Vista previa del material en texto
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN ESPECIALIDAD EN TERAPÉUTICA HOMEOPÁTICA “Efecto de Mercurius vivus sobre el crecimiento in Vitro de Streptococcus pyogenes” TESINA QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE LA ESPECIALIDAD EN TERAPEUTICA HOMEOPATICA Presenta Jaqueline González Cortés Asesora: Dra. María de Lourdes Cruz Juárez Co-asesor: C.D. José M. Delgado Ruiz Agosto 2009 Índice 1. INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................................1 1.1 STREPTOCOCCUS PYOGENES .................................................................................................................................. 1 1.1.1. Cepas de Streptococcus β hemolíticos .................................................................................................. 2 1.2. FARINGOAMIGDALITIS ESTREPTOCÓCICA ................................................................................................................. 6 1.2.1. Etiología ................................................................................................................................................ 6 1.2.2. Epidemiología ....................................................................................................................................... 6 1.2.3. Patogenia.............................................................................................................................................. 7 1.2.4. Cuadro Clínico ....................................................................................................................................... 7 1.2.5. Diagnóstico ........................................................................................................................................... 9 1.2.5.1. Diagnóstico Laboratorio ..................................................................................................................................9 1.2.6. Pronóstico ........................................................................................................................................... 10 1.2.7. Tratamiento ........................................................................................................................................ 11 1.3. MERCURIO ..................................................................................................................................................... 11 1.3.1. Historia del uso de Mercurio en la Medicina....................................................................................... 11 1.3.2 Mercurio............................................................................................................................................... 13 1.3.3. Características fisicoquímicas ............................................................................................................. 14 1.3.4. Estado natural y obtención ................................................................................................................. 15 1.3.5. Usos..................................................................................................................................................... 15 1.3.6. Forma de penetración en el organismo, distribución, metabolismo y eliminación (Toxicocinética)... 17 1.3.7. Intoxicación aguda.............................................................................................................................. 18 1.3.8. Intoxicación subaguda ........................................................................................................................ 18 1.3.9. Intoxicación crónica ............................................................................................................................ 19 1.3.10. Efectos teratógenos, mutágenos y cancerígenos.............................................................................. 20 1.3.11. Exploraciones complementarias de acuerdo con la tóxico cinética para establecer el diagnóstico .20 1.3.12. Datos de laboratorio ......................................................................................................................... 21 1.3.13 .Tratamiento ...................................................................................................................................... 22 1.4. HOMEOPATÍA.................................................................................................................................................. 22 1.5. BACTERIOLOGÍA............................................................................................................................................... 25 1.6. EVIDENCIA CIENTÍFICA DE SUSTANCIAS NATURALES SOBRE STREPTOCOCCUS PYOGENES .................................................. 30 2 METODOLOGÍA ......................................................................................................................................... 32 2.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................................................................ 32 2.2. JUSTIFICACIÓN................................................................................................................................................. 32 2.3. HIPÓTESIS ...................................................................................................................................................... 33 2.4. OBJETIVOS...................................................................................................................................................... 33 2.4.1. Objetivo General ................................................................................................................................. 33 2.4.2. Objetivos Particulares ......................................................................................................................... 34 2.5. TIPO DE INVESTIGACIÓN .................................................................................................................................... 34 2.6. DELIMITACIÓN DE LA MUESTRA........................................................................................................................... 34 2.6.1. Criterios de inclusión ........................................................................................................................... 34 2.6.2. Criterios de exclusión .......................................................................................................................... 34 2.6.3. Criterios de eliminación....................................................................................................................... 34 2.6.4. Tamaño de la muestra ........................................................................................................................ 35 2.7. MATERIAL Y MÉTODO ....................................................................................................................................... 35 2.7.1. Recursos humanos .............................................................................................................................. 36 2.7.2. Recursos físicos ................................................................................................................................... 36 2.8. MÉTODO........................................................................................................................................................ 37 2.9. RECOPILACIÓN DE DATOS .................................................................................................................................. 