Enfermedades cardiovasculares y colesterol

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1. INTRODUCCIÓN 
1.1 GENERALIDADES 
 
Desde 1990 más personas han muerto por enfermedades coronarias 
que por alguna otra causa. Se estima que 17 millones de personas mueren por 
enfermedades cardiovasculares al año en el mundo, particularmente por 
infartos cardiovasculares y cerebrales. Más del 60% de la población mundial 
con enfermedades coronarias pertenece a países desarrollados (WHO, 2005; 
Thom et al., 2006). En México, las enfermedades del corazón son la principal 
causa de defunción, siendo la aterosclerosis la causa más importante de 
enfermedades cardiacas, donde la elevada concentración sanguínea de 
colesterol juega un papel muy importante (Krieger, 1998; INEGI, 2006). En 
países desarrollados, al menos una tercera parte de las enfermedades 
cardiovasculares son atribuidas a factores de riesgo: uso de tabaco, uso de 
alcohol, presión alta, colesterol alto, diabetes y obesidad. Se ha encontrado 
que el uso del tabaco induce a enfermedades cardiovasculares al promover el 
daño al endotelio de vasos sanguíneos, incrementando las placas de colesterol 
(depósitos grasos en las arterias). Se estima que un 82% del incremento en la 
mortalidad en enfermedades coronarias ocurrirá en países desarrollados 
(WHO, 2005). 
 
A pesar de que el colesterol es necesario para realizar muchas 
funciones de nuestro organismo, estudios epidemiológicos y experimentales 
han demostrado que existe una fuerte correlación entre las concentraciones 
elevadas de colesterol en la sangre con la frecuencia de enfermedades 
cardiovasculares y de aterosclerosis en el hombre (Libby et al., 2000). El riesgo 
de aparición de una enfermedad cardiovascular por cifras elevadas de 
colesterol en sangre se ha relacionado con las LDL-colesterol (lipoproteínas de 
baja densidad) y HDL-colesterol (lipoproteínas de alta densidad). El riesgo de 
padecer aterosclerosis se incrementa con el aumento de la concentración de 
las LDL-colesterol, mientras que es inversamente proporcional a los niveles de 
HDL-colesterol (Krieger, 1998). 
 
 1
 
1.2 ESTRUCTURA QUÍMICA DEL COLESTEROL 
 
El colesterol es un lípido, que pertenece a los esteroles. En la figura 1 se 
muestra la molécula de colesterol, formada por 27 átomos de carbono, 46 de 
hidrógeno y uno de oxígeno, dispuestos en anillos unidos entre sí, tres anillos 
cíclicos hexagonales y uno pentagonal, una cadena lateral ramificada en la 
posición 17, con grupos metilo en las posiciones 10 y 13, y un doble enlace en 
la posición 5, además tiene un grupo hidroxilo en la posición 3 (Mathews et al., 
2000). El único grupo polar del colesterol es el hidroxilo en tanto que los anillos, 
metilos y la cadena hidrocarbonada son los que le confieren a la molécula la 
propiedad hidrofóbica 
 
 
 
Figura 1. Estructura del colesterol 
 
1.3 FUNCIONES FISIOLÓGICAS DEL COLESTEROL 
 
 El colesterol es el principal esterol en los mamíferos incluyendo a los 
humanos, por lo tanto, existe en los alimentos de origen animal y se concentra 
en la fracción lipídica de los alimentos de este origen, tiene especial 
importancia principalmente para la formación de membranas, ya que la 
proporción entre colesterol y fosfolípidos de la membrana es importante para 
determinar la fluidez de las membranas celulares. El cuerpo también sintetiza 
su propio colesterol llamado colesterol endógeno, casi todo el colesterol 
endógeno que circula en las lipoproteínas del plasma se forma en el hígado, 
pero todas las células del cuerpo sintetizan al menos algo de colesterol 
 2
(Campbell y Farell, 2004). Aproximadamente, la mitad del colesterol del 
organismo se origina de su síntesis y el resto es proporcionado por una 
alimentación promedio; el hígado sintetiza más o menos 50% del total, el 
intestino cerca de 15% y la piel una gran proporción del resto (Murray et al., 
1988). El uso no membranal más abundante del colesterol en el organismo es 
la formación de ácido cólico y el ácido quenodesoxicólico (ácidos biliares) en el 
hígado, éstos se conjugan con otras moléculas para formar sales biliares, lo 
que favorece la digestión y absorción de grasas. La biosíntesis de ácidos 
biliares es el principal destino metabólico del colesterol aunque, una pequeña 
cantidad de colesterol la utilizan: a) las glándulas suprarrenales para formar 
hormonas corticosuprarrenales; b) los ovarios para formar progesterona y 
estrógeno; c) los testículos para formar testosterona (Krieger, 1998; Devlin, 
2002); y d) la piel para la formación de provitamina D (Krieger, 1998; Nelson y 
Cox, 2000). 
 
1.4 BIOSÍNTESIS DEL COLESTEROL 
 
 La biosíntesis de colesterol requiere una fuente considerable de átomos de 
carbono y una fuente reductora. Todos los átomos de carbono se derivan del 
acetato, la fuente reductora en forma de NADPH la proporciona principalmente 
la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de 
la ruta de las pentosas fosfato (Devlin, 2002). 
 
 La vía de biosíntesis del colesterol se realiza en el citosol y en el retículo 
endoplásmico, ésta ocurre en tres etapas (Figura 2). La primera etapa se 
refiere a la conversión de acetil CoA en el intermediario 3-hidroxi-3-metilglutaril 
CoA (HMG CoA), esta primera etapa de la reacción ocurre en el citosol. Dos 
moléculas de acetil CoA se condensan para formar acetoacetil CoA en una 
reacción catalizada por la acetoacetil CoA sintetasa, en el siguiente paso se 
introduce una tercera molécula de acetil CoA formando la HMG-CoA ésta 
reacción es catalizada por la HMG CoA sintetasa, la HMG CoA que se forma 
está presente en el citosol y es metabólicamente distinta de la que se forma en 
la mitocondria para síntesis de cuerpos cetónicos (Montgomery et al., 1996). La 
siguiente etapa de la síntesis de colesterol es la conversión de HMG CoA a 
 3
escualeno, en el primer paso, la HMG CoA se reduce a mevalonato, donde el 
grupo tioéster de la HMG CoA se convierte a alcohol utilizando 2 moléculas de 
NADPH, la reacción es catalizada por una importante enzima del retículo 
endoplásmico, la HMG CoA reductasa, ésta enzima cataliza la reacción que 
regula la biosíntesis del colesterol y se inhibe por altos niveles de colesterol. El 
papel central de la HMG CoA reductasa en la homeostasis del colesterol, ha 
sido evidenciado por la efectividad de una familia de fármacos denominados 
estatinas (lovastatina, pravastatina, fluvastatina, cerivastatina, atorvastatina, 
etc.), que inhiben la actividad de la HMG CoA reductasa, particularmente en el 
hígado y bajan el colesterol total del plasma hasta en un 50% (Devlin, 2002). 
Después, el mevalonato se convierte a escualeno a través de intermediarios 
activados, el mevalonato se activa mediante tres fosforilaciones sucesivas y 
una descarboxilación para dar isopentenilpirofosfato, luego una molécula se 
isomeriza a dimetilalil pirofosfato y se combina con otra molécula de isopentenil 
pirofosfato para dar geranil pirofosfato que reacciona con otra molécula más de 
isopentenil pirofosfato para dar farnesil pirofosfato, estas reacciones ocurren en 
el citosol. Posteriormente, la escualeno sintasa une dos moléculas de este 
último para dar preescualeno pirofosfato que sufre la eliminación del pirofosfato 
para dar el escualeno. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la 
ciclización del escualeno a lanosterol y la conversión de lanosterol en 
colesterol, y esto ocurre en el retículo endoplásmico (Mathews et al., 2000). 
 
 
 
 Figura 2. Biosíntesis del colesterol 
 4
 
1.5 LIPOPROTEÍNAS Y SU RELACIÓN CON EL COLESTEROL 
 
Los lípidos más abundantes del cuerpo humano son el colesterol, ésteres de 
colesterol, triacilglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos libres. Debido a que los 
lípidos son insolubles en agua, se requiere de proteínas especializadas para su 
transporte y distribución en los diferentes órganos y tejidos corporales, 
llamadas lipoproteínas. Se han descrito diversos tipos de lipoproteínas,cada 
una de ellas, desempeña funciones concretas en el transporte de lípidos. Estas 
lipoproteínas se clasifican en función de su densidad, determinada mediante 
centrifugación (Campbell y Farell, 2004). Las lipoproteínas de cada clase 
contienen apoproteínas características y poseen una composición química 
distintiva en proteínas, triacilgliceroles, colesterol libre, ésteres de colesterol y 
fosfolípidos. La clasificación de las lipoproteínas incluye: quilomicrones, 
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad 
intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta 
densidad (HDL). En la figura 3, se muestra un esquema general de una 
lipoproteína. 
 
 
 
Figura 3. Estructura general de una lipoproteína. Modificado de Mckee y Mckee, 2003. 
 
Las lipoproteínas son partículas hidrosolubles parecidas a micelas que 
consisten de un núcleo no polar de triacilgliceroles y ésteres de colesterol, 
rodeados por una monocapa de fosfolípidos y colesterol. Las proteínas 
 5
específicas se encuentran incrustadas en la membrana lipídica (Voet y Voet, 
2004). Todas las lipoproteínas comparten características estructurales 
comunes, especialmente una forma esférica que puede detectarse mediante 
microscopía electrónica (Montgomery et al.,1996; Mathews et al., 2000) (Figura 
3). 
 
