Produccion-purificacion-y-caracterizacion-de-la-pectin-liasa-de-aspergillus-flavus-cect-2687

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRODUCCIÓN, PURIFICACIÓN Y 
CARACTERIZACIÓN DE LA PECTIN-LIASA 
DE Aspergillus flavus CECT 2687 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
 
PRESENTA 
 MICHELLE MONSERRATH CAMACHO LARA 
 
 
 
 
 MÉXICO, D.F. AÑO 2014 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
ii 
 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE Wacher Rodarte María del Carmen 
VOCAL Aguilar Osorio José Guillermo de Jesús 
SECRETARIO Martín Fuentes Ruth Edith 
1° SUPLENTE Giles Gómez Martha 
2° SUPLENTE Camacho de la Rosa Norma Angélica 
 
 
 
SITIO EN DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
Grupo de Fisiología de Hongos Filamentosos del Departamento de Alimentos y 
Biotecnología, Conjunto E Laboratorio 312, de la Facultad de Química de la 
Universidad Nacional Autónoma de México bajo la dirección del Dr. Guillermo Aguilar 
Osorio. 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Dr. Guillermo Aguilar Osorio ________________________ 
 
 
SUSTENTANTE: 
Michelle Monserrath Camacho Lara ________________________ 
 
 
 
 
 
iii 
 
 
 
 
 
La presente investigación fue realizada con recursos del Programa de Apoyo a 
Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la UNAM. Proyecto; 
Identificación de enzimas degradadoras de polisacáridos producidas por cepas 
autóctonas del grupo Flavi durante su crecimiento en sustratos complejos, clave 
IN219813. Agradezco a la Dirección General de Asuntos del Personal Académico 
(DGAPA) la beca recibida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
 
CONTENIDO 
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 1 
OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 4 
2.1 OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 4 
2.2 OBJETIVOS PARTICULARES ......................................................................................... 4 
2.3 JUSTIFICACIÒN ............................................................................................................... 5 
ANTECEDENTES ................................................................................................................................ 6 
3.1 El género Aspergillus ...................................................................................................... 6 
3.1.1 Aspergillus flavus ................................................................................................................ 8 
3.1.2 Aflatoxinas ......................................................................................................................... 10 
3.1.3 Efecto de la contaminación por aflatoxinas de cultivos agrícolas en México .............. 12 
3.2 Polisacáridos estructurales de la pared celular vegetal ............................................. 14 
3.2.1 Sustancias pécticas .......................................................................................................... 16 
3.3 Enzimas fúngicas degradadoras de la pared celular de plantas ............................... 18 
3.3.1 Pectinasas ......................................................................................................................... 19 
3.3.2 Transeliminasas ................................................................................................................ 22 
3.3.2.1 Pectin liasas ............................................................................................................... 23 
3.3.3 Regulación genética de las enzimas degradadoras de pared celular en Aspergillus. 25 
3.3.3.1 Expresión coordinada de los genes que codifican para el sistema pectinolítico . 25 
3.3.3.2 Represión catabólica por fuente de carbono ........................................................... 25 
3.3.3.3 Expresión de genes dependiente de pH .................................................................. 26 
3.4 Aislamiento y purificación de Proteínas ...................................................................... 26 
3.4.1 Cromatografía ................................................................................................................... 26 
3.4.1.1 Cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel............ 27 
3.4.1.2 Separación de proteínas por precipitación con sales (salting out) ........................ 28 
MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................................. 29 
4.1 Cultivo del microorganismo ......................................................................................... 29 
4.2 Producción de enzimas en medio líquido.................................................................... 30 
 4.2.1 Medios y condiciones de cultivo............................................................................... 30 
4.3 Obtención de filtrados enzimáticos crudos ................................................................. 30 
 4.3.1 Inóculo para fermentación ........................................................................................ 30 
 
v 
 
 4.3.2 Fermentación en lote ................................................................................................ 31 
 4.3.3 Actividad exo-pectinolítica medida por grupos reductores .................................... 31 
 4.3.4 Actividad de pectin liasas ......................................................................................... 31 
 4.3.5 Concentración de los filtrados enzimáticos por liofilización y precipitación con 
Sulfato de Amonio ...................................................................................................................... 32 
4.4 Purificación .................................................................................................................... 32 
 4.4.1 Cromatografía de intercambio iónico ....................................................................... 32 
 4.4.2 Pre-tratamiento de las fracciones enzimáticas provenientes de una cromatografía 
para su uso en geles de SDS-PAGE (SDS Polyacrilamide-Gel Electrophoresis) ................ 33 
 4.4.3 Obtención de geles de SDS-PAGE ......................................................................... 34 
 4.4.4 Zimogramas ............................................................................................................... 34 
4.5 Caracterización .............................................................................................................. 35 
4.5.1 Medición de proteína por el método de Bradford ........................................................... 35 
4.5.2 Preferencia de sustrato .................................................................................................... 35 
4.5.3 Determinación del pH óptimo........................................................................................... 36 
4.5.4 Determinación de temperaturaóptima ............................................................................ 36 
4.5.5 Determinación del efecto de iones .................................................................................. 36 
4.5.6 Estabilidad al pH ............................................................................................................... 37 
4.5.7 Estabilidad a la temperatura ............................................................................................ 37 
4.5.8 Cinética enzimática ........................................................................................................... 37 
4.6 Esquema general de la producción, purificación y caracterización de pectin liasas 
de Aspergillus flavus CECT 2687 ....................................................................................... 38 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................................... 39 
5.1 Efecto de la concentración de la fuente de carbono sobre la producción de 
pectinasas en fermentaciones en lote ............................................................................... 39 
5.1.1 Comportamiento del pH a través del tiempo durante la producción de pectinasas .... 42 
5.1.2 Comportamiento de la actividad de las transelminasas durante su producción ......... 43 
5.1.3 Determinación del tipo de síntesis de las transeliminasas producidas por Aspergillus 
flavus CECT 2687; síntesis constitutiva o inductiva. ............................................................... 44 
5.2 Medición de la actividad de transeliminasas y factores que la afectan..................... 46 
5.2.1 Determinación del efecto del pH y de la presencia del ión Calcio sobre la actividad de 
pectin liasas. ............................................................................................................................... 47 
5.3 Purificación de pectin liasas por cromatografía de intercambio Iónico. ................... 48 
5.3.1 Reproducibilidad de la producción y purificación de pectin liasas................................ 49 
 
vi 
 
5.3.2 Pruebas de nivel de purificación de pectin liasas (gel SDS-PAGE y zimograma) ...... 51 
5.3.3 Rendimiento de la purificación ......................................................................................... 55 
5.4 Caracterización de la pectin liasa pura ........................................................................ 56 
5.4.1 Preferencia de sustrato .................................................................................................... 57 
5.4.2 Determinación del pH óptimo........................................................................................... 59 
5.4.3 Determinación de la temperatura óptima ........................................................................ 60 
5. 4.4 Ecuación de Arrhenius y Ea ............................................................................................ 61 
5.4.5 Efecto de iones sobre la actividad ................................................................................... 62 
5.4.6 Determinación de la estabilidad al pH............................................................................. 64 
5.4.7 Determinación de la estabilidad a la temperatura .......................................................... 64 
5.4.8 Cinética enzimática ........................................................................................................... 66 
5.5 Identificación de proteínas por espectrometría de masas de alta definición ........... 70 
CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 75 
REFERENCIAS .................................................................................................................................. 78 
 
INTRODUCCIÓN | 1 
1 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 1 
INTRODUCCIÓN 
 
La presencia de hongos en las actividades humanas, principalmente las relacionadas 
con la alimentación, tienen un fuerte impacto sobre las mismas. Algunos son deseables 
por ejemplo en la producción de quesos, mientras que otros son indeseables 
principalmente en la agricultura y almacenamiento de semillas requeridas para su 
consumo animal o humano. En contraste, muchos hongos, incluyendo a Aspergillus, 
aprovechan los recursos que las actividades humanas les proporcionan para su 
desarrollo, lo que resulta en la asociación de grandes poblaciones de hongos con 
diversas actividades humanas, principalmente las relacionadas con la agricultura (Cotty 
et al, 1994). 
 
La diseminación de hongos está asociada con la mayoría de los objetos que residen en 
los campos, incluidos los insectos, pues éstos pueden servir como vectores de 
propagación. Aspergillus flavus crece y se multiplica fácilmente en cosechas dañadas 
por insectos, excrementos de insectos y en los insectos muertos y otros hospederos 
parasitados (Cotty et al, 1994). 
 
El género Aspergillus se encuentra distribuido en todo el mundo y de él se derivan 
secciones como Flavi, Circumdati, Fumigati, Nigri (Samson et al, 2006), entre otras, las 
que, en conjunto, se componen por más de 180 especies oficialmente reconocidas. A 
pesar de que incluye uno de los principales patógenos para los seres humanos; 
Aspergillus fumigatus, la mayor parte de los miembros de este género son 
INTRODUCCIÓN | 1 
2 
 
microorganismos útiles en la naturaleza para la degradación de plantas y polisacáridos, 
además de tener una importancia significativa en la industria para la producción a gran 
escala de enzimas homólogas y heterólogas. Entre ellos, Aspergillus oryzae y 
Aspergillus niger se encuentran reconocidos generalmente como seguros (GRAS, por 
sus siglas en ingles) por la Food and Drug Administration (FDA, por sus siglas en 
inglés) en Estados Unidos (Ward et al, 2006). 
 
Durante periodos de sequía se ha observado el rápido incremento y desarrollo de 
varios Aspergilli en asociación con cultivos. Estos Aspergilli incluyen a A. flavus, el cual 
a principios de los años 60´s, fue identificado como productor de aflatoxinas, las cuales 
han intoxicado y causado cáncer de hígado a diversas especies animales. (Cotty et al, 
1994). 
 