44 2.10. RESULTADOS.................................................................................................................................................44 3.0 DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 46 4. CONCLUSIONES ........................................................................................................................................ 47 5. RECOMENDACIONES Y SUGERENCIAS PARA TRABAJO FUTURO................................................................. 47 6. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................................... 50 i Relación de Figuras y Tablas Fig. 1 Streptococcus pyogenes 1 Fig. 2 Factores de virulencia 3 Fig. 3 Enfermedades supurativas y no supurativas 4 Fig. 4 Faringoamigdalitis 4 Fig. 5 Escarlatina 5 Fig. 6 Pioderma 5 Fig. 7 Erisipela 5 Fig. 8 Fascitis necrotizante 5 Fig. 9 Absceso periamigdalino 5 Fig. 10 Endocarditis post-estreptococica 5 Fig. 11 Faringoamigdalitis en grados diferentes 8 Fig. 12 Grafica para medir inhibición de CIM 29 Fig. 13 Muller Hinton preparados en placas 36 Fig. 14 Caldo de soya Tripticosena 36 Fig. 15 Frasco de sangre de carnero 37 Fig. 16 Mercurius vivus 37 Fig. 17 Inoculación de S. pyogenes ATTC 19615 en Todd Hewitt 38 Fig. 18 Esterilización de sensidiscos de papel filtro 38 Fig. 19 Ordenamiento de sensidiscos 38 Fig. 20 Impregnación de sensidiscos con medicamento homeopático 39 Fig. 21 Sensidiscos impregnados 39 Fig. 22 Celdas de Espectrofotometría 39 Fig. 23 Espectrofotometría 39 Fig. 24 Medición de longitud de onda 39 Fig. 25 Peso medio de cultivo en polvo 40 Fig. 26 Agregación de medio en 250 ml de agua 40 Fig. 27 Mezcla de agua con medio 40 Fig. 28 Esterilización de preparación 40 Fig. 29 Enfriado de mezcla por 20 min 41 Fig. 30 Agregar sangre de carnero 41 Fig. 31 Mezcla del medio con la sangre de carnero 41 Fig. 32 Llenado de placas Petri 41 Fig. 33 Medio preparado en cajas Petri 41 Fig. 34 Toma de S. pyogenes de Tod Hewitt 42 Fig. 35 Inoculo de placas 42 Fig. 36 Colocación de sensidicos impregnados 43 Fig. 37 Colocación de sensidicos impregnados 43 Fig. 38 Crecimiento bacteriano 43 Fig. 39 Crecimiento bacteriano sin inhibición 45 Fig. 40 Control positivo antibiograma 45 Tabla 1 Factores de virulencia 3 Tabla 2 Densidad óptica para espectrofotometría 28 Tabla 3 Densidad óptica 39 Tabla 4 Rsultados de las 8 muestras usadas en los experimentos 45 Cuadro 1 Clasificación de Streptococcus pyogenes 2 ii Glosario y Abreviaturas 1. ADNasas: Enzima que hidroliza el ácido desoxirribonucleico. 2. Aglutinación: Proceso de unión en la curación de una herida. Colección de masas celulares o bacterias distribuidas en un líquido producida por sustancias específicas llamadas aglutinas, cuyas moléculas se unen a las células. 3. Antiflogístico: Adj. Antiinflamatorio. 4. Antifagocítico: Proceso en el que se evita la fagocitosis (proceso por el cual determinadas células embullen y desechan microorganismos y detritus celulares). 5. Antiséptico: Agente que tiende a inhibir el crecimiento y la reproducción de los microorganismos. 6. Anuria: Incapacidad para orinar, supresión de la producción de orina o excreción urinaria menor de 100 a 250 ml al día. 7. Argentíferos: que contiene plata, mineral argentífero, plomo argentífero. 8. Ataxia: Trastorno caracterizado por la disminución de la capacidad de coordinar movimientos. Falta o irregularidad de la coordinación especialmente de los movimientos musculares sin debilidad o espasmos de estos. 9. Auríferos: Adj. Que lleva oro (terreno). 10. β lactamasa (betalactamasa): Enzimas cuyo diversos tipos son producidos o componentes de la mayoría de las bacterias. Pueden inactivar teóricamente todos los antibióticos del grupo de las penicilinas y de las cefalosporinas. 11. Capnofílicos: Dícese de las bacterias que se desarrollan mejor en presencia de anhídrico carbónico. 12. Calomelanos: Protocloruro de mercurio usado como purgante. 13. Eritrodermia: Afección cutánea caracterizada principalmente por enrojecimiento o eritema. 14. Estreptolisinas: Hemolisina producida por estreptococos del grupo A. Sustancia filtrable producida por algunos estreptococos que libera hemoglobina de la sangre. 15. Excoriante, excoriación: Pérdida superficial de sustancia que sólo interesa la epidermis, como la producida por rascadura. iii 16. Exotoxinas: Toxina microbiana que ejerce una acción fuera e independiente de la bacteria productora y que es posible aislar sin destruir ésta. 17. Faneras: Término general para las producciones aparentes y persistentes de la piel como el pelo, uñas, etc. 18. Fuerza Vital: espíritu de vida autocrática, que dinámicamente anima al cuerpo material (organismo), gobierna con poder irrestricto, y subordina todas las partes del organismo en admirable y armoniosa operación vital. 19. Gingivitis: Anomalía caracterizada por enrojecimiento, tumefacción y hemorragia de las encías. 20. Homogenizar: Volver homogéneo. 21. Mononucleosis: Presencia de gran número de leucocitos mononucleares en la sangre. 22. Neutrófilos: Que se tiñe por los colorantes neutros. Leucocito polinuclear de granulaciones neutrófilas. 23. Opsonización: Proceso por el cual las opsoninas confieren a las bacterias mayor susceptibilidad a la fagocitosis por los leucocitos. 24. Parestesias: Trastorno de la sensibilidad subjetiva, como hormigueos, adormecimiento, quemazón, etc. 25. Pirogenicidad: Pirógeno: Dícese de cualquier sustancia o agente que tiende a provocar un aumento de la temperatura corporal, como algunas toxinas bacterianas. 26. Proteinuria: Presencia de cantidades excesivas de proteína en orina, generalmente albumina. 27. Teratógena, teratogénesis: Desarrollo de defectos físicos en el embrión. iv Fórmulas 1. AsF6: Hexafluoruro de arsénico 2. Cl-Hg-Cl: Cloruro mercúrico 3. Cl-Hg-Hg-Cl: Cloruro mercuroso 4. Hg: Mercurio 5. Hg (ClO4)2: Perclorato mercúrico 6. Hg (CN)2: Cianuro mercúrico 7. Hg (NO3)2: Nitrato mercúrico 8. HgS: Sulfuro mercúrico 9. LDH: Deshidrogenasa láctica 10. VIH: Virus de Inmunodeficiencia Humana 11. VSG: Velocidad de Sedimentación Glomerular v Resumen En el estudio del Mercurius vivus, medicamento homeopático importante en el tratamiento de algunas faringoamigdalitis con cuadro clínico característico, se buscó una posible actividad inhibitoria sobre el crecimiento de Streptococcus pyogenes. Se realizó estudio por duplicado utilizando el método de difusión, se impregnaron sensidiscos con Mercurius vivus en cuatro diferentes dinamo-diluciones o potencias (6c, 12c, 30c y 200c), además se colocaron sensidiscos impregnados unos con alcohol homeopático y otros con agua destilada como controles negativos, previamente a su colocación se dejaron evaporar. Como control positivo se colocó sensidisco con antibióticos para bacterias Gram positivas. Se preparo medio de cultivo Agar caldo de Soya Tripticasa y se vertió en cajas de Petri, donde posteriormente fueron sembrada la cepa de la bacteria Streptococcus pyogenes ATTC 19615, el inoculo fue tomado del medio de cultivo líquido Todd Hewitt, en el cual se dejo llegar a una concentración bacteriana estandarizada, siguiendo la técnica de Kirby-Bauer, con una densidad óptica de DO 550 nm = 0.125. Las cajas de Petri fueron rotuladas para control negativo, positivo y cada potencia de Mercurius vivus con la que se valoro su efecto. Se colocaron los sensidiscos sobre las siembras y se incubaron a 37ºC por 18 horas. Se recogieron resultados 18 horas después, observando un adecuado crecimiento bacteriano sin existir evidencia de inhibición del