ANA-MARIA-NAVA-CABRERA

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN 
BIOTECNOLOGÍA APLICADA 
 
 
“ANÁLISIS DEL GEN QUE CODIFICA PARA EL 
PÉPTIDO LUNASINA” 
 
 
T E S I S 
 
 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
 
 
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA APLICADA 
 
 
PRESENTA: 
 
 
ANA MARÍA NAVA CABRERA 
 
 
DIRECTORES: 
 
 
DRA. SILVIA LUNA SUÁREZ 
DRA. FLOR DE FÁTIMA ROSAS CÁRDENAS 
 
 
 
 TEPETITLA DE LARDIZABAL, 
TLAXCALA 
DICIEMBRE 2016 
 
 
 
 
II | P á g i n a
 
 
COMITÉ TUTORIAL: 
 
Dra. María del Carmen Cruz López (CIBA-IPN) 
Dr. Víctor Eric López y López (CIBA-IPN) 
Dra. María del Carmen Guadalupe Avelino Flores (BUAP) 
Dra. Silvia Luna Suárez (CIBA-IPN) 
Dra. Flor de Fátima Rosas Cárdenas (CIBA-IPN) 
 
 
 
III | P á g i n a
 
 
 
IV | P á g i n a
 
 
 
V | P á g i n a
 
El presente trabajo se llevó a efecto en el Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada del 
Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección de la Dra. Silvia Luna Suárez y la Dra. Flor de Fátima 
Rosas Cárdenas.
 
1 | P á g i n a
 
 
 
2 | P á g i n a
 
INDICE 
 
ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................................................4 
ÍNDICE DE TABLAS .....................................................................................................................................5 
RESUMEN ..................................................................................................................................................6 
ABSTRACT ..................................................................................................................................................7 
INTRODUCCIÓN .........................................................................................................................................8 
ANTECEDENTES ...................................................................................................................................... 12 
CONTENIDO DE LUNASINA EN DISTINTAS SEMILLAS ......................................................................... 15 
JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................................... 18 
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................................ 19 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................................... 19 
MATERIALES Y METODOS ...................................................................................................................... 20 
Obtención de ADN genómico de soya. .............................................................................................. 20 
Preparación de la harina de soya ................................................................................................... 20 
Extracción de ADN genómico de semilla........................................................................................ 20 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Sambrook et al., 2001): .............................................. 22 
Clonación en vector pJET 1.2/blunt ................................................................................................... 23 
Transformación por choque térmico de E.coli TOP 10 y E.coli BL21 RIL ............................................ 24 
Preparación de células quimiocompetentes (Sambrook et al., 2001) ........................................... 24 
Transformación .............................................................................................................................. 25 
Obtención de ADN plasmídico por lisis alcalina con SDS: (Sambrook et al., 2001) ........................... 26 
Miniprep ......................................................................................................................................... 26 
Midiprep ......................................................................................................................................... 28 
Subclonación en vector pET32b(+) .................................................................................................... 29 
Preparación del vector pET32b(+) .................................................................................................. 29 
Preparación del Inserto. ................................................................................................................. 30 
Ligación .......................................................................................................................................... 31 
Transcripción in vitro .......................................................................................................................... 32 
Expresión de proteínas ...................................................................................................................... 33 
 
3 | P á g i n a
 
Purificación de proteínas ................................................................................................................... 33 
Precipitación diferencial de proteínas con Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 ......................................... 34 
Preparación de geles de Acrilamida SDS-PAGE .................................................................................. 35 
Electroelución de proteínas. .............................................................................................................. 35 
RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................................................................... 35 
Búsqueda de las condiciones necesarias para la amplificación de los fragmentos de interés. ......... 38 
Amplificación, clonación y secuenciación de los fragmentos de interés. .......................................... 40 
Subunidad chica (Sch) .................................................................................................................... 40 
Análisis de restricción de Sch ......................................................................................................... 41 
Resultados de secuenciación para Sch ........................................................................................... 41 
Subunidad Grande (Sgde) .............................................................................................................. 43 
Análisis de restricción para Sgde .................................................................................................... 44 
Resultados de secuenciación para Sgde ........................................................................................ 44 
Subunidad chica y subunidad grande (Sgde) ................................................................................. 45 
Análisis de restricción para Schg .................................................................................................... 46 
Secuenciación ................................................................................................................................. 46 
Subunidad chica y subunidad grande (Sgde) ................................................................................. 47 
Análisis de restricción para Pch ...................................................................................................... 48 
Secuenciación para pJET_Pch1 ...................................................................................................... 49 
Péptido señal, subunidad chica y subunidad grande (Pchg) .......................................................... 50 
Secuenciación para pJET_Pchg ....................................................................................................... 51 
Transcripción in vitro ..........................................................................................................................52 
SUBCLONACIÓN EN VECTOR DE EXPRESIÓN pET32b(+) .................................................................... 53 
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS ................................................................................................................. 55 
CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 60 
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................................... 61 
 
 
 
 
 
4 | P á g i n a
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Sulfato de amonio requerido para la precipitación de proteína............................................. 34 
Figura 2. Gen que codifica a Albúmina 2S en G. max, y las diferentes partes del gen que codifican para 
cada subunidad. ..................................................................................................................................... 36 
Figura 3. Fragmentos de interés. ........................................................................................................... 36 
Figura 4. Metodología para la construcción de fragmentos de interés. ................................................ 37 
Figura 5. Mapa genético del vector de clonación pJET 1.2/blunt y pENTRTM/D-TOPO utilizados en E.coli 
TOP 10.. .................................................................................................................................................. 39 
Figura 6. Fragmento perteneciente a la subunidad chica (Sch). ............................................................ 40 
Figura 7. Análisis de restricción para Sch. .............................................................................................. 41 
Figura 8. Resultados de secuenciación para Sch.. .................................................................................. 41 
Figura 9. Fragmento perteneciente a la subunidad grande (Sgde).. ..................................................... 43 
Figura 10. Análisis de restricción para Sgde.. ......................................................................................... 44 
Figura 11. Resultados de secuenciación para Sgde................................................................................ 44 
Figura 12. Fragmento perteneciente a la subunidad chica y subunidad grande .. ................................ 45 
Figura 13. Análisis de restricción para Schg 8. ....................................................................................... 46 
Figura 14. Resultados de secuenciación para Schg 8. ............................................................................ 47 
Figura 15. Fragmento perteneciente a Péptido señal_subunidad chica (Pch). ..................................... 47 
Figura 16. Análisis de restricción para Pch 1B. ....................................................................................... 48 
Figura 17. Resultados de secuenciación para Pch 1B.. .......................................................................... 49 
Figura 18. Fragmento perteneciente a la Péptido señal_subunidad chica_subunidad grande (Pchg).. 50 
Figura 19. Análisis de restricción para Pch_gde.. ................................................................................... 51 
Figura 20. Resultados de secuenciación para Pchg 3C........................................................................... 52 
Figura 21. Linealización del vector Sch_pJET con la enzima Hind III. ..................................................... 52 
Figura 22. Transcripción in vitro Sch. ..................................................................................................... 53 
Figura 23. Preparación del vector y del inserto. .................................................................................... 53 
Figura 24. PCR para verificar direccionalidad del fragmento Sch. ......................................................... 54 
Figura 25. PCR para verificación de direccionalidad de fragmentos Pchg y Pch. .................................. 54 
Figura 26. PCR para verificación de direccionalidad de fragmentos Sgde y Schg. ................................. 54 
Figura 27. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. ......................................................................................... 55 
Figura 28. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Expresión del plásmido pET32b(+) vacío ........................ 56 
Figura 29. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Expresión del plásmido pET32b(+)_Pchg. ...................... 56 
Figura 30. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Expresión del plásmido pET32b(+)_Pch ......................... 57 
Figura 31. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Precipitación diferencial con (NH4)2SO4 para Subunidad 
chica. ...................................................................................................................................................... 58 
Figura 32. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Precipitación diferencial con (NH4)2SO4 para la subunidad 
grande. ................................................................................................................................................... 58 
Figura 33. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Precipitación diferencial con (NH4)2SO4 para la subunidad 
chica_grande .......................................................................................................................................... 59 
file:///C:/Users/l%20kifilz´kyn/Dropbox/tesis/avance_tesis.docx%23_Toc469381129
file:///C:/Users/l%20kifilz´kyn/Dropbox/tesis/avance_tesis.docx%23_Toc469381132
file:///C:/Users/l%20kifilz´kyn/Dropbox/tesis/avance_tesis.docx%23_Toc469381135
file:///C:/Users/l%20kifilz´kyn/Dropbox/tesis/avance_tesis.docx%23_Toc469381138
 
5 | P á g i n a
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Nombre de cada fragmento y su abreviación. ......................................................................... 37 
Tabla 2. Condiciones de PCR utilizadas para la amplificación de fragmentos. ...................................... 38 
Tabla 3. Características de cada fragmento.. ......................................................................................... 38 
Tabla 4. Pesos de los péptidos.. ............................................................................................................. 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 | P á g i n a
 
RESUMEN 
 
Se ha sugerido que el consumo de alimentos ricos en soya puede contribuir a disminuir el índice de 
cáncer de mama, próstata y colon en ciudades como China y Japón. Esto ha despertado el interés 
para la búsqueda de nuevos tratamientos que ayuden a promover la salud y prevenir enfermedades, 
incluyendo el cáncer. Una de las proteínas de soya que ha sido estudiada es 2S albúmina presente en 
semillas que coincide con su fase de expansión celular del desarrollo, esta proteína está conformada 
por una subunidad grande y una subunidad pequeña siendo esta última de amplio interés debido a 
que contiene un péptido denominado lunasina de 43 aminoácidos que presenta un sitio de adhesión 
celular RGD (Arginina, Glicina, Aspartato) justo antes de una cola de 8 aspartatos presentes en su C-
terminal. La cola de poli-aspartatos se especula tiene una función fisiológica en esta etapa, sin 
embargo su rol específico para regular el ciclo celular durante la embriogénesis es desconocido. Al ser 
expresado en E. coli se observa que interrumpe la formación del septo bacteriano, este fenotipo 
observado corresponde a la mutación en el gen que codifica a la proteína Fts-z homóloga de 
tubulina, este hecho y su presencia en semilla llevó a investigar el efecto en líneas celulares 
cancerígenas obteniendo interrupción de la mitosis, seguido de muerte celular. Se especula que esto 
sea debido a la carga negativa presente en la cola de aspartatos, sin embargo aún se desconoce el 
mecanismo porel cual actúa. La importancia de este trabajo fue la obtención de fragmentos 
presentes en la 2S albúmina y observar el fenotipo que presenta Escherichia coli. 
 