1.6 TRANSPORTE DEL COLESTEROL 
 
 Tras una ingesta de comida rica en grasas, el colesterol presente en la dieta 
se incorpora dentro de micelas (quilomicrones) que se forman en combinación 
con la bilis, producida en el hígado, almacenada en la vesícula biliar y 
secretada al intestino delgado en respuesta a alimento con contenido graso. 
Estas micelas contienen ácidos biliares conjugados (sales biliares), fosfolípidos 
y colesterol. Los ésteres de colesterol presentes en la comida son hidrolizados 
en las micelas por la colesterol esterasa, enzima secretada por el jugo 
pancreático. El colesterol entonces se absorbe por el intestino delgado donde 
se esterifican nuevamente, y es incorporado en las lipoproteínas llamadas 
quilomicrones (Horton et al., 2006), éstas son secretadas vía ducto linfo-
torácico a la sangre y liberadas a los tejidos; este proceso es llamado ruta 
exógena de transporte lipídico, porque los lípidos provienen del exterior del 
organismo. La lipoproteín lipasa (LPL) actúa sobre los quilomicrones 
circulantes en sangre, principalmente sobre los triacilglicéridos, reduciendo la 
relación de triglicéridos: colesterol. Los quilomicrones remanentes son 
absorbidos por el hígado, donde los lípidos y las lipoproteínas se degradan 
(Figura 4). 
 
 
Figura 4. Transporte exógeno de lípidos. TG, triacilglicéridos; COL, colesterol; LPL, 
lipoproteín lipasa; AGL, ácidos grasos libres. Modificado de Montgomery et al., 1996. 
 6
 
 Los lípidos absorbidos por el hígado, vía quilomicrones remanentes, son 
enzimáticamente digeridos y reensamblados dentro de nuevas partículas de 
lipoproteínas; además, el hígado sintetiza lípidos “de novo”. Éstos, se combinan 
con apoproteínas hepáticas y son secretados a la sangre como lipoproteínas 
de muy baja densidad (VLDL). A través de la acción de la LPL sobre los 
triacilglicéridos, las VLDL nacientes se convierten a remanentes. Después de la 
liberación de los ácidos grasos a tejidos periféricos, muchas de las VLDL 
remanentes son recolectadas por el hígado; la liberación de colesterol y 
triacilglicéridos por las VLDL a tejidos extrahepáticos vía circulación sanguínea 
forma parte de la ruta endógena de transporte de lípidos (Figura 5). Los 
remanentes de las VLDL que no fueron absorbidos por el hígado sufren de 
nuevo una lipólisis convirtiéndose en lipoproteínas de densidad intermedia 
(IDL) que se transforman después en lipoproteínas de baja densidad (LDL). 
Una fracción significativa de IDL y LDL es captada por el hígado, sin embargo, 
aproximadamente el 60% de las LDL es recolectada por tejidos periféricos 
(Montgomery et al., 1996; Krieger, 1998). 
 
 
 
Figura 5. Transporte endógeno de lípidos. VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad; IDL, 
lipoproteínas de densidad intermedia; TG, triacilglicéridos; COL, colesterol; LPL, lipoproteín lipasa; 
AGL, ácidos grasos libres. Modificado de Montgomery et al., 1996. 
 
 
 Aunque todos los tejidos del organismo son capaces de sintetizar su propio 
colesterol, la incorporación de LDL es la forma preferente para abastecerse de 
 7
colesterol. La captación del colesterol de las LDL por las células, es mediante 
la acción de un receptor específico llamado receptor de LDL y el mecanismo 
por el cual sucede, se conoce en general como endocitosis mediada por el 
receptor. Los receptores están agrupados en una invaginación rica en clatrina, 
una proteína capaz de formar una estructura en forma de jaula. La endocitosis 
se lleva a cabo cuando las LDL se unen a su receptor, mediante el 
reconocimiento de la apoproteína B-100 por parte del receptor. La LDL se 
engloba y es captada por la célula (Figura 6). La membrana plasmática se 
fusiona en la proximidad del complejo LDL-receptor, y la invaginación se 
convierte en una vesícula endocítica. Varias de estas vesículas revestidas de 
clatrina se fusionan para formar un endosoma. El endosoma se fusiona 
entonces con un lisosoma, con lo que el complejo LDL-receptor se pone en 
contacto con las enzimas hidrolíticas del lisosoma. La apoproteína de las LDL 
se hidroliza en sus aminoácidos, y los ésteres de colesterol se hidrolizan para 
dar colesterol libre. El receptor se recicla, y vuelve a la membrana plasmática 
para captar más LDL. 
 
 
 
Figura 6. Participación de los receptores de LDL en la captación y metabolismo del 
colesterol. ACAT: colesterol acil transferasa, LDL: lipoproteína de baja densidad. Modificado de 
Mathews y Van Holde, 1998. 
 
 8
 
 Gran parte del colesterol liberado se desplaza hacia el retículo 
endoplásmico liso, en donde se utiliza para la síntesis de las membranas. El 
colesterol internalizado, además ejerce algunos efectos reguladores, por medio 
de los cuales se controla la cantidad de colesterol que se internaliza en cada 
célula como: 1) la supresión de la síntesis endógena de colesterol por la HMG 
CoA reductasa. La inhibición farmacológica de esta enzima ha sido muy exitosa 
para disminuir los niveles plasmáticos de colesterol (Devlin, 2002), 2) la 
activación de la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa (ACAT), enzima 
que se encuentra en el reticulo endoplásmico rugoso y cataliza la formación 
intracelular de ésteres de colesterol y tienen un papel clave en el balance 
intracelular de colesterol, en la absorción intestinal de colesterol y en la 
secreción hepática de VLDL. Las moléculas que inhiben a esta enzima son un 
blanco terapéutico muy efectivo contra la aterosclerosis (Chang et al., 2006), 3) 
regulación del propio receptor de LDL, proceso que explica el por qué de una 
regulación tan exacta de las concentraciones intracelulares de colesterol 
(Mathews et al., 2000). 
 
 Bajo circunstancias normales, el exceso de colesterol se puede acumular en 
las membranas de las células de tejidos extrahepáticos. Este colesterol puede 
ser regresado al hígado vía HDL, en un proceso llamado transporte reverso de 
colesterol. Las HDL adquieren el colesterol no esterificado (colesterol libre) de 
las células, y una enzima llamada lecitin-colesterol-aciltransferasa (LCAT) 
actúa sobre el colesterol en las HDL para formar ésteres de colesterol. Los 
ésteres de colesterol pueden ser transferidos de las HDL a las VLDL por la 
proteína que transfiere ésteres de colesterol (CETP) (Figura 7). 
 
Además, las HDL pueden proveer de colesterol a las glándulas productoras de 
hormonas esteroideas. 
 
 9
 
 
Figura 7. Transporte reverso de colesterol. CL, colesterol libre; EC, colesterol esterificado; 
LCAT, lecitin colesterol acil transferasa; CETP, proteína que transfiere esteres de colesterol.:LPL, 
lipoproteín lipasa. Modificado de Montgomery et al., 1996. 
 
 
1.7 ELIMINACIÓN DE COLESTEROL Y CIRCULACIÓN ENTEROHEPÁTICA 
 
 El humano no tiene la capacidad de degradar núcleos esteroideos, el 
colesterol y otros esteroides no pueden ser degradados a moléculas pequeñas, 
sino que, se convierten en derivados con mejores propiedades de solubilidad, 
permitiendo su excreción. El mecanismo más importante para la eliminación del 
colesterol es la síntesis de ácidos biliares que ocurre en el hígado. La 
conversión de colesterol a 7-α-hidroxicolesterol catalizada por la Colesterol 7-
α-hidroxilasa, es el paso limitante en la síntesis de ácidos biliares, importantes 
componentes de la bilis, junto con el colesterol, los fosfolípidos y los pigmentos 
biliares (McKee y McKee, 2003). Así el colesterol hepático puede ser excretado 
en la bilis como ácido biliar o como colesterol libre, donde puede sufrir 
reabsorción por el hígado o bien ser excretado por heces. La mayoría de los 
ácidos biliares, secretados en el duodeno, se reabsorben en el íleon y vuelven 
al hígado para ser excretados de nuevo en la bilis, a este ciclo se le conoce 
como circulación enterohepática (Figura 8); el restante que no es absorbido, es 
excretado en heces (Mathews et al., 2000). Sobre el colesterol actúan las 
bacterias intestinales y se convierte a otro esterol neutro, antes de que éste sea 
excretado en heces. En humanos, los principales esteroles neutros en heces 
 10
son el coprostanol y la colestanona. Otro esterol neutro excretado en heces es 
el colestanol (Murray et al., 1988). 
 
La conversión de colesterol a ácidos biliares en hígado es la principal vía de 
mayor eliminación de colesterol, la estimulación de este proceso da como 
resultado respuestas adaptativas que promueven la síntesis de colesterol 
hepático y la endocitosis mediada por receptor de LDL, induciendo a la 
reducción de LDL colesterol en plasma, esto ha mostrado ser benéfico en la 
prevención de enfermedades del corazón (Gälman et al., 2003). Por otro lado, 
la inhibición de la Colesterol 7-α-hidroxilasa está relacionada con la 
aterosclerosis y padecimientos de cálculos biliares (Soudi et al., 1998). 
 
 
 
Figura 8. Circulación enterohepática de ácidos biliares (AB) y colesterol (C). 
Modificado de Newshole y Leech, 1983. 
 
 
1.8 ENFERMEDADES NO GENÉTICAS CAUSADAS POR LA 
HIPERCOLESTEROLEMIA 
 
ATEROSCLEROSIS 
 
La aterosclerosis es el proceso patológico causado por la acumulación de 
colesterol en la pared de una arteria, donde éstas se obstruyen en mayor o 
menor grado por la formación de depósitos de placas de colesterol, lo cual 
 11
conduce a infartos cardiacos y cerebrales. La hipercolesterolemia es uno de los 
principales factores de riesgo para la aterosclerosis (Montgomery et al., 1996). 
En la formación de placas ateroscleróticas, el cual es un proceso progresivo, 
degenerativo, participan además, células del músculo liso, macrófagos y varios 
restos de células. Como los macrófagos se llenan con lípidos 
(predominantemente colesterol y ésteres de colesterol derivados de depósitos 
de LDL), éstos toman apariencia espumosa, de ahí el nombre de células 
espumosas (Figura 9) se secretan factores que aumentan la proliferación de 
células musculares. Finalmente, las placas ateroscleróticas pueden calcificar y 
sobresalir suficientemente dentro de la arteria impidiendo el flujo sanguíneo 
(McKee y McKee, 2003). 
 