mismo con ninguna de las dinamo-diluciones de Mercurius vivus teniendo el mismo resultado con los controles negativos, siendo el control positivo el único en manifestar inhibición.Esto pudo deberse a que la acción de los medicamentos homeopáticos es dinámica y se vi manifiesta en el paciente pero no en estudios in vitro, sin embargo se deja abierta la posibilidad de realizar cambios en el método, el uso de otras bacterias, así como de otros medicamentos. vii Abstract In the study of the Mercurius vivus, an important homeopathic medicine for the treatment of some pharyngitis with certain clinical characteristics , an inhibitory activity over the growth of the Streptococcus pyogenes was searched. Study was performed in duplicate using the diffusion method, in four different is permeated with sensidiscos Mercurius vivus in four different dilutions or dynamo-power (6c, 12c, 30c y 200c), some sensidiscos were treated with homeopathic alcohol and other with distilled water as a negative control. They were left to evaporation. As a positive control, was placed sensidisco with antibiotics for Gram-positive bacteria. An Agar culture with Tripticasa Soy broth was put into Petri cases. A strains of the Streptococcus pyogenes ATTC 19615 bacteria was cultivated. The inoculum was take from the liquid culture means Todd Hewitt, which was left to a bacteria standardized concentration, following the Kirby-Bauer technique, with an optic density of DO 550 nm = 0.125. the Petri cases were labeled for negative and positive control, and every potency of Mercurius vivus as well. Sensidiscos were placed on the planting and incubated at 37 ° C for 18 hours. As a result and adequate bacteria growth was observed, without evidence of inhibition with none of the dynamo-dilutions. The same result was obtained with the negative controls. Only the positive control showed growth inhibition. This could be because the action of the homeopathic drugs is dynamic and shows in the patient, but not in vitro studies. Nonetheless, it is possible to change the method of analysis, the use of different bacteria, and other medicines. 1 1. Introducción 1.1 Streptococcus pyogenes El género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos gram positivos que normalmente se dispone en parejas o en cadenas, son ovales o esféricos de 0.5 a 1.0 µm de diámetro, se caracterizan por formar cadenas largas cuando se cultivan en caldo, carecen de enzimas citocromo, son inmóviles. La mayoría de las especies crecen en una atmósfera enriquecida con dióxido carbono (crecimiento capnofílico, anaerobios facultativos), con metabolismo fermentativo (hidratos de carbono) en el que producen ácido láctico o fórmico, etanol y CO2. Sus requerimientos nutricionales son complejos, necesitando para su aislamiento el uso de los medios enriquecidos con sangre o suero. Su crecimiento óptimo es a 37 °C. Al contrario que las especies de Staphylococcus, los estreptococos son catalasa- negativos (Figura 1). Figura 1. Streptococcus pyogenes 2 1.1.1. Cepas de Streptococcus β hemolíticos Los es treptococos se clasifican β-hemolíticos y β-no hemolíticos, α no hemolíticos. Dentro de los β-hemolíticos están los del grupo A (S. pyogenes, S. anginosus) y los del grupo B (S. agalactiae). Cuadro 1 Clasificación de los estreptococos más frecuentes Clasificación bioquímica Clasificación serológica Patrón de hemólisis S. pyogenes A Beta Grupo S. anginosus A,C,F,G, no agrupables Beta no hemolítico, ocasionalmente alfa S. agalactiae B Beta ocasionalmente no hemolítico S. dysgalactiae C,G Beta S. bovis D Alfa ocasionalmente no hemolítico Estreptococos del grupo viridans No agrupable Alfa no hemolítico S. pneumoniae No agrupable Alfa Cuadro 1 La virulencia de los estreptococos del Grupo A está determinada por la capacidad que tienen las bacterias de adherirse a la superficie de las células del huésped, invadir las células epiteliales, evitar la opsonización y la fagocitosis, y producir una variedad de toxinas y de enzimas. En la Tabla 1 se enumeran y en la (Figura 2) se esquematizan los factores de virulencia de Streptococcus pyogenes (Murray, 2000). 3 Factores de virulencia Factores de virulencia Efecto biológico Cápsula Antifagocítica Ácido lipoprotéico Se une a las células epiteliales Proteína M Adhesina, antifagocítica, degrada el componente C3B del complemento Proteínas del tipo M Se une a las inmunoglobulinas M y G y a la α2 –macroglobulinas (inhibidor de la proteasa) Proteína F Media en la adherencia a las células epiteliales Exotoxinas pirógenas Median la pirogenicidad, el aumento de la hipersensibilidad retardada y la susceptibilidad a la endotoxina, la citotoxicidad, la mitogenicidad, inespecífica de las células T, la inmunosupresión de la función de las células B, y la producción de un exantema escarlatiniforme Estreptolisina S Lisa leucocitos, plaquetas y eritrocitos; estimula la liberación de enzimas lisosomales; no inmunogénica Estreptosina O Lisa leucocitos, plaquetas y eritrocitos, estimula la liberación de enzimas losomales, inmunogénica Estreptocinasa Lisa los coágulos sanguíneos, facilita la diseminación de las bacterias a los tejido ADNasa Despolimeriza el ADN libre de la célula en el material purulento C5a peptidasa Degrada el componente C5a del complemento Tabla 1 Figura 2 Factores de virulencia de S. pyogenes 4 El Streptococcus pyogenes clínicamente es causante de muchas enfermedades supurativas y no supurativas como son (Figura 3) faringitis, faringoamigdalitis (Figura 4), escarlatina (Figura 5), pioderma (Figura 6), erisipela (Figura 7), fascitis necrotizante (Figura 8), abscesos periamigdalinos (Figura 9), Síndrome de shock tóxico estreptocócico, sepsis puerperal, bacteriemia, endocarditis (Figura 10), fiebre reumática, glomerulonefritis. Figura 3 Enfermedades supurativas y no supurativas Figura 4 Faringoamigdalitis 5 Figura 5 Escarlatina Figura 6 Pioderma Figura 7 Erisipela Figura 8 Fascitis necrotizante Figura 9 Absceso periamigdalino Figura 10 Endocarditis postestreptocica 6 1.2. Faringoamigdalitis estreptocócica La mayoría de las faringitis tiene un origen probablemente viral. Muchos se asocian al resfriado común. La causa bacteriana de la faringitis más frecuente es el estreptococo del Grupo A (Streptococcus pyogenes). Este microorganismo es responsable del 15% de los casos de faringitis y puede ocasionar complicaciones importantes tanto supurativas (absceso perimigdalar y retrofaringeo) como no supurativas (escarlatina, síndrome del shock tóxico por estreptococos, fiebre reumática, glomerulonefritis postestreptocócica aguda) (Harrison, 1998). 1.2.1. Etiología Los estreptococos son bacterias gram positivas de forma esférica u ovoidea que de forma característica forman cadenas cuando crecen en medios líquidos. Son anaerobios facultativos aunque algunos son anaerobios estrictos. Es la única especie que pertenece al Grupo A y se caracteriza por ser β hemolítico (Harrison, 1998). 1.2.2. Epidemiología La faringitis producida por S. pyogenes es una enfermedad fundamentalmente de niños entre 5 y 15 años, aunque los lactantes y adultos también son susceptibles. El patógeno se extiende de persona a persona a través de gotitas respiratorias. El hacinamiento como el caso de las aulas y las guarderías, aumentan las oportunidades que tiene el microorganismo de diseminarse, fundamentalmente en 7 los meses de invierno (Murray, 2000). Es responsable de entre el 20% y el 40% de los casos de faringitis exudativa (Harrison, 1998). 