 
 
 
 
7 | P á g i n a
 
ABSTRACT 
 
It has been suggested that consumption of soy-rich foods may contribute to lower breast, prostate 
and colon cancer rates in countries such as China and Japan. This has sparked interest in the search 
for new treatments that help promote health and prevent diseases, including cancer. One of the soy 
proteins that has been studied is 2S albumin present in seeds that coincide with its developmental 
cell expansion phase, this protein is made up of a large subunit and a small subunit is the latter of 
wide interest because it contains a Peptide designated lunasin of 43 amino acids that have a cell 
adhesion site RGD (Arginine, Glycine, Aspartate) before of 8 aspartates present in its C-terminal. The 
tail of poly-aspartates is speculated has a physiological function at this stage, however its specific role 
to regulate the cell cycle during embryogenesis is unknown. When expressed in E. coli, it is observed 
that it interrupts the formation of the bacterial septum, this observed phenotype corresponds to the 
mutation in the gene that encodes the homologous Fts-z protein of tubulin, this fact and its presence 
in the seed led to investigate. The effect on cancerous cell lines obtaining interruption of mitosis, 
followed by cell death. It is speculated that the sea by the negative charge present in the tail of 
aspartates, however unknown the mechanism by which it acts. The importance of this work was to 
obtain fragments in 2S albumin and to observe the phenotype that presents Escherichia coli. 
 
 
8 | P á g i n a
 
INTRODUCCIÓN 
 
El cáncer es una de las primeras causas de muerte a nivel mundial, es denominado por la 
Organización Mundial de la Salud (OMS) como un proceso de crecimiento y diseminación 
incontrolados de células. Puede aparecer prácticamente en cualquier lugar del cuerpo. El 
tumor suele invadir el tejido circundante provocando metástasis en puntos distantes del 
organismo. (OMS, 2014) 
Tomando en cuenta esta definición, se han definido las señales del cáncer que concentran 
seis capacidades biológicas adquiridas durante el desarrollo de los tumores humanos. 
(Hanahan et al., 2011). Estas señales constituyen un principio para racionalizar la complejidad 
de la enfermedad neoplásica, e incluyen lo siguiente: 
1. Mantenimiento de la señalización proliferativa, ya que las células estimulan su propio 
crecimiento y no requieren de señales externas para multiplicarse, es decir, generan 
sus propias señales. 
2. Evasión de los supresores de crecimiento, no son sensibles a señales que inhiban su 
crecimiento, y estas pueden provenir de células vecinas. 
3. Resistencia a muerte celular, la apoptosis es la muerte celular programada y las 
células cancerígenas superan este proceso generando hipoxia. 
4. Inmortalización, las células normales mueren después de un número de divisiones 
celulares y las células cancerígenas escapan de este proceso inactivando proteínas del 
Retinoblastoma, p53 y enzimas como la telomerasa. 
 
9 | P á g i n a
 
5. Angiogénesis, habilidad para generan nuevos vasos sanguíneos enviando señales a las 
células vecinas para que produzcan las proteínas necesarias para la formación de 
éstos, ya que requieren de oxígeno y nutrientes, así como de desechar sus residuos. 
6. Invasión y metástasis, la capacidad que tienen para invadir tejidos adyacentes y la 
habilidad para infiltrarse a vasos linfáticos y sanguíneos, viajar por torrente sanguíneo 
e instalarse en otro tejido. 
 
Según datos de la OMS, en 2012 se detectaron 14.1 millones de nuevos casos de cáncer, 8.2 
millones de muertes y 32.6 millones de personas viven con cáncer. Los cánceres que causan 
un mayor número anual de muertes son los de pulmón, hígado, estómago, colon y mama. 
Estos son diferentes en el hombre y en la mujer, así como también entre grupos de edad. La 
tasa global de incidencia de cáncer es 25% mayor en los hombres que en las mujeres, 
reportando 205 y 65 por 100,000 casos respectivamente (OMS, 2012). 
Aproximadamente un 30% de las muertes por cáncer se deben a cinco factores de riesgo 
comportamentales y alimentarios, por lo tanto, pueden prevenirse. Las infecciones que 
pueden provocar cáncer, como las causadas por los virus de las hepatitis B y C y el del 
papiloma humano, son responsables del 20% de las muertes por cáncer en los países de 
ingresos bajos y medianos y del 7% en los países de ingresos altos. El tabaquismo es el factor 
de riesgo que por sí solo provoca un mayor número de casos y a nivel mundial causa 
aproximadamente un 22% de las muertes por cáncer y un 71% de las muertes por cáncer de 
pulmón. El 70% de todas las muertes por cáncer registradas en 2012 se produjeron en África, 
 
10 | P á g i n a
 
Asia, América Central y Sudamérica. Se prevé que los casos anuales de cáncer aumentarán de 
14 millones en 2012 a 22 en las próximas dos décadas (OMS, 2012). 
En México, según la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC), el cáncer es la tercera causa 
de muerte y estima que cada año se detectan 128 mil casos nuevos (Secretaría de Salud 
[SSA], Subsecretaría de Prevención y Promoción de la Salud [SPPS], 2013), pese a los 
esfuerzos realizados por las instituciones de salud para detectar y tratar el cáncer, muchos 
mexicanos aun mueren por este mal. En la población menor de 20 años predominan las 
neoplasias no epiteliales, el primer lugar lo ocupan los tumores malignos en los órganos 
hematopoyéticos (médula ósea, bazo y timo) que representan 59% de los cánceres; por sexo 
concentra 58.7% en los varones y 59.3% en las mujeres de esta edad. En los hombres, le 
siguen las neoplasias en el sistema linfático y tejidos afines (9.7%), y de hueso y de los tejidos 
articulares (5.6 por ciento); y para las mujeres de encéfalo y otras partes del sistema nervioso 
central (6.9%), y de hueso y de los tejidos articulares (5.8 por ciento). En la población menor 
de 20 años, los tres principales tumores malignos que causan mortalidad se encuentran en 
órganos hematopoyéticos, encéfalo y sistema nervioso central y hueso y cartílago. Los 
tumores malignos que padece la población adulta son diferentes según el sexo. En 2011 para 
los hombres, la principal causa de morbilidad hospitalaria por cáncer se debe a las neoplasias 
en órganos digestivos (23.9%); le siguen los tumores en órganos genitales (12.2%), siendo el 
de próstata el más frecuente; y los de órganos hematopoyéticos (9.8 %). En tanto en las 
mujeres, la principal causa de egreso hospitalario por tumores malignos se deben al de 
cáncer de mama (29.6%); le siguen las neoplasias en órganos genitales (16.7%) –del cuello 
del útero y útero principalmente–; y de los órganos digestivos (14.3 %) (INEGI, 2014). 
 
11 | P á g i n a
 
En la infancia hay un mayor predominio de neoplasias no epiteliales (leucemias, linfomas y 
sarcomas) y en la etapa adulta hay un mayor predominio de las epiteliales (carcinomas), 
sugiriendo que las causas de cáncer en la infancia son diferentes a las de edad adulta y se 
asocian a factores de riesgo por estilos de vida poco saludables o ambientales (Saldivar etal., 
2005). Por lo que estos factores pueden resumirse en un índice de masa corporal elevado, 
consumo insuficiente de frutas y verduras, falta de actividad física y consumo de alcohol y 
tabaco. Tomando en cuenta estos factores podemos observar que la alimentación está 
involucrada en el desarrollo del cáncer, por lo que algunos estudios nos marcan que el 
consumo regular de granos de cereal está asociado a la disminución de varias de 
enfermedades crónicas degenerativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 | P á g i n a
 
ANTECEDENTES 
 
Las proteínas de los alimentos son una fuente importante de productos nutracéuticosque proveen beneficios a la salud incluyendo prevención y tratamiento de enfermedades 
malignas. Actualmente se conocen péptidos con actividad biológica y éstos se obtienen a 
través de la digestión y la fermentación que ocurre dentro del organismo. Al ingresar un 
alimento como una leguminosa, cereal o pseudocereal es digerido por enzimas digestivas, los 
péptidos bioactivos llevan inhibidores de proteasa (Inhibidor de proteasa Bowman-Birk), por 
lo que no pueden ser degradados, ellos se desprenden de las proteínas por digestión 
enzimática o hidrolasas, son absorbidos por el organismo, realizando actividades en el 
sistema inmune u endócrino, por lo que pueden realizar funciones para prevenir 
enfermedades incluyendo el cáncer (Ortiz et al., 2014). Estudios epidemiológicos indican una 
variación internacional en los índices de cáncer, que han sido atribuidos en gran parte a la 
dieta. Se ha sugerido que el consumo de alimentos ricos en soya puede contribuir a disminuir 
el índice de cáncer de mama, próstata y colon en ciudades como China y Japón. 
La soya (Glycine max) es una de las plantas de cultivo más importantes por su contenido de 
proteínas y aceites en su semilla, y por la capacidad que tiene de fijar nitrógeno atmosférico 
a través de la simbiosis con microorganismos presentes en el suelo. Glycine max pertenece a 
la Familia Fabaceae, subfamilia Papilionoideae, género Glycine, subgénero Soja, especie G. 
max. (NCBI). Shmutz et al., 2010, obtuvieron la secuencia de Glycine max variedad Williams 
82 por medio de la técnica de shotgun donde se secuenció 1.1 gigabases de genoma, que se 
encuentra ensamblado en 20 cromosomas; predijeron 46,430 genes que codifican para 
proteínas y 19,667 intrones. 
 
