Evaluacion-del-papel-de-especies-de-enterococcus-en-la-maduracion-de-quesos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
EVALUACIÓN DEL PAPEL DE ESPECIES DE ENTEROCOCCUS EN LA 
MADURACIÓN DE QUESOS 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
RODRIGO GABRIEL BRAVO PICHARDO 
 
DIRECTOR DE TESIS 
DRA. MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
 
 
 
 Ciudad Universitaria, CD. MX., 2017 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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II 
 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: GLORIA DIAZ RUIZ 
VOCAL: Profesor: MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
SECRETARIO: Profesor: ALEIDA MINA CETINA 
1er. SUPLENTE: Profesor: SARA MARGARITA GARZA AGUILAR 
2° SUPLENTE: Profesor: NORMA ANGELICA CASTELLANOS CHAVEZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. EDIFICIO E, LABORATORIO 
312. FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. 
SE RECONOCE EL APOYO PERCIBIDO POR EL PROYECTO DGAPA PAPIIT 
IN222717: “ESTUDIO Y APLICACIONES DE LAS PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS 
OBTENIDAS DEL METAGENOMA Y BACTERIAS DE QUESOS TRADICIONALES 
MEXICANOS”, JUNTO CON EL PROGRAMA DE APOYO A LA INVESTIGACIÓN Y EL 
POSGRADO (PAIP-FQ) CON LA CLAVE 5000-9102. EL ALUMNO AGRADECE 
TAMBIÉN LA BECA RECIBIDA POR EL SUBPROGRAMA 127 DE FORMACIÓN 
BÁSICA EN INVESTIGACIÓN, DEL DEPARTAMENTO DE SUPERACIÓN ACADÉMICA 
DE LA FACULTAD DE QUÍMICA. 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Maricarmen Quirasco Baruch 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
Myrna Elena Olvera García 
SUSTENTANTE: 
Rodrigo Gabriel Bravo Pichardo 
 
III 
 
Índice 
1. RESUMEN…………………………………………………….………… .….………...…1 
2. INTRODUCCIÓN…………………………………….………………….….………….....3 
3. MARCO TEÓRICO…………………………………….……………………..…….........5 
3.1 Bacterias Ácido Lácticas (BAL)……………………………………..………...5 
3.2 Enterococos……………………………………………………………………..5 
3.3 Identificación por secuenciación del gen ARNr 16S…………………….….6 
3.4 Identificación mediante análisis de las ITS………………………………......7 
3.5. Importancia de los enterococos en alimentos…………………………..…..8 
3.5.1 Quesos……………………………………………………........…..…9 
3.5.2 Carnes………………………………………………...……….……...9 
3.5.3 Vegetales…………………………………………………………....10 
3.6 Actividades relevantes de los enterococos en alimentos………….….…..10 
3.6.1 Formación de ácido láctico………………………………....…......11 
3.6.2 Formación de aromas y sabores………………………….……....12 
3.6.3 Formación de aromas, sabores y textura…………………..........13 
3.7 Producción de compuestos con actividad antibacteriana…………….......14 
3.7.1 Bacteriocinas………………………………………...……..15 
3.7.2 Peptidoglucano Hidrolasas (PGH´s)…………..……..…..16 
4. ANTECEDENTES DEL GRUPO DE TRABAJO………………………….…….…....17 
4.1 Generalidades Queso Cotija……………………………………….…….......17 
4.2 Análisis metagenómico del queso Cotija……………………………….…...18 
4.3 Identificación y caracterización de cepas de Enterococcus 
aisladas de Queso Cotija…………………………………………...……………..19 
4.4 Identificación y caracterización enzimática de microorganismos 
aislados de queso Cotija y sus materias primas……………………………..…19 
4.5 Producción de peptidoglucano hidrolasas por 
Enterococcus del queso Cotija…………………………………………………....20 
5. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………..……………..21 
6. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………….21 
7. OBJETIVOS…….……………………………………………………………………..….22 
IV 
 
8. METODOLOGÍA…………………………………………………………………………23 
8.1 Descripción de las muestras………………………………………..………..23 
8.2 Reactivación y caracterización fenotípica y bioquímica………….…….....24 
8.3 Cinéticas de crecimiento…………………………………………..……........24 
8.4 Identificación molecular……………………………………….….……..........25 
8.4.1 Extracción de ADN…………………………….……….….............25 
8.4.2 Amplificación del gen ribosomal 16S y secuenciación….…...…26 
8.4.3 Amplificación y perfil de bandeo de las ITS……….….…........…27 
8.5 Detección de actividades enzimáticas…………………………...…..……..29 
8.6 Detección de productos con actividad antibacteriana………..……………30 
8.6.1 Difusión en agar………………………………..……,…….............30 
8.6.2 Cuantificación de proteína…………………..…………..…...........31 
8.6.2.1 Método de Bradford…………..………………...………..31 
8.6.3 Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones 
 desnaturalizantes (SDS-PAGE) y zimografía……..…………….31 
9.RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………….….………..34 
9.1 Caracterización fenotípica y bioquímica……………………….…….……..34 
9.2 Identificación molecular………………………………………..………….…..35 
9.3 Detección de actividades enzimáticas………………………..……….…….47 
9.3.1 Actividad proteolítica……………………….……………….………49 
9.3.2 Actividad lipolítica……………………….………………………..…51 
9.3.2.1 Esterasas…………………….…………………………....51 
9.3.2.1 Lipasas…………………….………………………………52 
9.4 Cinéticas de crecimiento…………………….……………………………..…55 
9.5 Evaluación de productos con actividad antibacteriana…….……………...57 
9.5.1 Pruebas preliminares de difusión en agar…………....................57 
9.5.2 SDS-PAGE y zimografía………….……………………,……..…...63 
9.6 Análisis final………………………………………………….………………...69 
10. CONCLUSIONES………………………………………………….……………….…..71 
11. PERSPECTIVAS………………………………………………….……………………71 
12. REFERENCIAS………………………………………………….……………………..72 
13. ANEXOS……………………………………………………….………………………..79
1 
 
1.- Resumen 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son importantes en los alimentos fermentados ya 
que pueden influir de manera positiva sobre diversas características como el aroma, 
sabor, color, textura, valor nutricional e inocuidad del alimento. Una de sus 
principales funciones en los alimentos como leche, carne, cereales y vegetales es 
la de ser microorganismos fermentadores y así lograr obtener productos como 
yogurt, queso, embutidos, encurtidos y vino, por mencionar algunos (Parra, 2010; 
Ramírez et al., 2011). Los enterococos forman parte de este grupo de bacterias, la 
influencia positiva que los enterococos ofrecen a los alimentos radica en las 
actividades bioquímicas que presentan, tal es el caso de las actividades proteolítica 
y lipolítica, lo que origina la producción de compuestos característicos de un 
producto fermentado, pues se sabe que ambas actividades son las responsables de 
generar el sabor y aroma en los alimentos. Además, es sabido que los enterococos 
son capaces de producir compuestos con actividad antibacteriana (PGHs y/o 
enterocinas) lo que demuestra su relevancia en la inocuidad microbiológica de los 
alimentos, específicamente durante el proceso de maduración de quesos (Giraffa, 
2014). El objetivo de este trabajo consistió en identificar a nivel especie 14 cepas 
de enterococos previamente aisladas, caracterizarlas fenotípicamente y 
bioquímicamente, así como analizar su capacidad de producir diversas actividades 
enzimáticas relevantes en la maduración de quesos. 
Se trabajó con 13 cepas de Enterococcus spp. provenientes de diversos quesos, 
las cuales se caracterizaron fenotípica y bioquímicamente. Se observó que todas 
las cepas eran cocos Gram-positivos y catalasa negativos. Mediante la 
secuenciación y amplificación del ARNr 16S se intentó identificarlas a nivel especie, 
pero se obtuvo un resultado no concluyente pues la metodología no discriminaba 
entre las especies faecium, durans e hirae ya que éstas pertenecen al grupo 
denominado E. faecium, donde las especies que lo conforman presentan una 
similitud de hasta un 98.8% en dicho gen, por lo tanto se optó por realizar la 
amplificación y secuenciaciónde espaciadores transcritos internos (Tyrell et al., 
2 
 
1997) donde a partir del perfil de bandeo se identificaron 5 cepas como E. faecium, 
5 como E. durans y 3 como E. hirae. 
Utilizando agar leche descremada, agar tributirina y agar aceite de oliva se evaluó 
cualitativamente la actividad proteolítica, esterolítica y lipolítica respectivamente. 
Todas las cepas presentaron actividad proteolítica y esterolítica, pero en menor 
intensidad comparadas con el control positivo usado (K. marina), ninguna cepa 
presentó actividad lipolítica. A través de pruebas de difusión en agar, zimografía y 
SDS-PAGE, se evaluó la producción de compuestos con actividad antibacteriana. 
Por difusión en agar se obtuvo que 7 cepas (4 E. faecium, 1 E. durans y 1 E. hirae) 
presentaron halos de inhibición contra S. aureus, 4 cepas (3 E. faecium y 1 E. hirae) 
contra Salmonella enterica, ninguna presentó actividad contra L. monocytogenes. A 
través de zimografía 9 cepas (3 E. faecium, 4 E. durans y 2 E. hirae) presentaron 
bandas de inhibición con un peso aproximado de 30 y 55 kDa contra S. aureus, 10 
cepas (4 E. faecium, 4 E. durans y 2 E. hirae) contra Salmonella enterica, ninguna 
presentó bandas contra L. monocytogenes. Por lo tanto, las 13 cepas aisladas de 
queso Cotija pertenecen a las especies E. faecium (5), E. durans (5) y E. hirae (3), 
presentaron actividad proteolítica, esterolítica y la mayoría demostró producir 
compuestos con actividad antibacteriana frente a dos bacterias, por lo que éstas 
tienen el potencial de desempeñar un papel importante durante la maduración del 
queso porque presentan actividades enzimáticas necesarias para la producción de 
aromas, sabores y puede contribuir a la inocuidad del producto durante la 
maduración del queso Cotija. 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
2.- Introducción 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son microorganismos que tienen diversas 
aplicaciones, una de las más importantes es durante la fermentación de diversos 
alimentos tal como lácteos, cárnicos, vegetales, también en vinos y en algunas 
cervezas (Ramírez, 2011); Durante la fermentación son capaces de acidificar el 
alimento, inhibir microorganismos patógenos, reducir el contenido de lactosa en 
productos lácteos, producir aromas y sabores característicos a cada alimento, 
producir CO2 y también ser usados como probióticos. Este grupo de bacterias se 
relaciona entre sí porque producen ácido láctico como principal o único metabolito 
durante la fermentación. Dentro de este grupo de bacterias se encuentran los 
enterococos que son bacterias que pueden encontrarse en diversos nichos como el 
suelo, agua y plantas, son comensales dentro del tracto gastrointestinal (GI) de 
animales, humanos e insectos, su amplia distribución se debe a diferentes 
características que presentan tales como su capacidad de crecer en amplios rangos 
de pH, tolerancia al calor así como resistencia a condiciones hipotónicas e 
hipertónicas, debido a esto son capaces de colonizar el ambiente donde se 
desarrollan (Parra, 2010). Los enterococos son importantes en el ambiente, en los 
alimentos y en la microbiología clínica. Son importantes en la producción de varios 
alimentos fermentados tales como quesos o salchichas donde son necesarios para 
la obtención de las características sensoriales de cada producto (Giraffa et al., 
1997). En los alimentos, en especial la carne (res, cerdo) E. faecalis ha demostrado 
ser la especie predominante seguido de E. faecium y no están solamente asociados 
a carne cruda, también con alimentos procesados ya que, en algunos productos, 
donde la cocción es necesaria, los enterococos presentan una ventaja selectiva 
entre otras especies de BAL, pues son termo tolerantes. Del mismo modo en los 
quesos las dos especies ya mencionadas son las más frecuentemente aisladas de 
diferentes quesos seguidas por la especie E. hirae que también ha sido aislada de 
diversos quesos del mediterráneo europeo donde llevan a cabo el proceso de 
maduración (Franz et al., 1999). Respecto a su papel en la inocuidad microbiológica 
de alimentos son de mucha importancia debido a que varias especies de 
enterococos son capaces de producir compuestos con actividad antibacteriana 
4 
 