 Figura 9. Corte de una arteria con aterosclerosis (Internet 1) 
 
 
COLELITIASIS 
La presencia de cálculos biliares es llamada colelitiasis. La mayoría de las 
piedras que se forman en adultos son predominantemente de colesterol. El 
colesterol es solubilizado en la bilis por asociaciones moleculares con sales 
biliares y fosfatidilcolina para su transporte por el tracto biliar, la cantidad de 
colesterol que puede estar en estos agregados micelares depende de la 
cantidad de sales biliares y fosfatidilcolina, así como de la cantidad de agua 
contenida en la bilis. Una composición anormal de bilis secretada por el hígado 
 12
puede causar cristalización del colesterol y formación de piedras, por lo tanto la 
cristalización del colesterol es resultado de que la bilis es incapaz de solubilizar 
todo el colesterol (Montgomery et al., 1996). 
 
 
1.9 TRATAMIENTOS CONTRA LA HIPERCOLESTEROLEMIA 
 
Como la hipercolesterolemia implica básicamente un incremento de las 
LDL-colesterol, se han buscado y diseñado moléculas con actividad 
hipocolesterolemiante con la finalidad de que causen una disminución de las 
LDL-colesterol en la sangre, dentro de ellos están: a) los inhibidores naturales y 
sintéticos de la HMG-CoA reductasa, las estatinas, que reducen las 
concentraciones de LDL-colesterol (Istvan y Deisenhofer, 2001), b) los 
secuestrantes de ácidos biliares, como colestipol y colestiramina, que impiden 
la reabsorción de las sales biliares al combinarse con ellas, incrementando así 
su pérdida fecal (Benson, et al., 1993), c) la niacina, que es el agente más 
potente para incrementar los niveles de HDL (Piepho, 2000), d) los fibratos, que 
ejercen parte de su efecto hipolipidémico por el desvío de la utilización de 
ácidos grasos libres en el hígado de las vías de esterificación a las de 
oxidación, reduciendo así la secreción hepática de triacilgliceroles y colesterol 
en las VLDL (Murray et al., 1988; Denke, 2004). Por otra parte, la inhibición 
intracelular en la esterificación del colesterol en los macrófagos, como una 
manera de prevenir la acumulación de ésteres de colesterol en las arterias, ha 
sido considerada por la comunidad científica como una estrategia con gran 
potencial aunque se han obtenido resultados contradictorios. Actualmente, 
existen datos que sugieren que una estrategia para el tratamiento de 
enfermedades del corazón relacionadas con la hipercolesterolemia, puede ser 
la inhibición específica de la ACAT-2 (Rudel et al., 2005). 
 
Pero, a pesar de que se han diseñado y probado una gran cantidad de 
compuestos hipocolesterolemiantes, algunos de los cuales han dado resultados 
alentadores, el problema de la aterosclerosis aún no ha sido resuelto. 
 
 
 13
1.10 α-ASARONA 
 
Dentro de los compuestos probados con la finalidad de obtener una buena 
actividad hipocolesterolemiante, se encuentra la α-asarona (Figura 10a). En 
estudios realizados en el Laboratorio de Enzimología del Departamento de 
Bioquímica, se obtuvieron los siguientes resultados cuando se probó a la α-
asarona en ratas macho con una dieta hipercolesterolémica: el colesterol total 
se redujo en un 30%, las LDL-colesterol se redujeron en un 74.7%, la 
concentración de colesterol biliar se redujo en 29.1%, la concentración de 
ácidos biliares aumentó en 8%, el flujo biliar aumentó en 70.4%, las 
secreciones de colesterol y de ácidos biliares aumentaron en un 56 y 93% 
respectivamente, además de que el índice de saturación de colesterol se redujo 
(Rodríguez-Páez et al., 2003). Todo esto, hace a esta molécula, excelente 
contra la hipercolesterolemia, aunque su uso farmacológico, se ha restringido 
por la toxicidad que presenta (Chamorro et al., 1993; Chamorro et al., 1994; 
Hasheminejad y Caldwell, 1994). 
 
Por otro lado, se han probado varios análogos de la α-asarona con la 
finalidad de mejorar el efecto hipocolesterolemiante (Aquino, 2003; Calvo, 
2003; Orduña, 2003; Jiménez, 2004) y disminuir su toxicidad, pero aún no se 
ha logrado este objetivo. 
 
El ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (Figura 10b) es el producto metabólico 
principal de la α-asarona, que podría ser empleado en la clínica, por no 
presentar efectos tóxicos como la α-asarona (Hasheminejad y Caldwell, 1994). 
Al llevar a cabo el desarrollo experimental en ratas macho con dieta 
hipercolesterolémica, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico redujo el colesterol total 
en un 24.5 %, las LDL-colesterol se redujeron en un 73.3%, se redujo elcolesterol biliar en un 26.6%, los ácidos biliares se redujeron en un 16.6%, 
aumentó en un 30% el flujo biliar y la secreción de colesterol y ácidos biliares 
aumentaron en un 15 y 54.5%, respectivamente (Antúnez, 2001). Por lo que se 
demostró que el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico presenta propiedades 
farmacológicas semejantes a la α-asarona. 
 14
 
Sin embargo, a pesar de la toxicidad de la α-asarona, en el Laboratorio de 
Enzimología del Departamento de Bioquímica de esta Escuela, tenemos interés 
en dilucidar el mecanismo de acción hipocolesterolemiante de la α-asarona y 
su principal metabolito, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, ya que nos ayudaría a 
entender mejor los diferentes procesos que afecta la α-asarona, en el 
metabolismo del colesterol, lo que a su vez nos permitiría, tomando a la α-
asarona como molécula guía, desarrollar nuevas moléculas 
hipocolesterolemiantes con blancos de acción muy definidos. 
 
Una primera aproximación a este planteamiento ya se ha iniciado, puesto que 
en estudios in vitro se ha encontrado que la α-asarona es un inhibidor 
competitivo de la HMG CoA reductasa de hígado de rata (Chávez, 2004). No 
obstante, es necesario profundizar en ello para proponer un mecanismo de 
acción coherente con todos los procesos metabólicos en los que 
aparentemente participa la α-asarona y que tiene como resultado el efecto 
hipocolesterolemiante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
COOH
H3CO
H3CO
OCH3
 
CH3H3CO
H3CO OCH3 
(a) (b) 
 
 
Figura 10. Estructura molecular de la α-asarona (a) y del ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico (b). 
 
 
 15
 
2. JUSTIFICACIÓN 
 
Los estudios epidemiológicos indican que, en México se ha incrementado la 
mortalidad por enfermedades cardiovasculares de manera importante, 
convirtiéndose en la primera causa de defunción (INEGI, 2006) y que la 
ateroclerosis derivada de la hipercolesterolemia es la tercera causa de 
enfermedades cardiovasculares en todo el mundo (WHO, 2005) de tal manera 
que la hipercolesterolemia se ha convertido en un problema de salud pública. 
 
La progresión de las placas ateroscleróticas en las arterias depende 
principalmente de la hipercolesterolemia, básicamente por un incremento en la 
concentración de las LDL-colesterol en sangre, además se ha considerado que 
las HDL-colesterol tienen propiedades antiaterogénicas. Por lo tanto, el objetivo 
principal en el diseño de fármacos hipocolesterolemiantes es tratar de que 
estos compuestos causen disminución de las LDL-colesterol en sangre, ya que 
son éstas las verdaderamente aterogénicas, y que no se afecte la 
concentración de las HDL- colesterol, debido al beneficio que se obtiene de 
ellas. 
 
Sin embargo a pesar de los esfuerzos por obtener fármacos con 
actividad hipocolesterolemiante, el problema de la aterosclerosis aún no se ha 
resuelto. Es por esto que en el Laboratorio de Enzimología del Departamento 
de Bioquímica de la ENCB del IPN se ha intensificado la investigación en esta 
área. 
 
 
 
 
 16
 
3. OBJETIVOS 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
 
Dilucidar el posible mecanismo de acción hipocolesterolemiante de la α-
asarona y su principal producto metabólico, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico 
(TMC) in vitro e in vivo, a través de sus efectos sobre el metabolismo hepático 
del colesterol. 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 
1) Estandarizar y determinar la actividad de la ACAT-2 (Acil Coenzima A: 
colesterol acil transferasa 2) de hígado de rata en ausencia y presencia 
de la α-asarona y el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, in vitro e in vivo. 
 
2) Estandarizar y determinar la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa de 
hígado de rata en ausencia y presencia de la α-asarona y el ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico in vitro e in vivo. 
 
3) Determinar la actividad de la HMG CoA (Hidroxi-metilglutaril coenzima 
A) reductasa de hígado de rata en ausencia y presencia de la α-asarona 
y el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico in vitro e in vivo. 
 
 
 
 
 
 17
 
4. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
 
4.1 REACTIVOS 
 
HMGCoA-14C (57.7 mCi/mmol), Oleoil CoA [ Oleoil-1-14C] (53 mCi/mmol), 4-
14C-colesterol (56.30 mCi/mmol) se obtuvieron de NEN-DUPONT. Colesterol, 
DL-3-hidroxi-3-metilglutaril CoA, colesteril oleato, oleoil CoA, 2,6-di-ter-butil-4-
metilfenol (hidroxitolueno butilado), 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, tiloxapol 
(Tritón WR-1339) glucosa-6-fosfato deshidrogenada, α-asarona y el TMC, se 
obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemical Company. La resina Bio-Rex® resina 5, 
fue obtenida de Bio-Rad Laboratories. Las placas de aluminio cubiertas de 
sílica gel 60F254 se obtuvieron de Merck. Las columnas de sílica Sep-Pak® 
(500 mg) fueron de Waters. El líquido de centelleo ACS II de Amersham. Todos 
los demás reactivos que se utilizaron fueron de grado analítico. 
 
 
4.2 MATERIAL BIOLÓGICO 
 
Ratas macho Wistar de 350 a 400 g de peso fueron colocadas en cámaras de 
40 x 60 x 20 (5 ratas por cámara) y a temperatura ambiente. El alimento y agua 
fueron ad limitum. 
 
