………………………….…………….26 7.1. Estudios cristalográficos para la obtención de la estructura tridimensional y el entendimiento de función de las ALDHs………..………..……………….26 7.2. Estudios cristalográficos en las ALDHs para obtención y el entendimiento de nuevos fármacos …………………………………………………..…….....39 8. Conclusiones ………………………………………….…………………………….44 9. Bibliografía …………………………………………………………………………...45 Ing. Daniel Corte Texto escrito a máquina ÍNDICE DE FIGURAS Figura1. Esquema general que ilustra el proceso de resolución de las estructuras de proteínas mediante la difracción de rayos X………………………………………3 Figura 2. Representación gráfica del modelo de Bragg……………………………...5 Figura 3. Espectro de radiación electromagnética, trasmitida por fotones, desde la onda de radio hasta rayos X………………………….………………………………….5 Figura 4. Cristales de lisozima...……………………………………………………..….7 Figura 5. Diagrama de solubilidad de las proteínas…………………………….……..8 Figura 6. Método de difusión de vapor de gota colgante……..………………………9 Figura 7. Método de difusión de vapor en gota apoyada…..…………………………9 Figura 8. Cristalización de proteínas por el método de diálisis……………………..10 Figura 9. Cristalización de una proteína por el método de “microbatch”..…………11 Figura 10. Excitación producida por bombardeo de rayos X………………………..13 Figura 11. Diagrama de la Crio-cristalografía………………………………………...14 Figura 12. Diagrama de Ramachandran para la L-asparaginasa…….……….…..21 Figura 13. Mecanismo de reacción de una ALDH……………………………………23 Figura 14. Figura 14. Modelo tridimensional del monómero (A), dímero (B) y tetrámero (C) de la BADH de P. aeruginosa………………………………………….24 Figura 15. ALDH2 en complejo con NAD+…………………………………………….27 Figura 16. Estructura triple mutante de la ALDH2 (E268Q/ C301S/ C303S) en complejo con GNT y NAD(H)…………………………………………………………..29 Figura 17. Reacción de la síntesis de glicina betaína………………………….……29 Figura 18. Modelo de unión de la betaína aldehído con Cys297…………….…….32 Figura 19. Tetrámero de PaBADH……………………………………………….…….34 Figura 20. Residuos aromáticos de SoBADH involucrados en la unión con BAL.35 Figura 21. Figura del sitio activo de la ALDH mostrando las diferentes conformaciones de Cys (reposo y ataque)……………………………………………36 Figura 22. Posiciones e interacciones de la moléculas de agua que se encuentran en diferentes ALDHs…………………………………………………………………….38 Figura 23. Mecanismo propuesto para la etapa de desacilación en ALDH’s……..39 Figura 24. Interacciones entre ALDH2 y Daidzina…………………………………...41 Figura 25. Modelo de activación de ALDH2*2 por alda-1…………………………...42 Figura 26. Estructura de la ALDH3A1 en conjunto con Aldi1…………………….…43 ABREVIATURAS ACh- Acetaldehído ADN- Ácido desoxirribonucleico ALDH- Aldehído Deshidrogenasa Arg- Arginina ARN- Ácido ribonucleico Asn- Aspargina Asp- Ácido aspártico BADH- Betaína aldehído deshidrogenasa C- Cisteína Cys- Cisteína E- Ácido Glutámico F- Fenilalanina Fc- Factor de estructura calculado Fo- Factor de estructura obtenido GABA- Ácido gamma-aminobutirico GB- Glicina betaína GDN- Dinitrato de glicerilo Glu- Ácido glutámico Gly- Glicina GTN- Trinitrato de glicerilo Ile- Isoleucina Leu- Leucina Lys- Lisina M- Metionina MAD-Difracción anómala múltiple Met- Metionina MIR- Remplazo isomorfico múltiple N- Asparagina NAD(P)+- Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato nm- Nanómetros NO- Óxido nítrico PaBADH- Betaína aldehido deshidrogenasa de Pseudomona aeruginosa PDB- Protein Data Bank Phe- Fenilalanina Q- Glutamina RM- Remplazo isomórfico S- Serina Thr- Treonina Trp- Triptofano Tyr- Tirosina Val- Valina W- Triptófano Y- Tirosina 4-HNE- 4-Hidroxinonenal 1 1. RESUMEN El presente trabajo es un estudio bibliográfico sobre la cristalografía de rayos X, así como su aplicación en estudios realizados en las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) para su caracterización, entendimiento de las bases estructurales de la catálisis enzimática y el desarrollo de nuevos fármacos. Se pretende describir detalladamente la cristalografía de rayos X, la cual es una técnica que permite analizar a nivel atómico la estructura de moléculas orgánicas, macromoléculas y moléculasinorgánicas que se encuentren en su forma cristalina. La cristalografía de rayos X se basa en la interacción de un haz de rayos X con los átomos de un cristal, el cual generará dispersiones en ciertas direcciones conociéndose este fenómeno como difracción, una vez analizando la intensidad y posición de los rayos difractados, se analiza el desfasamiento causado por las diferentes capas dentro de la red cristalina también denominado problema de las fases, ya resuelto el problema de las fases se procede a obtener los mapas de densidad electrónica, para posteriormente realizar el afinamiento del modelo que consiste en modificar el modelo inicial para reducir la discrepancia entre los datos experimentales y el propio modelo. El interés de analizar los estudios cristalográficos realizados en las aldehído deshidrogenasas, surgió debido a que este grupo de enzimas son las encargadas de la oxidación de diferentes aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos utilizando NAD+ o NADP+ como coenzimas. Las ALDHs son enzimas que participan en diversos procesos biológicos como la desintoxicación de aldehídos generados tanto exógena como endógenamente. La cristalografía de proteínas ha permitido estudiar el mecanismo de reacción de estas enzimas, debido a que se cuenta con numerosas estructuras cristalográficas resueltas en complejos con sus diferentes ligandos, lo cual ha permitido conocer detalles específicos a nivel atómico de los residuos catalíticos involucrados en cada paso del mecanismo químico de la reacción. Por otra parte, los estudios cristalográficos en las ALDHs 2 también han tenido una aplicación importante para la obtención de nuevos fármacos. INTRODUCCIÓN 2.1 Cristalografía de proteínas La cristalografía de rayos X es una técnica que permite describir a nivel atómico la conformación estructural de una proteína, fue hace cincuenta años en la Universidad de Cambridge cuando los científicos Max Perutz y John Kendrew usaron por primera vez la cristalografía de rayos X para describir la estructura molecular de una proteína, Max Perutz describió la hemoglobina y John Kendrew la mioglobina (Strandberg et al., 2009), a partir de estos estudios la cristalografía empezó a ser utilizada para describir diversas macromoléculas, el avance en las descripciones de las macromoléculas desde la determinación de la hemoglobina y mioglobina hasta la fecha ha tenido una aceleración por la introducción de nuevos algoritmos, programas de afinamiento, así como programas computacionales que permiten la colecta de los datos de difracción (Wlodawer et al., 2007). Debido a que la cristalografía de rayos X es una técnica que depende de la interacción de la radiación electromagnética en el intervalo de 0.01-10nm con los electrones de las moléculas que conforman a un cristal (Huxford, 2001), para poder obtener la estructura por medio de la cristalografía primero debemos de obtener el cristal de la macromolécula de estudio. El cristal debe de tener una calidad suficiente que nos permita hacer estudios de difracción de rayos X, colectar un patrón de difracción completo y resolver el problema de las fases, esto es, conocer qué punto del espacio (dentro del cristal) proviene cada rayo X difractado. Posteriormente, se genera un mapa de densidad electrónica, a partir del cual se construye el modelo tridimensional (figura 1). 3 Figura1. Esquema general que ilustra el proceso de resolución de las estructuras de las proteínas mediante la difracción de rayos X. Primero se debe obtener un cristal de la proteína de interés, al cual se le debe obtener un patrón de difracción, resolver el problema de las fases para poder calcular el mapa de densidad electrónica para posteriormente construir el modelo de la proteína (http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia). 