13 | P á g i n a
 
La soya contiene muchos compuestos bioactivos con actividad cancerígena demostrada 
incluyendo isoflavonas, saponinas y más reciente el péptido lunasina (Messina et al., 1994). 
La lunasina es un péptido ampliamente estudiado, fue descubierta por primera vez por Shoji 
et al. (1987) en la Universidad de Niigata Japón, de un extracto de semillas de soya (Glycine 
max) está conformado por 43 aminoácidos con un peso molecular de 5.5 kDa y punto 
isoeléctrico 5.5 (Galvez et al., 1997), su secuencia es 
SKWQHQQDSCRKQKQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD. En 1997 se descubrió un gen 
de 770pb en soya (Glycine max), que se le dio el nombre de PGR97-103, que codifica para la 
proteína 2S-albúmina (Gm2S-1) rica en metioninas, un péptido señal, un péptido de unión y 
una subunidad pequeña. Se dieron cuenta que del triplete 27 al 69 de este gen codificaba 
para esa pequeña subunidad y que es liberado de la proteína Gm2S-1 por un proceso 
postraduccional (Galvez et al. 1997). A esta subunidad se le llamó inicialmente “péptido de 
frijol de soya rico en ácidos aspárticos” pero en 2001 se le cambió el nombre a lunasina que 
proviene del Talago (lengua filipina) que significa “para curar”, debido a que interrumpe la 
mitosis después de su introducción en células tumorales como hepatomamurino, cáncer de 
mama y fibroblastos murinos. (Galvez et al. 1999). La primera vez que se observó que 
lunasina causaba muerte celular, fue en células procariotas, ya que construyeron un vector 
que contenía la secuencia para expresar lunasina y lo introdujeron en cepas DH5 de E. coli, 
observaron que al inicio del ciclo celular de E. coli no formaba septos y eventualmente las 
células morían, por lo que decidieron eliminar del vector los nucleótidos que codificaban 
para los 9 Asp, y nuevamente lo introdujeron en la misma cepa de E. coli observando que la 
carga negativa del carboxilo terminal de la lunasina juega un rol importante en la división 
 
14 | P á g i n a
 
celular bacteriana aberrante. (Galvez et al., 1999). La filamentación sin septación fenotípica 
en procariontes es causado por mutaciones que interrumpen la polimerización de Fts-Z 
(protofilamentos) de la división celular bacteriana en placa (Erickson et al.,1997), esta 
información junto con el hecho de que la lunasina se encuentra en el almacén del 
parénquima de las células inhibiendo la mitosis, llevó a la hipótesis de que esta podría tener 
un efecto similar en la división celular de eucariontes (Galvez et al., 1999). 
Este péptido ha demostrado ser un eficaz supresor de carcinogénesis en sistemas modelo in 
vitro e in vivo. La lunasina contiene una estructura de hélice, obtenida por modelado 
homóloga a una región conservada de proteínas de unión a cromatina, en el extremo C- 
terminal nueve residuos de Asp (D), un motivo Arg-Gly-Asp (RGD) que permite unirse a la 
matriz extracelular de las células tumorales (Ruoslahti et al.,1986). Los péptidos que 
contienen este motivo se ha reportado que previene la metástasis de las células tumorales 
por adhesión competitiva a la matriz extracelular (Akiyama et al., 1995). Para lunasina, se ha 
reportado que este motivo es necesario para internalizarse dentro del núcleo de las células 
C3H10T1/2, pero que no es necesario para internalizarse al núcleo de las células NIH3T3, por 
lo que se sugiere que el motivo RGD debe ser específico para cada línea celular (Galvez et al., 
2001). 
En diferentes estudios, se ha observado que la fragmentación cromosomal y la apoptosis es 
causada después del proceso de transfección, esto se atribuye al efecto que tiene la carga 
negativa de poli-D en su carboxilo terminal de la lunasina para unirse a los fragmentos 
altamente básicos de las histonas dentro del nucleosoma de los cromosomas condensados, 
en regiones que quizá se encuentren cargadas positivamente, así como a la cromatina 
 
15 | P á g i n a
 
hipoacetilada que encontramos en los telómeros y los centrómeros. La lunasina causa un 
desplazamiento de las proteínas del cinetócoro que normalmente se unen al centrómero 
evitando la unión de las fibras del huso mitótico y ocurriendo posteriormente el arresto de la 
mitosis seguido de muerte celular (Galvez et al., 1999). 
Suprime la transformación de células de mamíferos causada por productos químicos 
carcinogénicos y cuando se aplica tópicamente inhibe la carcinogénesis de piel en ratones 
(Galvez et al., 2001). Es de destacar que lunasina elimina selectivamente células 
transformadas o en vías de transformación (Jeong et al., 2007). 
 
CONTENIDO DE LUNASINA EN DISTINTAS SEMILLAS 
 
Se ha reportado que lunasina está presente en diferentes genotipos de soya en un rango de 
concentración de 0.5 a 8.1 mg/g de semilla (González de Mejía et al.,2004) (Jeong et al., 
2007). Otras fuentes naturales de lunasina han sido identificadas además de la soya, como es 
el caso de la cebada con 0.013 a 0.099 mg /semilla (Jeong et al., 2002), trigo con 0.2 a 0.3 
mg/semilla y amaranto 11.1g/g extracto proteico (Silva et al., 2008). 
En 2008 Silva et al., investigaron la presencia, caracterización y propiedades anticancerígenas 
del péptido lunasina en semillas de amaranto. Encontrando una concentración de 11.1 ug de 
lunasina por gramo del total de proteína extraída en cuatro genotipos de semillas maduras 
de amaranto. La fracción de glutelina tiene una alta concentración de lunasina (3.0 ug/g). La 
lunasina también se identificó en la albúmina. Las glutelinas extraídas digeridas con tripsina, 
mostraron la inducción de apoptosis en células HeLa. 
 
16 | P á g i n a
 
El amaranto (Amaranthus hypocondriacus) es una planta tradicional mexicana, que provee de 
granos y hojas de alto valor nutrimental. La National Academy of Sciences ha declarado que 
el amaranto podría ser un grano con alto potencial de explotación comercial porque tiene 
una alta calidad nutricional. Los altos niveles de proteínas en semillas (17 %) y su 
composición de aminoácidos proporcionan el balance requerido en la dieta humana 
(Schnetzler et al., 1994). Ha ganado interés en los últimos 20 años debido a sus 
características nutricionales y por su importancia agronómica, ya que es una plantade 
crecimiento rápido, tolerancia a sequía, puede crecer en suelos pobres de nutrientes y ser 
cultivado en cualquier época del año (Avanza et al., 2005). Pertenece al orden Caryophyllales, 
familia Amaranthacea, subfamilia Amaranthoideae, género Amaranthus (Grobelnik-Mlakar 
et al., 2009). 
Sunil et al., 2014 publicaron el primer borrador del genoma y transcriptoma de Amaranthus 
hipocondriacus, estimando el tamaño del genoma en 466 Megabases, que codifica para al 
menos 24,829 proteínas. La información está disponible en GenBank bajo el BioProject ID 
PRJNA214803 y PRJNA214804 tanto para genoma y transcriptoma respectivamente. Estos 
datos abren una ventana a investigaciones que nos ayuden a individualizar los diferentes 
genes y determinar cuál es a función de cada uno de ellos y de esta manera conocer más 
acerca de esta planta. 
Como se mencionó anteriormente, la lunasina fue encontrada por primera vez en la semilla 
de soya (Glycine max), el desarrollo temprano de semillas en angiospermas es caracterizado 
por la rápida división celular y diferenciación. La división celular cesa, la expansión celular 
inicia cuando la síntesis masiva de proteínas de almacenamiento, carbohidratos y lípidos 
 
17 | P á g i n a
 
ocurre en el endospermo de cereales y cotiledones de leguminosas. Durante la fase de 
expansión celular, el DNA genómico incrementa como resultado de la endorreduplicación del 
DNA (Schweizer et al.,1995). 
En los estudios anteriores se ha observado que la inducción de la apoptosis en las líneas 
celulares ocurre cuando estas son transformadas y tratadas en una suspensión de lunasina. 
Por lo que para este trabajo resulta de interés la construcción de productos génicos 
obtenidos del gen que codifica para la Albúmina 2S, proveniente de semillas de soya para ser 
probados en líneas celulares tumorales. 
 
 
 
18 | P á g i n a
 
JUSTIFICACIÓN 
 
 
Actualmente el cáncer es la tercera causa de muerte en México, éste afecta a diferentes 
grupos de edad. Algunos de los factores de riesgo para desarrollar cáncer están asociados a 
la alimentación por lo que se han buscado péptidos con actividad biológica que puedan ser 
utilizados para la prevención y tratamiento contra esta enfermedad. Plantas como la soya 
que presenta características nutrimentales y agronómicas importantes, ha sido blanco de 
estudio para desarrollar tratamientos contra el cáncer. Lunasina es un péptido ampliamente 
estudiado por la característica que presenta de arrestar la mitosis, por tal motivo es 
importante conocer la función de los diferentes fragmentos del gen que codifican para 
albúmina 2S en donde está localizada lunasina y conocer sí estos fragmentos presentan 
actividad antitumoral. 
 