como: bacteriocinas (enterocinas) y peptidoglucano hidrolasas (PGHs) las cuales 
presentan actividad lítica contra patógenos como Staphylococcus aureus, Listeria 
monocytogenes, Salmonella spp. entre otros (Franz et al., 2007; García-Cano et al., 
2014). 
Por otro lado, existen alrededor de 37 especies reconocidas de Enterococcus. Se 
han establecido las relaciones filogenéticas entre las especies de este género, 
obteniendo así 7 grandes grupos. Para tener una identificación correcta entre cada 
una de las especies de estos grupos es necesaria la combinación de información 
fenotípica, genotípica y filogenética (Franz et al., 2003). 
De acuerdo al análisis y secuenciación de la subunidad 16S del ARNr (Giraffa, 
2014), dichas especies se han dividido de la siguiente forma: 
Grupo E. faecium: E. faecium, E. durans, E. hirae, E. mundtii, E. villorum, E. canis 
Grupo E. avium: E. avium, E. malodoratus, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. gilvus 
Grupo E. gallinarum: E. gallinarum E. casseliflavus, E. flavescens 
Grupo E. dispar: E. asini, E. dispar, E. pallens, E. hermanniensis, E. canintestini 
 
Grupo E. saccharolyticus: E. saccharolyticus, E. sulfureus, E. saccharominimus 
(E. italicus), E. aquimarinus 
 
Grupo E. cecorum: E. cecorum, E. columbae 
 
Grupo E. faecalis: E. faecalis, E. haemoperoxidus, E. moraviensis, E. ratti 
E. faecium y E. faecalis son las especies que tienen una mayor participación en la 
fermentación de alimentos y como probióticos, ya que son los que más comúnmente 
se encuentran en alimentos fermentados (Franz et al., 1999). 
Por otro lado, ciertas cepas de este género pueden causar enfermedades ya que 
son patógenos oportunistas en enfermedades nosocomiales, como endocarditis, 
bacteremia e infecciones del tracto urinario y se les ha dado una importancia debido 
a que presentan resistencia intrínseca a ciertos antibióticos, así como su habilidad 
de transferir material genético. Los enterococos son bacterias que presentan un 
5 
 
elevado potencial biotecnológico, ya que por un lado pueden usarse como 
probióticos o como cultivos iniciadores; sin embargo, son capaces de transferir 
genes de resistencia a antibióticos lo que puede ocasionar problemas en ambientes 
hospitalarios (Franz et al., 1999). 
 
3. Marco teórico 
3.1 Bacterias Ácido Lácticas (BAL) 
 Las BAL constituyen un grupo de bacterias Gram-positivas relacionadas entre sí 
debido a sus características metabólicas y fisiológicas. Son cocos o bacilos no 
esporulados, aerotolerantes o microaerofílicos, carecen de la enzima catalasa, en 
presencia de hexosas utilizan la vía Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis), 
obteniendo como producto mayoritario principal ácido L (+) láctico, son clasificadas 
como homofermentativas cuando el único producto final de la fermentación es el 
ácido láctico y como heterofermentativas cuando producen CO2 y otros metabolitos 
como etanol. De acuerdo a su clasificación taxonómica pertenecen al filum 
Firmicutes y algunos de los diferentes géneros que incluye son: Aerococcus, 
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococccus, 
Lactococccus y Streptococcus (Lahtinen, et al., 2012). Las BAL están ampliamente 
distribuidas en la naturaleza y han sido aisladas de diversos lugares como plantas, 
suelo y alimentos. Se relacionan con los alimentos, en específico con la 
fermentación de estos y algunas cepas son consideradas como microorganismos 
benéficos para la salud (probióticos). Pueden presentar acción conservadora 
principalmente por la producción de ácidos orgánicos, la forma no disociada del 
ácido láctico puede penetrar la pared celular microbiana donde el pH más alto del 
contenido celular promueve ladisociación, dando lugar a la liberación de iones 
hidrógeno y el anión correspondiente, de modo que ambos iones interfieren en el 
metabolismo e inhiben el crecimiento celular (Ramírez et al., 2011). 
3.2 Enterococos 
6 
 
Los enterococos son bacterias Gram-positivas, de morfología esférica u ovoide que 
pueden presentarse solos, en pares o cadenas, son no esporulados, anaerobios 
facultativos, homofermentativos durante la fermentación de hexosas y 
heterofermentativos frente a pentosas, debido a su metabolismo se clasifican como 
BAL (Lahtinen et al., 2012). Tienen una temperatura óptima de crecimiento de 35 
⁰C, pero pueden crecer en un rango entre 10 a 45⁰C, son termo-tolerantes ya que 
pueden resistir hasta 60 ⁰C durante 30 minutos (Giraffa, 2014). Pueden crecer en 
medios que contienen 6.5% de NaCl, hidrolizan la esculina en presencia de 40% de 
sales biliares y son catalasa negativos. La influencia positiva que los enterococos 
ofrecen a los alimentos radica en las actividades enzimáticas que presentan, tal es 
el caso de las actividades proteolítica y lipolítica, por la producción de compuestos 
de aroma y sabor derivados de dichas actividades (Giraffa, 2014). Los enterococos 
pueden presentar actividad proteolítica y lipolítica, aunque presentan menores 
actividades en comparación con otras BAL, pero en cuanto a la actividad esterolítica 
entre las BAL, es el género que presenta la mayor actividad (Giraffa, 2003). 
Por otra parte, los enterococos obtenidos de aislados clínicos han mostrado la 
presencia de diversos factores de virulencia (citolisina-hemolisina, adherencia de 
proteínas), de forma contraria aquellas cepas aisladas de alimentos o usadas como 
cultivos iniciadores, no presentan dichos factores. Una característica que convierte 
a los enterococos en un tema controversial en cuanto a su presencia y uso en 
alimentos son los reportes que existen sobre la resistencia intrínseca que presentan 
frente diferentes compuestos antimicrobianos como cefalosporina, lincosamidas, β-
lactamicos y algunos aminoglucósidos. Solamente en aislados de diversos quesos 
europeos, se ha identificado a E. faecium y E. faecalis resistentes a penicilina, 
tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, por mencionar algunos (Teuber 
et al., 1999). 
3.3 Identificación por secuenciación del gen ribosomal (ARNr) 16S 
El ARNr 16S es de aproximadamente 1500 pb y es la región de ADN más 
ampliamente utilizada para estudios filogenéticos y taxonómicos, su aplicación 
como identificador molecular fue propuesta por Carl Woese en 1970 (Rodicio y 
7 
 
Mendoza, 2004). Existen muchas características relevantes del ribosoma que lo 
vuelven ideal como herramienta filogenética y taxonómica entre las que destacan: 
1) su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy 
prologando, de modo que las alteraciones en su secuencia reflejan probablemente 
cambios aleatorios, dichos cambios han ocurrido de manera suficientemente lenta; 
2) el tamaño relativamente largo del ARNr 16S minimiza fluctuaciones estadísticas; 
3) debido a la facilidad de secuenciar dicho gen existen bases de datos muy amplias 
que están en continuo crecimiento y, 4) como este gen se encuentra presente en 
todas las bacterias, se convierte en un gen diana útil para su identificación. El 
método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 
16S incluye tres estapas: a) amplificación del gen a partir de la muestra apropiada; 
b) determinación de la secuencia de nucleótidos del amplicón y c) análisis y 
comparación de la secuencia (Rodicio y Mendoza, 2004). 
a) Amplificación: Una vez extraído el ADN de la muestra, se debe de realizar 
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), las 
regiones conservadas del 16S facilitan el diseño de oligonucleótidos 
iniciadores (cebadores) diseñados con base en secuencias conservadas 
próximas a los extremos 5´y 3´ del gen. 
b) Secuenciación del amplicón (Método Sanger): En esta etapa se llevan a cabo 
las reacciones de secuenciación y el análisis de los productos por 
electroforesis, un método muy usado es el método de Sanger, el cual se basa 
en la polimerización del ADN y el uso de dideoxinucleótidos (nucleótidos que 
en su carbono 3´ no contienen el grupo -OH) que sirven como terminadores 
de la reacción los cuales están marcados con moléculas fluorescentes y el 
resultado de la reacción se resuelve mediante electroforesis capilar. 
c) Análisis de la secuencia: Esta última etapa es la comparación de la secuencia 
del RNAr 16S con las depositadas en bases de datos como GenBank NCBI 
(National Center for Biotechnology Informtion), RDP (Ribosomal Database 
Project) por mencionar algunas. 
3.4 Identificación mediante análisis de los ITS 
8 
 