2.1.1 Historia y propiedades de los rayos X Los rayos X fueron descubiertos en 1895 por Wilhem Conrad Röntgen, en la Universidad de Wurzburg, Bavaria, mientras experimentaba con cristales de platinocianuro de bario dentro de un tubo cubierto completamente con un cartón negro. Él observó que eran luminiscentes al producir cerca de ellos una descarga generada por un tubo de rayos catódicos, Röntgen no pudo describir completamente la nueva radiación por lo cual la denominó rayos X, dicho descubrimiento le permitió ganar el primer premio nobel en física en 1901, el descubrimiento de los rayos X por Wilhem Röntgen tuvo diversas aplicaciones en el campo de la medicina, sin embargo, no era tan evidente el uso de los rayos X en otros campos (Strandberg et al., 2009). Esta situación cambió con el 4 descubrimiento de la difracción de rayos X en cristales inorgánicos por el físico alemán Max von Laue, el cual describió a la difracción como patrones de interferencia constructiva que se generan cuando la radiación electromagnética como los rayos X o la luz interactúan con la materia, Von Laue predijo que los cristales eran una representación de la materia sólida en la que una disposición atómica sencilla se repite simétricamente para llenar un espacio. Dicha predicción se verificó experimentalmente al obtener la primera fotografía de difracción de rayos X de un cristal de SnZ, por lo cual recibió el premio nobel de física en 1914 (Huxford, 2001). Posteriormente, H. Bragg y William L. Bragg consideraban a los rayos X como partículas, ellos con sus experimentos fueron los primeros en determinar la estructura atómica de un cristal inorgánico mediante el uso de rayos X. Ellos demostraron que por medio de la difracción de rayos X se podía conocer la disposición atómica dentro de un cristal y formularon la ley de Bragg, la cual se resume mediante la siguiente ecuación: nλ = 2dsenƟ Ecuación1. Ecuación de Bragg. Donde n es un número entero, λ es la longitud de onda de los rayos x, d es la distancia de los planos de la red cristalina y Ɵ es el ángulo entre los rayos incidentes y los planos de dispersión (Drenth, 2007). El experimento de H. Bragg y William L. Bragg consistía en incidir un haz de rayos X sobre un cristal, en el que se asignó a los átomos que conformaban al cristal dentro de planos, los cuales se encontraban paralelos y perpendiculares unos de otros, estos planos estaban definidos por los índices de Miller h,k,l, los cuales son las coordenadas de los átomos (planos) dentro de un cristal, ellos dedujeron que los planos se encontraban separados una distancia “d”, por lo cual al incidir un haz en cada plano, éstos reflejaban una porción de la radiación, el haz incidente forma un ángulo Ɵ sobre los planos, con lo cual se obtenían haces difractados siempre y cuando las reflexiones fueran constructivas, como se muestra en la figura 2. 5 Figura 2. Representación gráfica del modelo de Bragg (http://servicios.fis.puc.cl/rayosx/teoria.html, consultada última vez el 10 de febrero de 2014). Después de años de estudios se pudo clasificar a los rayos X como radiaciones electromagnéticas que presentan longitudes de onda desde 10 nm hasta 0.001 nm como se muestra en la figura 3, cabe mencionar que las longitudes de onda empleadas en la cristalografía de rayos X son de 0.7 a 1.8 A. Figura 3. Espectro de radiación electromagnética, trasmitida por fotones, desde la onda de radio hasta rayos X. Estos últimos se sitúan en el intervalo de mayor energía dentro del espectro electromagnético con longitudes de onda menores a los 10nm (http://www.astronomia2009.es/Zona_Articulos/La_nueva_mirada_de_Galileo/El_Universo_mas_all a_de_lo_visible.html consultada última por última vez el 16/10/14). 6 Las propiedades de los rayos X son las siguientes: -Penetran y atraviesan la materia. -Provocan X emisión de luz en algunas sustancias mediante el fenómeno de excitación. -Ionizan los gases que penetran. -Se propagan en línearecta y a la velocidad de la luz (3X108m/s). -Son reflectados, difractados, polarizados y refractados. -Afectan las propiedades eléctricas de sólidos y líquidos cuando los penetran. -Impresionan películas radiográficas. -Producen efectos biológicos al generar daño y muerte celular así como mutación genética. -Se atenúan con el cuadrado de la distancia la fuente. -Pueden ser producidos con un espectro continuo. 2.1.2 Cristalización de una proteína Para poder determinar la estructura tridimensional de una proteína por cristalografía de rayos X es necesario obtener primero un cristal de la molécula en estudio. El cristal es un estado sólido, cuyos elementos constituyentes se alinean de una forma ordenada y paralela, en otras palabras simétricamente, por lo tanto, una propiedad de un cristal es ser periódico, a su vez, el cristal está formado por celdas unitarias, las cuales son la unidad fundamental dentro de un cristal. La celda unitaria se define como translaciones no coplanarias que tienen las dimensiones mínimas dentro de la red cristalina. 7 Figura 4. Cristales de lisozima (Faust et al., 2008). La cristalización de proteínas implica cuatro pasos importantes: 1. La proteína a cristalizar debe encontrarse en su forma pura. 2. La proteína debe encontrarse en un disolvente que le permita precipitar. 3. La proteína a precipitar debe encontrarse en sobresaturación. 4. Una vez formado el agregado pre nuclear se formará el cristal por la asociación de los agregados. Los cristales deben crecer mediante la reducción de la sobresaturación a un nivel más bajo, ya que a una alta sobresaturación formaría gran cantidad de núcleos generando muchos cristales pequeños (figura 5). 8 Figura 5. Diagrama de solubilidad de las proteínas. La zona de color representa las condiciones en donde la proteína estaría solubilizada. En la zona de color azul la proteína dejaría de ser soluble y aparecería como un precipitado. En la zona de color rosa se presenta una ligera sobresaturación, idónea para la nucleación y crecimiento cristalino. (http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_07_1.html, consultada por última vez el 17-09). 2.1.2.1 Método de difusión de vapor En este método la nucleación ocurre cuando la concentración de la proteína se incrementa por la reducción del volumen del disolvente donde se encuentra la muestra, esto debido al equilibrio de vapor de agua del líquido que contiene la proteína con una solución higroscópica, se coloca una gota de la muestra a alta concentración en un cubre objetos para así favorecer la cohesión molecular y formar una gota semiesférica, la gota de la proteína es mezclada por partes iguales con liquido precipitante, dentro del mismo sistema se coloca un volumen mayor de líquido precipitante que funcionará como reservorio y con el cual se equilibrará la gota que contiene la proteína a precipitar (Drenth, 2007). Dentro del método de difusión de vapor existen diferentes variantes, el más usado es el de gota colgante, en el cual la gota de la solución de proteína (1-2 µl) se coloca en el centro de un cubreobjetos de vidrio y se le añade el mismo volumen de la solución precipitante. El cubreobjetos que contiene a la gota de mezcla se le 9 da la vuelta y con él se tapa el pocillo en donde se encuentra la solución precipitante (figura 6). Figura 6. Método de difusión de vapor de gota colgante (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cristalografia.pdf consultada última vez el 12-02). Otra variante de este método es el de difusión de vapor en gota apoyada en donde la muestra de proteína se coloca en un “puente” (figura 7). Figura 7. Método de difusión de vapor en gota apoyada (http://www- structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Crystals/Theory/methods.html consultada última vez el 17-09) Por último, el método de difusión de vapor denominado tipo sándwich, en el cual la muestra proteína-precipitante se coloca en medio de dos porta objetos ligeramente separados, de esta manera se reduce significativamente la superficie expuesta por la que la gota se equilibrará con el reservorio (Drenth, 2007). 10 2.1.2.2 Método de diálisis En el método de diálisis se utiliza una membrana semipermeable la cual permitirá el paso de moléculas de bajo peso molecular generando que se alcance una cantidad de componentes exactos y adecuados dentro de la membrana para el proceso de cristalización, al igual que otros métodos de cristalización existen diversas variantes de esta técnica, para cantidades moderadas de proteína se pueden utilizar tubos o capilares de diálisis, una de las ventajas que permite el método es cambiar la solución precipitante de una forma sencilla (figura 8; Drenth,2007). Figura 8. Cristalización de proteínas por método de diálisis (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cristalografia.pdf consultada última vez el 12-02). 2.1.2.3 Método de “microbatch” El método de “microbatch” es el método más simple y antiguo para la formación de cristales, se basa en añadir a la solución que contiene a la proteína, un reactivo precipitante para que así la solución pase a un estado de supersaturación y se formen los cristales como se muestra en la figura 9 (Drenth, 2007). 11 Figura 9. Cristalización de una proteína por el método de “microbatch” (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cristalografia.pdf consultada última vez el 12-02). 