 
 
19 | P á g i n a
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Analizar los productos génicos del gen que codifica para la albumina 2S sobre líneas 
celulares. 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 
Amplificar el gen que codifica para el péptido lunasina y su precursor. 
Expresar los fragmentos amplificados en E. coli. 
Extraer los productos génicos de E. coli. 
 
 
 
 
 
 
 
20 | P á g i n a
 
 
MATERIALES Y METODOS 
 
Las técnicas que a continuación se enlistan fueron las utilizadas durante el desarrollo del proyecto. 
Obtención de ADN genómico de soya. 
El ADN se obtuvo de semilla de Glycine max 
Preparación de la harina de soya 
1) Se colocaron 5 semillas a remojar en 2 a 3mL de etanol al 96% y se agitó. 
2) Se enjuagó con agua destilada hasta que no se percibió el olor a etanol. 
3) En seguida se puso a remojar en solución de cloro comercial “Cloralex” al 10% durante 20min 
agitando periódicamente. 
4) Se lavaron las semillas con agua destilada repetidas veces hasta que se eliminó el olor a cloro. 
5) Se dejaron secando las semillas sobre una toalla de papel seca durante 24 horas. 
6) Ya secas las semillas se molieron hasta obtener una harina. 
7) Se colocó la harina obtenida en tubos eppendorf de 1.5 ml y se almacenaron a -80°C. 
 
Extracción de ADN genómico de semilla. 
1) Se tomó una pequeña cantidad de harina obtenida y se colocó en tubo eppendorf de 1.5 ml. 
2) Se añadieron 500 ul de solución de lisis y se mezcló el tubo por agitación. 
- Solución de lisis: 
 200mM Tris-HCl pH 8.5 
 250mM NaCl 
 25mM EDTA pH 8.0 
 1% SDS 
 
21 | P á g i n a
 
 
3) Se añadieron 500 ul de Fenol:Cloroformo:Isoamílico (25:24:1) y se agitó en vortex durante 1 
minuto. 
4) Se centrifugó a 12,000 rpm por 10 minutos. Se separó la fase acuosa y pasó a tubo limpio. 
5) Se añadieron 500 ul de Cloroformo:Isoamílico y se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 
minutos. 
6) Se recuperó la fase acuosa a la cual se le añadió la décima parte de Acetato de Sodio 
(C2H3NaO2) 3M pH 4.8 y la mitad de volumen de isopropanol. 
7) Se incubó el tubo a -20°C durante 30 minutos. 
8) Se centrifugó a 12,000 rpm por 10 minutos y se desechó el sobrenadante. 
9) Se añadió 1 ml de etanol al 70% tratando de resuspender la pastilla. 
10) Se centrifugó a 12,000 rpm por 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se evaporó el resto 
de etanol a temperatura ambiente. 
11) Una vez seca la pastilla se resuspendió en 20-100ul de agua desionizada estéril. 
12) Se agregó 1 ul de RNAsa (1:10) e incubó a 37°C durante 30 minutos. 
13) Se eliminó la RNAsa iniciando desde el paso 5. 
14) Para verificar la integridad del ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa 1%. 
15) Se almacenó a -20°C. 
 
 
 
 
 
 
22 | P á g i n a
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Sambrook et al., 2001): 
 
En un tubo eppendorf de se preparó 12.5 μL de mezcla de reacción : 
 
 
10X DreamTaq Buffer 1.25 ul 
dNTP Mix, 2 mM cada uno 0.25 ul 
MgCl2 0.75 ul 
Forward primer 0.5 ul 
Reverse primer 0.5 ul 
ADN genómico* 0.5 ul 
DNA Polimerasa 0.0625 ul 
Volumen total 12.5 ul 
*Se utilizaron colonias de células trasformadas crecidas en agar LB. 
 
La enzima utilizada fue DreamTaq DNA Polymerase de la marca Thermo Scientific. 
 
Se realizó gradiente de temperatura para ubicar la temperatura de alineación (Tm) 
correspondiente a cada fragmento. Las condiciones que se utilizaron fueron las siguientes: 
 
 
 
 
 
23 | P á g i n a
 
 Temperatura Tiempo 
Desnaturalización 
inicial 
95°C 2´ 
Desnaturalización 95°C 30´´ 
Alineación Variable 40´´ 
Elongación 72°C 1´30´´ 
Elongación final 72°C 10´ 
 4°C 
 
 
Clonación en vector pJET 1.2/blunt 
 
Se utilizó el kit CloneJET PCR Cloning de Thermo Scientific: 
 
En tubo eppendorf se preparó la siguiente reacción: 
 
2X Buffer de Reacción 5 ul 
Producto de PCR 3.5 ul 
Enzima DNA blunting 0.5 ul 
Volumen total 9 ul 
 
1) Se agitó suavemente en vortex. 
2) Se centrifugó 5 segundos para bajar el líquido del tubo. 
3) Se incubó a 70°C durante 5 minutos. 
4) Se colocó en hielo. 
 
A continuación se agregó a la reacción anterior: 
 
 
24 | P á g i n a
 
Vector de Clonación pJET1.2/blunt (50ng/L) 0.5 ul 
T4 DNA Ligasa 0.5 ul 
Volumen total 10 ul 
 
Transformación por choque térmico de E.coli TOP 10 y E.coli BL21 RIL 
 
Preparación de células quimiocompetentes (Sambrook et al., 2001) 
 
Se prepararon las siguientes soluciones, se esterilizaron y almacenaron a 4°C: 
- Solución 1: 
 MgCl2 10Mm 
- Solución 2: 
CaCl2 50mM 
Glicerol 20% 
1) Se inocularon 5 ml de medio LB líquido sin antibiótico, con células de E. coli. 
2) Se incubaron a 37°C toda la noche. 
3) El cultivo se diluyó 1 a 100 en medio LB líquido sin antibiótico. 
4) Se incubaron a 37°C hasta alcanzar una densidad óptica 0.3-0.4. 
5) Se transfirieron a tubos Falcon de 50 ml estériles y fríos. 
6) Se incubó en hielo por 10 minutos. 
7) Se centrifugó a 3500 rpm durante 7 minutos a 4°C. 
8) Se descartartó el sobrenadante cuidadosamente. 
9) Se resuspendió la pastilla suavemente en 5 ml de Solución 1 fría y estéril. 
10) Se añadieron 120 ml de Solución 1. 
 
25 | P á g i n a
 
11) Se centrifugó a 3500 rpm por 7 minutosa 4°C. 
12) Se descartó el sobrenadante y resuspendió en 5ml de Solución 2 fría y estéril. 
13) Se añadieron 5 ml de Solución 2. 
14) Se incubaron en hielo por 1 hora. 
15) Se transfirieron a tubos eppendorf de 1.5 ml estériles y fríos alícuotas de 100 ul. 
16) Se colocó etanol para congelar. 
17) Se almacenó a -70°C. 
 
Transformación 
1) Se descongelaron células quimiocompetentes E. coli en hielo (aproximadamente 5min). 
2) Se tomaron los 10 ul de la mezcla de ligación y se agregaron a los 100μL de células 
quimiocompetentes E. coli, se incubaron en hielo durante 30 minutos. 
3) Se pasaron a 42°C por 45 segundos. 
4) Se colocó nuevamente en hielo durante 2 minutos. 
5) Se adicionaron 250μL de medio líquido LB e incubaron a 37°C por 1 hora con agitación. 
6) Se centrifugaron a 13,000 rpm durante 2 minutos, se desechó 250 ul del sobrenadante. 
7) Lo que restó ≈100μL, se resuspendieron con la pipeta y se plaquearon en agar LB con 
antibiótico. 
8) Se incubaron toda la noche a 37°C. 
 
 
 
 
26 | P á g i n a
 
 
Obtención de ADN plasmídico por lisis alcalina con SDS: (Sambrook et al., 
2001) 
 
Preparar las siguientes soluciones: 
Solución I: 
50mM Glucosa 
25mM Tris-HCl pH 8.0 
10mM EDTA pH 8.0 
 
Solución II: (preparar al momento) 
0.2 N NaOH 
1% SDS 
 
Solución III: 
 
5M Acetato de Potasio 60 ml 
Ácido Acético glacial 11.5 ml 
Agua 28.5 ml 
 
Las soluciones I y II se esterilizan y se almacenan a 4°C. 
 
Miniprep 
1) Se inocularon 5 ml de medio líquido LB con antibiótico una colonia transformada de E. coli. Se 
dejó toda la noche a 37°C en agitación. 
 
27 | P á g i n a
 
2) Se colocaron 1.5 ml de cultivo en un tubo eppendorf y se centrifugó a 13,500 rpm durante 30 
segundos a 4°C. 
3) Se eliminó el sobrenadante tratando dejar la pastilla lo más seca posible. 
4) Se adicionaron 100 ul de Solución I y mezclaron en vortex vigoroasamente. 
5) Se agregaron 200 ul de Solución II y mezcló agitando vigorosamente 5 veces. No vortex. Se 
colocó en hielo. 
6) Se agregaron 150 ul de Solución III, se mezcló invirtiendo y colocó en hielo de 3-5 minutos. 
7) Se centrifugó a 13,500 rpm durante 5 minutos a 4°C y se transferió sobrenadante a tubo 
nuevo. 
8) Se adicionó una cantidad equivalente de Fenol:Cloroformo. Se mezcla la fase orgánica y 
acuosa con vortex y se centrifuga a 13,500 rpm durante 2 minutos a 4°C. Se transfirió fase 
acuosa a tubo nuevo. 
9) Para precipitar los ácidos nucleicos se agregaron 2 volúmenes de etanol 100% a temperatura 
ambiente, mezclando con vortex y dejando 2 minutos a temperatura ambiente. 
10) Se centrifuga a 13,500 rpm durante 5 minutos a 4°C. Eliminar sobrenadante. 
11) Se agregaron 1ml de etanol 70% tratando de despegar la pastilla y se centrifugó a 13,500 rpm 
durante 2 minutos a 4°C. 
12) Se desechó el sobrenadante y se dejó secar hasta que se evaporara el etanol. 
13) Se resuspendió pastilla en 20-30ul de agua desionizada estéril. 
14) Se agregó 1 ul de RNAsa (1:10) e incubó a 37°C durante 30 minutos. 
15) Se verificó la integridad del ADN sometiendo a electroforesis en gel de agarosa 1%. 
 