El análisis del RNAr 16S ha sido la mejor herramienta para la discriminación 
taxonómica en la actualidad, pero estas secuencias altamente conservadas muchas 
veces no pueden brindar suficiente variabilidad para discriminar entre especies, esto 
debido a que pueden existir similitudes de hasta 98% de dicho gen (Devriese et al., 
2002). 
En procariontes, el gen ARNr está codificado como un operón cuyo orden es 16S-
23S-5S, los genes están separados por regiones espaciadoras y se co-transcriben 
en un solo RNA policistrónico que es procesado para originar el RNA maduro. 
Muchos estudios han revelado que los espaciadores transcritos internos (ITS, por 
sus siglas en inglés) entre el 16S-23S presentan variabilidad entre especies del 
mismo género o cepas de la misma especie, ya que no están bajo la misma presión 
selectiva a la cual está sometido el gen 16S (debido a su función vital) y por lo tanto 
presentan variabilidad. La metodología en general, es parecida a la del análisis del 
gen 16S, consiste en: a) amplificación de las ITS, b) electroforesis de los amplicones 
y c) análisis del patrón de bandeo; pero se diferencia en los cebadores utilizados, 
pues se utilizan los correspondientes para amplificar los ITS deseadas. Después se 
realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% para una correcta resolución 
de bandas y al final se comparan las bandas obtenidas con algún patrón de 
referencia (Tyrell et al., 1997; Nguimbi et al., 2003). 
3.5 Importancia de los enterococos en alimentos 
Los enterococos son parte común de la microbiota de los alimentos, por su 
capacidad de colonizar diversos ambientes una vez fuera de su hábitat en el tracto 
GI, por lo que pueden estar presentes tanto en alimentos crudos como procesados. 
Es sabido que la presencia de enterococos en leche es indicador de un tratamiento 
térmico deficiente, pero muchos autores indican que ciertas cepas de enterococos 
en diferentes quesos son los responsables de la producción de aromas y sabores 
característicos durante la maduración y que por lo tanto la presencia de estas 
bacterias en la leche, para la producción de quesos es importante (Giraffa, 2002). 
Especialmente en quesos artesanales, elaborados con leche cruda (bronca) o 
pasteurizada, donde al final de la maduración de quesos se pueden encontrar en 
9 
 
concentraciones de 105-107 UFC/g. Las especies que más frecuentemente han sido 
aisladas de quesos son faecium y faecalis (Giraffa, 2014). Otro ejemplo de su amplia 
distribución es su presencia en diversos embutidos cárnicos de diversos países 
como Italia y Alemania, ya que de manera general dichos alimentos después de un 
periodo de fermentación se someten a un proceso de salado o ahumado, los 
enterococos resisten este tipo de procesos y son parte de la microbiota del producto 
terminado. También se tiene registro de su presencia en vegetales fermentados, 
pero no es muy clara su participación en dichos alimentos, pues no está definido si 
se encuentran desde la materia prima o son resultado de contaminación posterior 
por el ambiente (Franz et al., 1999; Giraffa, 2002). 
3.5.1 QuesosLos enterococos están presentes en diversos quesos como bacterias ácido lácticas 
no iniciadoras (NSLAB, por sus siglas en inglés), se encuentran en quesos 
elaborados con leche cruda de vaca, búfala, cabra entre otras, aunque debido a su 
capacidad de soportar temperaturas de pasteurización (60 ⁰C/ 30 min), se pueden 
encontrar en quesos elaborados con leche pasteurizada. Están involucrados en el 
proceso de maduración de los siguientes quesos: Manchego, Armada, Cebreiro, 
Picante, Feta, Serra, Fontina, Venaco, Majoero y Comté, por mencionar algunos. 
Diversos estudios han demostrado que estas bacterias afectan positivamente en el 
sabor, aroma y estructura de los quesos, ya que en quesos producidos con 
enterococos se ha observado aumento en diversos compuestos que influyen en 
estas características, como: amino ácidos libres totales, ácidos grasos libres de 
cadena corta y larga, concentración de acetoína y diacetilo (Giraffa, 2003; Giraffa, 
2014). 
3.5.2 Carnes 
Normalmente se asocia la presencia de enterococos con contaminación durante el 
sacrificio y procesamiento de la carne, pero también tienen una importancia ya que 
su función, es la de llevar a cabo un proceso de fermentación láctica y se han aislado 
de diferentes embutidos fermentados como chorizo, fuet y espetec los tres 
producidos en España. En chorizo mexicano se han aislado cepas de E. faecium 
10 
 
donde se ha demostrado su capacidad de producir bacteriocinas con actividad 
contra L. monocytogenes (Alvarez-Cisneros et al., 2016). En cárnicos fermentados, 
como el salami y el “landäger”, que es otro tipo de embutido producido en diversas 
regiones de Europa, se han aislado entre 102 hasta 105 UFC/g. Debido a su 
tolerancia al NaCl y nitritos, los enterococos no solo pueden sobrevivir, sino también 
multiplicarse en estos alimentos (Franz et al., 1999). 
3.5.3 Vegetales 
Los enterococos se encuentran en una amplia variedad de vegetales fermentados, 
aunque no es claro su origen. Se han aislado de fermentaciones de aceitunas 
comúnmente durante el proceso fermentativo de la aceituna, donde se ha sugerido 
que su presencia durante las primeras etapas de la fermentación ayuda a 
incrementar la inocuidad del producto final, los enterococos son capaces de resistir 
el tratamiento alcalino inicial que se le da a las aceitunas para hidrolizar la 
oleuropeína (De Castro et al., 2002); se han aislado de alimentos a base de sorgo, 
como el Hussuwa que es típico de Sudán, en dicho alimento los enterococos llevan 
a cabo el proceso de degradación de azúcares que no pueden ser digeridos por 
humanos, como rafinosa y estaquiosa. La presencia de éstas bacterias es 
importante para iniciar el proceso fermentativo pues disminuyen el pH durante la 
producción de ácido láctico y también contribuyen al mantenimiento del color de los 
vegetales (Franz et al., 1999). 
 
3.6 Actividades relevantes de los enterococos en alimentos 
Durante la maduración de quesos, la formación de aromas y sabores es un proceso 
lento, e involucra diversos cambios químicos y bioquímicos, se han identificado 
principalmente tres rutas metabólicas relacionadas con este proceso, glucólisis, 
lipólisis y proteólisis. En la glucólisis la principal conversión que se lleva a cabo es 
la fermentación de la lactosa en ácido láctico, pero durante ésta, una fracción del 
piruvato puede ser transformado en diversos compuestos como diacetilo, acetoína 
o acetaldehído los cuales son moléculas con sabores lácteos. La lipólisis tiene por 
11 
 
objetivo formar ácidos grasos libres que pueden ser precursores de metilcetonas, 
alcoholes secundarios, esteres y lactonas los cuales también brindan aromas y 
sabores, dentro de esta actividad las esterasas han sido relacionadas no sólo al 
aroma y sabor sino también a la textura del queso, ya que llegan a formar (como 
producto secundario de la lipólisis) glicéridos los cuales actúan como compuestos 
tensoactivos que influyen en la textura del queso. La degradación de caseína 
durante la maduración es otro aspecto importante, debido a las proteinasas y 
peptidasas de los enterococos logran formar péptidos más pequeños y amino ácidos 
libres los cuales son convertidos en alcoholes, aldehídos, ácidos, esteres y 
compuestos azufrados, la combinación de estos compuestos es lo que brinda el 
sabor y aroma característico de cada queso. De igual forma la agregación de las 
caseínas debido a esta actividad es un factor importante para la textura este 
alimento (Franz et al., 1997). Generalmente los enterococos muestran una baja 
actividad proteolítica, la actividad lipolítica es muy variada dentro de este género 
pues es dependiente de cada especie y cepa, solamente E. faecalis ha demostrado 
alta capacidad lipolítica (Giraffa, 2003), mientras que presentan una actividad mayor 
en comparación con otras BAL. E. faecium es el que presenta la mayor actividad 
esterasa de este género (Giraffa, 2003). 
3.6.1 Producción de ácido láctico 
La ruta metabólica implicada en la formación del ácido láctico en alimentos es la 
glucólisis. Es la oxidación de la glucosa para formar ácido pirúvico, también se 
conoce como vía Embden-Meyerhof, las enzimas participantes catalizan la escisión 
de la glucosa que sufre el proceso de oxidación y otro de reordenamiento, para 
formar dos moléculas de ácido pirúvico, dando como resultado una producción neta 
de dos moléculas de ATP por fosforilación a nivel sustrato (Tortora et al., 2007). 
Ésta puede realizarse en presencia o ausencia de oxígeno, en ausencia de oxígeno 
esta ruta puede tomar dos caminos, la fermentación alcohólica o láctica, como se 
observa en la Figura 1. En el primero se forma una molécula de ácido láctico, una 
de etanol y una de CO2 (fermentación heteroláctica) mientras que en el otro se 
forman dos moléculas de ácido láctico (fermentación homolática), esto se encuentra 
12 
 
definido por el tipo de microorganismo que lleva a cabo la fermentación, el sustrato 
con el que cuenta el microorganismo y las enzimas que se encuentren presentes en 
el medio o en el microorganismo (Tortora et al., 2007). 
 
Figura 1. Esquema general de la glucólisis en ausencia de oxígeno (Moddificado de: Voet et al., 
2006) 
3.6.2 Lipasas y producción de aromas y sabores 
Los lípidos desempeñan un papel importante pues contribuyen en diversos factores 
como: a) ser la fuente de ácidos grasos libres de cadena corta y cadena larga, los 
cuales son transformados por la microbiota presente en un alimento para producir 
distintos compuestos que dan aroma y sabor, b) debido a la oxidación de estos 
ácidos grasos libres puede haber formación de aldehídos insaturados que se 
asocian a sabores fuertes o penetrantes c) convertirse en solventes para los 
distintos compuestos hidrofóbicos de sabor. La lipólisis, como se observa en la 
Figura 2, es la ruptura del enlace éster entre el grupo glicerol y una cadena de ácido 
graso, las enzimas lipolíticas se dividen en dos grupos, esterasas y lipasas las 
cuales son carboxilhidrolasas pero pueden diferenciarse por el sustrato sobre el cual 
actúan; las esterasas solo hidrolizan enlaces éster en soluciones acuosas y actúan 
sobre triacilglicéridos formados por ácidos grasos de cadena corta (C≤10). Por otro 
lado las lipasas pueden catalizar la hidrólisis de enlaces éster para liberar ácidos 
grasos libres y glicerol actuando en la interfase aceite/agua (O/W por sus siglas en 
inglés) de una emulsión, por lo que su actividad radica sobre sustratos insolubles 
13 
 
en agua y sobre triacilglicéridos de 1cadena larga (C>10). Ambas enzimas llevan a 
cabo la reacción de hidrólisis. (Holland, 2005) 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Mecanismo de acción de enzimas lipolíticas. 
3.6.3 Proteasas y modificación de atributos sensoriales 
La degradación de la caseína juega el papel más importante en cuanto a la textura 
del queso, mientras que la degradación de amino ácidos tiene como resultadola 
formación de componentes que otorgan sabor, también algunos péptidos pueden 
dar origen a estos componentes, pero en menor cantidad. La degradación 
enzimática de la caseína (en la producción de queso) está a cargo de la renina 
mientras que las proteinasas y peptidasas de las BAL degradan los polipéptidos en 
péptidos y aminoácidos libres (Smit et al., 2005). La actividad proteolítica de las BAL 
puede dividirse en tres grandes componentes, el primero lo forman distintas 
proteinasas que pueden estar integradas a la membrana o pueden ser excretadas 
y que tienen la función de formar péptidos más pequeños para que puedan ser 
introducidos a la célula, después están los transportadores peptídicos, estos son los 
encargados de dirigir a los péptidos o aminoácidos al interior de la célula y por último 
peptidasas intracelulares, las que se encargan de degradar por completo el péptido 
hasta aminoácidos, en la Figura 3 se puede observar dicho mecanismo descrito 
(Smit et al., 2005). 
= sitio de corte 
14 
 