2.1.2.4 Método de co-cristalización En el método de co-cristalización se construye el cristal con dos o más compuestos (generalmente la enzima en estudio y su molécula blanco o algún ligando), la formación del co-cristal puede mejorar las propiedades de la disolución y vida la larga útil del cristal; la capacidad para formar un co-cristal depende de una serie de variables como son disolventes, temperatura, presión y técnica de cristalización (Sladková et al., 2014). 2.1.2.5 Método de soaking “remojado” Esta técnica consiste en poner el cristal en estudio en contacto con una solución que contenga la molécula blanco del cristal y, posteriormente, llevar a cabo la resolución de la estructura, en algunos casos esta técnica no se puede llevar acabo debido al empaquetamiento del cristal o por los cambio conformacionales que se producen cuando la proteína dentro del cristal interacciona con la molécula blanco, entonces es necesario llevar a cabo estudios de co-cristalización (Aymamy et al., 2008). 12 2.1.3 Difracción de rayos X La cristalografía de rayos X se basa en la dispersión de los rayos X por los electrones de las moléculas que constituyen a la proteína que se está estudiando. La proteína en estudio debe de encontrarse en su forma cristalina y debe tener un tamaño de 50 micrómetros aproximadamente, los rayos X pueden ser producidos por dos fuentes de radiación, una es el ánodo rotatorio y la otra el sincrotrón; la radiación por ánodo rotatorio es menos intensa y tiene una longitud de onda fija, la cual es generada por tubos de alto voltaje, la radiación producida por medio del sincrotrón es mucho más intensa, ésta se basa en la manipulación de la dirección de un haz de electrones a una alta velocidad por medio de campos magnéticos, la ventaja del sincrotrón es que puede modular la longitud de onda de los rayos X; para el caso de la cristalografía se selecciona la radiación electromagnética con una longitud de onda de 10-10 metros o un Angstrom (Å), esta longitud también llamados rayos duros, se resuelven mejor las distancias interatómicas (Bravo, 2012). La difracción ocurre cuando los rayos X interactúan con la materia a través de los electrones que la conforman, cuando la radiación electromagnética X alcanza un electrón, éste se convierte en una fuente de radiación electromagnética secundaria dispersada, por lo que si se incideun haz de rayos X en un cristal, éste chocará con los átomos haciendo que los electrones que se encuentran en su trayectoria vibren con una frecuencia idéntica a la de la radiación incidente y actúan como fuentes secundarias de nuevos frentes de onda de rayos X con la misma longitud de onda y frecuencia. 13 Figura 10. Excitación producida por bombardeo de rayos X (http://www.scienceinschool.org/2011/issue19/ consultada última vez en 17/02/2014 a las 03:35 pm). 2.1.4 Uso de temperaturas criogénicas. Normalmente, un cristal sufre daños durante el bombardeo de rayos X a temperatura ambiente, ésto se ve reflejado con una pérdida en la resolución en el patrón de difracción, el daño será proporcional a la dosis de radiación absorbida (Garman, 2003). Los daños por radiación pueden ser clasificados de naturaleza primaria o secundaria, el daño primario es la ionización de un átomo por un fotón de rayos X el cual no puede ser evitado; el daño secundario es debido a la formación de electrones secundarios con una energía de algunas decenas de KeV, éste tipo de daño depende de la química del cristal y la difusión de especies reactivas del mismo (Garman, 2003). El daño causado por radiación de naturaleza secundaria puede ser reducido usando temperatura criogénica alrededor de los 100°K, generando una mayor resolución y mejor calidad en los datos. Esto debido a que en el uso de temperatura criogénica la mayor parte de los radicales libres producidos por la radiación incidente tienen una difusión mucho más lenta confinando así el daño, 14 incrementado la estabilidad del cristal y, como consecuencia, una mayor resolución y datos de mayor calidad. Otra ventaja que presenta la temperatura criogénica es el almacenamiento de los cristales mientras se encuentren en óptimas condiciones para futuros experimentos (Garman, 2003). El método se basa en montar el cristal en una asa de manera manual, posteriormente se utiliza un crio-protector y un amortiguador con el fin de evitar la formación de hielo en el cristal, en éste caso lo óptimo sería hacer crecer el cristal en una solución crio-protectora, los crio-protectores más utilizados son el glicerol, polietilenglicol 400, etilenglicol, 1,2 propanodiol entre otros. Posteriormente, al momento de irradiar el cristal con rayos X se añade el agente criogénico, el cual puede ser nitrógeno líquido (N2) o helio (He) (Garman, 2003) (figura 11). Figura 11. Diagrama de la Crio-cristalografía (Garman, 2003). 15 2.1.5 Colecta de datos Como se mencionó anteriormente, la difracción de los cristales se puede realizar en dos fuentes de radiación conocidas como ánodo rotatorio y sincrotrón. Durante la medición de difracción de rayos X, el cristal es montado en un goniómetro (instrumento que permite colocar a un cristal en un ángulo definido) y se rota gradualmente mientras es bombardeado con rayos X, produciendo un patrón regularmente espaciado de puntos llamado “patrón de difracción”. Un patrón de difracción completo consta de una serie de imágenes en dos dimensiones tomadas a diferentes valores de rotación del cristal utilizando un detector sensible a los rayos X. La cantidad de estas imágenes va a depender de la simetría del cristal, es decir, del grupo espacial. Una vez colectadas todas las imágenes se integran los valores de la intensidad (I) y de la desviación estándar de la intensidad (I/sigma(I)) de cada uno de los puntos de difracción en un mismo conjunto de datos de colecta (Drenth, 2007). 2.1.6 Resolución del problema de las fases La resolución de las fases es uno de los problemas principales en la determinación de una macromolécula, el problema de las fases consiste en la imposibilidad de determinar de forma directa el desfasamiento que un haz de rayos X presenta al interactuar con dos átomos equivalentes dentro de una red cristalina, los cuales se encuentran en distintos lugares del cristal; si no se determina este cambio de fase generado por la distinta trayectoria que recorre un haz de rayos X para interactuar con dos átomos equivalentes, no es posible conocer la información tridimensional sobre la posición de éste par de átomos, es por ello, que para resolver este problema se utilizan principalmente los siguientes métodos: -Remplazo molecular. -Difracción anómala múltiple. -Reemplazo isomorfo múltiple (Kleywegt, 2000). 16 2.1.6.1 Reemplazo molecular (RM) La técnica más utilizada para resolver el problema de las fases se denomina Reemplazo Molecular (RM). Esta técnica, parte de la base que las moléculas orgánicas similares tienen estructuras similares, donde puede emplearse como modelo de partida una molécula parecida y modificarla de forma que concuerden los datos experimentales (Zbigniew, 2005). El reemplazo molecular originado por Rossman (1972), actualmente se ha empleado en la mitad de los datos de estructura depositados en el Proteín Data Bank (PDB). Para poder utilizar esta técnica es necesario contar con un modelo estructural de una proteína con una secuencia de aminoácidos homóloga a la proteína de estudio, la proteína homóloga es considerada como la proteína a determinar y sirve como primer método, el cual será posteriormente afinado; el posicionamiento de la molécula conocida en la celda unitaria de la molécula desconocida requiere determinar la correcta posición y orientación, esto se calcula mediante las funciones de rotación y translación de Patterson (Zbigniew, 2005). El primer paso es la rotación, la orientación espacial de la molécula conocida y desconocida con respecto a la otra (cálculo de tres parámetros de ángulos), y el segundo paso es calcular la translación necesaria para superponer la molécula ahora orientada correctamente en la otra molécula (cálculo de tres parámetros de orientación). 