 
 
 
 18
MÉTODOS 
 
 
4.3 PROCEDIMIENTO GENERAL 
 
 
4.3.a Experimentos in vivo: Se formaron tres lotes de 15 ratas macho, 
que se alimentaron con una dieta hipercolesterolémica ad lubitum, 
(Poplawsky et al., 2000), por 7 días. Un lote fue el control, al que se le 
administró el vehículo, una solución de bicarbonato de sodio al 8%, otro lote 
fue tratado durante 7 días con α-asarona a una dosis de 80 mg/kg de peso 
y el último lote fue tratado durante 7 días con TMC a una dosis de 80 mg/kg, 
todas las soluciones fueron administradas por vía subcutánea. Al término 
del tratamiento, se extrajeron los hígados y se obtuvieron los microsomas 
que se guardaron en congelación a -82 ºC hasta su análisis posterior. 
 
4.3.b Experimentos in vitro: Se extrajeron hígados de ratas macho sanas 
y se obtuvieron los microsomas que se guardaron en congelación a -82 ºC 
hasta su uso. En los microsomas se midieron las actividades de HMG CoA 
reductasa, ACAT-2 y Colesterol 7-α-hidroxilasa en presencia y ausencia de 
α-asarona y ácido 2,4,5-trimetoxicinámico. 
 
4.3.c Preparación del alimento hiperlipidémico: 
Se molieron nutricubos (alimento estándar para roedor) y con base a la 
siguiente formulación, se mezclaron todos los ingredientes (Poplawsky et 
al., 2000): 
 
Formulación para 1 kg de alimento 
Componentes Cantidad (g) 
Nutricubos molidos 938 
Colesterol 10 
Colato 2 
Aceite de oliva 50 
 19
Con ayuda de agua bidestilada se preparó una masa homogénea con la 
cual se formaron canicas de 2.5 cm de diámetro, las cuales se dejaron 
secar sobre una charola de aluminio por un lapso de 3-4 días, pasado este 
tiempo el alimento hiperlipidémico estuvo listo para servir de alimento a las 
ratas macho. 
 
4.3.d Obtención de microsomas. Después de que los animales se 
sacrificaron, se extrajeron los hígados e inmediatamente se colocaron y se 
homogeneizaron en regulador A (regulador de fosfatos 0.04 M, pH 7.2, con 
sacarosa 0.1 M, KCl 0.05 M, EDTA 0.03 M), se emplearon 2 mL de 
regulador por gramo de hígado. La homogeneización se realizó en un 
homogeneizador eléctrico modelo GKH-GT motor control, marca Glas Col. 
El homogeneizado resultante se centrifugó en una centrifuga modelo RC-
5B, marca Sorvall® DUPONT Instruments a 10,000 g por 10 min, 
posteriormente el sobrenadante se centrifugó nuevamente a 100,000 g por 
60 min en una ultracentrífuga modelo L8-M, marca Beckman. El 
sobrenadante se decantó, eliminándose el material lipídico. Los microsomas 
se lavaron por resuspensión del sedimento en el regulador A y se centrifugó 
a 100,000 g por 45 min. Todo el procedimiento para la obtención de los 
microsomas se realizó a 4°C. El paquete microsomal lavado se congeló 
lentamente y se mantuvo hasta su análisis posterior en un congelador de -
86ºC de la marca Forma Scientific. Antes de usar los microsomas, se 
resuspendieron en 250 µL del regulador B (Regulador A + 10 mM de 
ditiotreitol) y se determinó laconcentración de proteínas por el método de 
Bradford y las actividades enzimáticas correspondientes. 
 
4.3.e Determinación de proteínas por el método de Bradford. 
 
Reactivo de Bradford. Se disolvieron 100 mg de azul de Coomassie G250 
en 50 mL de etanol al 95% y se adicionaron 100 mL de ácido fosfórico al 
85%. Esta solución concentrada se diluyó en 0.8 L con agua destilada y con 
filtró en papel Whatman No. 2 
 
 
 20
Procedimiento: 
 
1.-A siete tubos de 16 X 150 mm, se les colocaron las siguientes cantidades 
de una solución de 0.3 mg/mL de albúmina sérica bovina (ABS): 0.0, 0.05, 
0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mL respectivamente, por duplicado. 
 
2.- A otros tubos se les adicionaron 5 µL de una solución diluida 1:2 de las 
muestras de microsomas de las ratas. 
 
3.-Se adicionó agua a cada uno de los tubos del paso 1 y 2 hasta llevarlos a 
un volumen final de 1 mL. 
 
4.- Se adicionaron 4 mL del reactivo de Bradford a cada tubo y se agitó. 
 
5.-Después de 15 min a 1 hora se leyeron las absorbancias de las muestras 
en un espectrofotómetro a 595 nm y se determinó la concentración de 
proteína microsomal de las muestras, utilizando la curva tipo preparada. 
 
 
4.4 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA HIDROXI-METILGLUTARIL 
COENZIMA A REDUCTASA (HMG CoA REDUCTASA) (Alberts et al., 1980; 
Edwards et al., 1979). 
 
4.4.a Medición de la actividad de la HMG CoA reductasa. Se descongeló la 
preparación microsomal. Una vez descongelada se activó a 37°C durante 30 
min. Se preparó la mezcla de reacción que contenía en 100 μL: regulador de 
fosfatos 0.14 M, pH 6.8; KCl 0.18 M, EDTA 3.5 mM, pH 7; ditiotreitol 10 Mm, 
albúmina sérica bovina a una concentración final de 0.1 mg/mL, DL- HMG CoA-
14C 0.04 µCi; 50 µM de HMG CoA, y 30 µL de la preparación enzimática. Se 
preincubó esta mezcla 5 min a 37°C. La reacción se inició con la adición de 0.2 
mM de NADPH, se incubó 60 min a 37°C. La reacción de detuvo con la adición 
de 20 µL de HCl 5 M. Se incubó 30 min más a 37°C, se eliminó la proteína 
precipitada por centrifugación a 10,000 g por 15 min, en una microcentrifuga 
 21
modelo Micro Centaur, marca Sanyo, se pasó el sobrenadante por una 
columna de 0.5 X 5 cm de resina Bio-Rex, previamente equilibrada con agua 
desionizada. Se eluyó con agua desionizada y se colectaron los primeros 3 mL 
a los que se les adicionaron 15 mL de líquido de centelleo ACS II. Se leyó la 
radiactividad asociada a las fracciones colectadas que contienen el producto de 
la reacción enzimática (mevalonato), en un contador de centelleo líquido 
Beckman modelo LS6500. Una unidad de HMG CoA reductasa es la cantidad 
de enzima que produce un pmol de mevalonato por min, bajo las condiciones 
experimentales. 
 
Para la determinación de la actividad HMG CoA reductasa in vitro, los 
compuestos α-asarona y TMC se disolvieron en dimetilsulfóxido al 80% y se 
probaron diversas concentraciones de los compuestos mencionados para 
obtener la cinética correspondiente. Se utilizó un control positivo conteniendo 
dimetilsulfóxido al 80%. 
 
4.4.b Fundamento de la reacción: 
La determinación de la actividad se basa en la cuantificación del producto 
marcado con 14C, mevalonato, que se forma de la reacción catalizada por la 
HMG CoA reductasa, que utiliza HMG CoA marcada con 14C y NADPH como 
sustratos. La reacción es la siguiente: 
 
 
 
 
 
C SCoA
O
CH2
C
CH2
COOH
HO CH3
H2C OH
CH2
C
CH2
COOH
HO CH3
 
 
 
 
* * 
 
 
 
 
 
 
 
+ 2 NADPH + CoA SH + 2 NADP
Hidroxi-metilglutaril Co A
 reductasa
Hidroxi-metilglutaril Co A Mevalonato
 
 
 22
4.5 DETERMINACIÓN DE ACIL COENZIMA A: COLESTEROL ACIL 
TRANSFERASA (ACAT) (Ligeramente modificada de Gillett y Owen, 1992). 
 
4.5.a Reactivos: 
a. Regulador de fosfatos de potasio 0.1 M, pH 7.4 con glutatión reducido 1 
mM. 
b. Albúmina sérica bovina: 20 mg/mL en el regulador de fosfatos. 
c. Solución madre de colesterol/Tritón WR-1339: 33.4 mg de colesterol y 1 
g de tritón WR-1339 en 10 mL de acetona. 
d. Solución de trabajo de colesterol/Tritón WR.1339. Esta solución se 
preparó diariamente para 10 determinaciones. Se adicionó 1 mL de 
regulador (a) a un tubo con tapón de rosca, se pesó y calentó a 60°C. La 
solución (c) se calentó a 60ºC para asegurar que el colesterol se 
disolviera. Se adicionaron 60 µL de la solución (c) al regulador (a), gota a 
gota mientras se agitaba en un “vortex”. Se eliminó la acetona por 
calentamiento en baño maría a 50-55ºC. Se volvió a pesar el tubo para 
calcular la cantidad de agua perdida; se reemplazó adicionando agua, 
gota a gota, mientras se agitaba en un “vortex”. La solución resultante fue 
transparente (soluciones turbias daban resultados falsos negativos por lo 
que se descartaron) y cada mL contenía 520 nmoles de colesterol y 6 mg 
de Tritón WR-1339. 
e. 1-14C-oleoil Co A (5000 dpm/nmol): 1 mM en regulador de fosfato de 
potasio 0.01M, pH 6.0. Se diluyó la oleoil CoA marcada (50-60 µCi/µmol 
almacenada en atmósfera de nitrógeno a –80°C para evitar su 
descomposición) con oleoil CoA no marcada, justo antes de usar. 
 