Proteinasas es el nombre genérico que se le da al grupo de enzimas que son 
capaces de hidrolizar el enlace peptídico de las proteínas y degradarla en péptidos 
más pequeños, estas enzimas se clasifican de acuerdo a su mecanismo de acción, 
por lo que se dividen en: endopeptidasas que hidrolizan uniones peptídicas en el 
interior de las cadenas proteínicas y exopeptidasas que hidrolizan uniones 
peptídicas terminales, a su vez estas se dividen en dos: amino peptidasas las cuales 
hidrolizan desde el extremo amino terminal y carboxipeptidasas hidrolizan a partir 
del extremo carboxilo terminal (Cremonesi, 2002). 
Figura 3. Mecanismo general de sistema proteolítico de las BAL (Modificado de: Van Kranenburg et 
al., 2002). 
3.7 Producción de compuestos con actividad antibacteriana 
Numerosas cepas de enterococos asociadas a sistemas alimenticios, 
principalmente E. faecalis y E. faecium son capaces de producir una variedad de 
bacteriocinas denominadas enterocinas, las enterocinas producidas por estas 
especies comúnmente se clasifican como de clase II, con actividad contra L. 
monocytogenes, S. aureus, Clostridium spp. (Giraffa, 2003). Diferentes cepas de 
enterococos aisladas del queso Cotija han mostrado tener un efecto antibacteriano 
debido a la producción de PGHs con actividad contra patógenos Gram-positivos y 
15 
 
Gram-negativos como S. aureus y S. enterica (Olvera-García et al., 2015). La 
producción de bacteriocinas y PGHs ocurre de forma natural durante la fase 
logarítmica del desarrollo bacteriano o al final de la misma, guardando una relación 
directa con la biomasa producida (Beristain-Bauza et al., 2012). 
3.7.1 Bacteriocinas 
Las bacteriocinas son péptidos antibacterianos los cuales son metabolitos primarios 
producto de la síntesis ribosómica, conformados por péptidos entre 20 y 60 
aminoácidos. Son secretados de la célula y presentan una alta actividad bactericida. 
La mayoría de las bacteriocinas se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro, 
tioéter o grupos tiol libres, entre sus características principales destacan el ser 
estables al calor y a pH ácidos (Beristain-Bauza et al., 2012). Las enterocinas de 
acuerdo a sus propiedades fisicoquímicas, estructurales y moleculares se clasifican 
en: 
Clase I: lantibióticos, péptidos policíclicos pequeños modificados pos-
traduccionalmente por la deshidratación de la serina y treonina dando lugar a la 
dehidroalanina, que a través de un grupo tioéter puede unirse a cadenas de cisteína 
dando lugar a los aminoácidos lantionina y β-metil lantionina. 
Clase II: péptidos conformados por aminoácidos sin modificaciones, estables al 
calor y al pH, éstas a su vez se dividen en tres sub clases: clase II.1 bacteriocinas 
tipo pediocinas, que se caracterizan por contar con una región catiónica hidrofílica 
con una región conservada denominada “caja de pediocina” y dos residuos de 
cisteína unidos por un enlace disulfuro. Clase II.2: enterocinas sintetizadas sin 
péptido líder, que son diméricos. Se requieren los dos péptidos para la actividad 
bactericida. Clase II.3 enterocinas lineares no del tipo pediocina esta clase incluye 
a aquellas que no entran dentro de las otras dos sub clases y que son enterocinas 
lineares sintetizadas con un péptido líder. 
La clase III: incluye péptidos cíclicos que poseen dicha estructura por la unión 
covalente de sus extremos carboxilo y amino, son termoestables y no se modifican 
después de la traducción. 
16 
 
Clase IV: son proteínas largas denominadas enterolisinas tienen un peso molecular 
mayor a 30 kDa y son termolábies (Franz et al., 2007; Beristain-Bauza et al., 2012). 
El mecanismo de acción de las enterocinas clase I, es que pueden formar dos caras 
una hidrofóbica y otra hidrofílica, creando oligomeros que pueden atravesar la 
membrana ocasionando la pérdida de iones como K+, Na+ y ATP, lo que genera una 
pérdida del potencial de membrana. Las de clase II tienen una estructura anfifílica 
helicoidal lo que les permite orientarse e insertarse en la membrana celular 
interfiriendo con su estructura y conduciendo a una despolarización. Las de clase III 
tienen un mecanismo de acción similar a las enterocinas de clase II y las de clase 
IV actúan directamente sobre la pared celular de las bacterias Gram-positivas lo que 
conduce a la lisis y muerte de la célula. Las enterocinas tienen una acción limitada 
contra bacterias Gram-negativas esto debido a que presentan un lipopolisacárido el 
cual está en el exterior de la célula sirviendo como una barrera contra las 
enterocinas (Beristain-Bauza et al., 2012). 
3.7.2 Peptidoglucano hidrolasas (PGHs) 
El principal componente de la pared celular bacteriana es el peptidoglucano (PG), 
el cual está constituido por cadenas alternadas de N-acetilglucosamina (NAG) y 
ácido N-acetilmurámico (NAM) los cuales están unidos mediante enlaces β (1-4) y 
entrecruzados por péptidos pequeños, el grupo D- lactoil de cada NAM está 
sustituido por un péptido corto formado de diversos aminoácidos. Las PGHs son 
enzimas que pueden hidrolizar el PG, tienen pesos moleculares que pueden ir 
desde los 30 kDa hasta los 140 kDa y tienen diversas funciones como la 
maduración/autolisis del PG, anclaje del septum durante la división celular, 
resistencia a antibióticos debido al reciclaje del PG pues los fragmentos reciclados 
pueden actuar como moléculas efectoras en la respuesta inmune de las bacterias, 
entre otras (Martínez-Caballero et al., 2017). Las PGHs se clasifican (Figura 4) de 
acuerdo a su mecanismo de acción sobre el PG, las amidasas rompen el enlace 
amida entre NAM y la L-alanina del péptido. Las peptidasas son capaces de 
hidrolizar el último aminoácido del extremo carboxilo de los péptidos 
(carboxipeptidasas), o de romper completamente los puentes formados por los 
17 
 
péptidos (endopeptidasas). Las N-acetilglucosaminidasas y las N-
acetilmuramidasas hidrolizan los enlaces β (1-4) de la cadena de glicanos. Las 
primeras lo hacen dejando un extremo NAG reductor, mientras que las segundas 
hidrolizan el enlace entre NAM y NAG, pudiendo dejar libre un extremo NAM 
reductor, llamadas lisozimas, o formando un anillo 1,6-anhidro en NAM, conocidas 
como transglicosilasas líticas (Vollmer et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Mecanismo de acción de las PGHs sobre el PG (Modificado de Martínez-Caballero et al., 
2017). 
Una función que este tipo de compuestos lleva a cabo en un producto alimenticio 
es la de asegurar la inocuidad del producto, pues presentan la capacidad de inhibir 
microorganismos patógenos tales como L. monocytogenes o S. aureus lo cual indica 
que en los productos denominados “artesanales” tales como quesos o embutidos 
(Sarantinopolus et al., 2001; Foulquié, 2006) no presentan un riesgo para la salud 
del consumidor debido al efecto benéfico que la microbiota le confiere al alimento. 
4. Antecedentes del grupode trabajo 
4.1 Generalidades del Queso Cotija 
El Queso Cotija es un producto lácteo artesanal, madurado, salado, de pasta dura 
no cocida y de textura desmoronable que se elabora desde hace más de cuatro 
siglos, en la región serrana entre los estados de Jalisco y Michoacán (Sierra 
18 
 
Jalmich). Es elaborado a partir de leche entera, bronca, de ganado cebú o criollo, 
su periodo de elaboración se restringe a los meses de lluvia debido a que el alimento 
para el ganado es más abundante en esa época. Su proceso de maduración se lleva 
a cabo durante al menos 3 meses, con lo que se logra obtener un producto con 
características únicas, de acuerdo con la NOM-243-SSA1-2010 el queso Cotija se 
clasifica como un queso madurado, prensado, de pasta dura y desmoronable. 
La composición fisicoquímica del queso Cotija oreado de 3-6 meses de maduración 
presenta una actividad de agua entre 0.87 y 0.90; un pH entre 4.8 y 5.2, y una acidez 
que fluctúa entre 0.20 y 0.32%, expresada como ácido láctico. Asimismo, presenta 
valores de humedad entre 32 y 40% (Hernández-Briones et al., 2009). 
4.2 Análisis metagenómico del queso Cotija 
Escobar, realizó en el 2016 el análisis metagenómico del queso Cotija, encontrando 
que la microbiota a los tres meses de maduración está conformada casi en su 
totalidad por Firmicutes donde tres géneros son los dominantes: Lactobacillus, 
Leuconostoc y Weissella, estos fueron encontrados con una abundancia relativa 
total >10%. Como sub dominantes se encontró: Aerococcus, Enterococcus, 
Lactococcus y Staphylococcus, estos con una abundancia total relativa entre el 1 y 
10%, dentro del género Enterococcus encontró a las especies: faecium, faecalis, 
casseliflavus, italicus y gallinarium, por último se encontraron otros 38 géneros como 
no dominantes con una abundancia relativa total <1%. 
Respecto a la formación de aromas y sabores por parte del consorcio bacteriano, 
se encontró que éste tiene el potencial metabólico para transformar aminoácidos 
libres en sus respectivos α-cetoácidos por la vía de la transaminasa a partir de 
sustratos de cadena ramificada y fenilalanina, también se encontró que hay una 
gran cantidad de genes con anotación para carboxil esterasas que rompen enlaces 
éster para generar alcoholes y ácidos carboxílicos, donde no sólo estas enzimas 
son las responsables ya que además se encontraron aldehído y alcohol 
deshidrogenasas lo que indica que el consorcio bacteriano tiene la capacidad de 
generar una mezcla compleja de compuestos con una amplia variedad de cetonas, 
aldehídos y ácidos orgánicos. 
19 
 