1.2.3. Patogenia Los estreptococos de Grupo A elaboran un cierto número de componentes superficiales y productos extracelulares importantes tanto para la patogenia de la infección como para la respuesta inmunitaria del huésped humano. La pared celular contiene un antígenode carbohidratos, la reacción de estos extractos con el antisuero específico del Grupo A es la base de la identificación definitiva de S. pyogenes. Las moléculas de proteínas M se relacionan con la capacidad de la cepa de resistir la fagocitosis en sangre, también interfiere la activación del complemento y el depósito de fragmentos opsónicos del complemento sobre la célula bacteriana. Los estreptococos del Grupo A originan un elevado número de productos extracelulares que pueden ser importantes en la toxicidad local y sistémica y en la diseminación de la infección por los tejidos. Entre estos productos se incluyen las estreptolisinas S y O, toxinas que lesionan las membranas celulares y que son responsables de la hemólisis que producen estos microorganismos; la estreptocinasa, ADNasas, proteasa; y las exotoxinas pirógenas A, B y C (Harrison, 1998; Murray, 2000). 1.2.4. Cuadro Clínico El periodo de incubación es de 1 a 4 días. Un porcentaje de los casos permanecen asintomáticos, otros presentan sólo fiebre o faringitis leve (similar a la 8 faringitis vírica) o desarrollan síntomas inespecíficos como cefalea, malestar general, náuseas, vómitos (especialmente en niños) o taquicardia (Harrison, 1998). En los niños también se ha observado la presencia de exantema escarlatiforme (fino, eritematoso, en piel de lija) (Strange, 2000). Los síntomas y signos son bastante variables, desde una leve molestia de garganta con mínimos hallazgos en la exploración, hasta fiebre alta e intenso dolor faríngeo, con eritema llamativo, tumefacción de la mucosa faríngea y la presencia de un exudado purulento sobre la parte posterior de la faringe y los pilares amigdalinos (Figura 11) (Merck, 2000). Frecuentemente se encuentran adenopatías cervicales y submaxilares incrementadas de tamaño e hipersensibles acompañando a la faringitis exudativa (Harrison, 1998; Merck, 2000). Figura 11 Faringoamigdalitis en grados diferentes 9 1.2.5. Diagnóstico El diagnóstico diferencial de la faringitis estreptocócica incluye las otras muchas causas bacterianas y virales. Entre otras infecciones que causan faringitis exudativa figuran la mononucleosis infecciosa y la infección por adenovirus, entre causas de faringitis sin exudado, figuran los virus coxackie, de la gripe, micoplasmas o Neisseria gonorrhoeae, así como la infección aguda por VIH (Harrison, 1998). 1.2.5.1. Diagnóstico Laboratorio El cultivo faríngeo sigue siendo el método fundamental en el diagnóstico de la faringitis estreptocócica. Cuando se toma (con hisopo estéril enérgicamente sobre ambos pilares amigdalinos) y se procesa correctamente, el cultivo faríngeo es el medio más sensible y específico de realizar el diagnóstico definitivo. La VSG (Velocidad de Sedimentación Glomerular) suele ser >50 mm/h en la infección aguda, con cifras de leucocitos entre 12.000 y 20.000/ml, y 75% a 90% de neutrófilos, muchos de ellos formas jóvenes. La orina no muestra en general anomalías específicas, excepto las atribuibles a la fiebre (p. ej., proteinuria) (Merck, 2000). La presencia de estreptococos en muestras tomadas de la zona infectada (faringe, heridas de piel, secreciones, etc.) se puede demostrar mediante incubación durante una noche en placa de agar sangre de carnero o, para los gérmenes del Grupo A, por tinción inmediata con anticuerpos fluorescentes. 10 Actualmente se dispone de reactivos de diagnóstico rápido de estreptococos mediante aglutinación en látex o inmunoensayo enzimático (Strange, 2000). El método de anticuerpos fluorescentes evita la necesidad de pruebas serológicas para diferenciar entre estreptococos del Grupo A y otros estreptococos b-hemolíticos, pero son frecuentes las falsas reacciones positivas con estafilococos hemolíticos (Merck, 2000). 1.2.6. Pronóstico La evolución habitual de la faringitis estreptocócica no complicada es la resolución de los síntomas trascurridos entre 3 y 5 días. El curso se acorta ligeramente para evitar las complicaciones supurativas y la fiebre reumática. Las complicaciones supuradas de la faringitis estreptocócica se han hecho infrecuentes con el uso generalizado de antibióticos en la mayoría de los casos. Estas complicaciones aparecen como resultado de la diseminación de la infección a partir de la infección a partir de la mucosa faríngea a tejidos más profundos tanto por extensión directa como por diseminación hematógena o linfática. Se debe considerar la posibilidad de que existan complicaciones locales, como la formación de un absceso en el espacio periamigdalino o parafaríngeo en pacientes que presentan síntomas inusualmente intensos o prolongados o que presentan un dolor localizado asociado a fiebre elevada y aspecto de toxicidad. 11 1.2.7. Tratamiento El tratamiento alopático consiste en administración de antibiótico según la sensibilidad del streptococcus pyiogenes. 1.3. Mercurio 1.3.1. Historia del uso de Mercurio en la Medicina El Mercurio es un elemento conocido desde la antigüedad. Los descubrimientos en las tumbas faraónicas prueban que los egipcios ya lo empleaban, y hay referencias de que se extraía mercurio de las minas de Kwichan, en China hacia el año 1200 a.C. Los fenicios, setecientos años antes de la era cristiana, lo utilizaban para extraer y purificar el oro. Aristóteles (384-322 a.C.) fue el primero en mencionar el empleo profesional del metal. Dioscórides, grabador griego del siglo I a.C. lo llamó hydrargyros (planta líquida) término del que se deriva el símbolo químico actual Hg. El latino Plinio, en su Historia naturalis, lo designó con el nombre de argentum vivum, es decir, planta viva. Los árabes lo conocían como azoc, que significa movimiento, y de ahí el término azogue con que también se conoce. En el siglo XVII se acostumbraba a relacionar los metales conocidos con los planetas y el azogue por sus características de movimiento se le relacionó con Mercurio, nombre que ha prevalecido hasta la actualidad. 12 Su verdadero carácter metálico fue definitivamente admitido en 1759, año en que Braun lo encontró en estado sólido durante un riguroso invierno en San Petersburgo, en que la temperatura descendió por debajo de los -39°. La introducción del Mercurio en la Medicina se debe a los árabes, quienes lo utilizaban en aplicaciones externas contra la lepra, su utilización como medicamento interno parece provenir del XV y se le atribuye a J. Widman cuyo tratado sobre la sífilis apareció en 1497. Empleado desde entonces en las más diversas enfermedades ha sido considerado hasta nuestros días como el específico de la sífilis, aunque recientemente ha tenido que ceder parte de su dominio a los arsenobenzoles. No obstante, se consideró como un medicamento de gran valor como antisifilítico, antiséptico y antiflogístico (Uribe, 1990). Como anti-luético actualmente ya no se le emplea, pero aún es útil como antiséptico y antiflogístico en algunos casos. El Mercurio es un metal blanco plateado, muy brillante, líquido a temperatura ordinaria y extremadamente móvil. En la naturaleza se lo encuentra raramente en estado natural, más bien se halla en estado de sulfuro rojo de Mercurio o cinabrio. Este mineral que se presenta en masas cristalinas de un rojo vivo, se encuentra y es explotado en España y California (Lathoud, 2003), en nuestro país lo hay en Sonora, Chihuahua, Durango, Zacatecas, Nuevo León, San Luis Potosí, Nayarit, Jalisco, Guanajuato e Hidalgo (Mendiola, 1974). Para obtenerlo se tuesta el cinabrio en horno especial, se forma entonces ácido sulfuroso y mercurio que se condesa en compartimientos dispuestos entre horno y chimenea, y por ésta escapa el ácido 13 sulfuroso. Las tres primeras dinamizaciones se preparan por trituración Hahnemanniana. Las dinamizaciones más elevadas se obtienen por nuevas trituraciones, o porprocedimientos de trituración habitual (Lathoud, 1974). 