 
4.5.b Determinación de la actividad de ACAT-2. A cada tubo con tapón de 
rosca, se adicionó 200-300 µg de proteína microsomal, 50 µL de albúmina 
bovina y 100 µL de la solución de trabajo de colesterol/TritónWR-1339. Se 
completó a 0.18 mL con el regulador de fosfatos (solución a) y los tubos se 
preincubaron a 37°C por 30 min. Se inició la reacción y se adicionó, a intervalos 
de 15 seg, 20 µL de 14C-oleoil CoA a cada tubo y se mezcló. Después de 
exactamente 10 min, se detuvo la reacción en el primer tubo con la adición de 4 
 23
mL de la mezcla cloroformo-metanol (2:1, v/v) conteniendo 40 µg de colesteril-
oleato como acarreador. Éste último procedimiento se repitió a intervalos de 15 
seg para los otros tubos. Se adicionaron 0.8 mL de agua, se mezcló y 
centrifugó en una centrifuga analítica marca Clay Adams a 4000 g por 15 min 
para separar y clarificar las fases clorofórmica y acuosa. Se eliminó la fase 
superior y las proteínas desnaturalizadas de la interfase por aspiración. Los 
ésteres de 14C-colesterol se separaron de la fase inferior por cromatografía en 
capa fina, después de concentrar casi a sequedad en baño María a 50-55°C. 
Se utilizaron placas de aluminio cubiertas de sílica gel G de 10 X 20 cm. Cada 
placa se dividió en 10 carriles. El solvente se preparó aproximadamente una 
hora antes del desarrollo cromatográfico, que es una mezcla de hexano: éter 
dietílico: ácido acético, 90:20:1 (v/v/v). Se desarrolló hasta 1 cm del tope de la 
placa. Después, se secó por 5 min aproximadamente, y se reveló con yodo. 
Las posiciones de los ésteres de colesterol y colesterol libre se marcaron por 
comparación con estándares. Los valores de Rf fueron 0.80 y 0.15, 
respectivamente. Se dejó sublimar el yodo. Cada mancha se cortó con tijeras y 
se transfirió a viales a los que se les adicionó 15 mL de líquido de centelleo 
ACS II. Se agitó y se midió la radiactividad de los ésteres de colesterol. La 
actividad de la ACAT-2 se expresó como pmol de oleato de colesterilo formado 
por min por mg de proteína. 
 
Para la determinación de la actividad ACAT-2 in vitro, los compuestos α-
asarona y TMC se disolvieron en dimetilsulfóxido al 80% y se probaron 
diversas concentraciones de los compuestos mencionados para obtener la 
cinética correspondiente. Se utilizó un control positivo conteniendo 
dimetilsulfóxido al 80%. 
 
4.5.c Fundamento de la reacción: 
La determinación se basa en la cuantificación de ésteres de colesterol 
marcados radiactivamente con 14C, que se forman en la reacción enzimática 
catalizada por la ACAT-2 presente en los microsomas y que utiliza como 
sustratos el colesterol y la oleoil CoA marcada con 14C. El producto de la 
reacción se separa por cromatografía en placa fina y se cuantifica en un 
contador de centelleo líquido. 
 24HO O
H3C (CH2)7 HC CH (CH2)7 C SCoA
O
H3C (CH2)7 HC CH (CH2)7 C
O
Acil Coenzima A: colesterol
 Acil transferasa
Colesterol Oleoil colesterol
*
* Coenzima A
 Oleoil CoA
 
 
 
4.6 DETERMINACIÓN DE COLESTEROL 7-α-HIDROXILASA (Ligeramente 
modificada de Van Patten et al., 2001; De Caprio, et al., 1992). 
 
4.6.a Medición de la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa. La mezcla 
de reacción contenía en un volumen final de 0.5 mL, regulador de fosfatos de 
potasio 100 mM, pH 7.4, EDTA 0.1 mM, ditiotreitol 5 mM, nicotinamida 30 mM, 
300-400 µg de proteína microsomal. Por separado, se preparó una solución 
que contuvo 150.4 nmol de 4-14C-colesterol y 265.1 nmol de colesterol no 
marcado solubilizado en 160 µL de 2-hidroxipropil-ß-ciclodextrina al 45% 
(peso/volumen). Una muestra (10 μL de la solución previamente preparada: 26 
nmol de colesterol, 52 μmol/L, 9% de 2-hidroxipropil-ß-ciclodextrina, 
concentración final) se adicionó a cada ensayo enzimático. La reacción se 
inició por la adición de un sistema generador de NADPH (NADP 3.4 mM, 
glucosa-6-fosfato 30 mM, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0.3 U) y se incubó 
por 15 min a 37°C. La reacción se detuvo por la adición de 0.5 mL de KOH 1 N 
conteniendo 5 µg de hidroxitolueno butilado. Se saponificó a 37°C por una hora 
y se extrajeron los esteroles dos veces con 3 mL de n-hexano. Los extractos se 
evaporaron a sequedad en baño maría entre 50-55ºC. El residuo se disolvió en 
0.3 mL de n-hexano:2-propanol (97:3, vol/vol) y se aplicó sobre una columna de 
sílica (500 mg, Waters). Después de lavar la columna con 1 mL de n-hexano, 
seguido por 4 mL de n-hexano:2-propanol (97:3, vol/vol), se eluyó 7-α-
 25
hidroxicolesterol con 3 mL de n-hexano:2-propanol (80:20, vol/vol) y 
posteriormente se separó por cromatografía en placa fina, en placas de sílica 
gel, con éter dietílico como solvente de desarrollo cromatográfico y se 
cuantificó en un contador de centelleo líquido Beckman modelo LS6500. El 
valor de Rf para 7-α-hidroxicolesterol fue de 0.7. La actividad de la Colesterol 7-
α-hidroxilasa se expresó como pmol de 7-α-hidroxicolesterol formado por min 
por mg de proteína. 
 
Para la determinación de la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa in vitro, 
los compuestos α-asarona y TMC se disolvieron en dimetilsulfóxido al 80%, y 
se probaron diversas concentraciones de los compuestos mencionados para 
obtener la cinética correspondiente. Se utilizó un control positivo conteniendo 
dimetilsulfóxido al 80%. 
 
4.6. b Fundamento de la reacción: 
El colesterol marcado con 14C es hidroxilado en el carbono 7 por la Colesterol 
7-α-hidroxilasa. El producto, 7-α-hidroxicolesterol, se obtiene en la fracción 
80:20 (hexano:2-propanol) y se separa por cromatografía en placa fina. La 
reacción es la siguiente: 
 
 
 
 
HO HO OH
 
NADP NADPH
 
 ** Colesterol 7-α-hidroxilasa
 
Colesterol 7-α-hidroxicolesterol 
 
 
 
 
 26
4.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 
La evaluación estadística se realizó con el programa Sigma Stat®. Los datos se 
trataron por un análisis de varianza de una cola (ANOVA). La significancia de 
las medias se determinó por el método de Holm-Sidak. El valor aceptado de p 
fue <0.05. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 27
5. RESULTADOS 
 
 
5.1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA HMG CoA REDUCTASA 
 
5.1.a In vitro 
 
Se determinó el efecto del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico y de la α-
asarona sobre la actividad de la HMG CoA reductasa de microsomas hepáticos 
de ratas macho alimentadas con una dieta estándar. Los resultados se 
muestran en la figura 10 y en la Tabla 1. Se observa que la α-asarona inhibe a 
la HMG CoA reductasa, con una IC50 de 3.22 mM, como ya se había 
encontrado previamente (Rodríguez-Páez et al., 2003); también se encontró 
que el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, inhibe a la reductasa, con una IC50 de 
69.8 mM, es decir, aproximadamente 22 veces menos que la α-asarona, 
resultado que también se había obtenido en un estudio anterior (Antúnez, 
2001). 
 
5.1.b In vivo 
 
Se determinó la actividad de la HMG CoA reductasa de microsomas 
hepáticos de ratas hipercolesterolémicosque estuvieron sometidas a los 
tratamientos con el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico y con la α-asarona, 
obteniéndose para las ratas testigo 3.8 + 0.59 pmol mevalonato/min/mg 
proteína, mientras que para las ratas tratadas con el TMC fue de 3.43+0.43 
pmol mevalonato/min/mg proteína y para las ratas tratadas con α-asarona fue 
de 11.88 + 1.32 pmol mevalonato/min/mg proteína (Figura 11). De acuerdo a 
estos resultados, la actividad de la HMG CoA reductasa in vivo aumenta por el 
tratamiento con la α-asarona al compararla con la actividad del grupo testigo, 
mientras que el tratamiento con el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico no produjo 
diferencias significativas con respecto al control. Cuando se comparan los 
 28
datos de los lotes problema (α-asarona y ácido 2,4,5-trimetoxicinámico) sí hay 
diferencia estadísticamente significativa (Figura 11). 
 
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Concentración del inhibidor (mM)
A
ct
iv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
Concentración del inhibidor (mM)
Ac
tiv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(%
)
B 
A 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Inhibición de la HMG CoA reductasa hepática in vitro en microsomas 
de ratas macho alimentadas con una dieta estándar por el ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico (A) y la α-asarona (B). La actividad enzimática se 
expresa como porcentaje del testigo (sin inhibidor). La actividad total de la 
enzima fue 122 pmol de mevalonato producido/min/mg de proteína. 
 29
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A
ct
iv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(p
m
ol
 m
ev
al
on
at
o/
m
in
/m
g 
pr
ot
eí
na
)
0
2
4
6
8
10
12
14
 Testigo TMC α−asarona
 
*
 
 
 
Figura 12 . Actividad enzimática de la HMG CoA reductasa hepática in vivo en ratas 
macho hipercolesterolémicas. TMC: ácido 2,4,5-trimetoxicinámico. * p < 
0.0001, n= 15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 30
5.2 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ACAT-2 
 
5.2.a In vitro 
 
El efecto que producen el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico y la α-asarona sobre la 
actividad de esta enzima microsomal hepática de ratas macho alimentadas con 
una dieta estándar, fue semejante al que produjeron sobre la actividad de la 
HMG CoA reductasa. Ambos compuestos fueron capaces de inhibir a la ACAT-
2 hepática de una manera dependiente de la concentración (Figura 12). 
También en este caso, la α-asarona fue mucho mejor inhibidor que el ácido 
TMC, inhibió 31.2 veces más que el TMC, ya que las IC50 fueron de 0.96 mM y 
30.0 mM, para la α-asarona y el TMC, respectivamente (Tabla 1). Es más, la α-
asarona produjo mayor inhibición sobre la ACAT-2 que sobre la HMG CoA 
reductasa. Esta es la primera vez que se informa que esta enzima es inhibida 
por la α-asarona. Es probable que, como lo mencionamos en el caso de la 
inhibición de la HMG CoA reductasa, la densidad de carga negativa del grupo 
carboxilo en el TMC, que no se presenta en la α-asarona, produce una 
inhibición mucho menor, ya que también es una enzima de retículo 
endoplásmico y por lo tanto, hidrofóbica. 
 