Por otro lado, se identificaron 43 contings con al menos un gen codificante para 
bacteriocina. Se concluyó que ninguna de las especies dominantes posee un 
arsenal importante de genes codificantes para bacteriocinas, pero sí genes que 
codifican para proteínas de inmunidad, demostrando una estrategia de 
sobrevivencia para las bacterias que forman parte de la comunidad en el producto 
madurado por tres meses (Escobar, 2016). 
4.3 Identificación y caracterización de cepas de Enterococcus aisladas de Queso 
Cotija 
Guzmán, en el 2015 analizó un total de 39 cepas de Enterococcus mediante PCR 
especie-específica donde identificó un total de 13 cepas como E. faecalis y 12 como 
E. faecium. Por lo tanto 14 cepas no pertenecieron a ninguna de esas dos especies, 
por lo que sólo pudieron caracterizarse a nivel género, quedando como 
Enterococcus spp. 
Para las cepas de E. faecium se demostró la presencia de 4 nuevas secuencias tipo 
(ST 1045, ST 1046, ST 1047 y ST 1048) y los resultados de tipificación por MLST 
indicaron que las cepas aisladas del queso Cotija no están relacionadas con el 
complejo clonal 17 conocido como de “alto riesgo” (CC17) el cual se caracteriza por 
resistencia a vancomicina, ampicilina y quinolina, por lo que está asociado a 
enfermedades nosocomiales (Guzmán, 2015). 
4.4 Identificación y caracterización enzimática de microorganismos aislados de 
queso Cotija y sus materias primas 
Camacho en 2014, identificó una colección de 65 cepas aisladas del queso, de las 
materias primas para su elaboración y superficies en contacto con el alimento 
mediante la amplificación y secuenciación del rRNA 16S encontrando la presencia 
de bacterias de diversos géneros como: Enterococcus, Staphylococcus, Kocuria, 
Klebsiella, Enterobacter, Bacillus, Aerococccus y Acinetobacter, también evaluó la 
actividad proteolítica y lipolítica de todas las cepas, en cuanto a los enterococos, se 
identificaron 12 cepas provenientes del queso, faecium (8) y faecalis (4), donde solo 
20 
 
5 presentaron actividad esterolítica en agar tributirina y ninguna presentó actividad 
proteolítica en agar leche descremada (Camacho, 2014). 
4.5 Producción de peptidoglucano hidrolasas por Enterococcus del queso Cotija 
Serrano en 2010, identificó y caracterizó proteínas con actividad antibacteriana de 
4 cepas aisladas de queso Cotija, una de ellas perteneciente al género 
Enterococcus (E. faecalis), encontrando mediante zimografía contra S. aureus, E. 
coli y M. lysodeikticus que para dicha cepa se identificaron 3 bandas con actividad 
lítica solo contra bacterias Gram positivas, debido a la intensidad presentada por las 
bandas estas se secuenciaron por lo que se pudo obtener su identidad, se identificó 
una proteína de 87 kDa que debe su actividad antibacteriana a su acción como 
peptidasa de pared celular. Se concluyó que la actividad lítica producida por las 4 
cepas no era debido a bacteriocinas pues la masa molecular de los compuestos 
producidos por todas las cepas era mayor a 30 kDa y las bacteriocinas tienen masas 
moleculares menores a 10 kDa (Serrano, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
5. Justificación 
Los análisis que el grupo de trabajo ha realizado sobre la funcionalidad de la 
microbiota del queso Cotija, específicamente sobre el género Enterococcus durante 
el proceso de maduración y en la inocuidad del producto final, dejan evidente su 
importancia. En el análisis metagenómico se encontraron especies diferentes a 
faecium y faecalis, por lo que es importante identificar y analizar la funcionalidad de 
otras especies de enterococos presentes en el queso. En este trabajo se pretende 
identificar a nivel de especie la colección de cepas de Enterococcus que se aislaron 
del queso Cotija, además de evaluar el potencial biotecnológico que pueden 
presentar y así aportar la información sobre la función que desempeña el género 
Enterococcus durante la maduración del queso. 
6. Hipótesis 
A partir del análisis metagenómico del queso Cotija, se propone que las 14 cepas 
no identificadas de Enterococcus spp. pueden pertenecer a las especies: italicus, 
casseliflavus y gallinarum. Además de presentar un potencial biotecnológico pues 
presentarán actividad proteolítica, carboxilesterasa y producción de proteínas con 
actividad antibacteriana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
7. Objetivos 
7.1 Objetivo general 
Identificar a nivel de especie cepas de Enterococcus spp. aisladas de queso Cotija 
artesanal madurado, así como evaluar el potencial biotecnológico que pueden tener 
durante el proceso de maduración del queso y en la inocuidad del producto final. 
7.2 Objetivos particulares 
• Mediante la secuenciación y amplificación del gen ribosomal 16S identificar 
a nivel de especie las cepas de Enterococcus spp. 
• A partir de la amplificación y secuanciación de espaciadores transcritos 
internos, diferenciar a las especies: faecium, durans e hirae. 
• Evaluar cualitativamente mediante pruebas bioquímicas la presencia de 
actividad proteolítica, lipolítica y esterolítica de cepas de Enterococcus spp. 
• Evaluar la producción de proteínas y péptidos extracelulares con actividad 
antibacteriana contra diferentes patógenos como Salmonella enterica, 
Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus 
 
 
23 
 
8. Metodología 
Figura 5. Esquemageneral de trabajo. TCA= Ácido tricloro acético, AT= Agar Tributirina, AAO= 
Agar Aceite de Oliva, ALD= Agar Leche Descremada. 
 
 
 
8.1 Descripción de las muestras 
Originalmente no se pudo identificar a nivel especie 14 cepas de Enterococcus, pero 
solo se pudieron recuperar 13, con las cuales se realizó este trabajo. Las cepas 
provenían tanto de agrupaciones previamente aisladas por el grupo de trabajo 
(Olvera, 2013) y de las que fueron aisladas por Guzmán en 2015 a partir de 
diferentes quesos Cotija con más de 3 meses de maduración. Todas se encontraban 
en congelación a -70 ⁰C (Tabla 1). 
24 
 
Tabla 1. Origen de las cepas utilizadas en este trabajo 
Muestra Región de Origen Calidad microbiológica Cepa 
Queso C Cotija 
 (Michoacán) 
Presencia de ADN 
Salmonella spp. 
QC5 
Queso D Quitupán 
 (Jalisco) 
Aceptable QD5, QD4, 
Queso E Quitupán 
 (Jalisco) 
Aceptable QE1, QE3, 
QE5, 
Queso G Santa María del 
Oro (Jalisco) 
Aceptable QG1 
Agrupación 
4 
Grupo de trabajo 
 (Olvera, 2013) 
Aceptable A47, A45, 
A44 
Agrupación 
5 
Grupo de trabajo 
 (Olvera, 2013) 
Aceptable A54, A55, 
A53 
Las agrupaciones consistían en mezclas de 20 colonias que presentaron 
crecimiento característico de enterococos en medio KAA (Kanamicina-Escualina-
Azida de Sodio) y pertenecían a un mismo queso. 
8.2 Reactivación y caracterización fenotípica y bioquímica 
A partir de gliceroles almacenados a -20 ⁰C se tomaron 300 µL y se inocularon en 3 
mL de caldo MRS (de Man Rogosa Sharpe; OXOID, Inglaterra), se dejaron incubar 
durante 12 horas en estufa estática (Gravity Convection E-71), a una temperatura 
de 37 ⁰C. A partir de dicho cultivo se realizó una tinción de Gram, se observaron al 
microscopio y se les realizó la prueba de catalasa usando H2O2 (30% v/v), la 
presencia de burbujas indicaba un resultado positivo. Ambas metodologías se 
realizaron de acuerdo al Manual de Prácticas de Microbiología General de la 
Facultad de Química, UNAM. 
8.3 Cinética de crecimiento 
Se prepararon preinóculos a partir de gliceroles almacenados a -20 ⁰C, se tomaron 
20 µL y se inocularon en tubos con 5 mL de caldo MRS, se dejaron incubar durante 
12 horas en estufa estática a una temperatura de 37 ⁰C, a partir de éste se tomó 1 
mL y se inoculó en un matraz de 250 mL con 50 mL de caldo MRS se dejó incubar 
por 22 horas en estufa estática a una temperatura de 37 ⁰C. Para realizar las 
cinéticas de crecimiento, se tomaron alícuotas de 1 mL cada 2 horas, a partir de las 
0 hasta las 22 horas de crecimiento, monitoreando la densidad óptica a una longitud 
25 
 
de onda de 600 nm en un espectrofotómetro (ThermoFisher Scientific Biomate 3; 
USA) y el pH en un potenciómetro (Hanna H1-4211). 
8.4 Identificación molecular de las cepas 
8.4.1 Extracción de ADN 
A partir de un preinóculo de 24 h en medio MRS, se tomó 1 mL y se inoculó en un 
matraz de 250 mL con 50 mL de caldo MRS, se incubó durante 8 horas en una 
estufa estática a una temperatura de 37 ⁰C. Para separar las células del 
sobrenadante se centrifugó a 10016 X g por 15 min a 4 ⁰C (Heraeus Biofuge primo 
R), las células se lavaron con 20 mL de solución salina estéril 0.85% (m/v), pH 6.5 
y se repitió dos veces. Al paquete celular obtenido se le adicionó 1 mL de solución 
salina estéril 0.85% (m/v), pH 6.5 se homogeneizó (Vortex Maxi Mini II 
ThermoFisher Scientific) y se transfirió a un tubo eppendorf de 2 mL, se centrifugó 
a 13 863 X g por 5 min a 4 ⁰C desechando el sobrenadante, a partir de este punto 
se utilizó el kit Genomic DNA Extraction (Genetic ID NA, INC; USA) y se siguieron 
las instrucciones del proveedor, modificando un paso de lisis celular, que para 
hacerla más eficiente se adicionaron 0.5 mg/mL de lisozima. Después se realizó 
una electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio al 0.1% 
para visualizar la presencia de ADN, usando el marcador de peso molecular 
GeneRuler DNA Ladder 1kb (ThermoFisher Scientific; USA). El ADN se cuantificó a 
través de la lectura de absorbancia a A260/280 en una placa Take 3 micro-volume 
(Bioteck; USA) en un espectrofotómetro Epoch (Bioteck; USA). 
La extracción está basada en la adsorción del ADN a una columna de sílice (SiO2) 
el cual se obtiene a partir de la adición de un buffer de lisis (tiocianato de guanidina, 
cloruro de guanidina, urea, perclorato de litio, dichas sales se denominan sales 
caotrópicas y detergentes), proteinasa K (enzima que ayuda a degradar las 
proteínas celulares), lisozima (enzima que rompe el enlace β 1-4 entre el NAG y el 
NAM del PG), una vez adsorbido el ADN se realizan una serie de lavados con las 
sales y con etanol frío 70% (v/v) para remover restos de proteínas, polisacáridos y 
sales en exceso, al final se utiliza un buffer de elución (10 mM Tris, pH: 8-9 a 60⁰C) 
para remover el ADN de la columna (Kennedy, 2010). 
26 
 