1.3.2 Mercurio Elemento químico, símbolo Hg, número atómico 80 y peso atómico 200.59. Es un líquido blanco plateado a temperatura ambiente (punto de fusión -38.4ºC o -37.46ºF); tiene su punto de ebullición de 357ºC (675.05ºF) a presión atmosférica. Es un metal noble, soluble únicamente en soluciones oxidantes. El Mercurio sólido es tan suave como el plomo. El metal y sus compuestos son muy tóxicos. El mercurio forma soluciones llamadas amalgamas con algunos metales (por ejemplo: oro, plata, platino, uranio, cobre, plomo, sodio y potasio). La tensión superficial de mercurio líquido es de 484 dinas/cm, seis veces mayor que la del agua en contacto con el aire. Por consiguiente, el Mercurio no puede mojar ninguna superficie con la cual esté en contacto. En aire seco el Mercurio metálico no se oxida, pero después de una larga exposición al aire húmedo, el metal se cubre con una película delgada de óxido. No se disuelve en ácido clorhídrico libre de aire o en ácido sulfúrico diluido, pero sí en ácidos oxidantes (ácido nítrico, ácido sulfúrico concentrado y agua regia). 14 1.3.3. Características fisicoquímicas El Mercurio es el único metal líquido a la temperatura ambiente y presión ordinaria. De aspecto blanco plateado brillante, goza de gran movilidad a pesar de su elevada densidad. En sus compuestos, el Mercurio se encuentra en los estados de oxidación 2+, 1+ y más bajos; por ejemplo, HgCl2, Hg2Cl2 o Hg3 (AsF6)2. A menudo los átomos de mercurio presentan dos enlaces covalentes; por ejemplo, Cl-Hg-Cl o Cl-Hg-Hg-Cl. Algunas sales de mercurio (II), por ejemplo, Hg (NO3)2 o Hg (ClO4)2, son muy solubles en agua y por lo general están disociadas. Las soluciones acuosas de estas sales reaccionan como ácidos fuertes a causa de la hidrólisis que ocurre. Otras sales de Mercurio (III), como HgCl2 o Hg (Cn)2, también se disuelven en agua, pero en solución sólo están poco disociadas. Hay compuestos en que los átomos de mercurio están directamente enlazados a átomos de carbono o de nitrógeno; por ejemplo, H3C-Hg-CH3 o H3C-CO-NH-Hg-NH-CO-CH3. En complejos, como K2 (HgI4), a menudo tiene tres o cuatro enlaces. El Mercurio se encuentra comúnmente como su sulfuro HgS, con frecuencia como rojo de cinabrio y con menos abundancia como metal cinabrio negro. Un mineral menos común es el Cloruro de Mercurio. A veces los minerales de Mercurio contienen gotas pequeñas de Mercurio metálico. 15 1.3.4. Estado natural y obtención Aunque el Mercurio se encuentra libre en la naturaleza en pequeñas cantidades, se extrae principalmente del cinabrio (sulfuro de Mercurio), pero también forma parte de diversos minerales (riolita, serpentina, andesita). Los principales yacimientos se encuentran en España (Almadén), Italia, Yugoslavia, Rusia, Estados Unidos y la India. De España se extrae aproximadamente el 50% de la producción europea y el 25% de la mundial (Mercadal, 1993). 1.3.5. Usos Las aplicaciones industriales del Mercurio y sus compuestos minerales orgánicos son muy diversas. Se emplea en el tratamiento de minerales auríferos y argeníferos. En la fabricación y reparación de termómetros, barómetros, bombas de Mercurio, lámparas de incandescencia, lámparas radiofónicas, tubos radiográficos, rectificadores de corriente y otros aparatos similares (Mercadal, 1993). El principal uso del Mercurio es en la manufactura de instrumentos de control, tubos, rectificadores, termómetros, barómetros, baterías y aparatos eléctricos. Se utiliza en celdillas de salmuera para la producción electrolítica de cloro y sosa cáustica, y como catalizador en espuma de poliuretano (LaDou, 1980). Se utiliza el Mercurio o sus compuestos como catalizadores para ciertas síntesis, como la del aldehído acético o la del alcohol sintético. En la electrólisis de los cloruros de álcalis (cloro y sosa cáustica) actúa de electrodo. 16 En la fabricación de pigmentos y pinturas anticorrosivas a base de cinabrio. En la preparación de amalgamas y compuestos del Mercurio. En la preparación de fieltros. En el dorado, plateado, estañado, bronceado y masquinado de metales. En la preparación de fungicidas para la conservación de los granos y también para evitar la proliferación de limo en la pasta de papel. Para la fabricación de cebos de fulminato de Mercurio y fuegos artificiales. Así mismo se emplea en las prótesis dentales, en algunos procesos de taxidermia. En la fabricación de seda artificial a base de cloruro de Mercurio. En ciertos trabajos de laboratorio fotográfico. En la industria farmacéutica su uso casi es histórico: preparación de calomelanos, mercurocromo, diuréticos mercuriales, etc. (Mercadal, 1993). Exposición laboral y ambiental Todos los trabajadores que participan en la extracción y recuperación de Mercurio tienen un riesgo de exposición a sus vapores. El trabajo de mantenimiento en hornos, cañones de chimenea y retortas es una fuente potencial de exposición. Los trabajadores que manufacturan equipo eléctrico que requiere Mercurio pueden exponerse por escape o manejo descuidado. Los trabajadores que recuperan metales llegan a exponerse al Mercurio y otros metales pesados. Puede ocurrir exposición elevada en corto plazo durante ciertos procedimientos dentales. 17 Han ocurrido varias epidemias por envenenamiento con Mercurio orgánico resultado de la contaminación ambiental por escapes industriales y uso inadecuado de fumigantes de granos. Se han observado envenenamientos con compuestos de Mercurio alquilo. La contaminación con Mercurio inorgánico del aire y agua por la combustión de carbón y en plantas de cloro ha tenido consecuencias menos espectaculares, pero ha sido una fuente importante de antecedentes de exposición (LaDou, 1980). 1.3.6. Forma de penetración en el organismo, distribución, metabolismo y eliminación (Toxicocinética) La principal vía de absorción profesional es la respiratoria (polvo o vapores). La vía cutánea, aunque poco frecuente, es posible cuando el Mercurio se halla finamente dividido e incorporado a una grasa en forma de pomada, en especial si existen lesiones de la piel. El Mercurio inorgánico, una vez absorbido, pasa al torrente circulatorio y es trasportado preferentemente por las fracciones proteicas del plasma, el Mercurio orgánico que lo es por los hematíes. Atraviesa fácilmente por las membranas celulares y se deposita en el hígado, intestinos, riñones, tejido nervioso, vísceras en general y en las faneras (pelos y uñas). Una parte del Mercurio inhalado se elimina por el aire espirado y el resto por orina y en menor cuantía por las heces, saliva y sudor (Mercadal, 1993). 18 1.3.7. Intoxicación aguda La intoxicación aguda por el Mercurio metal es poco frecuente en el medio industrial. Si la vía de penetración es la respiratoria, aparece traqueobronquitis y posteriormente bronconeumonía. Si el acceso es digestivo, provoca nausea y diarrea. Reviste mayor gravedad la ingestión accidental de sales mercúricas. Su carácter cáustico provoca lesiones ulcerosas en la boca y el esófago, vómitos profusos, diarreas, melenas y deshidratación. También se observa un cuadro de insuficiencia renal anúrica por nefrosis tubular necrótica con intensa uremia, que puede evocar a la muerte de 8 a 12 días. En otros casos, el óbito se produce en un plazo de 24 horas por shock grave o por complicaciones de tipo respiratorio. En los episodios no fatales la recuperación suele ser total. El tratamiento será el de las tubulopatías anúricas, prestando especial atención al equilibrio hidroelectrolítico y recurriendo a técnicas de depuración renal si es preciso. Para la eliminación especifica del tóxico, debe administrarse 2 a 3 dimercaptopropanol (BAL) con la mayor rapidez posible (Mercadal, 1993). 