 5.2.b In vivo 
 
Cuando se determinó la actividad de la ACAT-2 de microsomas 
hepáticos de ratas macho hipercolesterolémicas, que estuvieron sometidas a 
los tratamientos con el TMC y con la α-asarona, se obtuvieron los resultados 
que se presentan en la figura 13. Las ratas testigo presentaron una actividad de 
73.7 + 12 pmol de colesteril oleato/min/mg proteína, mientras que para las 
ratas tratadas con TMC fue de 89.7 + 15.4 pmol colesteril oleato/min/mg 
proteína y para las ratas tratadas con α-asarona fue de 99.8 + 18.9 pmol 
colesteril oleato/min/mg proteína. De acuerdo al análisis estadísticoaplicado a 
estos datos, la actividad de la ACAT-2 hepática in vivo no se modifica por los 
tratamientos con el TMC y la α-asarona al compararla con la actividad del 
 31
grupo testigo. Cuando se comparan los datos de los lotes problema (α-asarona 
y ácido 2,4,5-trimetoxicinámico) tampoco hay diferencias significativas. 
 
 
Concentración del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (mM)
0 20 40 60
Ac
tiv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(%
)
0
20
40
60
80
100
IC50 = 30.00 mM
 
 
Concentración de α-asarona (mM)
0 1 2 3 4 5 6
Ac
tiv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(%
)
0
20
40
60
80
100
IC50 = 0.96 mM
 
B 
A 
 
 
 Figura 13. Inhibición de la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa-2 
hepática in vitro en microsomas de ratas macho alimentadas con 
una dieta estándar, por el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (A) y la α-
asarona (B). La actividad enzimática se expresa como porcentaje del 
testigo (sin inhibidor). La actividad total de la enzima fue 100 pmol de 
colesteril oleato producido/min/mg de proteína. 
 
 
 
 
 
 
 32
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
20
40
60
80
100
120
140
A
ct
iv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a
(p
m
ol
 c
ol
es
te
ril
 o
le
at
o/
m
in
/m
g)
Testigo TMC α-asarona
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Actividad enzimática de la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa-2 
hepática in vivo en ratas macho hipercolesterolémicas. TMC: ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico. n=15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 33
5.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA COLESTEROL 7-α-
HIDROXILASA 
 
5.3. a In vitro 
 
Cuando se midió la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa microsomal 
hepática de ratas macho alimentadas con una dieta estándar, se obtuvieron los 
resultados de la figura 14 y la tabla 1. Como puede observarse, la α-asarona 
fue capaz de incrementar la actividad de la enzima, de una manera 
impresionante. El aumento en la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa fue 
dependiente de la concentración de α-asarona hasta 15 mM. Los resultados en 
la figura 14, se presentan normalizados. Se tomó un valor de 1 para el control 
sin α-asarona y, de acuerdo a estos datos, la concentración que provoca un 
aumento del 50% de la actividad de la enzima (AC50) fue de 2.41 mM. Este 
resultado aunque aparentemente extraño, no lo es, ya que en estudios previos 
(Antúnez, 2001) encontramos que se produce un incremento significativo en la 
concentración de ácidos biliares en la bilis de ratas macho 
hipercolesterolémicas tratadas con α-asarona y la Colesterol 7-α-hidroxilasa es 
la enzima que regula la vía clásica de síntesis de ácidos biliares (Montgomery 
et al., 1996). 
 
Al medir la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa en presencia de 
TMC, encontramos que esta enzima se inhibe de una manera dependiente de 
la concentración de TMC (Figura 14). La IC50 de esta inhibición fue de 54.4 mM 
(Tabla 1). Es decir, el TMC es un débil inhibidor de la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, como lo es para las otras dos enzimas ensayadas. Es posible que, 
como ya lo mencionamos previamente, su estructura química más polar que la 
α-asarona, le impida interaccionar con la Colesterol 7-α-hidroxilasa. 
 
5.3.b In vivo 
 
Al determinar la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa extraída de 
microsomas hepáticos de ratas macho hipercolesterolémicas, que estuvieron 
 34
sometidas a los tratamientos con el TMC y con la α-asarona, se obtuvieron los 
resultados que se presentan en la figura 15. Las ratas testigo presentaron una 
actividad de 13.5 + 1.36 pmol de 7-α-hidroxicolesterol/min/mg proteína, 
mientras que para las ratas tratadas con TMC, la actividad fue de 17.5 + 2.6 
pmol 7-α-hidroxicolesterol producido/min/mg proteína y para las ratas tratadas 
con α-asarona, la actividad fue de 25.5 + 5.2 pmol 7-α-hidroxicolesterol 
producido/min/mg proteína. El análisis estadístico mostró que la α-asarona 
incrementó la actividad de esta enzima en comparación con el lote testigo, en 
concordancia con los resultados mencionados antes, donde hubo un 
incremento en la concentración de ácidos biliares en la bilis de ratas macho 
hipercolesterolémicas tratadas con α-asarona. El TMC, no produjo modificación 
de la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa en relación al grupo testigo ni en 
relación al grupo tratado con α-asarona. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35
 
 
Concentración del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (mM)
0 20 40 60
A
ct
iv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
IC50 = 54.4 mM
 
 
 
 
 
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Concentración de α-asarona (mM)
Ac
tiv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a 
(n
or
m
al
iz
ad
a 
co
n 
el
 c
on
tro
l)
AC50= 2.41 mM
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B 
A 
 Figura 15. Efecto del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (A) y la α-asarona (B) sobre la 
Colesterol 7-α-hidroxilasa in vitro en microsomas de ratas macho 
alimentadas con una dieta estándar. La actividad enzimática se expresa 
como porcentaje del testigo. La actividad total de la enzima fue 22.02 pmol de 
7-α-hidroxicolesterol producido/min/mg de proteína. 
 
 
 36
 
 
 
 
 
A
ct
iv
id
ad
 e
nz
im
át
ic
a
(p
m
ol
 7
-α
-h
id
ro
xi
co
le
st
er
ol
/m
in
/m
g)
0
5
10
15
20
25
30
35
 Testigo TMC α-asarona
*
 
 
Figura 16. Actividad enzimática de la Colesterol 7-α-hidroxilasa hepática in vivo en 
ratas macho hipercolesterolémicas. TMC: ácido 2,4,5-trimetoxicinámico. * p 
< 0.05. n=15. 
 
 
 
 
 
 
 37
TABLA 1. Determinación de la IC50 o AC50 de la α -asarona y el TMC sobre 
las enzimas que regulan el metabolismo hepático del colesterol 
 
 
IC501
(mM) 
 
AC502
(mM) 
 
 
Enzima 
Microsomal hepática 
α -asarona 
 
TMC3
 
α -asarona 
 
TMC3
 
HMG CoA reductasa 
 
3.22 
 
69.8 
 
-4
 
- 
 
ACAT-2 
 
0.96 
 
30.0 
 
- 
 
- 
 
Colesterol 7-α-
hidroxilasa 
 
- 
 
54.40 
 
2.41 
 
- 
 
1Concentración que inhibe el 50% de la actividad enzimática. 2 Concentración que 
activa el 50% de la actividad enzimática.3 Acido 2,4,5-trimetoxicinámico. 4 no se 
observó. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 38
6. DISCUSION 
 
En la búsqueda de nuevos agentes hipocolesterolemiantes que contribuyan a 
disminuir las impresionantes cifras a nivel mundial de enfermedades 
cardiovasculares derivadas de la aterosclerosis (Thom et al., 2006), y además, 
porque los fármacos hipolipidémicos se están utilizando para el tratamiento de 
las dislipidemias asociadas a la resistencia a la insulina y a la diabetes mellitus 
tipo 2 (Moon y Kashyap, 2004; Ducobu, 2005), la investigación sobre nuevas 
moléculas y/o combinaciones de moléculas, tanto sintéticas como naturales, 
con actividad hipocolesterolemiante e hipolipidémica se está realizando en 
muchos laboratorios de investigación y compañías farmacéuticas en todo el 
mundo (Harris et al., 2003; Ishihara et al., 2004; Kim et al., 2005; Dell’Uomo et 
al., 2006; Santos et al., 2006). 
 
En nuestro laboratorio desde hace algunos años, nos hemos dedicado a la 
investigación sobre nuevas moléculas hipocolesterolemiantes y 
antiaterogénicas tratando de hacer nuestra aportación en este campo. 
 
En mamíferos, la homeostasis corporal de colesterol se mantiene 
principalmente por el balance entre su síntesis (a través de la HMG CoA 
reductasa) y su absorción intestinal (a través de la dieta y la circulación 
enterohepática) regulada a través de la modulación de los niveles de 
receptores de LDL en las superficies celulares y por cambios en los niveles y 
actividad de HMG CoA reductasa (Brown y Goldstein, 1986; Ness y Chambers, 
2000). 
 
El hígado tiene un papel relevante en la regulación de los niveles de colesterol. 
Este órgano podría llamarse el sensor del colesterol porque expresa los 
receptores corporales de las diferentes lipoproteínas y es el principal sitio de 
degradación de colesterol por su conversión a ácidos biliares y, aunquela HMG 
CoA reductasa se encuentra en casi todos los tejidos, el hígado expresa uno de 
los niveles más altos de esta enzima; además, y muy importante, la regulación 
por retroalimentación de la HMG CoA reductasa por el colesterol ocurre 
 39
principalmente en este órgano (Ness y Chambers, 2000). Por esto es que en 
este trabajo, nos enfocamos a estudiar, en el hígado, tanto in vitro como in vivo, 
los posibles mecanismos de acción hipocolesterolemiantes de la α-asarona y el 
ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (TMC). 
 