 
 
 
28 | P á g i n a
 
 
Midiprep 
1) Se inoculó 50 ml de medio líquido LB con antibiótico una colonia transformada de E. coli. Se 
dejó toda la noche a 37°C en agitación. 
2) Se colocó 50 ml de cultivo en un tubo Falcon y centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos a 
4°C. 
3) Se eliminó sobrenadante tratando dejar la pastilla lo más seca posible. 
4) Se adicionaron 200 ul de Solución I y mezcló en vortex vigoroasamente. Se pasó la mezcla a 
tubo eppendorf de 1.5 ml. 
5) Se adicionaron 400 ul de Solución II y mezcló agitando vigorosamente 5 veces. No vortex. 
Colocar en hielo. 
6) Se agregaron 300 ul de Solución III, se mezcló invirtiendo y se coló en hielo de 3-5 minutos. 
7) Se centrifugó a 13,500 rpm durante 5 minutos a 4°C. Se transfirieron 600 ul de sobrenadante 
a tubo nuevo. 
8) Se agregaron 600 ul de Fenol:Cloroformo. Se mezcló la fase orgánica y acuosa con vortex. Se 
centrifugó a 13,500 rpm durante 2 minutos a 4°C. Se transfirió fase acuosa a tubo nuevo. 
9) Para precipitar los ácidos nucleicos se agregaron 600 ul de isopropanol a temperatura 
ambiente, se mezcló con vortex y se dejó 2 minutos a temperatura ambiente. 
10) Se centrifugó a 13,500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó 
sobrenadante. 
11) Se agregó 1ml de etanol 70% tratando de despegar la pastilla. Se centrifugó a 13,500 rpm 
durante 2 minutos a temperatura ambiente. 
12) Se desechó el sobrenadante y se dejó secar hasta que se evaporara el etanol. 
13) Se resuspendió la pastilla en 50-100ul de agua desionizada estéril. 
 
29 | P á g i n a
 
14) Se agregaron 2 ul de RNAsa (1:10) e incubó a 37°C durante 1 hora. 
15) Para verificar la integridad del ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa 1%. 
 
 
 
Subclonación en vector pET32b(+) 
 
El sistema pET32b(+) es un sistema desarrollado para la clonación y expresión de proteínas 
recombinantes en E. coli. Los genes clonados en este vector son expresados por la célula huésped que 
contiene copia del gen de la RNA Polimerasa T7 bajo el control de lacUV5. Al agregar lactosa al cultivo 
bacteriano es como se induce la expresión. 
 
Preparación del vector pET32b(+) 
 
1) Se sembró una colonia en 50 ml de LB líquido y se dejó incubando toda la noche en agitación. 
2) Se extrajo el plásmido por la técnica de Midiprep. 
3) Se linealizó el vector con la enzima de restricción NcoI (corte único), preparando la siguiente 
reacción: 
pET32b(+) 3 ug 
10x Buffer Tango 3 ul 
Enzima NcoI 10-20 U 
Agua desionizada estéril X ul 
Volumen total 30 ul 
4) Se incubó toda la noche a 37°C 
 
30 | P á g i n a
 
5) Se corrieron 2ul de reacción de digestión en gel de agarosa 1% para evaluar la extensión de la 
digestión. 
6) Cuando la digestión estuvo completada se agregó 1ul de fosfatasa alcalina a la reacción de 
digestión. Se incubó a 37°C durante 30 minutos. 
7) Se desactivaron las enzimas a 65°C durante 20 minutos. 
8) En caso de ser necesario se purifica banda de gel de agarosa y se resuspende en 20 ul de 
agua desionizada estéril. 
9) Se cuantificó concentración en gel de agarosa 1%. 
 
 
Preparación del Inserto. 
 
Los insertos clonados en pJET 1.2/blunt deben ser liberados del vector de clonación para poder 
clonarlos en el vector pET32b(+), para esto se utilizó la enzima de restricción NcoI. 
1) Se inocularon 50 ml de medio LB líquido con las clonas de interés. Se dejó incubando toda la 
noche a 37°C en agitación. 
2) Se extrajó plásmido por la técnica de Midiprep. 
3) Se preparó la siguiente reacción de digestión para liberar el inserto: 
10 x Buffer Tango 5 ul 
Agua desionizada estéril 35 ul 
ADN (0.5-1ug/ul) 8 ul 
Enzima NcoI 2 ul 
Volumen total 50 ul 
4) Se incubó toda la noche a 37°C. 
 
31 | P á g i n a
 
5) Se corrieron 2ul de reacción de digestión en gel de agarosa 1% para evaluar la extensión de la 
digestión. 
6) Se desactivaron las enzimas a 65°C durante 20 minutos. 
7) En caso de ser necesario se purificó banda de gel de agarosa y se resuspendió en 20 ul de 
agua desionizada estéril. 
8) Se cuantificó la concentración en gel de agarosa 1%. 
 
Ligación 
 
1) Para realizar la ligación se tomó una relación 1:3 de Vector : Inserto. Se preparó la siguiente 
reacción de ligación: 
10 x Buffer Ligasa 2 l 
50-100 ng/ul de vector pET32b(+) 2 l 
50 ng/ul de Inserto X l 
Agua Y l 
T4 DNA Ligasa 1 l 
Volumen total 20l 
 
 
2) Se mezcló suavemente y se incubó a 16°C toda la noche. 
3) Se procedió a la transformación en E. coli TOP 10 agregando 2 l de reacción de ligación. 
4) Para hacer búsqueda de la clona que contenía el inserto en dirección esperada se hizo PCR en 
colonia. 
 
 
32 | P á g i n a
 
Transcripción in vitro 
La transcripción in vitro se realizó con el kit T7 RNA Polymerase de la marca Thermo Scientific. 
1) Se inoculó 50 mlde medio LB líquido con las clonas de interés y se dejó incubando toda la 
noche a 37°C en agitación. 
2) Se extrajo el plásmido por la técnica de Midiprep. 
3) Se linealizó el ADN plasmídico con enzima de restricción. 
4) Se limpió el DNA con la técnica de fenol/cloroformo 
5) Se preparó la siguiente mezcla de reacción: 
 
5x Buffer de transcripción 10 l 
Mezcla de ATP/GTP/CTP/UTP 10mM 10 l (2mM concentración final) 
ADN plasmídico linealizado 1 g 
Inhibidor de RNAsa 1.25 l (50U) 
RNA Polimerasa T7 30 U 
Agua X l 
Volumen total 50 l 
 
6) Se incubó a 37°C durante 2 horas. 
7) Se adicionaron 2 U de DNAsa I para remover el ADN, se mezcló e incubó a 37°C durante 15 
minutos. 
8) Para inactivar la DNAsa se limpió el ARN con extracción de fenol/cloroformo. 
9) Se verificar la integridad del ARNm sometiendo a electroforesis en gel de agarosa 1%. 
 
 
 
33 | P á g i n a
 
 
Expresión de proteínas 
1) Se inocularon 5 ml de medio líquido LB 
2) Se incubó 8 horas a 37°C en agitación. 
3) Se inoculó 2.5% de volumen de medio donde se realiza la expresión. 
4) Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO600) de 0.3 se agregó 0.5% de lactosa al 
10%, para la inducción. 
5) Se recolectó pastilla a las 2, 3 y 4 horas después de la inducción, centrifugando a 9000 rpm 
durante 10 minutos a 4°C. 
6) Se almacenó a -20°C. 
 
Purificación de proteínas 
 
1) Se recolectó 0.0001 g de la pastilla y se colocó en tubo eppendorf. Proteína Total 
2) Por cada gramo de pastilla se colocan 8 veces de volumen de buffer de fosfatos. Se agitó 
invirtiendo el tubo varias veces hasta deshacer pastilla. 
3) Se sonicó con potencia 50 y pulso 50 durante 1 minuto, después dejar 1 minuto en hielo. 
Se hicieron 6 ciclos de esto. 
4) Se centrifugó a 9000 rpm durante 10 minutos a 4°C. 
5) Se separó sobrenadante Proteína Soluble. 
6) Se pesó pastilla y se agregaron 4 veces el volumen de buffer de fosfatos con Urea 6M. Se 
agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. 
7) Se centrifugó a 9000 rpm durante 10 minutos a 4°C. 
8) Se recolectó sobrenadante en tubo eppendorf. Proteína Insoluble. 
 
34 | P á g i n a
 
9) Pastilla Remanente. Se guardó a -20°C. 
10) Se corrió gel de acrilamida SDS-PAGE para visualizar las proteínas. 
 
Precipitación diferencial de proteínas con Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 
 
El sulfato de amonio es la sal de elección para el desarrollo inicial de la precipitación por 
salado (“salting out”) de las proteínas buscadas. Este método se realizó siguiendo el 
protocolo reportado por Dunn et al., 2000. Y utilizando la siguiente Figura 1 que muestra la 
cantidad de sulfato de amonio requerido para llevar una solución de volumen conocido de 
una saturación inicial a una final. 
 