2.1.6.2 Difracción anómala múltiple (MAD) Este método es utilizado cuando un cristal presenta una dispersión anómala ( la capa interna de electrones de un átomo presenta transiciones cercanas en energía a la energía de los rayos X), en otras palabras una difracción anómala ocurre cuando la energía de los rayos X es similar a la energía de la ligadura de los electrones en un nivel atómico por lo cual los electrones entran en resonancia con el campo electromagnético, oscilando en fase con el mismo, al encontrar ésta 17 componente, es posible calcular las fases del átomo anómalo y expandirlo a las fases del resto de la proteína (Campos, 2013). Se busca introducir en la celda unitaria átomos dispersores de rayos X, estos átomos no deben de modificar la estructura cristalina de la proteína nativa, deben de ser cristales isomórficos, se introducen metales u otros átomos pesados (selenio) debido a que presentan gran número de electrones con poder de dispersión mayor a los átomos de las proteínas, éstos son introducidos en las cadenas laterales de los aminoácidos, capaces de coordinar con los metales como es el caso de la cisteínas (grupos SH) (Taylor, 2010). Para los átomos que se comporten de forma anómala, su factor de dispersión se describirá mediante la siguiente formula: f = f° + f´ + f´´ Ecuación 2. Ecuación que describe el factor de dispersión donde f es el factor de forma atómica total, f’ es el componente real dela fracción anómala o termino dispersivo, f’’ es el componente imaginario o termino de absorción y f° es la componente elástica (Taylor, 2010). Se deben de utilizar tres radiaciones de distintas energías, una en la que se minimice f´ (componente real de la fracción anómala; término dispersivo), una que maximice f´´ (componente imaginario de la fracción anómala; término de absorción) y una que se encuentre lejos de ambas; para así poder analizar las diferencias entre éstas, y sea posible el cálculo de las fases que generan las dispersionesanómalas, una vez obtenidas las fases anómalas se procede a calcular la densidad electrónica de toda la proteína (Taylor, 2010). 18 2.1.6.3 Reemplazo isomórfico múltiple (MIR) La estructura cristalina puede resolverse mediante el reemplazo isomórfico múltiple, este método incorpora a la estructura cristalina metales pesados, la incorporación de estos metales a la red cristalina no deben modificar la celda unitaria, ni ninguna de las interacciones del cristal nativo, debe de tratarse de un cristal isomorfo, los factores de estructura derivados de átomos pesados (ph), de la proteína nativa (p), y átomos pesados (h) guardan la siguiente relación: Fp= Fph – Fh Relación entre los factores de estructura derivados de la proteína nativa (Fp), factores de estructura derivados delos átomos pesados (Fh) y factores de estructura derivados de la molecula derivada (Fph) (Szoke, 1997). Las magnitudes Fp y Fph se miden experimentalmente, Fh y el ángulo de las fases se obtiene a partir del modelo (Szoke, 1997), una vez conociendo la posición de los átomos pesados, se calculan los factores de estructura mediante sus módulos y fases, posteriormente se procede a calcular la densidad electrónica. Los pasos a seguir en la técnica son: -Preparar derivados de átomos del cristal de la proteína (se comparan las dimensiones entre las celdillas del cristal nativo y del derivado). -Se toman datos de difracción para cristales nativos y derivados. -Se aplica la función de Patterson para determinar las coordenadas de los átomos pesados. -Refinamiento de los parámetros de los átomos pesados y cálculo de las fases de los haces difractados de la proteína. -Cálculo de la densidad electrónica. 19 2.1.7 Construcción y afinamiento Una vez obtenidas las fases iniciales (después de resolver el problema de las faces), se procede a calcular la densidad electrónica mediante la siguiente función: Ecuacion para determinar la densidad electrónica (Drent, 2007). Esta función combina los factores de estructura experimentales (Fo), con los factores calculados (Fc), una vez calculada la densidad electrónica se procede a realizar el refinamiento que es el montaje de los átomos de ubicación desconocida, o bien de moléculas de disolvente, de modo que se explique la totalidad de la densidad electrónica. 2.1.8 Validación del modelo estructural La distribución electrónica normalmente es interpretada en términos de átomos y moléculas individuales, este modelo molecular es una interpretación del resultado primario del experimento de difracción. El modelo atómico es refinado, variando todos los parámetros del modelo, para lograr el mejor acuerdo entre las amplitudes observadas de reflexión (Fo) y los calculados a partir del modelo (Fc), esto es medido mediante el factor R, el proceso de afinamiento involucra optimización automatizada (mínimos cuadrados, algoritmos de máxima probabilidad, etc) y correcciones manuales que mejoren el mapa de densidad electrónica. El valor R mide la correlación entre los parámetros Fc (factor de estructura calculada) y Fo (factor de estructura observada), es usado para evaluar el proceso de la estructura afinada, posteriormente se utilizó el uso del cálculo Rfree (Brunger, 1992), el cual se basa en reflexiones que no contribuyen al afinamiento usando un grupo de intensidades seleccionadas al azar. Rfree es mucho más informativo y proporciona un criterio de mayor calidad que el valor R estándar, un valor de R- 20 free bajo indica un mejoramiento de las fases en el modelo atómico (Zbigniew, 2005). Se generan dos tipos de mapas durante las fases de afinamiento: Mapas de densidad electrónica “2Fo-Fc”, éstos muestran una estimación de la densidad electrónica para la estructura y mapas los de diferencia “Fo-Fc”, los cuales muestran el estimado de la diferencia entre los datos estructurales y el modelo. En general, los mapas de diferencia revelan la densidad electrónica no explicada (Wlodawer et al., 2007). Después de que el modelo ha sido afinado, todavía puede contener errores principalmente donde la región electrónica es débil, por lo cual debe verificarse el modelo estructural en: -La conectividad de la cadena principal y laterales. -Conformación estereoquímica. Una manera útil de medir la calidad de nuestro modelo en cuanto a parámetros estereoquímicos, es mediante diagramas de Ramachandran y los parámetros térmicos denominados valores B. 2.1.9 Diagrama de Ramachandran El diagrama de Ramachandran sirve para visualizar las combinaciones posibles de los ángulos dieléctricos ψ (psi, ángulo de giro entre el carbono alfa y el carbonilo), contra los ángulos ɸ (phi, ángulo de giro entre el átomo de nitrógeno y el carbono alfa) en los aminoácidos de un polipéptido. Es habitual colorear en el diagrama las zonas en las que se concentran las parejas de valores permitidos, las zonas de color más intenso son las más favorables energéticamente (figura 11), en el primer cuadrante se encuentra la conformación beta, en el segundo cuadrante la conformación alfa con giro a la izquierda y en el tercer cuadrante la conformación alfa con giro a la derecha (Drenth, 2007). 21 Figura 12. Diagrama de Ramachandran para la L-asparginasa (Wlodawer et al., 2007). 2.2 Aldehído deshidrogenasas Las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) forman una superfamilia de enzimas ubicuas que catalizan la oxidación irreversible de una gran variedad de aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos usando como coenzima NAD(P)+. Tienen una gran importancia fisiológica ya que transforman aldehídos tóxicos, de origen endógeno o exógeno, en ácidos inocuos, o bien forman compuestos de interés para la célula como el ácido retinoico, el gamma-aminobutírico (GABA) ó el osmoprotector glicina betaína (GB). La reacción global catalizada por las aldehído deshidrogenasas es la siguiente: RCHO + NAD(P)+ + H2O RCOOH + NAD(P)H + 2H + La superfamilia de las ALDHs comprende un grupo diverso de enzimas ubicuas y muy antiguas agrupadas en diversas familias (Riveros-Rosas et al., 2013). Los diferentes miembros de cada familia usan como sustrato a aldehídos similares, aunque su agrupación se ha hecho en base a sus relaciones filogenéticas. Hasta la fecha, se conocen 29 familias de ALDHs. 