8.4.2 Amplificación del gen ribosomal 16S y secuenciación 
Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en 
inglés) utilizando los cebadores y condiciones descritas por Jensen en 1993 (Tabla 
2), para la mezcla de reacción se utilizaron las concentraciones indicadas en la 
Tabla 3, se utilizó la polimerasa de P. furiosus; con un volumen final de 50 µL, se 
utilizó un termociclador (Axygen, Maxygene Gradient; USA) usando las condiciones 
descritas en la Tabla 4. 
Tabla 2. Secuencia de cebadores utilizados para la amplificación del gen ribosomal 
16S 
Cebador Secuencia 5´-3´ 
fD1 CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 
rD1 CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTTGATCCAGCC 
Tabla 3. Concentraciones finales de los reactivos usados en la reacción de PCR 
para el gen ribosomal 16S 
Reactivo Concentración final 
ADN polimerasa Pfu 0.02 U/µL 
Amortiguador Pfu + MgSO4 1X 
dNTP 0.2 mM 
ADN 100 ng/ reacción 
Cebador directo (fD1) 0.2 µM 
Cebador reverso (rD1) 0.2 µM 
Agua (B.M) c.b.p 50 µL 
 
Tabla 4. Condiciones del termociclador para la amplificación del gen ribosomal 16S 
Ciclos Temperatura (⁰C) Tiempo (min) Etapa 
1 94 5 Desnaturalización 
inicial 
35 95 2 Desnaturalización 
42 0.5 Alineación 
72 4 Extensión 
1 72 10 Extensión final 
 
27 
 
Se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de 
etidio al 0.1% y se visualizó en un transiluminador (Mighty Bright UVTM, Hoefer; 
USA) para observar la presencia del amplicón esperado de 1500 pb, utilizando el 
marcador de peso molecular GeneRuler DNA Ladder 1kb. Los fragmentos 
amplificados se purificaron mediante el kit DNA Clean & Concentrator (Zymo 
Research; USA) siguiendo las instrucciones del proveedor, después se 
concentraron (DNA Plus VK-MINI Heto; USA) y se cuantificaron en un 
espectrofotómetro Epoch (Bioteck; USA), al final los amplicones se mandaron a 
secuenciar por tecnología de Sanger (MacroGen Inc; Seúl, Corea). Una vez 
obtenida la secuencia nucleotídica del gen 16S de cada cepa, se analizaron 
mediante la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Serach Tool, National 
Center for Biotechnology Information), interrogando la base de datos 16S para 
bacterias y arqueas (Ribosomal Data Base Project). 
8.4.3 Amplificación y perfil de bandeo de las ITS 
Se llevó acabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los 
cebadores descritos en la Tabla 5 (Tyrell et al., 1997), para la mezcla de reacción 
se utilizaron las concentraciones indicadas en la Tabla 6 con un volumen final de 50 
µL, se utilizó un termociclador (Axygen, Maxygene Gradient; USA) usando las 
condiciones descritas en la Tabla 7 (Jensen et al., 1993). 
 
 
Tabla 5. Secuencia de cebadores utilizados para la amplificación de los ITS 
Cebador Secuencias 5´-3´ 
L1 (directo) CAAGGCATCCACCGT 
G1 
(reverso) 
GAAGTCGTAACAAGG 
 
28 
 
Tabla 6. Concentraciones finales de los reactivos usados en la reacción de PCR 
para los ITS 
Reactivo Concentración final 
ADN polimerasa Pfu 1.25 U/µL 
Amortiguador Pfu + MgSO4 1X 
dNTP 0.15 mM 
ADN 500ng/ reacción 
Cebador directo (L1) 50 pmol 
Cebador reverso (G1) 50 pmol 
Agua (B.M) c.b.p 50 µL 
 
Tabla 7. Condiciones del termociclador para la amplificación de los ITS 
Ciclos Temperatura 
(⁰C) 
Tiempo 
(min) 
Etapa 
1 94 1 Desnaturalización 
inicial 
25 - 2 Rampa para 55 
⁰C 
55 7 Alineación 
- 2 Rampa para 72 
⁰C 
72 2 Extensión 
1 72 10 Extensión final 
 
Para obtener el perfil de bandeo de los amplicones obtenidos, primero se realizó 
una electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio al 0.1%, 
usando como control positivo la cepa E. faecium MXVK29 (Álvarez-Cisneros, 2010). 
Después se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% (descrito en el 
Anexo 10.2), con los reactivos y cantidades descritas en la Tabla 8, para obtener 
una mejor resolución de las bandas que corresponde a amplicones de peso 
molecular de menos a 1000pb. Se utilizó una cámara de electroforesis (DCODE 
DGGE, BioRad; USA); a 10 µL de muestra se le adicionaban 5 µL de buffer de carga 
6X DNA Loading (Thermo Fisher Scientific; USA), como marcador de peso 
molecular se utilizó Mass Ruler Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific; 
29 
 
USA), se tomó el mismo control positivo y se realizó la tinción del gel con nitrato de 
plata la cual está descrita en el Anexo 10.2, el análisis de las bandas se realizó en 
el software del equipo (Gel Doc™XR; BioRad, USA). 
Tabla 8. Cantidades empleadas en la preparación del gel de poliacrilamida al 6% 
Reactivo Cantidad 
Acrilamida / bis acrilamda (29:1) 9.96 mL 
Agua desionizada 28.04 mL 
Amortiguador TBE 1X 12 mL 
APS 10% 0.35 mL 
TEMED 25 µL 
APS= Persulfato de Amonio, TEMED =Tetrametiletilendiamina, Amortiguador= Tris, 
Borato, EDTA) 
Finalmente, el patrón de bandeo se transformó a una matriz de ausencia presencia 
(Anexo 10.5) y se analizó a través de la plataforma UPGMA 
(http://genomes.urv.es/UPGMA/) el cual construye el dendrograma a través de 
calcular el índice de Jaccard (Anexo 12.6) el cual está basado en la relación de 
presencia-ausencia entre el número de especies comunes en dos áreas y está 
definido como el tamaño de la intersección dividido por el tamaño de la unión del 
grupo de datos (García-Vallvé y Puigbó et al., 2012). 
8.5 Detección de actividades enzimáticas 
A partir de un preinóculo de 24 h en medio MRS, se tomó 1 mL y se inoculó en un 
tubo con 5 mL de medio MRS, se incubó durante 6 horas a 37 ⁰C en estufa estática, 
a partir de éste se inocularon por picadura y estría tubos con agar leche 
descremada, agar tributirina y agar aceite de oliva los cuales se prepararon de 
acuerdo al procedimiento descrito en el Anexo 10.3, se incubaron durante 6 días a 
37 ⁰C en estufa estática. Se utilizó como control positivo una cepa de Kocuria 
marina, aislada de una superficie de mesa de amasado de queso Cotija (Camacho, 
2014). Se utilizó una escala ordinal (para indicar la presencia o ausencia de la 
actividad) donde el máximo de cada actividad estaba representado por la actividad 
que K. marina presentaba en cada medio. 
30 
 
8.6 Caracterización de productos con actividad antibacteriana 
8.6.1 Difusión en agar 
Para elaborar las cajas, a partir de preinóculos de 24 h de cada patógeno en caldo 
BHI, se inoculó 1 mL en tubos con 10 mL de caldo BHI, se dejó incubar a 37 ⁰C en 
estufa estática y para obtener la concentración de células adecuada, se midió la 
D.O en un espectrofotómetro hasta obtener un valor de 0.4, a partir de éste cultivo 
se inocularon 20 µL en 25 mL de agar MRS, se homogeneizó la mezcla y se vertió 
en cajas Petri, los pozos en el agar se realizaron utilizando puntas estériles de 1000 
µL. 
A partir de un preinóculo de 24 h de las cepas en medio MRS, se tomó 1 mL y se 
inoculó en un matraz de 250 mL con 50 mL de medio MRS, se incubó durante 6 
horas, correspondiente a la fase logarítmica tardía, a 37 ⁰C en estufa estática. 
Posteriormente se centrifugó a 10016 X g por 15 min a 4 ⁰C, se recuperó el 
sobrenadante, se neutralizó a pH=7 con NaOH 50% (m/v) después se filtró con una 
membrana de 0.22µm (MF-Millipore, Merck; USA), se congelaron a -70 ⁰C durante 
12 horas y se liofilizaron (Mod Freezer Dry System, Labconco; USA). El 
sobrenadante liofilizado se resuspendió en 1.5 mL de amortiguador de fosfatos 
(PBS) 50 mM pH=7, adicionando 200 µL del sobrenadante en los pozos de las cajas. 
Las cajas se incubaron a 37 ⁰C durante 48 h en estufa estática, usando como control 
positivo 1 Nisaplin® (10 mg/mL) y 2 Ampicilina (100 mg/mL), como control negativo 
se usó el medio MRS liofilizado. Se midieron los halos de inhibición de cada 
sobrenadante con ayuda de un vernier, se consideró como prueba positiva aquella 
que presentara un halo de inhibición claro y nítido, parecido a los controles positivos 
utilizados. Controles positivos: 
Nisaplin®: Forma comercial de la Nisina, que es una bacteriocina (clase I) producida 
por Lactococcus lactis subsp. lactis, es la única bacteriocina aprobada para su uso 
en quesos como agente antimicrobiano contra patógenos Gram-positivos (≤250 
ppm), tiene actividad a pH ácidos y se pierde en pH neutros. Su mecanismo de 
acción se basa en la formación de poros en la membrana celular ocasionando la 
pérdida de la fuerza protón motriz (Lourenço et al., 2017). 
31 
 