 
 
 
Figura 1. Sulfato de amonio requerido para la precipitación de proteína. 
 
35 | P á g i n a
 
 En esta tabla se muestra la cantidad necesaria de sulfato de amonio (NH4)2SO4 para llevar una 
solución de 1 litro con una concentración inicial de saturación, a una final a cero (0) oC. 
 
Preparación de geles de Acrilamida SDS-PAGE 
Se prepararon geles al 12% y 13 % utilizando el protocolo reportado en el Manual Mini-
PROTEAN® Tetra Cell (Biorad). 
 
Electroelución de proteínas. 
Para la electroelución de proteínas se utilizó el protocolo reportado por Dunn et al., 2003. 
 
RESULTADOS Y DISCUSION 
Para el desarrollo del objetivo general se obtuvo la información del gen correspondiente a 
Albúmina 2S de Glycine max. 
ACTTCACTTCACCCATCAATAGCAAAATGACCAAGTTCACAATCCTCCTCATCTCTCTTCTCTTCTGCATCGCCCACA
CTTGCAGCGCCTCCAAATGGCAGCACCAGCAAGATAGCTGCCGCAAGCAGCTCCAGGGGGTGAACCTCACGCCCT
GCGAGAAGCACATCATGGAGAAGATCCAAGGCCGCGGCGATGACGATGATGATGATGACGACGACAATCACATT
CTCAGGACCATGCGGGGAAGAATCAACTACATAAGGAGGAACGAAGGAAAAGACGAAGACGAAGAAGAAGAAG
GACACATGCAGAAGTGCTGCACAGAAATGAGCGAGCTGAGAAGCCCCAAATGCCAGTGCAAAGCGCTGCAGAAG
ATAATGGAGAACCAGAGCGAGGAACTGGAGGAGAAGCAGAAGAAGAAAATGGAGAAGGAGCTCATTAACTTGG
CTACTATGTGCAGGTTTGGACCCATGATCCAGTGCGACTTGTCCTCCGATGACTAAGAAGTTAAAAGCAATGTTGT
CACTTGTACGTACTAACACATGATGTGATAGTTTATGCTAGCTAGCTATAACATAAGCTGTCTCTGAGTGTGTTGTA
TATTAATAAAGATCATCACTGGTGAATGGTGATCGTGTACGTACCCTACTTAGTAGGCAATGGAAGCACTTAGAGT
GTGCTTTGTGCATGGCCTTGCCTCTGTTTTGAGACTTTTGTAATGTTTTCGAGTTTAAATCTTTGCCTTTGCGAATAT
CGTTCGTTTTGCTCTTCAAGTTCTGTTTCTTTGCTCATAAAAGTATAAAAAGATTCATTCCATCGTTAATACCCCATA
GATGGGGTGCTATGGTCCGATTGATTCGGTAAAATTAATTAGGAGACTA 
 
36 | P á g i n a
 
 
Figura 2. Gen que codifica a Albúmina 2S en G. max, y las diferentes partes del gen que codifican para cada 
subunidad. 
Se diseñaron los siguientes fragmentos para ser clonados en los vectores pJET 1.2 y 
pENTRTM_D TOPO, en la Figura 3 se muestra el diseño de cada fragmento y el organismo en 
el que serán expresados. 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Fragmentos de interés. Los diferentes colores indican cada subunidad, tamaños. Serán expresados en 
E coli. 
En la Tabla 1 se muestra los nombres de cada subunidad y su abreviación para futura 
utilidad: 
 
 
 
37 | P á g i n a
 
FRAGMENTO DE INTERÉS ABREVIACIÓN 
Subunidad chica Sch 
Subunidad grande Sgde 
Subunidad chica-subunidad 
grande 
Schg 
Péptido señal-subunidad chica Pch 
Péptido señal-subunidad 
chica-subunidad grande 
Pchg 
 
Tabla 1. Nombre de cada fragmento y su abreviación. 
Para el cumplimiento de los objetivos, se llevó acabo la siguiente metodología (Figura 
4) para la obtención de los diferentes fragmentos de interés pertenecientes al gen de 
Albúmina 2S. 
 
Figura 4. Metodología para la construcción de fragmentos de interés. 
 
Para realizar la metodología fue necesario el uso de controles positivos y negativos para dar 
validez a los resultados. 
 
 
 
Obtención de 
DNA genómico 
a partir de 
semilla G. max 
Amplificación 
de fragmentos 
de interés 
Clonación en 
vector pJET 
2.1 
Transformación 
E. coli Top10. 
PCR en 
colonia 
Obtención de 
plásmidos 
positivos 
PCR Restricción Secuenciación 
 
38 | P á g i n a
 
Búsqueda de las condiciones necesarias para la amplificación de los 
fragmentos de interés. 
Se realizó gradiente de temperatura (Tabla 2)para ubicar la temperatura de alineación (Tm) 
correspondiente a cada fragmento. Las condiciones que se utilizaron fueron las siguientes: 
 Temperatura Tiempo 
Desnaturalización 
inicial 
95°C 2´ 
Desnaturalización 95°C 30´´ 
Alineación Variable 40´´ 
Elongación 72°C 1´30´´ 
Elongación final 72°C 10´ 
 4°C 
 
Tabla 2. Condiciones de PCR utilizadas para la amplificación de fragmentos. 
Se hizo una búsqueda de temperatura de alineación en el programa Oligoanalyzer (Tabla 3) 
que dio los resultados para cada oligonucleótido, y la Tm (temperatura de alineación) que se 
determinó por medio de gradiente de PCR para cada fragmento: 
 
Fragmento Tamaño 
(pb) 
Oligonucleótidos Tempera
tura (°C) 
 
Tm 
Sch 
 
(141pb) Fw CCATGGCGTCCAAATGGCAGCACCAGCAA 68.3 68°C 
Rv GACGATGATGATGATGACGACGACTAA 58 
Sgde 
 
(239 pb) Fw CCATGGAAGGAAAAGACGAAGACGA 58.8 68°C 
Rv GCGACTTGTCCTCCGATGACTGA 60.7 
Schg 
 
(423 pb) Fw CCATGGCGTCCAAATGGCAGCACCAGCAA 68.3 68°C 
Rv GCGACTTGTCCTCCGATGACTGA 60.7 
Pch 
 
( 204 pb) Fw ATGCCATGGGCACCAAGTTCACAATC 62 66.8°C 
Rv GACGATGATGATGATGACGACGACTAA 58 
Pchg 
 
(485 pb) Fw ATGCCATGGGCACCAAGTTCACAATC 62 65°C 
Rv GCGACTTGTCCTCCGATGACTGA 60.7 
Rv GGTAAAATTAATTAGGAGACTATGA 48.4 
 
 
Tabla 3. Características de cada fragmento. Se muestra el tamaño de cada fragmento, los oligos diseñados para 
cada fragmento, temperatura de cada oligo calculado en el programa Oligoanalyzer y temperatura de alineación 
determinada. 
 
 
39 | P á g i n a
 
Para la clonación de los fragmentos de interés se utilizó el vector de clonación pJET 2.1 blunt 
con el kit Clone JET™ PCR Cloning, con un tamaño de 2974 pb. 
A continuación se muestra el mapa genético vector pJET 1.2/blunt circular donde se 
observan cada una de sus características. 
 
Figura 5. Mapa genético del vector de clonación pJET 1.2/blunt y pENTR
TM
/D-TOPOutilizados en E.coli TOP 10. 
El vector pJET 1.2/blunt contiene: rep (pMB1) origen de replicación, bla (Ap
R
) gen de resistencia a ampicilina, 
eco47IR gen letal, promotor T7 para transcripción in vitro y sitio múltiple de clonación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 | P á g i n a
 
 
Amplificación, clonación y secuenciación de los fragmentos de interés. 
 
Subunidad chica (Sch) 
 
Figura 6. Fragmento perteneciente a la subunidad chica (Sch). a) Gradiente de temperatura para Sch de 
tamaño 140 pb, en el recuadro rojo se remarca la Tm (temperatura de alineación); b) diseño in silico de 
clonación de pJET 1.2/blunt con Sch (pJET_Sch) con un tamaño de 3114 pb; c) PCR en colonia de la 
transformación realizada en E.coli TOP10, indicando que la colonia 4 y 5 nos indican que fueron positivas al 
amplificar el fragmento deseado; d) PCR positivo de los plásmidos obtenidos de Sch 4 y 5. 
 
 
 
 
 
 
a) 
b) 
c) d) 
 
41 | P á g i n a
 
Análisis de restricción de Sch 
 
 
Resultados de secuenciación para Sch 
 
A) Secuencia del plásmido Sch 5 con primer Forward 
 
B) Secuencia del plásmido Sch 5 con primer Reverse 
Figura 8. Resultados de secuenciación para Sch. A) Secuenciación realizada con el primer Forward del 
vector pJET 1.2/blunt; B) Secuencia realizada con el primer reverso de pJET 1.2/blunt. 
El resultado de la secuenciación nos indica que el fragmento perteneciente a la subunidad 
chica de 140 pb, se encuentra clonado en la orientación 5´-3´del vector, para este resultado 
se envió a secuenciar el fragmento de PCR utilizando los primers Forward 5’-
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ y Reverso 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’ del 
vector pJET 1.2/blunt. 
Figura 7. Análisis de restricción para 
Sch. a) Gel de agarosa 1% donde se 
puede observar el plásmido Sch5 sin 
digerir; Sch 5 digerido con la enzima 
de restricción Xho I para linealizar el 
plásmido de 3114 pb ; Sch5 digerido 
con Xho I / Hind III obteniendo dos 
fragmentos de 2702 pb y 412 pb; b) 
simulación en gel de agarosa de la 
digestión para Sch con el programa 
Snapgene, en el carril 1 se observa el 
plásmido digerido con Xho I/Hind III, 
el carril 2 se observa el plásmido 
linealizado; c) tabla que indica los 
tamaños esperados con las enzimas 
utilizadas tanto en el vector pJET 
1.2/blunt sin clonar y con el 
fragmento Sch clonado. 
 
a) 
b) 
c) 
 
42 | P á g i n a
 
En el gel de la figura 7 se observa una banda de aproximadamente 1700 pb no esperada, 
indicando que la muestra se encuentra contaminada, es por esta razón que se decidió enviar 
a secuenciar fragmento de PCR utilizando los primers antes mencionados para evitar error en 
el estudio. Sin embargo, dicha banda no esperada no representa un riesgo para el siguiente 
paso que es clonar en vector de expresión debido a que este será digerido con la enzima NcoI 
para liberar el fragmento que contiene a la subunidad chica. 
 