El tipo de aflatoxina más común, la aflatoxina B1, es un potente hepatocarcinógeno, por 
lo que el contenido de aflatoxinas es regulado en alimentos, especialmente en 
productos para infantes (Cotty et al, 1994), siendo entonces la producción de 
aflatoxinas, para muchos, el tema de mayor interés del grupo fúngico A. flavus. 
 
Además de la importancia de la exposición y efecto de las aflatoxinas en humanos al 
consumir alimentos provenientes de cultivos contaminados, también se presenta un 
interés de estudiar y controlar la contaminación por razones económicas al limitar el 
valor y uso de productos agrícolas y ganaderos. 
 
Aunque el grupo de A. flavus no es comúnmente reconocido como benéfico, estos 
organismos ubicuos pueden convertirse en miembros dominantes de la microflora en 
determinadas circunstancias. Estos hongos son microorganismos degradadores 
importantes de restos de cultivos y pueden jugar un papel en la solubilización y el 
reciclaje de nutrientes para los cultivos y el suelo. A. flavus, incluso es capaz de 
degradar la lignina. Como patógenos de insectos, estos hongos son útiles para limitar 
las poblaciones de plagas e incluso han sido considerados como agentes potenciales 
de reemplazar a los insecticidas químicos (Cotty et al, 1994). 
 
INTRODUCCIÓN | 1 
3 
 
Por otro lado, los hongos del grupo A. flavus han tenido una larga historia en el 
procesamiento de productos para aumentar su utilidad y valor, por ejemplo, 
produciendo las enzimas del procesamiento de alimentos y otros usos industriales e 
incluso para producir productos terapéuticos. Entre las especies utilizadas para estos 
fines destacan A. sojae y A. oryzae.A lo largo de este trabajo, la característica mayormente descrita y de mayor importancia 
para los fines que nos incumben de Aspergillus flavus es la producción de enzimas. 
Este hongo filamentoso produce enzimas pectinolíticas, celulolíticas y xilanolíticas, que 
utiliza para degradar los polisacáridos de la pared celular y así poder penetrar y 
establecerse en el tejido vegetal. Las pectinasas, particularmente, son las primeras 
enzimas degradadoras de la pared celular en ser producidas por patógenos fúngicos al 
cultivarlos y durante una infección de tejido vegetal (Whitehead, 1995; Mellon, 2007), 
siendo de especial atención que, a la fecha, sólo se han caracterizado 4 pectinasas de 
A. flavus, a pesar de que el fitopatógeno tiene al menos 18 genes que codifican para 
ese tipo de enzimas (Cleveland et al, 2009). 
 
La importancia del estudio y caracterización de las enzimas producidas por A. flavus en 
este trabajo se debe a la naturaleza saprófita de este hongo en cultivos agrícolas y 
semillas de consumo humano y animal, además de los posibles efectos de las enzimas 
sobre la planta para poder crecer y desarrollarse en la misma. Por lo anterior, y aunado 
al impacto económico y en la salud que Aspergillus flavus tiene sobre la cadena 
alimenticia y la falta de trabajos que permitan elucidar la razón por la cuál es capaz de 
infectar el tejido de plantas vivas aún teniendo un arsenal enzimático más limitado que 
el de otras especies del género, este trabajo se enfoca a la evaluación de la producción 
de un tipo de enzimas degradadoras de la pared celular como factor de patogenicidad, 
las pectin liasas, provenientes de Aspegillus flavus. 
OBJETIVOS | 2 
4 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 2 
OBJETIVOS 
2.1 OBJETIVO GENERAL 
 
- Producir, purificar y caracterizar pectin liasas producidas por Apergillus flavus 
CECT 2687 empleando como sustrato desechos agroindustriales. 
 
2.2 OBJETIVOS PARTICULARES 
- Desarrollar una metodología que permita producir las pectin liasas de Aspergillus 
flavus CECT 2687. 
- Desarrollar una metodología que permita purificar las pectin liasas de Aspergillus 
flavus CECT 2687. 
- Determinar el grado de purificación de las pectin liasas mediante el empleo geles 
de electroforesis (SDS-PAGE) y zimogramas. 
- Determinar las constantes cinéticas de las pectin liasas obtenidas de A. flavus 
CECT 2687 como son Km, Vmax, Ea y temperatura y pH óptimos de trabajo. 
- Determinar la sensibilidad y estabilidad a la temperatura y el pH de pectin liasas 
aisladas de A. flavus CECT 2687. 
 
 
OBJETIVOS | 2 
5 
 
2.3 JUSTIFICACIÒN 
El interés por estudiar los sistemas enzimáticos producidos por Aspergillus flavus 
CECT 2687 se debe a que son considerados como factores de virulencia que permiten 
la propagación y colonización de tejidos vegetales por este hongo. Esto tiene una 
repercusión económica debido a la pérdida de cultivos de maíz, cacahuate y algodón 
principalmente, por la posible presencia de aflatoxinas, toxinas producidas por A. 
flavus, lo cual tiene graves implicaciones de salud. 
 
El conocimiento de las características de enzimas degradadoras de pared celular 
vegetal que produce el hongo durante la colonización de diversos tejidos vegetales, 
como lo son las pectin liasas, proporcionará información útil para la formulación de 
estrategias que permitan controlar el desarrollo de A. flavus en los cultivos.
ANTECEDENTES | 3 
6 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 3 
ANTECEDENTES 
3.1 El género Aspergillus 
Especies de Aspergillus pertenecen a los primeros organismos fúngicos que fueron 
cultivados en medios artificiales y estudiados por sus propiedades bioquímicas, 
además son de los hongos más comunes en el ambiente. La primera descripción de 
Aspergillus data de 1727, provista por Micheli con una clara descripción del género 
mediante un diagnóstico e ilustraciones simples siendo la morfología de su conidióforo- 
estructura que alberga las esporas asexuales- la característica taxonómica más 
importante (Smith et al, 1994; De Vries y Visser, 2001). 
 
Aspergillus es uno de los microorganismos más comunes en la tierra. Existen más de 
180 especies, todos agrupados juntos porque forman estructuras reproductivas 
asexuales similares. Las especies de Aspergillus son capaces de producir un gran 
número de conidiosporas. Sus esporas son clonales, por lo que la esporulación de una 
colonia de este género da como resultado la formación de millones de propágulos 
genéticamente idénticos (Bennett, 2009). 
 
Las características macro y micromorfológicas, tales como el color de los conidios, la 
forma de la cabeza, la superficie y dimensiones del conidióforo, la forma y textura de 
las esporas, han permitido agrupar los aspergilos en secciones, por ejemplo, 
Circumdati, Flavi, Fumigati, Nigri y otras, o grupos como: A. flavus, A. ochraceus, A. 
niger, entre otros (Carrillo, 2003, Samson et al, 2006). 
ANTECEDENTES | 3 
7 
 
La mayoría de los Aspergilli pueden ser fácilmente identificados cuando son cultivados 
en Czapek y agar extracto de malta. Samson y Pitt (1985) recomendaron agar Czapek-
levadura y agar extracto de malta mayormente para obtener especies anamórficas 
(Smith et al, 1994) siendo los Aspergilli, en su mayoría, un género que se reproduce 
sólo por esporas asexuales (Bennett, 2009). 
 
La principal característica macroscópica para la identificación de los grupos de 
Aspergillus es el color. Poseen distintos tonos de verde, pardo, amarillo, blanco, gris y 
negro. Bajo el microscopio se pueden observar cabezas conidiales en cuatro formas 
básicas: globosa, hemisférica, columnar y claviforme (Fig. 1) (Carrillo, 2003). 
 
 
Fig. 1 Representación esquemática de la estructura microscópica 
de los tipos de conidióforos del género Aspergillus (Carrillo, 2003). 
 
En los aspergilos, los conidios constituyen cadenas que se originan en la célula 
conidiógena o fiálide. En algunos Aspergilli hay células adyacentes a las fiálides 
denominadas métulas o células de soporte (Carrillo, 2003). La base del conidióforo es 
en forma de “T” o “L” y se llama célula de pie, a pesar de que no es una célula 
ANTECEDENTES | 3 
8 
 
separada. La célula de pie es una característica del conidióforo de Aspergillus (Bennett, 
2009). 
 
Este género contiene varias especies de importancia económica ya sea positiva o 
negativa para la industria, la agricultura y la medicina. Desde tiempos remotos han sido 
empleados en la fermentación de alimentos. Dentro de este género se encuentran 
algunas especies potencialmente patógenas como A. parasiticus, A. flavus, A. niger, A. 
nidulans, A. terreus y otras. Existen diversos tipos de patógenos; patógenos de plantas 
o de insectos, saprófitos y oportunistas. Los patógenos saprófitos y oportunistas 
presentan el espectro más amplio de proteínas y enzimas de degradación de 
polisacáridos, indicativos de un estado nutricional menos especializado. A. flavus se 
considera un patógeno oportunista (Bennett, 2009) que, por definición, ataca a cultivos 
especialmente en estrés, inmunosupresión o dañados. 
 
La identificación de especies de este género tradicionalmente se hace en base a las 
características macro y micromorfológicas en diversos medios de cultivo incubados a 
distintas temperaturas, debido a la necesidad de conocer el contaminante para orientar 
la búsqueda de micotoxinas en un producto. Además, se han desarrollado métodos 
inmunológicos y moleculares rápidos para la identificación de los hongos 
contaminantes de granos y otros productos vegetales. (Carrillo, 2003). 
 
Se usan algunos medios especializados para el aislamiento e identificación de 
Aspergilli potencialmente aflatoxigénicos (Smith et al, 1994). Es de considerar que el 
volumen de medio vaciado en la caja de petri influye sobre el diámetro de las colonias y 
otras características (Carrillo, 2003). 
 