22 2.2.1 Mecanismo químico y cinético de las ALDHs El mecanismo cinético que se ha encontrado en las ALDHs hidrolíticas es un Bi-Bi ordenado en estado estacionario, en el que el primer sustrato en unirse a la enzima es el NAD(P)+ y el último en disociarse de la enzima es el NADP(H) (Feldman y Weiner, 1972; Rivett y Tipton, 1981; Valenzuela-Soto y Muñoz- Clares,1993; Velasco-García et al., 2000; Marchal et al., 2000). Remover un ión hidruro de un aldehído es energéticamente muy costoso debido al carácter dipolar del grupo carbonilo, por lo que la oxidación se favorece por la conversión de un carbono planar a un carbono tetrahédrico (Fersht, 1999). Por esta razón, las aldehído deshidrogenasas usan una catálisis covalente con la formación de un intermediario tetrahédrico para oxidar el aldehído a un ácido. El mecanismo químico de la reacción catalizada por las aldehído deshidrogenasas involucra tres pasos principales (Feldman y Weiner, 1972): (1) el ataque nucleofílico del azufre de la cisteína catalítica, Cys302 (numeración para ALDH2 humana) sobre el carbono carbonílico del aldehído, lo que lleva a la formación del intermediario tiohemiacetal entre el sustrato y la enzima; (2) la transferencia del hidruro desde el intermediario al anillo de piridina, produciendo un intermediario tioéster y NAD(P)H, y (3) el ataque nucleofílico de una molécula de agua sobre el tioéster (desacilación), la cual produce un segundo intermediario tetrahédrico que resultaen la liberación del producto ácido de la reacción (Figura 13). Es bien aceptado que el Glu268 (numeración para la ALDH2 humana) es la base general que activa a la molécula de agua hidrolítica (Wang y Weiner, 1995; Vedadi et al., 1995; Marchal et al., 2000). La Asn169 (numeración para la ALDH2 humana) forma parte del agujero del oxianión involucrado en la polarización del grupo carbonilo del sustrato aldehído y en la estabilización de los intermediarios de la reacción covalentemente unidos a la enzima. La Cys302, el Glu268 y la Asn169 están estrictamente conservados entre las proteínas ALDHs con actividad de deshidrogenasas. 23 Figura 13. Mecanismo de reacción de una ALDH (Muñoz-Clares et al., 2011) 2.2.2 Estructura tridimensional de las aldehído deshidrogenasas A la fecha, se conocen las estructuras tridimensionales de 66 ALDHs de diferentes organismos, las cuales se encuentran depositadas en el Protein Data Bank (PDB). Las ALDHs son enzimas que se encuentran en forma dimérica o tetramérica, con cerca de 500 residuos de aminoácidos por subunidad. Cada monómero posee tres dominios distintos: uno de unión a la coenzima, que presenta una estructura tipo α/β con un plegamiento de tipo Rossman, un dominio catalítico que une al sustrato aldehído, el cual muestra cierta semejanza estructural con respecto al primero y un dominio de oligomerización que podría considerarse como una 24 extensión del dominio de unión a la coenzima, pero que interviene en la formación del dímero (Muñoz-Clares et al., 2004) (figura 14). Figura 14. Modelo tridimensional del monómero (A), dímero (B) y tetrámero (C) de la BADH de P. aeruginosa. El monómero muestra los tres dominios característicos de todas las ALDHs (Muñoz- Clares y Velasco-García, 2004). 3.1 OBJETIVOS GENERALES Elaborar un estudio bibliográfico sobre la cristalografía de rayos X, así como de la utilización de esta técnica en las enzimas aldehído deshidrogenasas. 3.2 OBJETIVOS PARTICULARES • Realizar una investigación bibliográfica sobre los estudios cristalográficos que se han llevado a cabo en las aldehído deshidrogenasas para su caracterización y entendimiento de función. Ing. Daniel Corte Texto escrito a máquina 3. OBJETIVOS 25 • Realizar una investigación bibliográfica sobre los estudios cristalográficos que se han llevado a cabo en las aldehído deshidrogenasas para el desarrollo de nuevos fármacos. 4. JUSTIFICACIÓN La cristalografía de rayos X ha sido una herramienta fundamental para el entendimiento de la estructura y función de las proteínas, esto presupone que una dificultad que se presenta es la determinación de la estructura a nivel molecular; el uso de esta técnica nos permite conocer la estructura tridimensional, el mecanismo molecular y el comportamiento de las moléculas en diversos procesos biológicos. En el presente trabajo se realizó una investigación bibliográfica sobre los estudios cristalográficos en las ALDHs, con el propósito de evidenciar los alcances que presenta la cristalografía y la importancia de los estudios en estas enzimas, para poder generar información que sirva como herramienta de trabajo para el lector. 5. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO La recopilación de la información sobre los estudios cristalográficos realizados en las aldehído deshidrogenasas, mostrará al lector una visión general sobre la utilización e importancia de esta técnica para obtener estructuras tridimensionales, además mostrará la importancia de las ALDHs y sus estudios, así como el amplio campo de investigación que presentan. 6. METODOLOGÍA Tipo de estudio / Diseño de la investigación: Monográfica. 26 7.1 Estudios cristalográficos para la obtención de la estructura tridimensional y el entendimiento de la función en las ALDHs Como se mencionó anteriormente, la cristalografía de rayos X es una técnica que permite obtener la estructura de macromoléculas que se encuentren en forma cristalina, una de las principales aplicaciones de esta técnica es el estudio de la relación entre la estructura y función. Una la de las ALDHs cuya estructura ha sido más estudiada es la ALDH2 humana, como se mencionó anteriormente, su mecanismo de reacción está dividido en tres pasos al igual que en todas las ALDHs: uno, el ataque nucleofilico del grupo tiol de la cisteína catalítica al grupo carbonilo del sustrato aldehído; dos, la transferencia del hidruro del intermediario tetraédrico tiohemiacetal al anillo de piridina de NAD(P)+ y tres, la hidrolisis del tioéster produciendo el ácido correspondiente, la reacción catalizada por esta enzima es la siguiente: Mecanismo de reacción de una ALDH (Liu et al., 1997). La ALDH2 humana es una proteína tetramérica con subunidades que comprenden 500 aminoácidos, es importante para la eliminación oxidativa del acetaldehído (ACh), sustancias toxicas como la 4-hidroxinonenal (4HNE), acroleína y aldehídos tóxicos para el organismo, también es encargada de formar compuestos de interés para la célula. Además de actuar como deshidrogenasa puede funcionar como una esterasa o presentar una actividad desnitrificante. (Pérez-Miller y Hurley, 2003). Ing. Daniel Corte Texto escrito a máquina 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27 Las primeras estructuras cristalográficas que se obtuvieron de la ALDH2 humana fueron en complejo con NAD+ y NADH, con el propósito de entender la unión del cofactor, así como el papel que presenta el ion magnesio en la reacción, la estructura de la ALDH2 en complejo con NAD+ se resolvió a 2.6 Å utilizando el método de “remojado”, en la cual se observó que el NAD+ prefiere unirse a la enzima en una conformación extendida ideal para la transferencia del hidruro intercalándose en los residuos Cys302 y Thr244; mientras que la estructura en complejo con NADH (método “remojado”) se resolvió a 1.9 Å mostrando un cambio en la posición de la nicotinamida (NADH) para pasar a una conformación ideal para la hidrólisis, intercalándose ahora en los residuos Gly245 y Phe401 y, formando puentes de hidrógeno con los residuos Leu269 y Asn169; en ambas estructuras se observó que el Mg+ estabiliza la unión con el cofactor (NAD+ y NADH); (Pérez-Miller y Hurley, 2003). Además, la estructura reveló el sitio de unión de NAD+ el cual se encuentra al lado del bolsillo catalítico, en el lado opuesto de la Cys302 catalitica, este sitio permite tanto la conformación de hidrólisis como la de transeferencia del hidruro del cofactor (Pérez-Miller y Hurley, 2003). Figura 15. ALDH2 en complejo con NAD+ (Pérez-Miller y Hurley, 2003). 28 Los estudios cristalográficos han permitido explicar otras funciones en la ALDH2 como es el caso de la bioactivación de nitroglicerina (trinitrato de glicerilo, GTN) en los vasos sanguíneos, esta función es importante debido a que genera una vasodilatación por óxido nítrico (NO) o una especie relacionada, además GTN es utilizada para el tratamiento de angina de pecho e insuficiencia cardiaca, el uso clínico de GTN está limitada por una pérdida de eficacia después de una aplicación continua, el conocimiento del mecanismo de reacción proporciona información importante en el desarrollo de tolerancia a los nitratos y la forma en que se produce la vasodilatación. En el 2012, se publicó la estructura tridimensional de la ALDH2 en complejo con GTN a una resolución de 2.4 Å y la estructura de una triple mutante (E268Q/ C301S/ C303S), con baja actividad desnitrificante determinada a 2.2 A° de resolución, lo que permitió explicar cómo se lleva a cabo el mecanismo de reacción, los cristales obtenidos de la triple mutante eran más grandes y robustos en comparación con la de tipo silvestre. La triple mutante (E268Q/ C301S/ C303S) se inactiva de forma más lenta que la ALDH2 silvestre permitiendo obtener una mejor densidad electrónicaen el sitio activo para poder explicar la unión con una molécula de GTN. En estos estudios se observó que la estructura de la triple mutante y de la enzima silvestre son practicamente idénticas, lo cual sugiere que la actividad de la