 
43 | P á g i n a
 
Subunidad Grande (Sgde) 
 
 
 
Figura 9. Fragmento perteneciente a la subunidad grande (Sgde). a) Gradiente de temperatura para Sgde de 239 
pb, en el recuadro rojo se remarca la Tm (temperatura de alineación); b) diseño in silico de clonación de pJET 
1.2/blunt con Sgde (pJET_Sgde) con un tamaño de 3213 pb; c) PCR en colonia de la transformación realizada en 
E.coli TOP10, eligiendo el pool de colonias 14 -16 que indicando mayor concentración al amplificar el fragmento 
deseado; d) PCR de los plásmidos obtenidos de Sgde 14, 15 y 16. 
 
 
 
 
 
 
 
a) b) 
d) 
c) 
 
44 | P á g i n a
 
 
Análisis de restricción para Sgde 
 
 
Resultados de secuenciación para Sgde 
 
A) Secuencia del plásmido Sgde 15 con primer Forward 
B) Secuencia del plásmido Sgde 15 con primer Reverse 
Figura 11. Resultados de secuenciación para Sgde. A) Secuenciación realizada con el primer Foward del vector 
pJET 1.2/blunt; B) Secuencia realizada con el primer reverso de pJET 1.2/blunt. 
 
En la figura 9, se muestra el gradiente de temperatura realizado para determinar la Tm, el 
diseño in silico, del vector clonado con la subunidad grande, en la figura 9C se realizó un pool 
de muestras, tomando 3 colonias para cada pool, y se eligió el pool que contenía las colonias 
14 a 16 debido a que presentaban una sola banda, de estás se obtuvieron los plásmidos y se 
verificó nuevamente por PCR dando como positiva la colonia 15. En la figura 10 se muestra el 
análisis de restricción realizado con la enzima XbaI que linealiza el vector clonado, 
c) 
Figura 10. Análisis de restricción para Sgde. a) 
Gel de agarosa 1% donde se puede observar en 
el segundo y tercer carril al plásmido Sgde 15 
linealizado con Xba I y con Xho I 
respectivamente, en el cuarto carril Sgde 15 
digerido Pst I que tiene sitio de corte dentro 
del fragmento clonado, y el quinto carril el 
plásmido sin cortar; b) simulación en gel de 
agarosa de la digestión para Sgde en el 
programa Snapgene; c) tabla que indica los 
tamaños esperados con las enzimas utilizadas 
tanto en el vector pJET 1.2/blunt sin clonar y 
con el fragmento Sgde clonado. 
 
a) 
b) 
 
45 | P á g i n a
 
observando el tamaño esperado, de igual manera se digirió con Pst I que presenta dos cortes 
uno dentro de la subunidad grande y el otro dentro del vector pJET 1.2/blunt. De igual 
manera en la figura 10C se observa una banda de 1700 pb aproximadamente que no se 
digiere y que nos indica contaminación, pudiendo eliminar este ruido en los fragmentos 
enviados a secuenciar al amplificar con los primers del vector y que no interfiere en futuros 
procedimientos. En la figura 11 se muestra los resultados de la secuenciación de Sgde 15, 
que indican que el fragmento se encuentra clonado en la dirección 5´-3´. 
 
Subunidad chica y subunidad grande (Sgde) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Fragmento perteneciente a la subunidad chica y subunidad grande (Schg). a) Gradiente de 
temperatura para Schg de 422 pb, en el recuadro rojo se remarca la Tm (temperatura de alineación); b) diseño 
in silico de clonación de pJET 1.2/blunt con Schg (pJET_Schg) con un tamaño de 3396 pb; c) PCR de los plásmidos 
obtenidos, remarcado con recuadro rojo la clona Schg 8 para análisis de restricción. 
a) 
b) 
c) 
 
46 | P á g i n a
 
Análisis de restricción para Schg 
Secuenciación 
a) Secuencia del plásmido Schg 8 con primer Forward. 
b) Secuencia del plásmido Schg 8 con primer Reverse 
 
Figura 13. Análisis de restricción para Schg 
8. a) Gel de agarosa 1% donde se puede 
observar en el segundo carril al plásmido 
Schg 8, el carril tercero al plásmido Schg 8 
digerido con la enzima Pst I que presenta 
un corte dentro del fragmento clonado y 
otro en el vector; b) simulación en gel de 
agarosa de la digestión para Schg en el 
programa Snapgene; c) tabla que indica los 
tamaños esperados con las enzimas 
utilizadas tanto en el vector pJET 1.2/blunt 
sin clonar y con el fragmento Schg clonado. 
 
a) 
b) 
c) 
 
47 | P á g i n a
 
Figura 14. Resultados de secuenciación para Schg 8. A) Secuenciación realizada con el primer Forward del vector 
pJET 1.2/blunt; B) Secuencia realizada con el primer Reverse de pJET 1.2/blunt. 
Como puede observarse en la figura 12 A, se puede observar el gradiente de temperatura realizado 
para este fragmento que a menores temperaturas amplificaba dos bandas, sin embargo a 68°C fue 
posible conseguir una sola banda que se clonó en pJET 1.2/blunt, de 3396 pb, en la figura 12 C, se 
elige para análisis de restricción la clona Schg 8 que dio positiva y que presentó una mayor 
concentración en el gel. En la figura 13 A, se observan las bandas obtenidas con la digestión realizada 
con Pst I que tiene dos cortes tanto en el fragmento clonado como en pJET 1.2/blunt, también se 
observa en este gel que ya no está presente la banda que nos indica contaminación. En la figura 14, 
se presentan los resultadosde las secuencias que nos indican que el fragmento se encuentra clonado 
en dirección 5´-3´. 
Subunidad chica y subunidad grande (Sgde) 
Figura 15. Fragmento perteneciente a Péptido señal_subunidad chica (Pch). a) Gradiente de temperatura para 
Pch de 203 pb, en el recuadro rojo se remarca la Tm (temperatura de alineación); b) diseño in silico de clonación 
de pJET 1.2/blunt con Pch (pJET_Pch) con un tamaño de 3177 pb; c) PCR en colonia de la transformación 
realizada en E.coli TOP10, eligiendo el pool de colonias B que indica mayor concentración al amplificar el 
fragmento deseado; d) PCR de los plásmidos obtenidos de Pch 1B, 2B y 3B, remarcando con rojo la colonia 1B 
que dio un resultado positivo. 
b) 
a) 
d) c) 
 
48 | P á g i n a
 
Análisis de restricción para Pch 
 
Figura 16. Análisis de restricción para Pch 
1B. a) Gel de agarosa 1% donde se puede 
observar en el primer carril al plásmido 
Pch 1B, el carril segundo al plásmido Pch 
1B digerido con las enzimas Xho I/ Hind III 
que cortan dentro del vector; b) simulación 
en gel de agarosa de la digestión para Pch 
en el programa Snapgene; c) tabla que 
indica los tamaños esperados con las 
enzimas utilizadas tanto en el vector pJET 
1.2/blunt sin clonar y con el fragmento 
Schg clonado. 
 
a)
) 
 a) 
b) 
c)
) 
 a) 
 
49 | P á g i n a
 
 
Secuenciación para pJET_Pch1 
A) Secuencia del plásmido Pch 1B con primer Forward 
B) Secuencia del plásmido Pch 1B con primer Reverse 
 
 
 
Figura 17. Resultados de secuenciación para Pch 1B. A) Secuenciación realizada con el primer Forward del 
vector pJET 1.2/blunt; B) Secuencia realizada con el primer Reverse de pJET 1.2/blunt. 
La figura 15a, podemos observar que la amplificación de nuestro fragmento nos amplifica 
dos bandas por lo que fue necesario realizar una purificación de la banda de 203 pb 
observada en el gel de agarosa para evitar complicaciones en la clonación con pJET 1.2/blunt, 
en la figura 15c se hicieron dos pools A y B conteniendo 3 colonias cada una, observando que 
la PCR en colonia en el pool B fue positiva, se procedió a extraer los plásmidos para verificar 
por PCR el candidato al análisis de restricción, dando positivo la clona Pchg 1B. En la figura 
16a se realizó la digestión con las enzimas Xho I y Hind III, que tienen sitios de corte dentro 
de pJET 1.2/blunt, y obteniendo los fragmentos esperados con el vector clonado. En la figura 
17, se presentan los resultados de secuencias que nos indican que el fragmento clonado en 
Pch1B se encuentra en la dirección 5´-3´. 
 