3.1.1 Aspergillus flavus 
Aspergillus flavus es un hongo saprófitoque tiene una distribución mundial y 
frecuentemente aislado de cultivos agrícolas. Crece en un muy vasto número de 
sustratos (particularmente bajo condiciones de alta humedad ambiental), teniendo la 
capacidad de crecer en medios simples y complejos, ya que contiene un amplio 
paquete enzimático. Este fitopatógeno crece preferentemente en cultivos de maíz, 
ANTECEDENTES | 3 
9 
 
algodón y cacahuate; aunque se ha aislado de mandioca, chiles, mijo, arroz, sorgo, 
semillas de girasol, nueces, trigo y una gran variedad de especias. Aspergillus flavus 
crece de forma agresiva en todas las etapas de la cadena alimenticia: en el campo, en 
el almacenamiento y en casa. 
 
Pertenece a la subdivisión de los Fungi Imperfecti que incluye a los hongos que se 
reproducen por mecanismos asexuales. Su ciclo de vida puede comprender de 2 
etapas, una etapa asexual; conidiación o producción de esporas por mitosis, y otra 
sexual; formación de cleistotecios con formación de esporas por meiosis. 
 
En relación a las características macroscópicas de Aspergillus flavus, las colonias son 
de color verde oliváceo a verde amarillento, micelio blanco, esclerocios (masas 
redondeadas de micelio parecidos a los cleistotecios pero sin esporas asexuales), 
cuando están presentes, de color marrón oscuro a negro, variables en forma y tamaño; 
reverso incoloro, marrón claro y/o anaranjado; textura de la colonia variable, 
generalmente lanosa o aterciopelada (Abarca, 2000). Tanto los esclerocios como los 
cleistotecios, son estructuras morfológicas que sirven como identificación entre una 
cepa y otra. Bennet (2010) comenta que los esclerocios, sirven como estructuras de 
descanso que permiten a las especies sobrevivir a condiciones adversas de 
crecimiento. 
 
Este organismo es un patógeno oportunista y tiene importancia agronómica debido a 
que algunas de las especies que comprenden el grupo A. flavus, como A. flavus y A. 
parasiticus, tienen la capacidad de producir metabolitos altamente tóxicos y 
carcinógenos llamados aflatoxinas. Puede producir la sustancia carcinogénica natural 
más potente conocida, aflatoxina B1, durante la infección de semillas, lo que resulta en 
la disminución del valor de los cultivos (Mellon et al, 2002), considerándola además 
como una gran amenaza para la salud humana y el ganado. Sin embargo, los factores 
de patogenicidad aún no han podido ser puestos en manifiesto por la secuencia de 
ADN o estudios de genómica funcional (Bennett, 2009). 
 
ANTECEDENTES | 3 
10 
 
El desarrollo óptimo de A. flavus ocurre a 36°C con una actividad de agua de 0.95, 
mientras que la producción de aflatoxinas es favorecida por una temperatura de 33°C a 
una actividad de agua 0.99, aunque pueda ser formada aún a 15°C con una actividad 
de agua de 0.95, por lo que su cultivo es relativamente seguro, debido a la baja posible 
exposición a las aflatoxinas (Carrillo, 2003). 
 
Además de los efectos patogénicos de algunas cepas de este grupo, otras también han 
tenido una larga historia en el tratamiento para aumentar utilidad y valor de productos. 
Cepas del grupo A. flavus, como A. oryzae y A. sojae, se utilizan para producir enzimas 
para el procesamiento de alimentos y otros usos industriales e incluso para producir 
productos terapéuticos tales como urato oxidasa y lactoferrina. 
 
Por otro lado, hongos del grupo A. flavus son degradadores importantes de restos de 
cultivos y pueden jugar un papel en la solubilización y el reciclaje de nutrientes de los 
cultivos y el suelo. Como patógenos de insectos, estos hongos pueden servir para 
limitar poblaciones de plagas e incluso se han considerado potenciales agentes 
sustitutos de los insecticidas químicos (Cotty et al, 1994). 
 
3.1.2 Aflatoxinas 
Químicamente, las aflatoxinas son un grupo de metabolitos secundarios heterocíclicos, 
estrechamente relacionados entre sí, sintetizados y excretados por Aspergillus flavus y 
Aspergillus parasíticus principalmente (Armijo & Calderón, 2009), y se consideran el 
cancerígeno biológico más potente conocido. 
 
Aunque han sido identificados al menos 20 tipos diferentes de aflatoxinas, las más 
comunes son: 
 Aflatoxina B1 (AFB1); es metabolizada a aflatoxina M1 (AFM1) (Fig.2). 
 Aflatoxina B2 (AFB2). 
 Aflatoxina G1 (AFG1). 
 Aflatoxina G2 (AFG2)(Moreno et al, 2000). 
 
ANTECEDENTES | 3 
11 
 
 
Fig.2 Biotransformación de la aflatoxina B1 a aflatoxina M1 
 
La AFB1 es la más común de las cuatro y presenta mayor toxicidad. La aflatoxina M1 
(AFM1) es el derivado 4-hidroxi de la AFB1 y es excretada en la leche de las hembras 
de mamíferos que consumen AFB1 en su dieta. Tanto la AFB1 como la AFM1 son 
compuestos hepatotóxicos y carcinogénicos y sus efectos sobre la salud pública 
constituyen una preocupación constante. (Armijo & Calderón, 2009). 
 
Estas micotoxinas se producen y consumen con alimentos contaminados, se acumulan 
por años en el ADN, causan efectos dañinos como mutaciones, malformaciones en 
fetos, abortos y cánceres diversos (de hígado, páncreas, colorectal, de pulmón, y/o 
cervicouterino). 
 
Las aflatoxinas no se ven, carecen de sabor y olor, son resistentes al calor (soportan 
entre 260 y 320°C sin descomponerse) y a procesos como cocción, ultrapasteurización, 
nixtamalización y fermentación (Carvajal, 2013). 
 
Además de los efectos adversos en la salud de animales y humanos, las aflatoxinas 
tienen un efecto negativo en la economía debido a las pérdidas de cultivos por 
contaminación. 
 
Por lo anterior, el contenido de aflatoxinas es regulado en alimentos, especialmente en 
productos para infantes. En los países donde la regulación es insuficiente en la comida 
o es aplicada inadecuadamente puede producirse la ingestión rutinaria de las 
aflatoxinas. En poblaciones con una exposición relativamente alta a las aflatoxinas, se 
ANTECEDENTES | 3 
12 
 
sugiere como un factor de riesgo de contraer cáncer primario de hígado en los seres 
humanos (Cotty et al, 1994). 
 
Por su importancia, las aflatoxinas han sido estudiadas constantemente y las ruta de su 
biosíntesis se ha convertido en un modelo para el estudio de la bioquímica y la biología 
molecular del metabolismo secundario de hongos (Bennett, 2009). 
 
3.1.3 Efecto de la contaminación por aflatoxinas de cultivos agrícolas en México 
El estudio intensivo y sistemático de las micotoxinas se inició a principios de la década 
de 1960 con el descubrimiento de las aflatoxinas, las cuales son productos del 
metabolismo secundario de ciertos hongos del género Aspergillus, de donde derivaron 
su nombre (Moreno et al, 2000). Los mohos verde-amarillentos que pertenecen al 
grupo Aspergillus flavus son los únicos capaces de producir aflatoxinas. No obstante, 
se debe indicar que no todos las especies de este grupo fúngico producen aflatoxinas, 
por lo que la presencia de Aspergillus no necesariamente implica la presencia de estas 
toxinas. Por el contrario, la ausencia de Aspergillus en el alimento no necesariamente 
implica que el alimento no tenga aflatoxinas, debido a que la toxina puede persistir aun 
después que el moho ha desaparecido e incluso después de la cocción del alimento 
(Armijo & Calderón, 2009). 
 
Las aflatoxinas se han detectado en la leche, queso, maíz, cacahuate, algodón, 
nueces, almendras, higos y una gran variedad de alimentos para animales. Leche, 
huevos y carne son contaminados algunas veces por el consumo de alimento 
contaminado por animales. Sin embargo, los productos básicos con el más alto riesgo 
de contaminación por aflatoxinas son el maíz, cacahuate y semillas de algodón (Armijo 
& Calderón, 2009). 
 
La contaminación por aflatoxinas es un problema agrícola peculiar y frustrante, porque 
menos de 1 % de la cosecha puede estar contaminado con niveles suficientemente 
altos como para que la media de toda la cosecha exceda las concentraciones 
permisibles (Cotty et al, 1994) que en México esde 20 µg/kg de producto (NOM-188-
ANTECEDENTES | 3 
13 
 
SSA1-2002). La manera más efectiva de evitar los problemas ocasionados por las 
aflatoxinas es impedir que el hongo crezca en el sustrato (Moreno et al, 2000). Su 
impacto económico incluye la pérdida de vidas humanas y animales, el incremento en 
los costos de salud y atención veterinaria, reducción en la producción animal y otros 
problemas económicos y comerciales (Quezada et al, 2011). 
 
Las aflatoxinas muestran ser productos químicos no nutritivos y agentes de control 
biológico de otras especies en el medio ambiente. Son metabolitos secundarios de los 
cuales su función principal es desconocida, sin embargo, su valor adaptativo resulta ser 
de importancia cuando se habla de interacciones entre las aflatoxinas, Aspergillus y la 
agricultura. Además el grupo A. flavus normalmente contiene una amplia gama de otros 
metabolitos tóxicos. Algunos de estos metabolitos no se encuentran en otras 
estructuras fúngicas y en combinación con aflatoxinas, estas toxinas pueden formar un 
sistema de defensa química dirigida a la protección de los esclerocios de la 
depredación de insectos. El ácido kójico, metabolito de la mayoría de las cepas de A. 
flavus, puede aumentar sinérgicamente la toxicidad de las aflatoxinas. 
 