enzima mutada se ve alterada por las propiedades quimicas de los residuos mutados y no debido a modificaciones estructurales del sitio activo. Además, se demostró que la enzima convierte GTN al 1,2-GDN y nitrito el cual posteriormente es reducido a NO, de tal manera, que el sustrato se somete a un ataque nucleofílico por la Cys302 del sitio activo. Un primer átomo de oxígeno se une a la cavidad del oxianión y un segundo átomo de oxígeno se une a la cadena lateral de Glu268, de tal forma que el grupo nitrato de GTN se mantiene en posición ideal para el ataque nucleofílico de la Cys302, el cual lleva a la formacion del intermediario tionitrato que, a su vez, es atacado por dos residuos de cisteína (301 y 303) para formar un enlace disulfuro. Posteriormente, el nitrito es liberado y reducido a NO y se observa como GTN genera modificaciones covalentes en la Cys302 en las cuatro cadenas de la unidad asimétrica, lo cual se interpreta como una unión con el tionitrato, identificándolo como el principal intermediario en la desnitrificación, se puede 29 observar al residuo catalitico Cys302 en dos conformaciones, una conformación de reposo y una conformación de ataque, en la conformacion de reposo el grupo SH de Cys302 está demasiado lejos del sustrato para ser cataliticamente competente, mientras que en la conformacion de ataque está en la posicion correcta para realizar el ataque nucleofílico sobre el nitrato de GTN (figura 16); (Lang et al., 2012). Figura 16. Estructura triple mutante de la ALDH2 (E268Q/ C301S/ C303S) en complejo con GNT y NAD(H). GTN unidoal sitio activo a través de los contactos polares de la cavidad del oxianión, a los residuos Glu 268 y Cys301, y a residuos hidrófobos de la bolsa catalítica mediante interacciones de van der Waals. Estrutura del intermediario tionitrato en ALDH2 silvestre, revelando la union con la cisteina cataliticaCys-302, evidensiandolo como el primer producto intermedio de reacción) ( Lang et al, 2012). Una aldehído deshidrogenasa cuyo papel es muy importante en la adaptación de los organismos al estrés osmótico es la betaína aldehído deshidrogenasa (BADH). Esta enzima realiza la síntesis de glicina betaína (GB) a través de la siguiente reacción: Figura 17. Reacción de la síntesis de glicina betaína (Muñoz-Clares y Velasco-García, 2004). 2 30 La BADH se encuentra ampliamente distribuida en diversos organismos. La función más ampliamente conocida de la BADH es la síntesis de glicina betaína. La glicina betaína es un soluto compatible y osmoprotector que diversos procariotas y eucariotas acumulan en respuesta a un estrés osmótico externo. Este compuesto es compatible con las funciones celulares y no interfiere con el metabolismo, pero además, se ha demostrado que éste y otros osmolitos protegen a las enzimas de la salinidad, el calor, la deshidratación y el congelamiento (Muñoz-Clares y Velasco-García, 2004). En mamíferos se ha reportado que la GB, además de su función osmoprotectora fundamental en el riñón, puede servir como donador de metilos en la biosíntesis de metionina para producir S-adenosil-metionina, la cual es utilizada por las metilasas para adicionar grupos metilo al ADN, ARN, lípidos y proteínas; en el humano una alta concentración de glicina betaína estabiliza los niveles de homocisteína sanguínea disminuyendo el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Además, la BADH podría ayudar en la prevención de un estrés oxidativo letal para la célula y también parece estar involucrada en el metabolismo de las poliaminas, ya que puede utilizar como sustrato a varios de los aldehídos intermediarios en dichas vías (Muñoz-Clares y Velasco-García, 2004). En plantas, al igual que en mamíferos, la BADH participa en la síntesis de GB en el cloroplasto, presentando una función osmoprotectora ante el estrés oxidativo causado por la sequía, la salinidad, o bajas temperaturas (Díaz-Sánchez et al, 2012). En el caso de las bacterias como Pseudomonas aeruginosa que tienen la capacidad de crecer en colina o precursores de colina (acetilcolina, fosfatidilcolina o fosforilcolina) como única fuente de carbono, nitrógeno y energía, la BADH cataliza un paso intermedio del metabolismo de estos compuestos y, al mismo tiempo, provee a la bacteria, no sólo del osmoprotector glicina betaína, sino también de equivalentes de reducción para el catabolismo (NADH) y el anabolismo (NADPH); por lo cual la BADH puede ser una enzima clave en el establecimiento y crecimiento de estas bacterias (Muñoz-Clares y Velasco-García, 2004). 31 La BADH además de encargarse de la síntesis de glicina betaína a partir de colina o sus precursores, puede proveer de equivalentes de reducción para el catabolismo y el anabolismo, servir como donador de metilos para las metilasas y prever el estrés oxidativo. La BADH es capaz de oxidar a otros aldehídos que guardan cierto parecido estructural con la betaína aldehído, por ejemplo el dimetilsulfoniopropionaldehído o el γ-amino butiraldehído. (Muñoz-Clares y Velasco-Garcia, 2004). El mecanismo químico de la reacción propuesto para las BADHs es el que se describió anteriormente para las aldehído deshidrogenasas, el cual involucra tres pasos principales: 1) la formación del intermediario tiohemiacetal entre el sustrato y la enzima; 2) la transferencia del hidruro y 3) el paso de desacilación (Feldman y Weiner, 1972). . En 1998, Johansson y col., publicaron la primer estructura tridimensional de una BADH, la de hígado de bacalao en la forma apo y en complejo con NAD+, estas estructuras se resolvieron a 2.1 y 2.8 Å de resolución, respectivamente, las cuales ayudaron a identificar a la BADH dentro de la familia ALDH9. El análisis de la estructura tridimensional de la BADH de bacalao demostró que el sustrato debía de llegar al sitio activo cuyo principal residuo es una cisteína catalítica por medio de un conducto hidrofóbico, donde el carácter nucleofílico de la cisteína está inducido por el posicionamiento del anillo de nicotinamida cerca de este residuo, la estabilización de la betaína aldehído en el sitio activo está dada por los residuos Tyr167, Met170, Trp174, Val296, Thr298, Ser460 y Phe466 en una conformación de “caja aromática” que además de permitir la correcta unión y reconocer el sustrato, confiere flexibilidad al sustrato y da especificidad a la enzima (figura 18). 32 Figura 18. Modelo de unión de la betaína aldehído con Cys297 (Johansson et al., 1998). Otra betaína aldehído deshidrogenasa que ha sido ampliamente estudiada es la de P. aeruginosa. Esta bacteria gram negativa es uno de los patógenos más importantes en plantas, animales y humanos, ya que tiene la habilidad de crecer en una gran variedad de compuestos orgánicos. En humanos, provoca infecciones en personas inmunodeprimidas, en pacientes con fibrosis quística, cáncer o SIDA y en personas que han sufrido quemaduras muy severas (Bergen y Shelhamer, 1996; Govan y Deretic, 1996; Bradley, 1980; Todar, 1997). Este patógeno invade principalmente el pulmón (Reynolds y Fick, 1980; Pier, 1985), las vías urinarias y el ojo (Geddes, 1980), así como las heridas causadas por quemaduras (Pruitt, 1980). En pacientes con fibrosis quística, P. aeruginosa coloniza el tracto respiratorio. Esta bacteria tiene la capacidad de crecer en colina o precursores de colina (acetilcolina, fosfatidilcolina o fosforilcolina) como única fuente de carbono, nitrógeno y energía. Un paso obligado en el metabolismo de estos compuestos es la reacción catalizada por laBADH. La actividad de la BADH de P. aeruginosa (PaBADH) parece crucial para el crecimiento de la bacteria en las condiciones de infección (abundancia de colina o de sus precursores y estrés osmótico y oxidativo) por lo que se le ha propuesto como blanco de agentes antimicrobianos contra este importante patógeno 33 oportunista, altamente resistente a los antibióticos (Velasco-García et al., 2000, 2003; Zaldívar-Machorro et al., 2011). En el 2009, se obtuvo la estructura tridimensional de la PaBADH a una resolución de 2.1 Å de resolución en complejo con NADP+. Esta enzima igual que la BADH de hígado de bacalao pertenecen a la familia ALDH9. En la estructura de la PaBADH, se pudo observar que la cisteína catalítica, Cys286, además de la conformación “de ataque”, en la que el grupo tiol está en la posición para llevar el ataque nucleofílico sobre el sustrato aldehído y formar el intermediario tiohemiacetal, podía obtener otra conformación “de descanso”, en la cual el grupo tiol está en una posición en la que no puede llevar a cabo el ataque nucleofílico. También, se encontró que la cisteína catalítica se encontraba oxidada, como ácido sulfénico o formando un disulfuro mixto con 2-mercaptoetanol. En lo que respecta a la unión del nucleótido, no se pudo observar la región de la nicotinamida en la estructura tridimensional. Sin embargo, en la región de la adenosina, se observó que ésta estaba unida a la proteína de igual forma que se encontraba en las otras estructuras de las ALDHs. En la región del 2´fosfato del NADP+ se observó un puente salino entre el Glu179 y la Arg40, la cual mueve al carboxilato del Glu179 lejos de éste, evitando choques y/o una repulsión electrostática entre estos dos grupos. En esta estructura cristalográfica se mostraron dos sitios de unión a K+ por subunidad. Uno que se encuentra en una cavidad intrasubunidad que ya se había descrito en otras ALDHs y uno nuevo que no se había descrito anteriormente, que se encuentra localizado entre dos subunidades, por lo cual, se le denominó intersubunidad. Debido a que el K+ intersubunidad está involucrado en una red de interacciones que estabilizan al dímero, éste puede jugar un papel importante para mantener su estructura cuaternaria y su actividad (figura 19); (González-Segura et al., 2009). 