Ampicilina: Es un antibiótico beta lactámico de amplio espectro contra bacterias 
Gram-positivas y Gram-negativas, su mecanismo de acción se basa en la unión e 
inhibición de las proteínas de unión a penicilina, localizadas en la parte interna de 
la pared celular de las bacterias por lo que interfiere en el entrecruzamiento de las 
cadenas del péptidoglucano cuando éste se sintetiza por lo que ocasionará la lisis 
de la bacteria (PubChem, National Center for Biotechnology Information). 
8.6.2 Cuantificación de proteína 
8.6.2.1 Método de Bradford 
Se tomaron 160 µL de muestra diluida en buffer de fosfatos (dilución 10-2) y se 
colocaron en una microplaca (Costar, Corning; USA) a la muestra se le adicionaron 
40 µL de reactivo de Bradford (BioRad; USA), se dejó incubar la reacción al menos 
5 minutos y se cuantificó a una longitud de onda de 595 nm en el equipo Epoch. 
El método está basado en la unión del colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 
a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe (amino ácidos aromáticos y básicos) de 
las proteínas provocando un máximo de absorción de 465 a 595 nm y se monitorea 
midiendo el incremento en la absorción a 595 nm; el colorante al unirse con los 
amino ácidos toma una coloración azul (García et al., 1998). 
8.6.3 Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-
PAGE) y zimografía 
Debido a que se puede obtener una buena resolución del perfil de bandeo de las 
proteínas e identificar los pesos moleculares de las que presenten actividad lítica 
respectivamente, se decidió realizar SDS-PAGE y zimogramas. Se utilizaron los 
reactivos descritos en la Tabla 9. A partir de 1.8 mL del extracto crudo se 
precipitaron las proteínas con 200 µL de ácido tricloro acético 100% (m/v), quedando 
una concentración final de ácido de 10% (m/v) incubado durante 1 hora a 4⁰C. 
Posteriormente se centrifugó a 17 968 X g durante 15 min a 4⁰C (Allegra X-30R 
Centrifuge, Beckman Coutler; USA), desechando el sobrenadante y el precipitado 
se lavó 3 veces con acetona al 90% (v/v), centrifugando con las mismas condiciones 
y al final se dejó evaporar los restos de acetona. Se midió la concentración de 
32 
 
proteína por el método de Bradford, el precipitado se resuspendió en amortiguador 
de fosfatos 50 mM pH=7 (dilución 10-2 y 10-3) y se realizó la medición de absorbancia 
a 595 nm en el equipo Epoch. 
Tabla 9. Reactivos utilizados para SDS-PAGE y zimogramas 
Separador [Acrilamida]= 10% Concentrador [Acrilamida]= 4% 
Reactivo Cantidad Reactivo Cantidad 
Agua desionizada 3.5 mL Agua desionizada 3.62 mL 
Tris-HCl 1.5M 
pH=8.8 
2.1 mL Tris-HCl 1.5M pH=8.8500 µL 
Acrilamida 30% 2.8 mL Acrilamida 30% 830 µL 
SDS 10% 85 µL SDS 10% 50 µL 
APS 10% 75 µL APS 10% 60 µL 
TEMED 7.5 µL TEMED 6 µL 
SDS= Dodecil sulfato de sodio, APS= Persulfato de Amonio, TEMED= 
Tetrametiletilendiamina 
Los precipitados se resuspendieron calentando a ebullición durante 5 minutos con 
25 µL de amortiguador de corrida 4X (Tris-HCl pH=6.8, glicerol, SDS, azul de 
bromofenol 0.5%, agua desionizada, 2-mercaptoetanol 0.2 M) y se adicionaron los 
volúmenes necesarios para que todas las cepas quedaran ajustadas a 1.57 mg/mL 
de proteína. 
Para los zimogramas, se utilizaron los mismos reactivos y cantidades descritos en 
la Tabla 9 así como los volúmenes para ajustar la proteína a la concentración ya 
descrita, pero adicionando a los geles células (con una D.O de 0.8) muertas por 
calor húmedo (121⁰C, 15 min) de los patógenos: Staphyococcus aureus, Salmonella 
enterica y Listeria monocytogenes y en el caso de Mycrococcus lysodeikticus ATCC 
4698 se ocuparon células liofilizadas (Sigma-Aldrich; USA). Las electroforesis se 
realizaron usando un marcador de peso molecular Precision Plus Protein® 
Standards (BioRad; USA) y en el equipo Mini-PROTEAN®II (Electrophoresis Cell, 
BioRad; USA) con las siguientes condiciones: 60 V durante 30 min y 120 V durante 
2.5 h a 4 ⁰C. 
33 
 
Los geles SDS-PAGE se tiñeron con una solución con azul brillante de Coomasie 
G-250 2.5 % (m/v), metanol 40% (v/v) y ácido acético 10% (v/v) para lograr visualizar 
las proteínas y se destiñeron con lavados constantes de una solución con ácido 
acético 10% (v/v), metanol 40% (v/v) y agua destilada 50% (v/v). Los zimogramas 
fueron tratados con una solución renaturalizante (Tritón 1% v/v, amortiguador de 
fosfatos 50mM pH=7) durante 18 horas a 37 ⁰C y con agitación constante (50 rpm), 
después se tiñeron con una solución con azul de metileno (0.1% m/v) y KOH (0.01% 
m/v), se destiñeron con lavados constantes de agua destilada; el SDS-PAGE se 
analizó con el software del equipo (Gel Doc™XR; BioRad, USA). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
9. Resultados y Discusión 
9.1 Caracterización fenotípica y bioquímica 
Esta metodología facilita la diferenciación de las bacterias debido al tipo de pared 
celular, los enterococos son bacterias Gram-positivas, cuya pared celular está 
formada por varias capas de PG el cual a su vez está compuesto por NAG y NAM, 
no presentan un LPS (lipo-polisacárido) como las Gram-negativas (Mandigan et al., 
2009). En la Tabla 11 se muestran los resultados obtenidos durante la tinción y 
prueba de catalasa de todas las cepas, demostrando que todas eran bacterias 
Gram-positivas con morfología de cocos, algunas en agrupaciones de diplococos y 
ninguna presentó la enzima catalasa durante la prueba, dicha enzima está 
encargada de la conversión del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Este 
resultado confirma la caracterización previa y demuestra que las cepas 
crioconservadas no presentan contaminación por un microorganismo de diferente 
Gram. 
Tabla 10. Características fenotípicas y bioquímicas de las cepas de trabajo 
Cepa Gram Morfología Prueba de 
Catalasa 
QD5 (+) Cocos (-) 
QE3 (+) Cocos (-) 
QC5 (+) Cocos (-) 
QG1 (+) Cocos (-) 
QE1 (+) Cocos (-) 
QE5 (+) Cocos (-) 
QD4 (+) Cocos (-) 
A45 (+) Cocos (-) 
A55 (+) Cocos (-) 
A54 (+) Cocos (-) 
A47 (+) Cocos (-) 
A44 (+) Cocos (-) 
A53 (+) Cocos (-) 
 
 
 
 
35 
 
9.2 Identificación molecular 
Una vez extraído el ADN, se procedió a realizar una electroforesis para comprobar 
la presencia y calidad de éste. En la Figura 6 puede observarse la presencia de 
bandas las cuales, al ser comparadas con el marcador de peso molecular, se 
encuentran a una altura mayor de 10 000 pb, lo que demuestra la presencia de ADN 
cromosomal, el cual tiene un peso molecular aproximadamente de 4.2 x106 pb. Por 
lo cual éste se encontraría en la parte superior del gel, debido a que no puede 
atravesar los poros del gel de agarosa por su gran tamaño. Además, puede 
observarse que no hay degradación del ADN ya que no se observó un barrido hacia 
pesos moleculares menores. 
 
 
 
 
 
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio 0.1%. MPM: 
Marcador de Peso Molecular, (1) cepa QD5, (2) cepa QE3, (3) cepa QC5, (4) cepa A47, (5) cepa 
QE1, (6) cepa A54, (7) cepa QG1 
 
Se procedió a realizar la cuantificación de la concentración de ADN y la relación 
A260/280 para determinar la pureza del ADN extraído, en la Tabla 12 se muestran los 
resultados. 
 
 
 
 
 
1 2 3 4 5 6 7 
>10,000 pb 
36 
 
Tabla 11. Concentración de ADN extraído de las cepas de Enterococcus con el kit 
Genomic DNA Extraction 
Cepa Concentración (ng/µL) A260/280 
QD5 3.58 2.27 
QE3 4.35 2.20 
QC5 8.47 1.88 
A47 70.82 2.67 
QE1 144.52 1.76 
A54 13.46 2.65 
QG1 46.68 2.27 
A45 41.99 2.42 
A55 16.77 1.41 
QE5 67.93 2.13 
QD4 22.13 2.44 
A44 48.51 2.14 
A53 4.38 2.51 
 