Desde la floración hasta la maduración, las semillas y frutos son vulnerables a diversas 
perturbaciones. Durante la maduración la mayoría de los cultivos son susceptibles a la 
contaminación por aflatoxinas. Heridas o estrés de los frutos pueden llevar al aumento 
de las porciones de los cultivos con niveles muy altos de toxina por predisposición a la 
infección, sin embargo, los hongos son capaces de infectar organismos sanos (Cotty et 
al, 1994). 
 
En México se ha reportado la incidencia de aflatoxinas en granos y productos 
elaborados a base de maíz en diferentes regiones geográficas (Quezada et al, 2011). 
 
En México el grano de maíz es el más importante para la alimentación humana, 
destacándose por sembrarse anualmente en casi 8,000,000 de hectáreas, produciendo 
alrededor de 21,000,000 de toneladas, con un rendimiento promedio de 2.63 ton/ha. La 
productividad del maíz se afecta por factores bióticos, abióticos y de manejo 
agronómico, desde la preparación de la siembra hasta el almacenaje poscosecha. 
ANTECEDENTES | 3 
14 
 
En un estudio hecho en el estado de Guerrero en 2010 se determinó que la cantidad de 
maíz contaminado del total producido en almacenamiento es del 5% con niveles de 
aflatoxinas superiores al límite permisible. 
 
Entre los agricultores de bajos recursos las pérdidas globales en poscosecha están 
entre 10 y 40%, demostrándose que las más importantes (arriba del 50%) ocurren 
cuando las condiciones de manejo y asistencia técnica son deficientes. En regiones 
tropicales y subtropicales comúnmente la infestación por plagas puede iniciar en campo 
y posteriormente en el almacén. En México se han realizado investigaciones sobre 
pérdidas poscosecha; las cuales reportan que, en regiones de clima húmedo la 
incidencia de plagas supera el 80%, y es la primera causa de pérdidas en grano 
almacenado (SAGARPA, 2011). 
 
3.2 Polisacáridos estructurales de la pared celular vegetal 
Los polisacáridos de la pared celular son los compuestos orgánicos más abundantes 
en la naturaleza. Ellos constituyen el 90 % de la pared celular vegetal y se pueden 
dividir en tres grupos: celulosa, hemicelulosa y sustancias pécticas (de Vries & Visser, 
2001) organizados de tal manera que la pared celular es químicamente estable y 
físicamente sólida. 
 
Las paredes celulares de las plantas forman una matriz extracelular única y continua a 
través del cuerpo de la planta y las paredes de muchas células juntas forman el 
esqueleto de los tejidos vegetales. Estas, además de controlar el crecimiento celular, 
influyendo en tamaño y forma, actúan como una barrera estructural pre-existente a la 
invasión de microorganismos (Schols & Voragen, 1996). 
 
La pared celular es la primera línea de defensa de las plantas, que tiene un importante 
papel en la prevención de infecciones. Su composición puede cambiar de acuerdo a la 
edad y las condiciones fisiológicas de la planta (Biscaro et al, 2009). 
 
ANTECEDENTES | 3 
15 
 
Si bien la composición química de los polímeros que componen la pared celular ha sido 
descrita en detalle, no existe un modelo definitivo acerca de la disposición 
tridimensional de estos componentes. El modelo más aceptado, propone que las 
microfibrillas de celulosa estarían entrecruzadas por xiloglucanos y que las pectinas 
estarían ocupando los espacios libres. En la figura 3, se esquematiza dicho modelo. Se 
observa por sobre la pared celular primaria la lámina media, que es una zona rica en 
pectinas entre las paredes primarias de dos células y que proporciona conexiones 
intercelulares (Guillermo, 2007). 
 
 
Fig.3.Representaciòn esquemática de la disposición de 
polisacáridos en la pared celular vegetal (Prasanna et al, 2007). 
 
Además, los componentes poliméricos de la pared celular tienen interacciones entre sí, 
teniendo una importancia en el arreglo y propiedades de la misma. Una representación 
simple y general de dichas interacciones se muestra en la figura 4. 
 
ANTECEDENTES | 3 
16 
 
 
Fig. 4 Esquema general de las interacciones presentadas entre 
los polisacáridos de la pared celular vegetal (Guillermo, 2007). 
 
3.2.1 Sustancias pécticas 
Uno de los componentes importantes de las paredes celulares de las plantas está 
formado por el grupo de sustancias pécticas. Las sustancias pécticas son complejos 
glicosídicos de alta masa molecular. Son macromoléculas encontradas en las plantas 
superiores. Se encuentran presentes en la pared celular primaria y son los 
componentes principales de las laminillas medias, actuando como adhesivo 
extracelular en una delgada capa formada entre las paredes de las células jóvenes 
adyacentes. En consecuencia, son en gran parte responsables de la integridad 
estructural y la cohesión de los tejidos de las plantas. 
 
Con frecuencia la palabra pectina se utiliza como un nombre genérico para las 
sustancias pécticas. 
 
Las sustancias pécticas se clasifican de acuerdo con su nivel de esterificación; pectina 
tiene al menos 75% de los grupos carboxilo metilados; ácido pectínico tiene menos del 
75% de los grupos carboxilo metilados; ácido péctico o ácido poligalacturónico no tiene 
ningún grupo carboxilo metil esterificado (Biscaro et al, 2009).Estas macromoléculas 
tienen carga negativa y son ácidas. Representan entre el 0,5 al 4% del peso fresco de 
material vegetal, no tienen un peso molecular definido. Las masas moleculares 
relativas de las sustancias pécticas van desde 25 hasta 360 kDa (Singh et al, 2005). 
 
ANTECEDENTES | 3 
17 
 
En general, las pectinas son el grupo de componentes mayoritarios en la pared celular 
de los frutos y pueden llegar a conformar la mitad del contenido polimérico de la pared 
(Guillermo, 2007). 
 
La pectina es un material polimérico que tiene grupos carboxílicos esterificados con 
metanol. Se puede dividir en dos regiones; “región lisa” y “región vellosa”, dependiendo 
del grado de ramificaciones que contenga la cadena de ácido galacturónico. El grado 
de esterificación depende de la fuente de la que se obtenga. En su mayoría se 
compone estructuralmente de tres tipos de polisacáridos bien caracterizados; 
homogalacturonano (HGA), ramnogalacturonano I (RGI) y ramnogalaturonano II (RGII). 
Estos tres polisacáridos forman una red compleja (Yadav et al, 2009). 
 
El HGA representa la cadena principal de la molécula de pectina, que contiene enlaces 
α-1,4 entre residuos de ácido-D-galacturónico que pueden estar metilados en la 
posición 6 (Yadav et al, 2009). Es conocido como la región lisa de la pectina (Fig. 5). 
RGI se compone de la repetición del disacárido ramnosa-ácido galacturónico. Losresiduos galacturónicos pueden ser acetilados y ambos residuos puede llevar cadenas 
laterales de azúcares neutras como galactosa, arabinosa y xilosa (Fig. 6). RGII es, a 
pesar de su nombre, una cadena de homogalacturonano con cadenas laterales de 
complejos unidos a los residuos de ácido galacturónico (Fig. 7) (Biscaro et al, 2009). 
 
 
Fig. 5 Representación esquemática del Homogalacturonano (HGA) (Guillermo, 2007). 
ANTECEDENTES | 3 
18 
 
 
 
Fig. 6 Representación esquemática del Ramnogalacturonano I (RI) (Guillermo, 2007). 
 
 
Fig. 7 Representación esquemática del Ramnogalacturonano II (RII) (Guillermo, 2007). 
 
3.3 Enzimas fúngicas degradadoras de la pared celular de plantas 
Los patógenos de plantas atacan a las células diana mediante la producción de un 
número de enzimas degradadoras de la pared, facilitando así la entrada y expansión 
del patógeno en el tejido del huésped. Tales enzimas fitopatógenas incluyen 
pectinasas, celulasas, xilanasas y proteasas (Yadav et al, 2009). 
ANTECEDENTES | 3 
19 
 
La producción de múltiples formas de enzimas mejora la capacidad del microorganismo 
de adaptación a las modificaciones del medio ambiente. La mayoría de los 
microorganismos patógenos producen una gran variedad de enzimas degradadoras de 
la pared celular de las plantas y algunos estudios muestran que, a este respecto, 
poligalacturonasas juegan un importante papel en la virulencia de algunos hongos y 
bacterias (Biscaro et al, 2009). 
 
Particularmente los hongos secretan ácidos y enzimas a su ambiente circundante, para 
romper las moléculas poliméricas en otras más simples como estrategia nutricional 
(Pradal, 2012). 
 
En el género Aspergillus se han identificado cuatro tipos de celulasas, aunque el 
número de isoenzimas producidas por diferentes especies, e incluso diferentes cepas 
de la misma especie, puede variar. Además, se ha observado la producción de 
celulasas y xilanasas por Aspergillus bajo la presencia de ciertas fuentes de celulosa y 
xilosa respectivamente en el medio de cultivo (Pradal, 2012). 
 
Cepas de A. flavus producen grandes cantidades de enzimas; pectinasas, celulasas, 
proteasas y xilanasas, que probablemente aumentan su capacidad de utilizar una 
amplia gama de recursos orgánicos (Cotty et al, 1994), incrementando así su 
capacidad de penetración e invasión de los cultivos. 
 
3.3.1 Pectinasas 
Las pectinasas son un gran grupo de enzimas que descomponen los polisacáridos 
pécticos de tejidos vegetales en moléculas simples como ácido galacturónico (Biscaro 
et al, 2009). 
 
Dado que las sustancias pécticas son un grupo de macromoléculas muy complejo, se 
necesitan varias enzimas pectinolíticas para degradarlas por completo (Biscaro et al, 
2009). En la región peluda actúan enzimas como la exogalacturonasa, la 
ramnogalacturonano hidrolasa, la ramnogalacturonano ramnohidrolasa y α-
ANTECEDENTES | 3 
20 
 
ramnosidasa, mientras que en la región suave actúan enzimas como las endo- y exo-
poligalacturonasas y liasas. 
 