34 Figura 19 . Tetrámero de PaBADH. Dominio de unión a coenzima en azul, dominio catalitico en verde, dominio de oligomerizacion en magenta e iones K + en amarillo (González-Segura et al., 2009). Otra BADH que ha sido ampliamente estudiada es la de espinaca. El estrés osmótico causado por la sequía, la salinidad y las bajas temperaturas, es la mayor limitante en la producción agrícola a nivel mundial. Ciertas plantas, como la espinaca son capaces de acumular glicina betaína, que como mencionamos anteriormente es un osmoprotector muy eficiente (Courtenay et al., 2000), se forma a partir de la betaína aldehído en una reacción catalizada por la enzima BADH. La BADH de Spinacia oleracea (SoBADH) pertenece a la familia ALDH10, las enzimas de plantas que pertenecen a esta familia poseen actividad de aminoaldehído deshidrogenasa (AMADH), ya que pueden catalizar la oxidación de ω-aminoaldehídos, como el 3-aminopropionaldehído (APAL) y el 4- aminobutiraldehído (ABAL) (Vojtěchová et al., 1997; Trossat et al, 1997; Šebela et al., 2000; Livingstone et al., 2003; Oishi y Ebina, 2005; Fujiwara et al., 2008; Bradbury et al., 2008) y de ω-trimetilaminoaldehídos, que poseen un grupo trimetilamonio (TMA), como la betaína aldehído y el 4-N, trimetilaminobutiraldehído (TMABAL) (TMABAL; Brauner et al., 2003; Fujiwara et al., 2008). 35 La estructura tridimensional de la SoBADH a 2.3 Å de resolución en complejo con NAD+ reveló la presencia de una “caja aromática” conformada por cuatro residuos aromáticos: Tyr160, Trp167, Trp285 y Trp456 en una disposición adecuada para la unión de trimetilamonio de la betaína aldehído (BAL) por medio de interacciones catión- π (figura 20). La Tyr160 y el Trp456 están estrictamente conservados en las ALDH10 de plantas, estos residuos forman un bolsillo en donde se une el grupo trimetilamonio. Este espacio está reducido en las ALDH10 con baja actividad de BADH, debido a que una isoleucina (Ile) empuja al Trp456 hacia la Tyr160. Aquellas enzimas con actividad alta de BADH en lugar de tener Ile, tienen Ala (Ala441 en la SoBADH) o cisteína, lo cual permite que haya suficiente espacio para la unión de BAL (Díaz-Sánchez et al., 2012). Figura 20. Residuos aromáticos de SoBADH involucrados en la unión con BAL (“Caja aromatica”) (Díaz-Sanchez et al., 2012). La cristalografía de rayos X ha permitido estudiar el mecanismo de reacción de las aldehído deshidrogenasas, el cual como se mencionó anteriormente, comprende de 3 pasos: 1- el ataque nucleofilico del grupo tiol de la cisteína catalítica al grupo 36 carbonilo del sustrato aldehído dando como resultado el intermediario tiohemiacetal unido covalentemente a la enzima, 2- la transferencia del hidruro del intermediario tetrahédrico tiohemiacetal al anillo de piridina de NAD(P)+ formando el intermediario tioester y 3- la hidrólisis del tioéster por el ataque nucleofilico de una agua produciendo un segundo intermediario tetraédrico y el ácido correspondiente, este paso se le conoce como desacilación. El análisis de las diferentes estructuras cristalográficas de las ALDHs que se han determinado en ausencia y presencia de NAD(P)+, NAD(H), aldehídos o de sus productos ácidos (Muñoz-Clares et al., 2011), permitió obtener información de los residuos involucrados en cada paso del mecanismo de catálisis. De estos análisis, se observó que el principal residuo catalítico, la Cys302 (numeración de la ALDH2 humana) puede adoptar dos conformaciones, una denominada “de descanso” en la cual se encuentra alejado del carbono del carbonilo del aldehído y la otra denominada “de ataque” en la cual se encuentra en la posición correcta para el ataque nucleofílico (figura 21). Figura 21. Figura del sitio activo de la ALDH mostrando las diferentes conformaciones de Cys (reposo y ataque). Se usó la PaBADH en complejo con NADP+ para la obtención de esta estructura (los numero de los residuos corresponden a PaBADH mientras que los números en paréntesis a la ALDH2); (Muñoz-Clares et al., 2011). 37 Otro residuo importante para la catálisis es el Glu268 (numeración de la ALDH2), el cual puede presentar 3 diferentes conformaciones estables: 1- en la conformación “adentro” donde el residuo Glu268 es estéricamente incompatible con el cofactor. En esta conformación, se propone que el Glu268 puede activar a la Cys302 para el ataque nucleofílico debido a que el grupo carboxilo está cerca del grupo tiol, 2- la conformación “intermedia”, la cual es estéricamente compatible con el cofactor donde se propone que es adecuada para la activación de la molécula hidrolítica, y 3- la conformación “afuera” en donde se libera el protón obtenido ya sea del residuo Cys o del agua hidrolítica a través de un mecanismo que involucra los residuos Glu476 y Lys178, esta conformación sólo la obtendrán las ALDHs que presenten estos residuos. Dentro de las ALDHs se han observado la presencia de 3 cavidades relacionadas con la catálisis, la primera de ellas es la “cavidad del oxianión” cuyas funciones son estabilizar el oxianión o el hidroxilo del intermediario tiohemiacetal durante la catálisis y participar durante la desacetilación, la segunda es la cavidad de la carboxamida en cargada de realizar la correcta unión de la nicotinamida para la transferencia del hidruro y, por último, la cavidad del carboxilo el cual dona un enlace de hidrógeno durante la conformación “interior”. Del análisis de las estructuras cristalográficas, se ha podido observar que enla etapa de desacilación se requiere de flexibilidad conformacional por parte del cofactor, ya que la unión de la nicotinamida en la conformación de transferencia del hidruro excluye el agua del sitio activo, después de la etapa de oxidación, el movimiento de la nicotinamida desde la posición de transferencia de hidruro a cualquiera de las posiciones de hidrólisis permite una entrada de una molécula de agua hidrolítica al sitio activo (figura 22). 38 Figura 22. Posiciones e interaciones de la moleculas de agua que se encuentran en direfentes ALDHs (Muñoz-Clares et al., 2011). Se han estudiado los cambios conformacionales que puede adoptar el Glu268 durante el ciclo catalítico y el papel que juega este residuo en la etapa de desacilación ya que puede interactuar con diferentes moléculas de agua en función de la conformación que adopta. Es importante mencionar que la molécula de agua que lleva acabo la hidrólisis debe estar situada correctamente respecto al carbono del carbonilo del intermediario tioéster en el que se realiza el ataque. Se ha propuesto un mecanismo de liberación de protones en las ALDHs, el cual sugiere que el Glu268 debe de encontrarse en la conformación intermedia. El glutámico en esta posición se encuentra protonado y estabilizado por un puente de hidrogeno que le dona al oxígeno carbonílico de la cadena principal de la Phe465, este carbonilo recibe el protón del Glu268 transitoriamente, convirtiéndose en un ácido imídico. El Glu268 desprotonado le quita el H+ a la molécula de agua hidrolítica y, posteriormente, el Glu268 se mueve hacia la conformación hacia afuera en donde le transfiere el H+ al Glu476. Cuando el Glu476 le cede el protón a una molécula de agua de un canal de agua, el Glu268 regresa a la conformación intermedia por efecto de la repulsión electroestática entre los dos glutámicos desprotonados. Finalmente, el Glu268 le quita el protón al enlace peptídico (figura 23); (Muñoz-Clares et al., 2011). 