1.3.8. Intoxicaciónsubaguda También infrecuente en el medio laboral, acostumbra a ser el resultado de una intoxicación medicamentosa, generalmente por calomelanos (cloruro mercuroso), y 19 se caracteriza por la aparición de nefritis, alteraciones digestivas (estomatitis, enteritis) y cutáneas (eritrodermia mercurial) (Mercadal, 1993). 1.3.9. Intoxicación crónica Constituye el dominado Hidrargirismo y es la forma más habitual de la intoxicación profesional. En una primera fase (periodo de absorción) aparecen signos poco precisos, anorexia, astenia, cefalea, vértigos, insomnio, dolores en los miembros y masticación dolorosa. El periodo de intoxicación propiamente dicho se caracteriza por: • Alteraciones digestivas: nauseas, vómitos y diarreas, estomatitis mercurial (sialorrea, hipertrofia de glándulas salivales, gingivitis, ulceraciones de mucosa oral, en encías un ribete gris azulado). • Alteraciones oculares: se puede detectar un reflejo parduzco en la cápsula anterior del cristalino (signo de Akitson), constituye un signo precoz de intoxicación mercurial. Escotomas de restricción concéntrica del campo visual, dato patognomónico de la intoxicación mercurial. • Alteraciones del sistema nervioso: Son las más importantes. Trastornos psíquicos: irritabilidad, tristeza, ansiedad e insomnio, temor y depresión (eretismo mercurial). Puede evolucionar a la demencia y a la caquexia. El gran síntoma del hidrargirismo es el temblor. Suele iniciarse en la lengua, labios, párpados y dedos, en forma de temblor fino. En cara se producen tics. Este temblor, con características típicas del temblor de origen cerebeloso, se asocia frecuentemente a ataxia, adiadococinesia, marcha cerebelosa y en 20 ocasiones nistagmos. Son poco frecuentes las contracciones dolorosas. El temblor parece guardar relación con la gravedad de intoxicación y la concentración del Mercurio en los tejidos. • Otras alteraciones: Dermografismo. Dermatitis de contacto, papulosas e hiperqueratosicas, así como rinitis y conjuntivitis (Mercadal, 1993). 1.3.10. Efectos teratógenos, mutágenos y cancerígenos Aunque el Mercurio puede atravesar la barrera placentaria y producir intoxicación en el feto, no está clara su posible acción teratógena. En trabajadores expuestos al Mercurio se dan casos de oligoespermia y de esterilidad atribuibles a la inhibición de la síntesis del ADN en los testículos. Los producen tanto el mercurio inorgánico como el orgánico. Todos los derivados mercuriales tienen capacidad mutágena, pero hasta la fecha no se ha podido demostrar acción cancerígena (Mercadal, 1993). 1.3.11. Exploraciones complementarias de acuerdo con la tóxico cinética para establecer el diagnóstico El diagnóstico clínico no suele presentar dificultades cuando se ha realizado una buena anamnesis laboral. Pueden surgir problemas de diagnóstico diferencial con ciertas formas de esclerosis en placas. Es necesario recurrir entonces a la punción lumbar, que en caso de intoxicación mercurial no revelará ninguna alteración en el líquido cefalorraquídeo (Mercadal, 1993). 21 Mercurio inorgánico: • Insuficiencia respiratoria aguda • Gingivitis • Temblor • Eretismo (Timidez, labilidad emocional) • Proteinuria, insuficiencia renal Mercurio orgánico (compuestos de Mercurio alquilo): • Trastornos mentales • Ataxia, espasticidad • Parestesias • Trastornos visuales y auditivos 1.3.12. Datos de laboratorio El diagnóstico se basaba hasta hace poco en la determinación del Mercurio excretado por la orina durante 24 horas, pero actualmente, es posible determinar el Mercurio en sangre (espectrometría de absorción atómica). Como prueba específica puede tener interés la determinación de la lacticodeshidrogenasa (LDH) urinaria, que con la exposición al Hg puede estar aumentada mientras es normal en suero, y la determinación de la aminoaciduria (Mercadal, 1993). 22 1.3.13 .Tratamiento Después de exposición aguda al Mercurio, debe instituirse el tratamiento inmediato con dimercaprol (5 mg/kg intramuscular). Las insuficiencias respiratoria y renal deben de tratarse de manera adecuada. En el envenenamiento agudo también es eficaz la penicilamina (LaDou), aunque es controversial debido a las reacciones secundarias (Mercadal, 1993). Los mejores resultados se obtienen con el BAL (2-3 dimercaptopropanol, sustancia para combatir las intoxicaciones por arsénico y algunos metales) por vía intramuscular, a dosis de 250 mg durante periodo de 15 días, hasta la completa remisión de los síntomas. Como medidas coadyuvantes para el tratamiento del temblor, se administrará vitamina B6 y sedantes (Mercadal, 1993). Las secuelas neurológicas del envenenamiento por Mercurio alquilo son irreversibles, resaltando así la necesidad de prevenirlos (LauDou, 1980). 1.4. Homeopatía La OMS (Organización Mundial de la Salud) establece que la Homeopatía es el segundo sistema médico más utilizado a nivel internacional, puesto que se destinan más de mil millones de dólares para este tipo de terapia (Tierney, 1998). Ha sido causa de gran debate tanto la elaboración de los medicamentos homeopáticos como la práctica de la misma. La homeopatía es una terapéutica médica utilizada en los últimos 200 años “perfectamente simple manteniéndose firme en sus principios (primon non nose, ley de semejante, dosis mínima, individualidad morbosa, 23 individualidad medicamentosa, experimentación pura, dinamismo vital) como en su práctica” (Organón de la Medicina, 5ª y 6ª edición). La cual busca restablecer la salud de una forma rápida, suave y permanente (§ 2, Organón de la Medicina). La homeopatía sabe que las enfermedades no son causadas por sustancia alguna, ni por ninguna acrimonia, es decir, ninguna materia-enfermedad, sino que son solamente desórdenes (dinámicos) del principio vital que anima al cuerpo humano. Así como también sabe que una curación sólo puede ser realizada por la reacción de la fuerza vital provocada por la administración del remedio correctamente elegido, y que la curación será segura y rápida en proporción a la fuerza con que la fuerza vital se mantenga en el paciente. De aquí que la homeopatía evite todo cuanto debilita aún el más ínfimo grado, y únicamente emplea en la curación a aquellas medicinas cuya facultad de alterar y deteriorar (dinámicamente), a la salud le sea conocida con certeza y de entre éstas selecciona una cuyo poder patógeno (su enfermedad medicinal) sea capaz de eliminar por similitud (similia similibus), a la enfermedad natural en cuestión y la administra al paciente en forma simple en pocas y diminutas dosis que sean suficientes para eliminar la enfermedad natural (Prefacio 6ª edición, Organon). Los principios fundamentales de la homeopatía son completamente diferentes de la medicina moderna, la farmacología y la química. La homeopatía cuenta con 3 premisas muy importantes: ley de los similares, individualidad de la terapia en sentido amplio de los síntomas y la utilización de muy pequeñas dosis (Johson, 2007). 