Las pectinasas son unas de las enzimas más ampliamente distribuidas en las 
bacterias, los hongos y las plantas (Singh et al, 2005). Estas se producen 
abundantemente por hongos saprófitos en tejido vegetal en descomposición, que 
representa el sustrato más común para los microorganismos productores de pectinasas 
(Biscaro et al, 2009). 
 
Casi todas las preparaciones comerciales de pectinasas se producen a partir fuentes 
fúngicas. Aspergillus niger es la especie fúngica más comúnmente utilizada para la 
producción industrial de enzimas pectinolíticas (Singh et al, 2005). 
 
El ataque de plantas por microorganismos por lo general comienza por el ataque de 
enzimas pectinolíticas al ser las sustancias pécticas más accesibles que otras fibras en 
el tejido vegetal (Biscaro et al, 2009). Estas enzimas desempeñan un papel 
fundamental en la completa degradación de la pared celular de la planta, ya que la 
despolimerización de pectina expone a otros componentes de la pared (Kitamoto et al, 
2001). Además, las enzimas pectinolíticas endógenas en plantas son de gran 
importancia para el ablandamiento de algunos tejidos durante la maduración y el 
almacenamiento. Estas también ayudan a mantener el equilibrio ecológico, causando la 
descomposición y el reciclaje de materiales de plantas de residuos. El deterioro de 
frutas y verduras por podredumbre es otra de las manifestaciones principales de las 
enzimas pectinolíticas (Singh et al, 2005). 
 
Varios estudios sobre las enzimas microbianas, de diversas cepas, han demostrado la 
producción de múltiples formas moleculares de pectinasas que difieren en propiedades 
físicas y cinéticas (Biscaro et al, 2009). 
 
Las pectinasas comprenden un número de enzimas clasificadas en varias clases y 
subclases dependiendo la especificidad de sustrato y modo de acción (Yadav et al, 
2009). Entre las pectinasas se distinguen dos grupos: las pectinesterasas, las cuales 
ANTECEDENTES | 3 
21 
 
remueven los grupos metoxilo, y las despolimerasas (hidrolasas y liasas) que degradan 
la cadena principal (Vallejo et al, 2009). 
 
Las diferencias estructurales entre las cadenas principales de la región ramificada y la 
región lisa de la pectina tienen implicaciones en las enzimas que degradan cada región 
(Pradal, 2012). Enzimas como protopectinasas, poligalacturonasas, pectina liasas y 
esterasas son algunas de las enzimas pectinolíticas más ampliamente estudiadas. Las 
protopectinasas catalizan la solubilización de protopectina. Las poligalacturonasas 
hidrolizan la cadena de ácido poligalacturónico mediante la adición de agua y son los 
más abundantes entre todas las enzimas pectinolíticas. Las liasas catalizan la escisión 
por trans-eliminación del polímero de ácido galacturónico. Las pectinesterasas liberan 
metanol por desesterificación de los enlaces éster en la cadena principal de la pectina 
(Singh et al, 2005). 
 
Las enzimas más importantes que participan en la degradación de la cadena principal 
pueden dividirse en hidrolasas y liasas. En Aspergillus se han identificado seis tipos de 
hidrolasas 
 
La cadena principal de la región lisa puede ser hidrolizada por pectin liasas, pectato 
liasas y poligalacturonasas. En la región rugosa, participan un gran número de enzimas 
degradadoras. Tanto enzimas que actúan en la región rugosa como la 
exogalacturonasa, la ramnogalacturonano hidrolasa, la ramnogalacturonano 
ramnohidrolasa y la ramnosidasa; como las endo- y exo-poligalacturonasas que actúan 
en la región lisa, hidrolizan el sustrato vía un mecanismo de inversión. Las liasas 
rompen la cadena principal de la pectina mediante β-eliminación (Pradal, 2012). 
 
La producción de enzimas pectinolíticas se ha encontrado al hacer crecer a hongos en 
pectina de betabel, pectina de manzana, ácido poligalacturónico, una combinación de 
ramnosa y ácido galacturónico, y harina de frijol de soya. Sin embargo, también se ha 
reportado que algunas enzimas pectinolíticas y algunos genes que codifican para 
poligalacturonasas se producen y se expresan constitutivamente en A. flavus, A. 
parasiticus y A. niger (Pradal, 2012). 
ANTECEDENTES | 3 
22 
 
La regulación de los genes pectinolíticos parece ser compleja, pues la expresión en 
cada organismo se presenta en diferentes momentos y en respuesta a diferentes 
fuentes de carbono que contienen ácido D-galacturónico (Biscaro et al, 2009), lo que 
resulta en una posible producción de una gran variedad de enzimas pectinolíticas. 
 
La capacidad de algunos microorganismos fitopatógenos de producir una variedad de 
enzimas pectinolíticas que difieren en sus características, principalmente en su 
especificidad de sustrato, puede darles más eficacia en la degradación de la pectina de 
la pared celular y por consiguiente más éxito en la infección de plantas (Biscaro et al, 
2009). 
 
Tabla 1 Resumen de las principales enzimas pécticas 
 
3.3.2Transeliminasas 
Las pectin liasas y pectato liasas son conocidas como transeliminasas por su modo de 
acción sobre la pectina. Ambas escinden la cadena principal de pectina por β-
eliminación, lo que resulta en la formación de un extremo no reductor 4,5-insaturado 
(fig. 8), dando como resultado una conjugación con el resto del carbonilo del metil ester 
que presenta una fuerte absorción de radiación UV a 235 nm (Famurewa et al, 1993). 
 
 
ANTECEDENTES | 3 
23 
 
 
Fig. 8 Representación esquemática de la reacción de despolimerización de la 
pectina por acción de las pectin liasas (Singh et al, 2005). 
 
Entre todas las pectinasas, las liasas son de particular interés porque degradan 
polímeros de pectina directamente por el mecanismo de β-eliminación, mientras que 
otras pectinasas actúan secuencialmente para degradar la molécula de pectina 
completamente (Yadav et al, 2009). 
 
Las pectin liasas prefieren sustratos con un alto grado de metilesterificación (De Vries & 
Visser, 2001) y actúan sobre los enlaces glucosídicos próximos a los grupos 
carboxílicos metil esterificados (Gummadi & Sunil, 2005), mientras que las pectato 
liasas prefieren aquellos con un bajo grado de esterificación. Una distinción más clara 
entre estos dos tipos de enzimas se puede hacer basado en el requisito absoluto de 
iones Ca2+ para la catálisis por pectato liasas a diferencia de las pectin liasa que son 
independientes de este ión (De Vries & Visser, 2001). 
 
El aumento del pH del medio promueve el descenso en la producción de 
poligalacturonasas y aumento en liasas cuyo pH óptimo de actividad suele ser alcalino 
(pH 8-10) (Guevara, 1997). 
 
3.3.2.1 Pectin liasas 
Las pectin liasas catalizan la escisión aleatoria de pectina, preferentemente de pectina 
altamente esterificada. Estas enzimas no requieren estrictamente de Ca2+, pero son 
estimuladas por este y otros cationes. Hasta ahora todas las pectin liasas descritas son 
endo pectin liasas (Biscaro et al, 2009). Las endo pectin liasas son las únicas enzimas 
conocidas capaces de escindir sin la acción previa de otras enzimas (Singh et al, 2005) 
pectinolíticas como las pectinesterasas. 
ANTECEDENTES | 3 
24 
 
Para la degradación completa del sustrato de pectina se requiere además de enzimas 
que escindan la cadena del ramnogalacturonano (Biscaro et al, 2009). 
 
Se ha reportado que en su mayoría las pectin liasas se obtienen de microorganismos y 
existen escasos reportes de su presencia en plantas y animales (Singh et al, 2005). 
Estas enzimas se cree que juegan un papel importante en el proceso de la infección 
inicial y la maceración de los tejidos vegetales (Famurewa et al, 1993). 
 
Las pectin liasas y otras pectinasas son enzimas inducibles y su producción está 
influenciada por la fuente de carbono (Gummadi & Sunil, 2005), siendo las que 
contienen en su estructura ácido-D-galacturónico las que promueven mayoritariamente 
su producción. 
 
Albersheim et al (1960) fue el primer grupo de trabajadores en informar sobre la 
capacidad de las enzimas para romper los enlaces glicosídicos de sustancias pécticas 
para liberar unidades de galacturónidos insaturados dividiendo el enlace en el C-4 con 
la eliminación simultánea de H+ del C-5. Desde entonces, esta reacción ha sido 
reportada para un gran número de bacterias y hongos, además se ha documentado 
que se requiere de la presencia de pectina para la inducción de la producción de otro 
tipo de transeliminasas para un gran número de microorganismos, lo que indica que las 
transeliminasas pueden ser de carácter constitutivo e inductivo. Todas las enzimas que 
hasta el momento se han reportado contribuyentes a la maceración de tejidos y la 
muerte celular vegetal son las capaces de dividir el enlace α-1,4-D–glicosídico de las 
sustancias pécticas. Por lo tanto, la maceración y la muerte celular en los tejidos 
vegetales pueden ser debido a la directa descomposición de sustancias pécticas 
presentes y accesibles en los tejidos de células huésped infectadas (Famurewa et al, 
1993). 
 
Existen escasos informes sobre la producción de pectin liasas reportados en la 
literatura. Se ha reportado que son las pectin liasas son en su mayoría sintetizadas por 
hongos, por ejemplo, Aspergillus japonicus, Penicillium paxilli, Penicillium sp., Pythium 
splendens, Pinus Pichia, Aspergillus sp, Thermoascus auratniacus (Singh et al, 2005). 
ANTECEDENTES | 3 
25 
 
El efecto de la aireación y agitación en la morfología de hongos es crucial para la 
máxima producción de pectin liasas (Gummadi & Sunil, 2005). 
 