39 Figura 23. Mecanismo propuesto para la etapa de desacilación en ALDH’s. (I) Glu268 protonado en la conformacion intermedia es unido al hidrógeno de una molecula de agua hidrolitica y al oxígeno del carbonilo del enlace péptiddico 465-466. El protón implicado en el último enlace mueve al oxígeno del carbonilo dando la formación de un ácido imıdico, y Glu268 toma un protón del agua. (II) El ion hidróxido hace un ataque nucleófilo sobre el carbono carbonilo de la enzima unida covalentemente al intermediario tioester. Glu268 se aleja del enlace peptídico imídico a la conformación exterior. En esta conformación Glu268 interactúa con Lys167 y Glu476, a la que se transfiere el protón. (III) Se forma el producto ácido de la reacción. Un Glu268 desprotonado vuelve a la conformación intermedia donde se protona de nuevo por la forma imídico del péptido . (Muñoz-Clares et al., 2011). 7.2 Estudios cristalográficos en las ALDHs para la obtención y el entendimiento de nuevos fármacos. La cristalografía tiene muchas aplicaciones en una gran variedad de disciplinas científicas, como la mineralogía, la química, la biología molecular, la bioquímica, la farmacología, la geología, la física aplicada y la ciencia de materiales. Una de las aplicaciones es el diseño de nuevos fármacos y medicamentos basados en inhibidores y sustratos naturales de diversas proteínas y enzimas involucradas en ciclos celulares y metabólicos. El conocimiento de la estructura de la parte de la proteína, la forma y la distribución de cargas electrostáticas que une a estos compuestos, facilita el diseño de fármacos y medicamentos, gracias a la mejor comprensión de las interacciones entre la proteína y el ligando de interés; 40 esto permite concentrarse en el diseño de fármacos con las características específicas deseadas. Un ejemplo de esta aplicación son los diferentes estudios que se han realizado en la ALDH2 humana cuya función principal es la eliminación oxidativa de acetaldehído (ACh) (Pérez-Miller et al., 2003), como se mencionó anteriormete cataliza la siguiente reaccion: Reacción catalizada por la ALDH2 (Liu et al., 1997). Recientemente, se obtuvo la estructura cristalográfica de la ALDH2 en presencia de daidzina a 2.4 Å de resolución, mediante la co-cristalización para poder observar el modo de interacción de este fármaco. La daidzina es un inhibidor específico de la ALDH2 utilizado para suprimir el consumo del etanol. En la estructura tridimensional se observó que la daidzina se encontraba ligada a una cavidad hidrofóbica formada entre el dominio catalítico y dominio de unión a coenzima con una separación entre ambas de 34 y 45 Å. La estructura muestra al anillo de isoflavona en daidzina presentando interacciones de tipo Van der Waals con los residuos circundantes Cys302 y Glu268, pertenecientes al dominio catalítico, generando la inhibición de la enzima, aumentando la concentración de AcH producido durante el consumo de etanol. El AcH es responsable de la “resaca” alcohólica, por lo que el aumento de la cantidad de este, da como resultado una rápida e intensa “resaca” evitando así el consumo de alcohol, además la daidzina incrementa la concentración de 5-hidroxindol-3-acetaldehido en el metabolismo de la serotonina produciendo una disminución en el abuso del 41 alcohol (necesitad de consumir alcohol) (Keung y Vallee, 1998). La daidzina se muestra situada entre las cadenas laterales de los residuos Phe170, Trp177, Phe269 y Phe459, mientras que su grupo hidroxilo O6 forma un puente de hidrogeno al carbonilo de Asp457, no compitiendo con el cofactor NAD(P)+, evidenciando a la daidzina como un posible fármaco para el tratamiento del alcoholismo (figura 24); (Lowe et al., 2008). Figura 24. Interacciones entre ALDH2 y Daidzina (Lowe et al., 2008). Otro ejemplo de investigación sobre la ALDH2, fue la obtención de la estructura cristalográfica en complejo con Alda-1, molécula agonista con potencial farmacológico capaz de restaurar la actividad de la ALDH2 dañada, como ocurre con la variante de origen natural asiática donde un glutamato en la posición 487 es cambiado por una lisina (E487K) en el dominio de oligomerización, la variante E487K se encuentra aproximadamente en un 40% de la población asiática y 10% de la población caucásica (Pérez-Miller et al., 2010). Esta sustitución está asociada con la pérdida de la actividad fenotípica en ALDH2 generando que los individuos ALDH2*2 exhiban una oxidación deficiente de acetaldehído, los niveles 42 elevados de acetaldehído en sangre originan fuertes efectos tóxicos y da lugar al síndrome de sensibilidad al alcohol (Flushing response;) (Steinmetz ,1997); la estructura de ALDH2 en complejo con alda-1 se obtuvo a una resolución de 1.86 Å de resolución. Con ayuda de la estructura tridimensional determinada (figura 25), se observó que alda-1 se encontraba localizada entre la salida del túnel del sustrato y el sitio activo, donde su grupo benzodioxol se mantenía unido al collar aromático e hidrofóbico formado por los residuos Val120, Met124, Phe 292, Leu173, Phe296 y Phe459 exclusivamente mediante interacciones hidrofóbicas donde sólo un puente de hidrógeno se forma entre las estructuras del anillo en alda-1 y el átomo de oxígeno del carbonilo de la cadena principal Asp457, dando como resultado la restauración de los residuos 245-262 y 466 a 478 dañados en la ALDH2*2 sin actividad enzimática, produciendo una restauración en la metabolización de aldehídos tóxicos (Pérez-Miller et al., 2010). Figura 25. Modelo de activación de ALDH2*2 por alda-1 (Perez-Miller et al., 2010). La ALDH2 no es la única clase de ALDH para la cual se han realizado estudios para la obtención de fármacos, debido a que diferentes clases de ALDH participan en diversas rutas metabólicas, como es el caso de la ALHD3A1la cual es responsable de conferir resistencia a la ciclofosfamida en las células de cáncer. La estructura se obtuvo de la ALDH3A1 en conjunto con Aldi-1( 3- clorhidrato de (1- azepanilo) 1-fenil-1-propanona ); Aldi 2 (3-(dimetilamino)-1-(3-fluoro-4-metoxifenil)- 1- propanona); Aldi-3 (3- (dimetilamino) -1 - (4 - etilfenil) -1 propanona) ; y Aldi-4 (1 - (4 - clorofenil) - clorhidrato de (1 piperidinil)-1-propanona) a una resolución de 43 2.1 Å, todos estos compuestos presentaban un efecto inhibitorio sobre ALDH3A1 debido a que interactúan en una cetona aromática y dos átomos de carbono adicionales en Cys234 (figura 26), ya que la Cys234 es el principal residuo catalítico en la ALDH3A1 hace de estos compuestos potenciales fármacos contra el cáncer, cabe mencionar que en este estudio no se determinó con exactitud las interacciones que presentan estos inhibidores con el sitio activo (Khanna et al., 2011). Figura 26. Estructura de la ALDH3A1 en conjunto con Aldi1 (Khanna et al., 2011). Como se puede observar en los ejemplos presentados, la obtención de la estructura cristalográfica de una enzima en presencia de un fármaco o posible fármaco, proporciona información importante del modo de interacción entre la enzima y el fármaco, la cual es utilizada para el desarrollo de nuevos fármacos, creación de fármacos análogos, mejorar fármacos existentes o bien comprender posibles reacciones adversas. 44 8. CONCLUSIONES � El uso de la cristalografía de rayos X ha permitido obtener numerosas estructuras cristalográficas de las ALDHs en sus diferentes complejos, lo cual ha ayudado a obtener información a nivel atómico de los residuos que están involucrados en los diferentes pasos del mecanismo catalítico de estas importantes enzimas. � Una aplicación importante de la cristalografía de rayos X es el diseño de nuevos fármacos. Actualmente, se está utilizando la cristalografía de rayos X como una herramienta importante en el diseño de inhibidores específicos de las ALDHs (ALDH2 y ALDH3A1), los cuales pueden ser potenciales fármacos contra el cáncer y el alcoholismo. 45 9. BIBLIOGRAFÍA Aragón C, Miquel M, Correa M, Sanchis-Segura C (2002). Alcohol y metabolismo humano, Adicciones, 14, 23-42. Aronov A, Suresh S, Buckner F, Van Voorhis W, Verdline C , Opperdoes F, Hol W, Gelb M (1999). Structure-based design of submicromolar, Biologically active inhibitors of trypanosomatid glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase. Biochemistry, 96, 4273-4278. Authier A (2012). Optical properties of X-rays–dynamical diffraction. Acta Crystallogr. Section A., 68, 40-56. Aymamy J, Martinell M, (2008). B2D2, la integración de las técnicas biofísicas en el descubrimiento de nuevos fármacos, Biotec. Farmespaña industrial, 2-5. Bergen G, Shelhamer J (1996). Pulmonary infiltrates in the cancer patient. 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