24 Es muy bien sabido que en homeopatía contamos con medicamentos útiles para el tratamiento de cuadro faríngeo y/o amigdalino, uno de los que pueden ser utilizados es Mercurius vivus, nosotros los homeópatas nos basamos en la sintomatología (en la totalidad de los síntomas) del paciente y así compararla con una serie de datos para encontrar el medicamento más adecuado respetando la ley de los semejantes (similares). Dentro de la patogenesia de Mercurius vivus encontrada en la bibliografía nos dice que a nivel faríngeo puede haber dolor punzante, excoriante o ardiente, que agrava al tragar, de noche, por el frío o por hablar, el dolor se extiende hasta oído, tendencia a supuración, ulceración y destrucción de tejidos en este caso de faringe, el moco es verde algunas veces con estrías de sangre, hay sialorrea fétida,sabor metálico, ganglios cervicales dolorosos, así como sensación de cuerpo extraño en la garganta, hay hinchazón y enrojecimiento de garganta o es de color cobrizo o púrpura con acumulación de mucosidades espesas y adherentes (Vijnosvky, 1978). El estado general del paciente se agrava, se encuentra con fiebre poco elevada, transpiración abundante por la noche. Localmente la faringe está inflamada, amígdalas y regiones periamigdalinas tienen un color “rojo oscuro” con una o varias ulceraciones poco profundas, salivación profusa y fétida con necesidad de deglutir constante y se acompaña de “dolores agudos” (Varnnier, 1957, 2004). Hay que recordar que el Mercurio fue experimentado homeopáticamente por primera vez por el Dr. Samuel Cristiano Federico Hahnemann, a partir del óxido negro de Mercurio o Mercurio soluble (de ahí su nombre en latín Mercurius solubilis). 25 El mercurio actúa sobre todos los tejidos pero de manera especial el sistema linfático, la sangre, las mucosas, las glándulas, la piel, el sistema nervioso, el periostio, los huesos largos, el riñón, el hígado y los intestinos. Y es en la Medicina Homeopática donde tiene preciosas indicaciones, en unión de gran parte de sus óxidos y sales que constituyen el gran grupo medicamentoso de los mercuriales (Mendiola, 1974). Los sinónimos con los que encontramos a Mercurius vivus son Mercurio soluble de Hahnemann. Hydrargirum oxidulatum nigrum ammoniatum, Dimercurosammonium nitrate. Oxido negro de Mercurio (Uribe, Farmacopea Mexicana). Otros sinónimos, Mercurio vivo. Mercurio metálico. Azogue. Plata viva Hg (Mendiola, 1947). La preparación homeopática de este mineral es por medio de la regla 7 de preparación homeopática: Regla 7 Trituración de sustancias sólidas.- Las trituraciones se obtienen por divisiones sucesivas de la sustancia base incorporando lactosa como vehículo. Colocar en un mortero, de preferencia mecánico y otra máquina similar, una parte de la sustancia por dinamizar, finamente pulverizada y noventa y nueve partes de lactosa. Tritura por espacio de una hora y media o hasta obtener la fineza y homogeneidad requeridas. La trituración obtenida constituye la trituración 1C (Farmacopea, SEP,). 1.5. Bacteriología 26 El cultivo y aislamiento de Streptococcus pyogenes deberá de realizarse en medios con pH entre 7.0-7.4 con sangre de carnero y CO2 entre 5%y 10%. No se debe descartar la existencia de especies exigentes que requieren de nutrientes y condiciones atmosféricas más estrictas CO2 más N2 entre 85-90%. La temperatura óptima es de 35-37ºC. La inmunofluorescencia se hace a partir de un cultivo en caldo Todd Hewitt o caldo cerebro corazón (BHI), incubando a 37ºC durante 4 horas (Cona, 2002). Existen dos técnicas o métodos por los que se puede realizar ese estudio son el Método de difusión y el Método de dilución (K. Bosio, C. Avanzini, A. D’Avolio, O. Ozino and D. Savoila, 2000). Método de dilución El método de dilución se lleva acabo mezclando (el momento de la preparación del medio de cultivo que contenga 5% sangre de carnero) el medicamento (a estudiar o experimentar) para posteriormente formar las placas en las que se hará la siembra de bacteria en estudio, posteriormente se incuba a 37°C, de 24 a 48 horas. En una atmósfera de CO2 al 5%, para posteriormente realizar la medición de halo de inhibición (de haberlo), recolección de datos, análisis estadísticos de los datos arrojados y reporte de resultados. 27 Método de difusión Este método se realiza mediante la colocación de sensodiscos impregnados con el medicamento de estudio a diferente sobre placas de medio de cultivo base en sangre ya sembrados con la bacteria. Al igual que con el método de dilución se incubarán a 37°C, de 24 a 48 horas. En una atmósfera al 5% de CO2, también se realizarán mediciones de la posible inhibición, recolección de datos, análisis estadísticos de los datos arrojados y reporte de resultados. McFarland Standard es una serie de patrones de turbidez directa que permite realizar una estimulación de la densidad de las sustancias microbianas. Estos patrones están designados por el número de los tubos de la escala descrita por McFarland. El principio de esta prueba es la comparación de la densidad de la suspensión microbiana con una ampolla de turbidez conocida y que tiene el mismo diámetro. Técnica: • Tomar el patrón elegido como referencia • Preparar una suspensión bacteriana en una ampolla del mismo diámetro (homogenizar bien) • Agitar lentamente la ampolla • Comparar la turbidez colocando dos ampollas delante de un fondo negro o un espectrofotómetro 28 • Si es necesario ajustar la suspensión bacteriana, agitar de nuevo el patrón antes de proceder a una nueva comparación. • La interpretación de dichas equivalencias se hace por medio de la siguiente tabla: Densidad óptica para espectrofotometría Patrón Concentración Bacteriana (1) X 10²/Ml Densidad Optica Teórica (2) A 550 Nm 0.5 150 0.125 1 300 0.25 2 600 0.50 3 900 0.75 4 1200 1.00 5 1500 1.25 Tabla 2 • La concentración bacteriana varía con el tamaño de los microorganismos. Las cifras indicadas representan una media variable para las bacterias • Los valores corresponden a las densidades ópticas de las suspensiones bacterianas La determinación de la susceptibilidad de los microorganismos in vitro, debe realizarse con métodos estandarizados de laboratorio y aprobados en estudios colaborativos, como el de Kirby-Bauer que quedó asentado en los documentos de la NCCLS M2-T4 de 1988 y M-2 A-5 de 1994. Los métodos incluidos en el documento M100-S9 de 1999 son los que se emplean actualmente como patrones de referencia (Giono, 2003). 29 El Método de Kirby-Bauer determina el crecimiento rápido de bacterias utilizando discos de papel filtro y practicar la determinación de beta lactamasa. El fundamento de la prueba de susceptibilidad de Kirby-Bauer es la utilización de discos de papel filtro con diferentes concentraciones del antimicrobiano, de esta manera se obtienen halos que corresponden a la zona de inhibición cuyos diámetros se miden en mm y son proporcionales a la concentración inhibitoria mínima (CMI) (Giono, 2003). Si se grafica el diámetro de la zona de inhibición, contra el logaritmo de la CMI, se obtiene casi siempre una recta que constituye una línea de regresión que puede ser calculada matemáticamente (Figura 12). R= Resistencia I= Susceptibilidad Intermedia S= Susceptibilidad Figura 12 Grafica para medir inhibición de CIM 30 La interpretación de los términos sensible, intermedio y resistente, se obtiene de la línea de regresión cuya pendiente depende de cada antibiótico y varía para cada grupo de microorganismos. 