3.3.3 Regulación genética de las enzimas degradadoras de pared celular en 
Aspergillus 
3.3.3.1 Expresión coordinada de los genes que codifican para el sistema 
pectinolítico 
La producción de enzimas que hidrolizan la cadena central de la pectina se detecta 
cuando Aspergillus se desarrolla en medios con pectina de remolacha azucarera, 
pectina de manzana, ácido poligalacturónico y harina de soya. Por otra parte, algunas 
enzimas pectinolíticas se producen constitutivamente. Adicionalmente se ha obtenido 
evidencia de que el ácido galacturónico y el ácido glucurónico, adicionados o liberados 
como monómero a parir de un polisacárido, funcionan como inductor general de los 
genes que codifican para las enzimas del sistema pectinolítico (De Vries & Visser, 
2001). 
 
3.3.3.2 Represión catabólica por fuente de carbono 
La represión catabólica por fuente de carbono en Aspergillus es predominantemente 
mediado por la proteína represora de unión al ADN llamada CreA (Dowser & Kelly, 
1991, Ruijter & Visser 1997). En presencia de fuentes de carbono que pueden ser 
fácilmente metabolizados (por ejemplo, D-glucosa, D-fructosa), CreA reprime la 
expresión de un gran número de genes mediante la unión a sitios específicos a los 
promotores de estos genes. 
 
CreA juega un papel importante en la regulación de la expresión de genes de 
Aspegillus que codifican para los sistemas de degradación de la pared celular vegetal. 
La represión por CreA ha sido reportado para los genes que codifican para arabinasas 
(Ruijter et al, 1997), endoxilanasas (Fernández-Espinar et al, 1994; Pinaga et al, 1994), 
β-xilosidasa (Kumar &Ramón, 1996), arabinoxilan arabinofuranohidrolasa (Gielkens et 
al, 1997), feruroilesterasas (De Vries et al, 2002),y varias pectinasas (Bussink et al, 
1991; Maldanado et al, 1989; Solis-Perreira et al, 1993) 
ANTECEDENTES | 3 
26 
 
3.3.3.3 Expresión de genes dependiente de pH 
Al igual que CreA en represión catabólica, PacC es la principal proteína involucrada en 
regulación genética regulada por pH en Aspergillus. A pH alcalino PacC activa genes 
que reprime a pH ácido, por lo que PacC tiene funciones duales. En condiciones 
alcalinas PacC se activa mediante proteólisis en la región C-terminal, lo cual le permite 
unirse a sitios clave en el promotor de los genes blanco. Específicamente la regulación 
genética por pH de las enzimas que degradan la pared celular de plantas, no ha sido 
estudiada a detalle, sin embargo se han obtenido indicios de una expresión 
dependiente de pH en los sistemas xilanolítico y pectinolítico (De Vries & Visser, 2001). 
 
3.4 Aislamiento y purificación de Proteínas 
La purificación de enzimas nos es de utilidad para la caracterización de las mismas, 
siendo una importante línea de investigación que permite la discriminación entre los 
componentes de complejos enzimáticos sobre mecanismo de degradación del sustrato, 
las condiciones óptimas de actividad y regulación de la síntesis de la enzima. (Biscaro 
et al, 2009). 
 
Las pectin liasas producidas por A. flavus son enzimas extracelulares debido a la 
función que cumplen (ruptura de la pared celular de plantas), pudiendo entonces 
separar las células del medio de cultivo y purificarlas a partir de este último mediante 
diversos procedimientos dependiendo de las características de cada enzima. 
 
Algunasde las características y técnicas mayormente aprovechadas para la 
purificación de pectinasas del género Aspergillus han sido: solubilidad; salting in o 
salting out, carga iónica; cromatografía de intercambio iónico, y tamaño molecular; 
cromatografía de filtración por geles 
 
3.4.1 Cromatografía 
La cromatografía es la técnica más potente de que se dispone para la purificación de 
enzimas y proteínas en general. Los métodos más comunes a nivel en laboratorio e 
ANTECEDENTES | 3 
27 
 
industria son clasificados de acuerdo con la característica de la enzima en que está 
basada la técnica. 
 
Las técnicas más comunes en la recuperación de proteínas son la cromatografía de 
intercambio iónico y de permeación en gel. Son de fácil implementación y permiten 
obtener elevados factores de purificación (incremento en la actividad especìfica) 
 
Ambas tecnicas han sido empleadas en la purificaciòn de pectin liasas de Aspergillus 
flavus (Yadav et al, 2008 y Yadav et al, 2007) y pectinasas, por lo que desde esta 
perspectiva, son herramientas que pueden ser de utilidad en la determinacion de 
protocolos de purificación de otras pectinasas producidas por distintas cepas de esta 
especie 
 
3.4.1.1 Cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel 
La cromatografìa de intercambio iónico es relativamente simple. Se requiere de un 
material hidrofìlico insolubles de carga opuesta a la carga neta de la proteìna. Se 
cuenta asì con resinas de intercambio ionico catiònico o intercambio anionico. 
 
 
 
Una vez unida la enzima a la resina y separada del resto de las proteìnas, es 
selectivamente eluida incrementando la concentraciòn de sal o bien modificando el pH. 
(Garcìa et al, 1993). 
 
Por otro lado el buffer en el que se aplica la enzima debe ser de baja fuerza iònica (de 
10 a 50mM), siendo el pH uno de los parámetros a seleccionar si se conoce el punto 
isoeléctrico de la enzima. 
 
La selecciòn de soportes para la cromatografía de permeación en gel es directo, pues 
el principal factor a considerar en que el peso molecular de la enzima esté ubicado 
ANTECEDENTES | 3 
28 
 
dentro del rango de fraccionamiento del gel. Esta técnica permite por lo tanto, previa 
estandarización, tener una idea del peso molecular de la enzima (García et al, 1993). 
 
3.4.1.2 Separación de proteínas por precipitación con sales (salting out) 
La multiplicidad de grupos ácidos y básicos de una proteínas hace que su solubilidad 
dependa de las concentraciones de las sales disueltas (Voet & Voet, 2006), lo cual se 
traduce a un cambio en la fuerza iónica del medio. 
 
A fuerzas iónicas elevadas se reduce la solubilidad de las proteínas, como la de la 
mayoría de las sustancias. Este efecto, conocido como salting out (reducción de la 
solubilidad por sales) es sobre todo resultado de la competencia por las moléculas de 
solvatación entre los iones salinos agregados y los otros solutos disueltos. En términos 
termodinámicos, se reduce la actividad del solvente (Voet & Voet, 2006). 
 
El sulfato de amonio es el reactivo más utilizado para el salting out de las proteínas, ya 
que su solubilidad elevada permite obtener soluciones de gran fuerza iónica. Los iones 
que reducen la solubilidad de las proteìnas estabilizan sus estructuras nativas, de 
manera que las proteínas sometidas a salting out no sufren desnaturalización (Voet & 
Voet, 2006). 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
29 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 4 
MATERIAL Y MÉTODOS 
 
4.1 Cultivo del microorganismo 
Se utilizó la cepa de Aspergillus flavus CECT-2687, obtenida de la Colección Española 
de Cultivos Tipo, Parque Científico de la Universidad de Valencia, en Paterna España, 
productora de aflatoxinas. La cepa se activó en agar papa dextrosa (PDA) mediante 
tres o cuatro perlas de esporas liofilizadas. Las placas se incubaron a 37°C por 72h. Se 
tomó una asada del cultivo con un asa micológica estéril, que fue depositada al centro 
de una placa con agar Sabouraud; a continuación, el inóculo fue extendido en toda la 
placa utilizando un asa de Drigalsky. La placa se incubó a 37°C por 72h. La cepa se 
manejó en una suspensión de esporas; se resembró quincenalmente en placas con 
agar Sabouraud (SA) mediante siembra masiva para mantener la cepa viable y hacer 
una nueva suspensión de esporas. Las placas se incubaron a 37°C por 72 h, tras lo 
cual se mantuvieron en refrigeración a 4°C durante quince días. 
 
Para la cosecha de esporas se vertieron 10 mL de solución salina isotónica (0.9% p/v) 
con Tween 80 (0.005% v/v) estéril en una de las cajas sembradas, y se raspó 
suavemente su superficie con un asa Drigalsky para recuperar las esporas. Una vez 
que las esporas estuvieron suspendidas en la solución, esta se transfirió con pipeta a 
un tubo estéril para centrífuga con tapón. Para lavar las esporas, se centrifugó la 
suspensión a 500 rpm por 5 min y se desechó el sobrenadante; a continuación, las 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
30 
 
esporas se resuspendieron hasta alcanzar un volumen de 10 mL de solución salina con 
Tween; dicho lavado se realizó cuatro veces más. 
 
4.2 Producción de enzimas en medio líquido 
 4.2.1 Medios y condiciones de cultivo 
Para la producción de las enzimas, se inocularon matraces de 500 mL, con 100 mL de 
medio, con una cantidad total de 1x106 esporas de Aspergillus flavus CECT-2687 en el 
total de volumen. Los medios de cultivo contenían medio basal (KH2PO4 2g/L, K2HPO4 
2 g/L y (NH4)2SO4 5 g/L) y 1% p/v de cáscara de limón seca, triturada y lavada con 
etanol previamente como fuente de carbono. Se prepararon dos soluciones y se 
esterilizaron por separado. La solución de fosfatos fue preparada a una concentración 
de 4g/L y se ajustó, con NaOH o H2SO4, a un pH de 9, mientras que la solución de 
cáscara de limón al 2% con (NH4)2SO4 10g/L se ajustó a un pH de 6. Se esterilizaron 
a 121°C y 15 psi por 20 min. Una vez estériles ambas soluciones se mezclaron en los 
matraces en una proporción 50:50 con el fin de obtener un pH aproximado de 8 y un 
medio con una concentración de 2 g/L KH2PO4, 2 g/L K2HPO4, 5 g/L (NH4)2SO4 y 1% 
p/v de cáscara de limón. Los matraces fueron incubados a 37°C por 72 horas en una 
incubadora con movimiento recíproco a 300 rpm, para favorecer la aireación y 
homogenización del medio. 
 