Las concentraciones de las cepas A53, QC5, QE3 y QD5 fueron bajas en 
comparación con las otras cepas, esto pudo deberse a que durante la extracción no 
se realizó una lisis completa de las células debido a una alta cantidad de éstas o 
que durante los lavados de la columna de sílice el buffer de lavado haya removido 
DNA. Sin embargo, en la mayoría de los casos se logró hacer una extracción de 
ADN de buena calidad y sin contaminación, reflejado en los resultados de relación 
260/280. Se procedió a realizar la reacción de PCR con las concentraciones 
obtenidas y usando las condiciones ya descritas para la amplificación del gen 
ribosomal 16S. 
37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio 0.1% de los 
amplicones obtenidos por la reacción de PCR del ADNr 16S. MPM: Marcador de Peso Molecular, 
(1) cepa QD5, (2) cepa QE3, (3) cepa QC5, (4) cepa A47, (5) cepa QE1, (6) cepa A54, (7) cepa 
QG1, (8) cepa A45, (9) cepa A55, (10) cepa QE5, (11) cepa QD4, (12) cepa A44, (13) cepa A53. 
Se realizó la electroforesis para determinar la presencia de los amplicones, la sub 
unidad 16S tiene un tamaño aproximado de 1500 pb, por lo que se puede observar 
en la Figura 7, se logró realizar la amplificación completa del gen, pues las bandas 
al ser comparadas con el marcador de peso molecular se encuentran en la altura 
de 1500 pb, no se observó la presencia de bandas para las cepas QE1, QE5 y A44, 
esto pudo deberse a que a pesar de tener una concentración alta de ADN, este 
puede contener proteinasa K, detergentes (provenientes de la solución 
amortiguadora de lavado) o etanol, ocasionando que la reacción no se llevara a 
cabo por inhibición de la actividad de la polimerasa (Moreira, 1998). También puede 
observarse la presencia de bandas en la parte inferior del gel, debajo de las 250 pb, 
esto indica la presencia de otros productos de amplificación, por ejemplo, altas 
concentraciones de cebadores pueden llevar a la formación de dímeros entre ellos 
lo cual disminuirá la eficiencia en la formación del producto de amplificación 
(Schrader et al., 2012). En los casos donde no hubo amplificación del gen, se repitió 
la extracción y amplificación del gen hasta tener un resultado positivo. Los 
1500 pb 
1500 pb 
38 
 
amplicones se purificaron a partir de solución para después cuantificar la 
concentración de ADN, ya que la concentración mínima necesaria para secuenciar 
ADN por el método de Sanger es de 20 ng/µL. En la Tabla 12 se observan los 
resultados de las muestras. A pesar de que las cepas QE1 y QE5 no llegaron a la 
concentración mínima, no era posible concentrar más la solución pues se corría el 
riesgo de evaporar la misma. 
Tabla 12. Concentración y A260/280 de los amplicones del gen ribosomal 16S 
Cepa Concentración (ng/µL) 
QD5 36.73 
QE3 23.28 
QC5 36.58 
A47 22.46 
QE1 15.94 
A54 33.13 
QG1 30.26 
A45 27.39 
A55 47.71QE5 18.31 
QD4 39.36 
A44 29.10 
A53 35.51 
 
Al obtener las secuencias de los amplicones en ambos sentidos, éstas se analizaron 
para obtener una secuencia consenso, mediante el servidor en línea MultlAlin. La 
secuencia consenso se interrogó mediante el algoritmo BLAST (NCBI), con la base 
de datos de la sub unidad 16S para bacterias y arqueas (RDP) Anexo 10.4, 
obteniendo resultados no concluyentes, lo cuales se muestran en la Tabla 13. 
 
 
 
39 
 
 
Tabla 13. Resultado obtenido mediante el algoritmo BLAST de las secuencias de 
las cepas de Enterococcus 
 
En la Tabla 13, puede observarse que solamente la cepa QC5 se logró identificar 
como E. durans con esta metodología. Para todas las demás cepas el resultado fue 
el mismo, el algoritmo no fue capaz de diferenciar entre las especies E. faecium, E. 
durans y E. hirae, obteniendo el mismo valor de % de identidad y expectancia para 
todas las comparaciones realizadas. La expectancia representa la probabilidad, que 
la secuencia tiene de obtener la misma puntuación al ser alineadas por azar con 
respecto al tamaño de la base de datos que se está usando. Los resultados indican 
que la identidad de las cepas no era conclusiva. El resultado arrojado por el BLAST, 
puede deberse a que se ha reportado que las tres especies pertenecen al grupo de 
Cepa Identidad Cobertura Identidad Expectancia 
QD5 E. durans/E. faecium/ E.hirae 92% 97% 0.0 
QE3 E. durans/E. faecium/ E.hirae 89% 98% 0.0 
QC5 E. durans 96% 98% 0.0 
A47 E. durans/E. faecium/ E.hirae 93% 98% 0.0 
A54 E. durans/E. faecium/ E.hirae 96% 97% 0.0 
QG1 E. durans/E. faecium/ E.hirae 91% 99% 0.0 
A45 E. durans/E. faecium/ E.hirae 89% 97% 0.0 
A55 E. durans/E. faecium/ E.hirae 84% 96% 0.0 
QE5 E. faecium/ E.hirae 91% 99% 0.0 
QD4 E. durans/E. faecium/ E.hirae 95% 96% 0.0 
A44 E. durans/E. faecium/ E.hirae 93% 95% 0.0 
A53 E. durans/E. faecium/ E.hirae 91% 97% 0.0 
QE1 E. durans/E. faecium/ E.hirae 97% 99% 0.0 
40 
 
E. faecium (Franz et al., 1993) donde las especies dentro de éste grupo comparten 
una similitud de aproximadamente 98.8% en el gen ARNr 16S (Devriese et al., 2002) 
y por lo tanto el algoritmo no fue capaz de discriminar sobre la identidad de las 
mismas. En la literatura está reportado que se han empleado otras metodologías 
para poder diferenciar entre diversas especies de enterococos, Tyrell (1997) y Baele 
(2000) se basaron en las diferencias que existen en los espaciadores transcritos 
internos (ITS, por sus siglas en inglés) para discriminar entre las diversas especies 
de enterococos que tienen una gran similitud en el gen 16S. Se sabe que éstos 
espaciadores (ubicados entre el 16S y 23S ARNr) son únicos para cada especie en 
secuencia y número de nucleótidos (Nguimbi et al., 2003). 
Como puede observarse en la Figura 8, la electroforesis en gel de agarosa demostró 
la correcta amplificación de las regiones ITS, ya que la mayoría de los amplicones 
obtenidos por PCR de las ITS se encuentran entre 600-300 pb (Tyrell et al., 1997), 
en la Figura 9 se muestra la electroforesis en gel de agarosa del control positivo 
utilizado E. faecium MXVK29, el cual se caracteriza por presentar dos bandas 
gruesas a un peso molecular aproximados de 500 y 400 pb (Alvarez-Cisneros et al., 
2016). 
 
41 
 
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los amplicones de regiones ITS obtenidos por 
PCR de las cepas de Enterococcus. (A) MPM: marcador de peso molecular, (3) cepa QD4, (6) 
cepa A54, (7) cepa A55, (10) cepa QE3. (B) MPM: marcador de peso molecular, (1) cepa A44, (2) 
cepa QG1, (3) cepa QE5, (4) cepa A47, (5) cepa QC5, (6) cepa A45, (7) cepa QD5, (8) cepa QE1, 
(9) cepa A53. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 1% del amplicón de la región ITS del control positivo 
obtenido por PCR. MPM: marcador de peso molecular. 
 
42 
 
Al comparar las Figuras 8 y 9, puede observase que las cepas QG1, QE5, QD5, 
QE1 y A53 tienen dos bandas a la altura de 500 pb igual que el control positivo, por 
lo que presuntivamente se podría decir que dichas cepas pertenecen a la especie 
E. faecium sin embargo se realizaron los geles de poliacrilamida al 6% para obtener 
una mejor resolución de bandas con un peso <1000 pb. 
 
Figura 10. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% de los amplicones de las ITS obtenidos por 
PCR. (M) marcador peso molecular (CP) E. faecium cepa MXVK29, (2) cepa A44, (3) cepa QG1, 
(4) cepa QE5, (5) cepa A47, (6) cepa QC5, (7) cepa A45, (8) cepa QD5, (9) cepa QE1, (10) cepa 
A53, (11) cepa QD4, (12) cepa A54, (13) cepa A55, (14) cepa QE3. 
 
 
 
43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% de los amplicones de ITS obtenidos por 
PCR de especies ATCC de Enterococos. (6) E. faecium ATCC 19434, (10) E. durans ATCC 19432, 
(11) E. hirae ATCC 8043. (Tyrell et al., 1997). 
En las Figuras 10 y 11 se muestran los perfiles de bandeo de los amplicones de las 
regiones ITS obtenidas por PCR, en la primera se muestra el perfil de las cepas de 
trabajo, mientras que en la segunda se muestra el perfil de las cepas control 
reportadas por Tyrell et al (1997). Comparando las bandas obtenidas en la Figura 
10 con el control positivo, se puede observar que los carriles 3, 4, 8 y 9 presentan 
el mismo patrón de bandeo, presentan dos bandas juntas de aproximadamente 
1500 y 1400 pb, a la altura de 700 pb se encuentra otra banda y por último una 
banda a la altura de 500 pb. Por lo tanto, los carriles que corresponden a las cepas 
QG1, QE5, QD5 y QE1 respectivamente, pertenecerían a la especie E. faecium por 
la similitud que presentan con el control positivo utilizado, esto puede confirmarse 
con la Figura 8 y 9, pues los carriles 2, 3, 7 y 8 que corresponden a las mismas 
cepas, presentan una doble banda a la altura de 500 pb al igual que el control 
positivo. No se observa banda en el carril 10 de la Figura 10 que corresponde a la 
cepa A53, pero al observar las Figuras 8 y 9 se observan dos bandas juntas en el 
control positivo y en la cepa por lo tanto se puede inferir que dicha cepa pertenece 
a la misma especie. 
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Se observa un perfil de bandeo similar para los carriles 11, 13 y 14 de la Figura 10, 
los cuales al ser comparados con los perfiles de la Figura 11, se observa un parecido 
con el carril 11 el cual pertenece a la especie E. hirae, en dicha figura hay cuatro 
bandas que aparecen arriba del marcador utilizado, éstas son las mismas bandas 
que aparecen en los carriles de la Figura 10 y que se encuentran a la altura de 1600, 
1500, 1200 y 1100 pb y al final dos bandas, una de 800 pb, la otra de 500 pb, por lo 
tanto las cepas A55, QE3 y QD4, pertenecerían a la especie E. hirae. 
Los carriles 5 y 7 de la Figura 10 presentan un perfil de bandeo similar, presentan 
dos bandas, de 1400 y 1200 pb, seguidas de tres bandas 600, 400 y 300 pb, las 
cuales al ser comparadas con los perfiles de la Figura 11, tienen una similitud con 
el carril 10 el cual pertenece a la especie E. durans, este carril presenta dos bandas 
por arriba del marcador y otras dos bandas juntas de aproximadamente 450 y 400 
pb, por lo que debido a su similitud con el perfil de E. durans las cepas A47 y A45 
pertenecerían a dicha especie. 
No se observaron bandas en los carriles 2, 6 y 12 de la Figura 10, que corresponden 
a las cepas A44, QC5 y A54, esto pudo deberse a diversas razones, a que no se 
realizó una correcta amplificación de las regiones ITS, ya que a pesar de que en el 
gel de agarosa (Figura 8) se podía observar bandas a la altura de 400-250 pb , dicho 
gel no logra resolver por completo las bandas pues el tamaño del poro es 
inversamente proporcional a la concentración de agarosa utilizada, pero en los 
geles de poliacrilamida se obtienen poros de menor tamaño logrando asi mejores 
resoluciones, por lo que al realizar un gel de poliacrilamida al 6% (Tyrell et al., 1997) 
y de un mayor