Nuestros resultados in vitro muestran que la HMG CoA reductasa 
hepática es inhibida tanto por la α-asarona como por el TMC, aunque la α-
asarona la inhibe aproximadamente 22 veces más que el TMC. El hecho de 
que la HMG CoA reductasa fuera inhibida por la α-asarona, es un resultado 
que ya se había obtenido en un estudio previo (Chávez, 2004). En ese estudio, 
se encontró que la α-asarona se comportó como un inhibidor competitivo de la 
reductasa, es decir, es capaz de acomodarse en el sitio activo de la enzima y 
lograr la inhibición. Al realizar un análisis comparativo de los sitios de unión de 
las estatinas (inhibidores competitivos de la enzima, con afinidades aún 
mayores que la del sustrato, Figura 17. (Istvan y Deisenhofer, 2001)) y los 
posibles sitios de unión de la α-asarona en la reductasa, se encontró que ésta 
última, podría anclarse en una región hidrofóbica que presenta el sitio activo de 
la reductasa, tal y como se ha demostrado, para las estatinas, por estudios 
cinéticos y cristalográficos, a través de sus regiones no polares (Istvan y 
Deisenhofer, 2001). Recientemente, por estudios químicos teóricos 
(acoplamiento molecular y QSAR tridimensional), se está tratando de 
correlacionar la estructura de la α-asarona con sus propiedades 
hipolipidémicas (Medina-Franco et al., 2005; Magdziarz et al., 2006). En cuanto 
al TMC, éste presenta una actividad inhibitoria muy baja hacia la HMG CoA 
reductasa, esto de debe probablemente, a la densidad de carga negativa del 
grupo carboxilo en el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, que no presenta la α-
asarona y que impide la inhibición de la HMG CoA reductasa, ya que es una 
enzima asociada a las membranas del retículo endoplásmico y por lo tanto, 
hidrofóbica, los inhibidores conocidos de esta enzima son generalmente no 
polares (Endo, 1992; Istvan y Deisenhofer, 2001). 
 
 
 
 40
Tipo 1 
Compactina Simvastatina 
HMG- CoA 
Fluvastatina Cerivastatina 
Atorvastatina Rosuvastatina 
Tipo 2 
 
 
Figura 17. Estructuras químicas de algunas estatinas. Tipo 1: Naturales, Tipo 
2: Sintéticas. (Modificado de Istvan y Deisenhofer, 2001) 
 
 
Con estos resultados, supusimos que el efecto hipocolesterolemiante de 
la α-asarona, demostrado en ratas macho hipercolesterolémicas (Rodríguez-
Páez et al., 2003) se debía a que era un inhibidor de la HMG CoA reductasa 
hepática, enzima que como ya se dijo con anterioridad, cataliza el paso 
limitante en la síntesis de colesterol; ya que, in vivo, al inhibirse esta enzima en 
los hepatocitos, hay una disminución del nivel intracelular de colesterol; las 
células responden sintetizando más receptores de LDL y enviándolos a la 
membrana celular para captar las LDL-colesterol circulantes y de esta manera 
mantener la homeostasis hepática de colesterol. Al inducirse este mecanismo, 
disminuyen los niveles sanguíneos de LDL-colesterol y se produce 
hipocolesterolemia (Shepherd, 2004). Sin embargo, al medir la actividad in vivo 
de la HMG CoA reductasa hepática en nuestras ratas macho 
hipercolesterolémicas tratadas con α-asarona, encontramos que ésta enzima, 
no solo no fue inhibida por el tratamiento, sino que se incrementó más de tres 
veces la actividad enzimática. 
 
 41
Las estatinas, que son los fármacos más utilizados y efectivos para 
disminuir la concentración sanguínea de colesterol por inhibición de la HMG 
CoA reductasa, producen altos niveles de expresión de la reductasa e 
incremento en la estabilidad de la proteína, como respuesta a su inhibición in 
vivo en ratas, de tal manera que la inhibición de la biosíntesis corporal de 
colesterol, no es tan grande como se esperaría (Fujioka et al., 1995; Ness et 
al., 1998; Ness y Chambers, 2000). Goldstein y Brown (1990) demostraron que 
la expresión de HMG CoA reductasa está controlada por retroalimentación 
negativa de los metabolitos producidos en la vía de síntesis de colesterol, así la 
inhibición de la HMG CoA reductasa, induce la expresión de la misma, lo que 
explica el incremento de la actividad de la enzima en presencia de las estatinas 
(Fujioka et al., 1995; Sawada et al., 2002). 
 
De acuerdo a lo anterior, la α-asarona se comporta como las estatinas: 
a) produce disminución en la concentración de colesterol en sangre, b) es un 
inhibidor de la HMG CoA reductasa hepática, c) se revierte la inhibición de la 
HMG CoA reductasa porque la disminución de colesterol hepático por inhibición 
de su síntesis, provocará también una disminución en los metabolitos que son 
sintetizados en la vía de la síntesis del colesterol, que son los que regulan por 
retroalimentación a la reductasa, de tal manera que la disminución o pérdida de 
metabolitos inducen la expresión de la enzima. 
 
Por otro lado, el TMC, que no es un buen inhibidor de la HMG CoA 
reductasa in vitro, no modifica la actividad in vivo de la HMG CoA reductasa 
hepática, con lo cual probablemente no se altera la concentración de 
metabolitos derivados de la síntesis de colesterol que tienen importantes 
efectos de regulación sobre la misma. 
 
La ACAT es la enzima microsomal responsable de la esterificación de 
colesterol con ácidos grasos de cadena larga, en una gran variedad de células 
y tejidos. Al transformar el colesterol libre en un éster de colesterol, la ACAT 
permite almacenar al colesterol intracelularmente de una manera no tóxica. La 
ACAT es otra de las enzimas significativas en el mantenimiento del balance 
intracelular de colesterol además de la HMG CoA reductasa, cuya posible 
 42
inhibición ha sido blanco recientemente de tratamientos quimioterapéuticos 
relacionados con la aterosclerosis (Burnett et al., 1999; Matsui et al., 2001; 
León et al., 2005; Chang et al., 2006), ya que aun con las estatinas existe la 
necesidad de desarrollar otros compuestos que pudieran complementar la 
acción de las mismas para reducir la incidencia de enfermedades 
cardiovasculares y muerte. 
 
Los inhibidores de la ACAT trabajan de manera diferente a las estatinas, 
ya que pueden actuar, por un lado, al disminuir el tamaño del núcleo lipídico en 
la placa aterosclerótica (por inhibición de la ACAT de los macrófagos), 
estabilizando y/o disminuyendo el riesgo de ruptura de la placa y por otro, 
disminuyendo la absorción intestinal del colesterol de la dieta (por inhibición de 
la ACAT intestinal) y la secreción hepática de VLDL-colesterol (por inhibición 
de la ACAT hepática). De tal manera que los inhibidores de la ACAT pueden 
prevenir la aterosclerosis no sólo por su actividad hipocolesterolemiante, sino 
también por su actividad antiaterosclerótica directa (León et al., 2005; Chang et 
al., 2006). 
 
Sin embargo, hasta hace aproximadamente 7 años, se conoció la 
existencia de dos genes que codifican para la actividad de ACAT, a las que se 
les llamó ACAT-1 y ACAT-2 y actualmente esta claro que las dos enzimas 
realizan funciones fisiológicas diferentes. La ACAT-1 se expresa en la mayoría 
de las células, esterificando el colesterol en respuesta a la abundancia de 
colesterol dentro de las células. En lesiones ateroscleróticas donde los 
macrófagos ingieren exceso de colesterol, esta enzima parece que es 
importante para la sobrevivencia celular, y la inhibición de la ACAT-1 puede 
llevar a la muerte celular. En contraste, la ACAT-2 se expresa sólo en 
hepatocitos y enterocitos y parece que su función es proporcionar ésteres de 
colesterol para sutransporte en lipoproteínas. Estos dos tipos celulares tienen 
mecanismos adicionales para disponer del colesterol y la disminución de la 
ACAT-2 no provoca apoptosis (Rudel et al., 2005). De tal manera que la 
información disponible a la fecha sugiere que la estrategia para el tratamiento 
de las enfermedades cardiovasculares asociada a aterosclerosis e 
hipercolesterolemia podría ser la inhibición específica de la ACAT-2. 
 43
 
Debido al efecto hipocolesterolemiante de la α-asarona y el TMC y a que 
este efecto podría ser debido a inhibición de la ACAT-2, medimos la actividad 
de la ACAT-2 hepática en presencia de la α-asarona y el TMC in vitro e in vivo. 
Los resultados mostraron que ambos compuestos inhibieron in vitro a la ACAT-
2 y, al igual que con al HMG CoA reductasa, la α-asarona inhibió a la ACAT-2, 
más de 30 veces con respecto al TMC. Al comparar la estructura química de la 
α-asarona con la de algunos inhibidores conocidos de la ACAT, encontramos 
que éstos pueden ser de dos tipos generales, derivados de amidas aromáticas 
con ácidos grasos y derivados de la urea (León et al., 2005). Dentro de los 
primeros existe una amplia gama de compuestos que incluyen inhibidores 
competitivos de derivados polimetoxilados, con regiones semejantes a la α-
asarona y al TMC (Azuma et al., 1998; Matsui et al., 2001). De aquí que, 
podríamos explicarnos la razón de la inhibición in vitro de la ACAT por nuestros 
compuestos de estudio. De acuerdo a esto, esperábamos encontrar la actividad 
de la ACAT disminuida in vivo, sin embargo, encontramos un ligero incremento 
no significativo, producido por los grupos tratados con respecto al control en la 
actividad de la ACAT-2 hepática. Posiblemente, la ACAT-2 se inhibe al inicio 
del tratamiento, pero después de los 7 días de tratamiento, y, de acuerdo a los 
resultados obtenidos con respecto a la elevación de la actividad de la HMG 
CoA reductasa en las ratas tratadas con α-asarona, que repercute en una 
elevación de los niveles intracelulares de colesterol libre, ocurre un ligero 
incremento en la actividad de la ACAT-2, porque el colesterol libre es un 
activador alostérico de esta enzima (Chang et al., 2006). Resultados similares 
se han obtenido con inhibidores de la HMG CoA reductasa al analizar el efecto 
de éstas moléculas sobre el metabolismo hepático de colesterol en ratas 
macho con una dieta hiperlipidémica (Clerc et al., 1993). 
 