4.3 Obtención de filtrados enzimáticos crudos 
 4.3.1 Inóculo para fermentación 
Se concentró la suspensión de esporas de Aspergillus flavus CECT 2687, obtenida de 
cajas de agar Sabouraud incubadas durante 72h a 37°C y recién cosechadas con la 
solución salina isotónica (0.9% p/v) y Tween 80 (0.005% v/v), por centrifugación a 4500 
rpm por 5 minutos, se resuspendió en 5 mL de solución salina isotónica(0.9% p/v) y 
Tween 80 (0.005% v/v) y se determinó el número de esporas/mL en la cámara 
Neubauer. Con esto se inocularon los matraces con medio líquido, con una 
concentración final en el medio de cultivo de 1x106 esporas. 
 
 
 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
31 
 
 4.3.2 Fermentación en lote 
Los matraces con los medios de cultivo líquidos se muestrearon a diferentes tiempos 
(0, 24, 48 y 72 horas), tomando en cada muestra 5 mL, los cuales se filtraron usando 
papel filtro Whatman 1 para retener la biomasa y la cáscara de limón residual. Los 
filtrados libres de células y sustrato se almacenaron en refrigeración a 4°C, hasta la 
determinación de sus actividades enzimáticas. 
 
 4.3.3 Actividad exo-pectinolítica medida por grupos reductores 
Se determinó por la cuantificación de azúcares reductores liberados por la pectina por 
el método DNS, usando una curva patrón de ácido galacturónico. La mezcla de 
reacción consistió de 0.5 mL de una solución de pectina cítrica 1% (p/v) a pH 5 en agua 
destilada, 0.4 mL de solución amortiguadora de acetatos 100 mM a pH 5 y la reacción 
se inició con la adición de 0.1 mL de filtrado libre de células, se incubó durante 20 
minutos a 45°C. Al término de estetiempo de incubación se agregaron 2 mL de 
reactivo DNS, la mezcla se calentó a ebullición en baño María por 5 min, se agregaron 
5 mL de agua destilada y se homogeneizaron en un vortex. Finalmente se centrifugó a 
500 rpm durante 5 min para eliminar la pectina insoluble y se leyó a una longitud de 
onda de 575 nm en el espectrofotómetro para medir los azúcares reductores 
producidos por la degradación del sustrato. Respecto a los blancos, se incubaron sin 
muestra y tras la adición del DNS se le añadió 0.1mL de filtrado enzimático y se 
continuó con el mismo tratamiento que se le dio a las muestras. La actividad se 
expresó en unidades enzimáticas (U), definidas como la cantidad de enzima necesaria 
para producir 1 µmol de ácido galacturónico en las condiciones de ensayo. 
 
 4.3.4 Actividad de pectin liasas 
Se determinó a partir del incremento en la absorbancia como consecuencia del doble 
enlace formado en la reacción de β-eliminación. La mezcla de reacción constó de 0.5 
mL de buffer de Tris-acetatos 100 mM con CaCl2 12 mM (pH 9), 0.5 mL de solución de 
pectina cítrica 1% p/v (pH 5.0) y 0.2 mL de filtrado enzimático. Los reactivos se 
adicionaron en ese orden en tubos de ensayo de 12x75 mm, y se consideró que la 
reacción iniciaba al momento de agregar el filtrado; se incubó durante 1 h a 40°C, y la 
reacción se detuvo adicionando 0.1 mL de HCl 1N. A partir de ello se hizo una dilución 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
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1:10, colocando 0.2 mL de la mezcla de reacción en otro tubo de ensayo de 12x75 mm 
y adicionándole 1.8 mL de HCl 10 mM. Se leyó la absorbancia de las muestras a una 
longitud de onda de 235 nm. En el caso de los blancos, éstos se incubaron sin muestra 
y tras la adición del HCl 1N se les añadieron los 0.2 mL de filtrado enzimático. La 
actividad de pectin liasas se expresó en unidades enzimáticas (U), siendo que cada 
unidad causa el incremento de 1.0 en la absorbancia a 235nm debido a la liberación del 
Δ-4,5 urónido insaturado producido a partir de la β-eliminación que tiene una fuerte 
absorción a esa longitud de onda. 
 
 4.3.5 Concentración de los filtrados enzimáticos por liofilización y 
precipitación con Sulfato de Amonio 
Se tomó el total de volumen de filtrado enzimático previamente centrifugado a 6000 
rpm durante 20 minutos, los cuales fueron congelados a -70°C, y liofilizados a 5x10-3 
mbar y -50°C por 48 horas. El sólido obtenido se resuspendió en una décima parte del 
volumen inicial con buffer de acetatos 100 mM (pH 5). 
 
Una vez resuspendido el sólido, se adicionó sulfato de amonio hasta una saturación del 
80% para precipitar las proteínas, dejándolo en agitación durante 20 minutos y en 
reposo durante 24 horas en refrigeración a 4°C. La suspensión se centrifugó a 16000 
rpm durante 20 minutos. Se decantó la solución y se desechó el líquido remanente. El 
pellet obtenido se resuspendió en la décima parte del volumen original. Este último 
concentrado se dializó contra agua de la llave durante media hora, durante media hora 
más contra agua destilada y una vez más contra buffer de renaturalización (Tris-HCl 10 
mM pH 7.5) durante una hora. 
 
4.4 Purificación 
 4.4.1 Cromatografía de intercambio iónico 
El filtrado enzimático se diluyó 3:10 con agua destilada. Se inyectó al equipo 1 mL de la 
dilución. 
 
Se utilizó una columna de intercambio iónico: High Q Cartdridge (BIO RAD), y el equipo 
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), Pharmacia Biotech. 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
33 
 
Columna de intercambio iónico Econo-Pac High Q Cartridge. BIORAD. 
Tipo: fuerte intercambio iónico. 
Grupo Funcional: -N+(CH3)3 
Volumen: 5 mL 
Capacidad de unión de proteína: ≥75 mg ferritina 
Capacidad iónica de la matriz: 190 ± 40 µeq 
Diámetro de partícula 50 µm 
Tamaño de poro: 1000 A 
Intervalo de pH: 2-12 
 
Para la elución de proteína de la columna de intercambio iónico Econo-Pac High Q 
Cartridge BIORAD, se utilizó una solución amortiguadora de fosfatos 100 mM a pH 6, 
1M de NaCl. Todas las soluciones empleadas para la cromatografía se desaerearon 
durante 20 minutos. 
 
Se empleó un flujo de 1mL/min, un gradiente de NaCl de 0 a 1M a partir de la fracción 
10 hasta la 40, colectando un total de 45 fracciones de 3mL cada una. 
 
 4.4.2 Pre-tratamiento de las fracciones enzimáticas provenientes de una 
cromatografía para su uso en geles de SDS-PAGE (SDS Polyacrilamide-Gel 
Electrophoresis) 
Se midió la actividad de pectin liasas a cada fracción obtenida de la cromatografía de 
intercambio iónico y se seleccionaron las ocho fracciones que presentaron la mayor 
actividad. 
 
Cada fracción seleccionada se colocó en un tubo de diálisis Spectra/Por, se dializó una 
vez contra agua destilada por 1 hora con agitación constante; se dializó dos veces más 
contra buffer de renaturalización (Tris-HCl 10 mM pH 7.5) durante 1 hora en cada 
ocasión, con agitación constante. 
 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
34 
 
Cada fracción se colocó en un tubo de ensayo de 12x75 mm, fueron congelados a -
70°C, y liofilizados a 5x10-3 mbar. Los sólidos obtenidos se resuspendieron en 50 μL de 
buffer de tanque 1x (0.025 M TRIZMA-BASE, 0.192 M glicina, 0.1% SDS, pH 8.3). 
 
 4.4.3 Obtención de geles de SDS-PAGE 
La preparación de los geles de poliacrilamida de 8x8 cm con SDS se realizó en 
condiciones desnaturalizantes. Se tomaron 5 μL de muestra concentrada a la cual se 
adicionó un volumen equivalente de buffer de tratamiento desnaturalizante (SDS 4%, 
glicerol 20%, 2-β-mercaptoetanol 10%, buffer Tris-HCl 125 mM a pH 6.8 y azul de 
bromofenol 0.005%) 2X. El gel separador se preparó al 10% de acrilamida. La 
electroforesis se corrió a corriente constante (15 mA/gel), por alrededor de 1 hora, a 
través de una unidad de geles verticales de 1.0 mm Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-
Rad Laboratories, Inc.). Los geles para determinar peso molecular se sumergieron en 
una solución de azul de Coomasie R-250 al 0.025%, metanol al 40% v/v y ácido acético 
al 7% v/v durante una hora con agitación suave (40 rpm) para teñir la proteína y se 
destiñeron con una solución de ácido acético al 10% v/v. 
 