 
 
 
 
 
 
 
50 | P á g i n a
 
Péptido señal, subunidad chica y subunidad grande (Pchg) 
 
Figura 18. Fragmento perteneciente a la Péptido señal_subunidad chica_subunidad grande (Pchg). a) 
Amplificación de Pchg de 485 pb; b) diseño in silico de clonación de pJET 1.2/blunt con Pchg (pJET_Pchg) con un 
tamaño de 3459 pb; c) PCR de los plásmidos obtenidos, observando que la clona Pchg 3C es positiva al 
fragmento. 
a)
b)
c)
a)
b
c)
 
51 | P á g i n a
 
 
 
 
Figura 19. Análisis de restricción para Pch_gde. a) Gel de agarosa 1% donde se puede observar en el primer 
carril al plásmido Pch_gde, el segundo carril se observa al plásmido Pch_gde digerido con la enzima Pst I que 
corta dentro del fragmento; b) simulación en gel de agarosa de la digestión para Pch_gde en el programa 
Snapgene; c) tabla que indica los tamaños esperados con las enzimas utilizadas tanto en el vector pJET 
1.2/blunt sin clonar y con el fragmento Pchg clonado. 
Secuenciación para pJET_Pchg 
A) Secuencia del plásmido Pchg 3C con primer Forward 
 
B) Secuencia del plásmido Pchg 3C con primer Reverse 
 
PCHG3_PJETR 
 
TCATGTAGGAGATCTTCTAGAAGATTCAGTCATCGGAGGACAAGTCGCACTGGAT
CATGGGTCCAAACCTGCACATAGTAGCCAAGTTAATGAGCTCCTTCTCCGTTTTCT
TCTTCTGCTTCTCCTCCAGTTCCTCGCTCTGGTTCTCCATTATCTTCTGCAGCGCTTT
GCACTGGCATTTGGGGCTTCTCAGCTCGCTCATTTCTGTGCAGCACTTCTGCATGT
GTCCTTCTTCTTCTTCGTCTTCGTCTTTTCCTTCGTTCCTCCTTATGTAGTTGATTCT
TCCCCGCATGGTCCTGAGAATGTGATTGTCGTCGTCATCATCATCATCGTCATCGC
TGCGGCCTTGGATCTTCTCCATGATGTGCTACTCGCAGGGCGTGAGGTTCACCCCC
TGGAGCTGCTTGCGGCAGCTATCTTGCTGGTGCTGCCATTTGGAGGCGCTGCAAGT
GTGGGCGATGCAGAAGAGAAGAGAGATGAGGAGGATTGTGAACTTGGTGCCCAT
GGATCTTGCTGAAAAACTCGAGCCATCCGGAAGATCTGGCGGCCGCTCTCCCTTA
GTATGAAGTCGA 
 
 
52 | P á g i n a
 
Figura 20. Resultados de secuenciación para Pchg 3C. A) Secuenciación realizada con el primer Forward del 
vector pJET 1.2/blunt; B) Secuencia realizada con el primer Reverse de pJET 1.2/blunt. 
En la figura 18a se observa la amplificación del fragmento perteneciente a Pchg con un 
tamaño de 485 pb, en la figura 18c se observa que el plásmido perteneciente a la clona Pchg 
3C es positiva al fragmento esperado, el control positivo no se observa claramente, sin 
embargo puede observarse una ligera banda de 485 pb que nos indica que es el fragmento 
esperado. Para el análisis de restricción se puede observar en la figura 19a, los fragmentos 
esperados al ser digerido el plásmido Pchg 3C con la enzima Pst I que tiene sitio de corte en 
la subunidad grande y en el pJET 1.2/blunt, nuevamente se observa una banda de 1700 pb 
aproximadamente que indica la presencia de contaminación adquirida durante el proceso de 
transformación, sin embargo, no interfiere con las pruebas que se realizarán posteriormente. 
En la figura 20 se presentan los resultados de secuencia utilizando los primers Forward y 
Reverse a) y b) respectivamente de pJET 1.2/blunt, indicando que la dirección de Pchg 3C se 
encuentra en 5´-3´ en el vector. 
 
Transcripción in vitro 
A continuación se presenta la transcripción in vitro del fragmento perteneciente a la 
Subunidad chica (Sch). Para esto primero se linealizó el plásmido Sch_pJET con la enzima 
Hind III. 
Figura 21. Linealización del vector Sch_pJET con la enzima Hind III obteniendo un tamaño de 3114 pb. 
 
 
 
 
 
 
a) b) 
 
53 | P á g i n a
 
 
Figura 22. Transcripción in vitro Sch. a)Representación in silico del fragmento transcrito que contiene el RNAm 
de Sch. b) Gel de agarosa donde puede observarse la banda esperada de aproximadamente 500 pb. 
En la Figura 21 se puede observar el plasmido linealizado que nos permite llevar a cabo la 
transcripción in vitro para obtener el RNAm que puede ser observado en la Figura 22 a). Este 
RNAm será evaluado sobre líneas celulares tumorales para observar si tiene un efecto sobre 
el crecimiento celular. 
SUBCLONACIÓN EN VECTOR DE EXPRESIÓN pET32b(+) 
 
Figura 23. Preparación del vector y del inserto. a) Se puede observar el vector linealizado con un tamaño de 
5899 pb. b) y c) El tamaño de los insertos corresponde con el esperado, se purificaron de gel y se clonaron en 
pET32b(+). 
a) b) 
c) 
 
54 | P á g i n a
 
Para seleccionar las clonas positivas se realizó PCR en colonia para verificar la direccionalidad 
del fragmento utilizando oligonucleótido que se une al promotor T7 y oligonucleótido que 
detecta al fragmento. 
 
Figura 24. PCR para verificar direccionalidad del fragmento Sch. Se puede observar el tamaño esperado de la 
banda en la construcción pET32b(+)_Sch de 703 pb. 
 
 
Figura 25. PCR para verificación de direccionalidad de fragmentos Pchg y Pch. a) Se puede observar que la 
construcción hecha para pET32b(+)_Pchg corresponde la banda esperada que nos indica que el fragmento está 
clonado en dirección correcta. b) La construcción hecha para pET32b(+)_Pch corresponde el tamaño esperado 
de banda que nos indica que Pch está clonado en la posición esperada. 
 
Figura 26. PCR para verificación de direccionalidad de fragmentos Sgde y Schg. a) Se muestra la direccionalidad 
del fragmento Sgde con un tamaño de 802 pb. b) Direccionalidad perteneciente al fragmento Schg de 985 pb. 
Con las clonas obtenidas para cada fragmento se procedió a transformar la cepa de expresión 
E. coli BL21-CodonPlus-RIL. 
a) 
b) 
a) b) 
 
55 | P á g i n a
 
 
 
EXPRESIÓN DEPROTEÍNAS 
A continuación se muestran los pesos calculados en el programa informático Expasy de cada 
péptido y el peso esperado al expresarse con en E. coli. 
Fragmentos PESO MOLECULAR 
(kDa) 
PM CLONADO 
(kDa) 
Sch 5.7 18 
Schg 18.4 29 
Sgde 10.7 24 
Pch 7.9 19 
Pchg 24.1 24 
Trx A 12.3 22 
Tabla 4. Pesos de los péptidos. En la primera columna se muestra el nombre de cada fragmento, TrxA es 
Tiorredoxina que será el control negativo. En la segunda columna se muestra los pesos calculados en el 
programa Expasy de los fragmentos solos. En la tercera columna se presentan los pesos observados de las 
proteínas expresadas de cada construcción. 
 
 
Figura 27. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. En este gel se puede observar las diferentes fracciones esperadas 
para cada construcción realizada. Los números en blanco indican el peso molecular en kDa de cada subunidad. 
 
 
56 | P á g i n a
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 28. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Expresión del plásmido pET32b(+) vacío, la expresión de 
Tiorredoxina se observa aproximadamente a 22 kDA. 
 
 
Figura 29. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Expresión del plásmido pET32b(+)_Pchg, la expresión de Péptido 
señal_subunidad chica_grande, se observa con un peso de 24 kDa. 
22 kDa 
 
57 | P á g i n a
 
 
 
 
 
Figura 30. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Expresión del plásmido pET32b(+)_Pch, la expresión de Péptido 
señal_subunidad chica, se observa con un peso de 19 kDa. 
Para las subunidades Sch, Schg y Sgde se llevó a cabo una precipitación diferencial con 
Sulfato de Sodio, obteniendo los siguientes resultados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
58 | P á g i n a
 
 
 
Figura 31. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Precipitación diferencial con (NH4)2SO4 para Subunidad 
chica fracción soluble e insoluble. 
 
Figura 32. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Precipitación diferencial con (NH4)2SO4 para la subunidad grande 
soluble e insoluble. Se puede observar que los diferentes porcentajes de (NH4)2SO4 nos da diferentes 
intensidades en la banda de nuestro péptido. 
 
 
 
 
59 | P á g i n a
 
 
Figura 33. Gel de acrilamida SDS-PAGE 13%. Precipitación diferencial con (NH4)2SO4 para la subunidad 
chica_grande soluble e insoluble. Se puede observar que los diferentes porcentajes de (NH4)2SO4 nos da 
diferentes intensidades en la banda de nuestra proteína. 
Con estos datos se procede a purificar las proteínas de interés por medio de electro elución. 
 
 
60 | P á g i n a
 
CONCLUSIONES 
 
El siguiente trabajo buscó la construcción de fragmentos no reportados con anterioridad que 
pertenecen a albúmina 2S de soya, ser expresados en E. coli y observar su impacto sobre el 
crecimiento. 
Con las construcciones obtenidas se podrá observar si la función de los diferentes fragmentos que 
codifican para Albúmina 2S es similar a la reportada en el péptido lunasina en E. coli, permitiendo 
determinar si los diferentes fragmentos de la Albúmina 2S participan en la interrupción de la 
formación del septo bacteriano, así como su acción sobre líneas celulares cancerígenas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
61 | P á g i n a
 
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