En nuestro estudio, también analizamos el efecto de la α-asarona y el 
TMC, sobre la actividad de la colesterol 7-α-hidroxilasa, otra de las enzimas 
importantes en el mantenimiento de la homeostasis de colesterol. Ésta es una 
enzima exclusiva del hígado, que cataliza el paso limitante, por la vía clásica, 
en la síntesis de ácidos biliares, los productos de excreción del colesterol 
 44
(Souidi et al., 2000). La transformación de colesterol en ácidos biliares es la 
única vía de eliminación corporal de colesterol. En estudios previos de nuestro 
laboratorio (Rodríguez-Páez et al., 2003), encontramos que la α-asarona 
produjo un incremento en la concentración de ácidos biliares de ratas macho 
hipercolesterolémicas que podría haber sucedido por un incremento en la 
actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa y, en este trabajo, comprobamos que 
realmente hay un incremento de casi el doble, en la actividad de la Colesterol 
7-α-hidroxilasa, en ratas hipercolesterolémicas tratadas con la α-asarona. La 
elevación en la concentración biliar de los ácidos biliares derivada del 
incremento en la actividad de esta enzima, significa que hay, a su vez, un 
incremento en la excreción (eliminación corporal) de colesterol. Y éste sería 
parte del mecanismo por el que la α-asarona presenta efecto 
hipocolesterolemiante. También, la elevación en la concentración biliar de 
ácidos biliares, producida por la elevación en la actividad de la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, explica el gran incremento en el flujo biliar, inducido por la α-
asarona (Rodríguez-Páez et al., 2003) que contribuye a eliminar mayor 
cantidad de colesterol y ácidos biliares del organismo. 
 
La crilvastatina y la pitavastatina, inhibidores de la HMG CoA reductasa 
producen, al igual que la α-asarona, elevación aparentemente inespecífica, en 
la expresión y actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa, en ratas (Clerc et al., 
1993; Fan et al., 2004), aunque existe la posibilidad de que el incremento en la 
actividad de esta enzima sea debido a que estos inhibidores de la HMG CoA 
reductasa, se sitúen en el sitio de unión del colesterol, que es quien activa a la 
Colesterol 7-α-hidroxilasa (Jelinek et al., 1990), o pueden modificar directa o 
indirectamente, la acción de los factores que regulan la expresión de esta 
enzima. 
 
El TMC, se comportó de manera diferente que la α-asarona, éste no 
modificó la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa in vivo. Un 
comportamiento semejante fue el que se observó in vitro: la α-asarona 
incrementó la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa, posiblemente, como ya 
lo mencionamos para las estatinas, porque ocupó el sitio de unión del 
 45
colesterol, activándola; mientras que el TMC inhibió a la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, posiblemente, porque se comportó como los ácidos biliares, que 
inhiben a la enzima (Xu et al., 1999). 
 
En resumen, en la búsqueda del mecanismo por el que la α-asarona y 
el TMC producen efecto hipocolesterolemiante, podemos decir que: 
 
 Por lo menos son cinco los mecanismos responsables de la homeostasis 
del colesterol que afectan su concentración sanguínea: a) biosíntesis a 
partir de acetato, regulada por la HMG CoA reductasa, enzima limitante en 
la vía. b) expresión de los receptores de LDL, especialmente en el hígado, 
donde se localizan más de la mitad de ellos. c) incorporación de colesterol a 
través de la dieta. d) almacenaje intracelular como ésteres de colesterol 
regulado por la ACAT. e) transformación de colesterol a ácidos biliares, sus 
productos catabólicos, regulado por la formación de 7-α-hidroxicolesterol, 
molécula sintetizada por la colesterol 7-α-hidroxilasa. 
 
 En este estudio, analizamos cuatro de los cinco puntos anteriores, tomando 
como base los resultados obtenidos previamente (Rodríguez-Páez et al., 
2003) en ratas macho hipercolesterolémicas, que fueron: a) La α-asarona 
produjo una disminución la concentración de colesterol total en suero. b) 
produjo un incremento en la concentración de ácidos biliares en la bilis. c) 
produjo disminución en la concentración de colesterol biliar. d) produjo 
incremento en el flujo biliar. e) produjo incremento en la secreción de 
colesterol y ácidos biliares hacia el intestino. 
 
 Los resultados antes mencionados, junto con los obtenidos en este estudio, 
y en otros estudios donde se utilizaron inhibidores de la HMG CoA 
reductasa, nos hace proponer el siguiente mecanismo de acción 
hipocolesterolemiante de la α-asarona in vivo: 
 
La α-asarona inhibió inicialmente a la HMG CoA reductasa hepática, lo que 
provocó captación de LDL-colesterol circulante en el hígado, disminución de 
 46
los niveles sanguíneos de LDL-colesterol y como consecuencia de ello, se 
produjo hipocolesterolemia; también hubo inducción y/o activación de la 
HMG CoA reductasa, por falta de colesterol. Esto produjo una elevación 
posterior del colesterol libre hepático, que no activó a la ACAT-2, para formar 
ésteres de colesterol no tóxicos, sino que activó a la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, incrementándose la síntesis de ácidos biliares y disminuyendo la 
concentración de colesterol biliar y hepática. A su vez, los ácidos biliares 
produjeron un aumento en la coleresis y por lo tanto, un aumento en la 
secreción de colesterol y de ácidos biliares, lo que finalmente condujo a una 
excreción corporal incrementada. 
 
 El TMC, que presentó los mismos efectos farmacológicos de la α-asarona, 
pero en menor proporción, se comportódiferente a la α-asarona: in vivo no 
fue capaz de activar a la HMG CoA reductasa, posiblemente debido a que in 
vitro, fue un inhibidor muy débil de la HMG CoA reductasa y en el tiempo en 
el que transcurrió el experimento, no pudo lograr el mismo efecto que la α-
asarona. Tampoco modificó la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa. In 
vitro, su comportamiento frente a esta enzima fue completamente opuesto al 
de la α-asarona, e in vivo, se comportó igual que el grupo control. Realmente, 
el TMC sí presenta efecto hipocolesterolemiante, pero el mecanismo de ello, 
puede ser diferente al de la α-asarona, por lo menos en algunos aspectos, 
como que el efecto hipocolesterolemiante esté orientado principalmente al 
efecto colerético que produce, lo que incrementaría la excreción corporal de 
colesterol y de ácidos biliares. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 47
7. CONCLUSIONES 
 
1) In vitro, la α-asarona inhibe a la HMG CoA reductasa y a la Acil 
Coenzima A: colesterol acil transferasa-2 hepáticas, con IC50 de 3.22 
mM y 0.96 mM, respectivamente; y activa a la Colesterol 7-α-hidroxilasa 
hepática con una AC50 de 2.41 mM. 
 
2) In vivo, después de un tratamiento por 7 días, a una dosis de 80 mg/kg, 
a ratas hipercolesterolémicas, la α-asarona incrementa la actividad de la 
HMG CoA reductasa y de la Colesterol 7-α-hidroxilasa hepáticas y no 
modifica la actividad de Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa 
hepática-2. 
 
3) In vitro, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico inhibe a la HMG CoA reductasa, 
a la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa-2 y a la Colesterol 7-α-
hidroxilasa hepáticas, con IC50 de 69.8 mM, 30 mM y 54.4 mM, 
respectivamente. 
 
4) In vivo, después de un tratamiento por 7 días, a una dosis de 80 mg/kg, 
a ratas hipercolesterolémicas, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico no 
modifica las actividades enzimáticas de HMG CoA reductasa, Acil 
Coenzima A: colesterol acil transferasa hepática-2 y Colesterol 7-α-
hidroxilasa hepáticas. 
 
5) Nuestros resultados sugieren que el mecanismo por el que la α-asarona 
tiene efecto hipocolesterolemiante es por inhibición inicial a la HMG CoA 
reductasa, lo que provoca captación de LDL circulante en el hígado, y 
activación de la HMG CoA reductasa, por falta de colesterol; elevación 
posterior del colesterol libre hepático, activación de la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, incremento en la síntesis de ácidos biliares que produce un 
aumento en la coleresis y por lo tanto, un aumento en la secreción de 
 48
colesterol y de ácidos biliares, lo que finalmente conduce a su excreción 
corporal incrementada. 
 
6) Nuestros resultados sugieren que el mecanismo por el que el ácido 2,4,-
trimetoxicinámico produce efecto hipocolesterolemiante es diferente, por 
lo menos en parte, al sugerido para la α-asarona. 
 
8. PERSPECTIVAS 
La realización de este trabajo nos ha permitido proponer la manera por 
la que la α-asarona produce efecto hipocolesterolemiante, a través de la 
medición de las actividades enzimáticas de la HMG CoA reductasa, la ACAT-2 
y la colesterol 7- α-hidroxilasa hepáticas, que son las enzimas que regulan el 
metabolismo hepático de colesterol. Sin embargo, aún faltan estudios por 
realizar para dilucidar el mecanismo de acción de este fármaco, como: evaluar 
las actividades enzimáticas antes mencionadas, in vivo, efectuando cinéticas a 
tiempos más cortos que los realizados en este trabajo, lo que evidenciaría el 
momento en el que la α-asarona deja de inhibir a la HMG CoA reductasa y se 
revierte esta inhibición; también, determinar las actividades de las tres enzimas, 
en ratas macho, tanto en condiciones normolipémicas como hiperlipémicas, 
para conocer la regulación natural de las actividades enzimáticas, en este 
modelo experimental, bajo estos regímenes alimenticios; determinar los niveles 
de las VLDL en presencia de la α-asarona para corroborar la participación de la 
ACAT-2 hepática; es importante también, cuantificar el efecto de la α-asarona 
sobre la ACAT-2 intestinal, in vivo, ya que es posible que la α-asarona presente 
un efecto inhibidor sobre esta enzima y como consecuencia, puede impedir la 
absorción intestinal de colesterol, lo que incrementaría los posibles sitios de 
acción de la α-asarona; estudiar el comportamiento de los receptores hepáticos 
de LDL en presencia de la α-asarona. 
 
Finalmente, este estudio evidencia, en forma rotunda, que la α-asarona 
puede estar ejerciendo su efecto, no solamente por acción directa sobre las 
actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo hepático de colesterol, 
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sino sobre la expresión de las mismas, lo que abre un nuevo campo de 
investigación. 
9. BIBLIOGRAFÍA 
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