 4.4.4 Zimogramas 
Cada vez que se corrió un gel para determinar proteína, uno análogo se corrió para 
generar su zimograma. Los geles de acrilamida, por separado, se incubaron en buffer 
de renaturalización (Tris-HCl 10 mM pH 7.5) a 37°C por 1 h; se decantaron e incubaron 
en buffer de Tris- acetatos 100 mM (pH 9.0) a 37°C durante 30 min. Se decantaron y se 
incubaron, para observar la actividad de las pectin liasa, en una mezcla 50:50 de 
pectina cítrica al 1% p/v (pH 5) y buffer Tris-acetatos 100mM (pH 9.0), a 37°C por 1 h. 
Se decantaron y se eliminó el exceso de sustrato con agua destilada; se deshidrataron 
en etanol al 96% a temperatura ambiente por 15 min, y se rehidrataron con agua 
destilada por 20 min. El gel se tiñó con una solución de rojo de Rutenio al 0.05% p/v 
por 30 min con agitación suave, y se lavó con agua destilada para remover el exceso 
de colorante. 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
35 
 
4.5 Caracterización 
4.5.1 Medición de proteína por el método de Bradford 
Se preparó una solución stock de albúmina (0.1mg/mL) para hacer una curva estándar 
La curva se hizo por duplicado empleando las cantidades de la tabla 2 en los pozos de 
una microplaca de policarbonato: 
 
Las muestras a las que se les midió la concentración de proteína se diluyeron, 
agregando 50 µL de muestra y 50µL de agua en cada pozo. Finalmente, se agregaron 
200µL del reactivo de Bradford a todos los pozos de reacción, incluyendo a la curva 
estándar. Se dejó reaccionar durante 5minutos medidos a partir de agregado el reactivo 
al último pozo y se leyó a 595nm. 
 
Tabla 2.Cantidades a adicionar en una microplaca de policarbonato 
para construir una curva estándar de albúmina de huevo por el 
método de Bradford. 
Punto de la curva 
estándar 
Volumen de solución 
stock (µL) 
Volumen de Agua 
(µL)1 0 100 
2 5 95 
3 10 90 
4 15 85 
5 20 80 
6 25 75 
7 30 70 
8 40 60 
9 50 50 
10 60 40 
 
4.5.2 Preferencia de sustrato 
Se prepararon soluciones con las pectinas disponibles (Tabla 3) con diferentes grados 
de esterificación y con ácido poligalacturónico al 1% y ajustando su pH a 5 con NaOH. 
Se midió la actividad de la pectin liasa normalmente empleando cada una de las 
soluciones preparadas como sustrato. 
 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
36 
 
Tabla 3. Pectinas empleadas para determinar la 
preferencia de sustrato y su grado de esterificación 
Pectina Grado de esterificación (%) 
Sigma 46 
Citrus fruits 57.6 
Cítrica 58.8 
Sigma esterificada 90 
Sigma altamente 
esterificada 
93 
 
4.5.3 Determinación del pH óptimo 
Se prepararon buffers 100mM ajustados a diferentes intervalos de pH y adicionados 
con 10mM de Ca2+, con los cuales midió la actividad de la pectin liasa normalmente. 
Los buffers usados y los rangos de cobertura de cada uno se presentan en la siguiente 
tabla: 
Tabla 4.Buffers usados para la determinación 
de pH óptimo y el rango de pH para cada uno. 
Buffer Rango de pH 
Acetatos 3-6 
MOPS 6.5-7.9 
Borato-cloruros 8.1-9.5 
Tris-acetato 7-9 
 
4.5.4 Determinación de temperatura óptima 
Se determinó la actividad empleando buffer tris-acetatos (100mM) a pH 9 empleando 
temperaturas de incubación de 30 a 75ºC. 
 
4.5.5 Determinación del efecto de iones 
Se prepararon soluciones con buffer tris-acetatos (100mM) a pH 9 adicionadas con los 
iones Ca2+, Ba2+, Co2+, Zn2+, Mn2+ y Mg2+(10mM) y una más con EDTA (20mM) como 
agente quelante. Se midió la actividad a 60ºC usando las soluciones preparadas. 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
37 
 
4.5.6 Estabilidad al pH 
El concentrado enzimático se diluyó 1:50 veces con buffers a diferentes pH`s entre 3 y 
9.5, preparando 3mL con cada pH. Las muestras se dispusieron en tubos de 12x75mm, 
dividiendo la cantidad de mezcla con cada buffer en dos tubos y tapadas con Parafilm. 
La mitad de los tubos, conteniendo todo el rango de pH, se incubaron a 4ºC durante 24 
horas, mientras que la otra mitad se incubó a 30ºC durante el mismo tiempo. 
Finalmente, pasado este tiempo se midió la actividad a 60ºC de cada tubo, por ser esta 
temperatura determinada como la optima para la enzima en cuestión. 
 
4.5.7 Estabilidad a la temperatura 
El concentrado enzimático se diluyó 1:50 veces con buffer de borato-cloruros (100mM; 
pH 9) por ser este el buffer en el que se encontró mayor estabilidad de la enzima, 
preparando 15 mL de disolución para cada temperatura a probar. Se incubó a 30, 40, 
50, 60, 70 y 80ºC, tomando una muestra de un mililitro cada cierto rango de tiempo en 
minutos dependiendo de la temperatura empleada, tomando muestras en un intervalo 
menor para 80ºC y en uno mayor para 30ºC. 
 
Se midió la actividad residual a 60ºC al final del ensayo de cada muestra tomada y de 
la solución inicial. 
 
4.5.8 Cinética enzimática 
Se preparó una solución stock de pectin cítrica al 2% ajustando el pH a 5 con NaOH 
1M, de la cual se hicieron diluciones para obtener soluciones de 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 
0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 y 2. Cada solución se 
ajustó a pH 5 con NaOH. Se midió la actividad a 60º con cada una de la soluciones. 
 
 
 
 
MATERIAL Y MÉTODOS| 4 
38 
 
4.6 Esquema general de la producción, purificación y caracterización de pectin 
liasas de Aspergillus flavus CECT 2687 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Purificación 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 9 Esquema general de la producción, purificación y caracterización de pectin liasas 
de Aspergillus flavus CECT 2687 
 
Recuperación, activación y 
mantenimiento de cepas. 
Producción de enzimas en 
medio líquido en matraces 
agitados. 
Preparación de concentrados 
enzimáticos por liofilización y 
precipitación. 
Cromatografía de intercambio 
iónico. 
Análisis electroforético y 
zimográfico. 
Análisis y caracterización de las 
enzimas 
 
Determinación de la 
estabilidad a la Temperatura y 
el pH. 
Determinación de Vmax y Km. 
Efecto de iones en la actividad. 
Determinación del pH, 
temperatura óptimos y Ea. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN| 5 
39 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 5 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
5.1 Efecto de la concentración de la fuente de carbono sobre la producción de 
pectinasas en fermentaciones en lote 
 
La finalidad del estudio en fermentaciones en lote fue evaluar el efecto de la 
concentración de la fuente de carbono sobre la producción de pectinasas, en este caso 
se empleó cáscara de limón. En base a los resultados generados a partir de esta 
primera etapa de trabajo, se determinó la concentración a emplear durante los ensayos 
posteriores. 
 
Durante esta etapa se realizaron fermentaciones en lote empleando dos diferentes 
concentraciones de cáscara de limón (CL) como sustrato (1 y 2%) y medio basal a un 
pH inicial alrededor de 7.5, aunque se buscaba obtener un pH de 8 al ser mencionado 
como el más apropiado para la producción de pectinasas por Aspergillus flavus CECT 
2687 en el trabajo realizado por Pradal (2012). 
 
La actividad exo-pectinolítica se midió en base a la producción de ácido-D-
galacturónico como azúcar reductor, determinando como una unidad de actividad 
enzimática a la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µmol de producto. Cada 
fermentación y ensayos de medición de actividad de exo-pectinasas se realizaron por 
duplicado (Fig. 10). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN| 5 
40 
 
 
Fig 10. Perfil de actividad exo-pectinolítca a través del tiempo en 
fermentaciones en lote con Aspergillus flavus CECT 2687 
empleando dos concentraciones de cáscara de limón, 1 y 2%, como 
sustrato. 
 
El comportamiento de la actividad de las exo-pectinasas durante las primeras 48 horas 
de fermentación fue el mismo para ambas concentraciones de sustrato empleadas, 
mientras que en el periodo comprendido entre las 48 y 72 horas de fermentación se 
observa una diferencia al incrementar la producción de exo-pectinasas para el caso de 
la concentración de sustrato de 1% con respecto a la de 2%. 
 
Durante las primeras 24 horas de fermentación se observa que, en ambas condiciones, 
hubo un incremento notable en la producción de exo-pectinasas hasta un máximo de 
alrededor de 6 a 6.5 U/mL, lo que supone, y en coincidencia con los resultados 
obtenidos previamente sobre el comportamiento del crecimiento de Aspergillus sp en el 
trabajo de Aguilar & Huitrón (1986), que durante esta etapa de la fermentación se lleva 
a cabo la fase exponencial de crecimiento, siendo los residuos de ácido galacturónico 
libres y disueltos en el medio provenientes de la cáscara de limón los inductores de 
estas enzimas dado que los Aspergilli no son capaces de importar polisacáridos hacia 
dentro de sus células (De Vries, 2003; Mach 2003). Pasadas las 24 horas es notable 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN| 5 
41 
 
una disminución en la actividad de exo-pectinasas, lo que sugiere que se ha llegado a 
la fase estacionaria de crecimiento, donde se presume una acumulación de productos 
por efecto de una mayor velocidad de degradación de la pectina en comparación con la 
utilización de los mismos para el crecimiento del hongo, habiendo así una represión por 
fuente de carbono. 
 
El incremento en la producción de exo-pectinasas en una segunda etapa posterior a 
una baja en la actividad, correspondiente al periodo entre las 48 y 72 horas, se propone 
que podría deberse a la inducción de algunas exo-pectinasas debido a la disminución 
de ácido galácturónico libre en el medio por su utilización para el crecimiento del 
hongo. Además, este incremento de la actividad exo-pectinolítica se propone que 
puede ser debida también a la regulación genética por pH, ya que al llegar el medio a 
un pH mucho más cercano a 8 a partir de las 48 horas (tabla 5) es donde se observa el 
incremento de la actividad para ambas concentraciones de sustrato,