1.6. Evidencia científica de sustancias naturales sobre Streptococcus Pyogenes Existe evidencia científica del efecto antibacteriano de sustancias o principios naturales, en forma particular aceites esenciales derivados de plantas (Larrono et al. 1995; Nelson 1997; Cosentino et al 1999; Mangena y Muyima 1999) y propóleos, sustancia resinosa natural o cérea recogida por las abejas a partir de exudados y secreciones de árboles (Marcucci 1995, Cheng y Wong 1996; Park y Ikegaki 1998); como ejemplo de este ultimo mencionare la información publicada en el artículo “In Vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes” donde se demostró la inhibición de crecimiento in vitro de Streptpcoccus pyogenes utilizando 2 extractos de propóleos tomados de dos zonas diferentes de Piamonte al noroeste de Italia. En este estudio recopilaron información de la composición de propóleos y propiedades antimicrobianas, en donde por lo general se encuentra compuesto, el 50% resina y bálsamo vegetal, el 30% cera, 10% más de aceites aromáticos esenciales, 5% de polen y 5% de otras sustanciasen las que se incluye desechos orgánicos. Las propiedades antimicrobianas de esta mezcla de sustancias naturales se le atribuye a los flavonoles pinocembrin, flavonoides galangin y al acido cafeico fenil éster, con un probable mecanismo de acción de inhibición de la ARN-polimerasa bacteriana. 31 Los objetivos de dicho estudio fueron la comprobación del efecto antibacteriano de extractos de propóleos contra Streptococcus pyogenes y la determinación de la forma más eficaz para lograrlo, las técnicas que se utilizaron son el Método de dilución y el Método le difusión. Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de los dos propóleos se utilizaron estas dos técnicas. En el método de dilución se realizo en Agar TH y diluciones de serie doble (de 1:2 a 1:8192), de cada extracto se añadieron en el mismo volumen del medio fundido. Como control se utilizo placas con el medio y etanol. Después del enfriado y el secado de las placas fueron inoculadas con Streptococcus pyogenes (10 ml de caldo a O.D. 660=0.5). Las placas se incubaron a 37ºC en 5% de CO2 por 48 horas. La CMI es la concentración más baja de propóleos que inhibe el crecimiento bacteriano con visibles halos. La CMB representa la concentración donde el 99.9% o más del inoculo inicial muere. Todos los ensayos los realizaron tres veces y se determinaron los valores de CMI y de CMB. Mientras que por el método de difusión se prepararon placas de 9 mm de diámetro, con una capa base (6 ml) de agar TH fundido y una capa (15 ml) de medio inoculado de cultivo de microorganismo conteniendo 108 cfu ml-1. Después de secado, discos de 6 mm de diámetro fueron remojados con 25 µl del extracto a diferentes diluciones de propoleo y se colocaron sobre el agar. Se incubo durante 1 día a 37ºC en atmosfera al 5% CO2, la zona de inhibición se midieron. El ensayo se realizo por triplicado. 32 En donde sus resultados fueron la comprobación de actividad antibacteriana de extractos propóleos a concentraciones baja. La inhibición del crecimiento se observo aproximadamente 50% de las cepas por soluciones que contengan 58.5 µg ml-1 de propóleos, lo que corresponde a 1:2048 dilución del extracto etanólico al 12%. Todas las cepas murieron con 234 µg ml-1 de propóleos, correspondiente a 0.023% de material sólido resinoso. Estudios controlados demostraron que la cantidad residual de los extractos en etanol inhibió el crecimiento bacteriano solo 1:4 de dilución. Además demostraron que el método de difusión es el que arroja resultados más claros y de mejor comprobación. 2 Metodología 2.1. Planteamiento del problema En homeopatía se trata al paciente buscando cumplir con los principios que la rigen, los cuales son fundamentales para la administración del medicamento, dos de ellos son la individualidad morbosa y la ley de semejantes. Identificar si los remedios homeopáticos en bajas potencias son capaces de inhibir el crecimiento de bacterias causantes de enfermedad y así encaminarnos a una posible explicación de su mecanismo de acción. 2.2. Justificación Tomando como referencia la frecuencia de Faringoamigdalitis bacteriana causada por S. pyogenes y ver la presencia de resistencia al tratamiento 33 antimicrobiano así como a los altos costos de los fármacos, es necesario el conocimiento de otros tratamientos adecuados tanto en eficacia como en costo accesible. No existen estudios sistemáticos sobre el mecanismo de acción de los remedios homeopáticos. 2.3. Hipótesis Considerando que Streptococcus pyogenes es una bacteria frecuente en la faringitis sería importante identificar si el medicamento Mercurius vivus a diferentes potencias es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de dicha bacteria. Mercurius vivus a diferentes potencias homeopáticas es incapaz de causar inhibición en el crecimiento in vitro de S. pyogenes debido a que los medicamentos homeopáticos actúan en el organismo de forma diferente, es decir de forma dinámica. 2.4. Objetivos 2.4.1. Objetivo General Determinar la acción de diluciones homeopáticas sobre el crecimiento de Streptococcus pyogenes in vitro. 34 2.4.2. Objetivos Particulares a) Valorar grado de inhibición del crecimiento bacteriano en presencia de sensidiscos impregnados con 10 µl de medicamento Mercurius vivus. b) Aplicar sensidiscos con y sin alcohol homeopático como control negativo. c) Aplicar sensidiscos con antibióticos (control positivo) para la observación de halos de inhibición. 2.5. Tipo de Investigación El estudio a realizar será de tipo longitudinal, prospectivo y experimental. 2.6. Delimitación de la muestra 2.6.1. Criterios de inclusión • Cepa Streptococcus pyogenes • Medios de cultivo sembrados con Streptococcus pyogenes 2.6.2. Criterios de exclusión • Streptococcus β hemolítico diferente a S. pyogenes 2.6.3. Criterios de eliminación • Medios de cultivo contaminados o que tengan fisuras • Medios de cultivo que se hayan sobrepasado el tiempo y temperatura de incubación 35 2.6.4. Tamaño de la muestra Se realizaron estudios por duplicado, es decir dos cajas sembradas con cada dinamo-dilución y 2 por cada control (16 cultivos in vitro de Streptococcus pyogenes), utilizando como control positivo sensidisco con antimicrobianos y dos controles negativos uno con agua bidestilada y otro alcohol homeopático 87º. 2.7. Material y método Los presentes experimentos se realizaron en el Laboratorio de Microbiología, en la Unidad de Posgrado de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía; ubicada en Guillermo Massieu Helguera # 239. Fraccionamiento “La Escalera”, Ticomán, C.P. 07320 México, D.F., y en los laboratorios de análisis clínicos de la misma escuela. a) Verificar medios de cultivo para efectuar siembra homogénea de Streptococcus pyogenes. b) Preparar sensidiscos impregnados con Mercurius vivus a diferentes dinamo- diluciones en los cultivos de Streptococcus pyogenes. c) Preparar sensidiscos impregnados con alcohol homeopático a los cultivos de Streptococcus pyogenes, como controles positivos. d) Destinar otros sensIdiscos secos estériles como controles negativos. 36 2.7.1. Recursos humanos El Maestro Javier Castillo del laboratorio Clínico de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía, se encargó de proporcionar el apoyo necesario tanto en el material requerido como con su valiosa experiencia para la realización de medios de cultivo Agar caldo de Soya Tripticasa, El C.D. José M. Delgado y co-asesor del presente experimento proporcionó cajas Petri estériles para la realización de medios de cultivo así como la preparación y adquisición del alcohol homeopático utilizado. 2.7.2. Recursos físicos El laboratorio apoyó con instrumentos necesarios para realizar la siembra de los cultivos, como son estufa de cultivo, cajas de Petri estériles, mechero, autoclave, asas para cultivo, hisopos, guantes, etc. Los medios de cultivo requeridos fueron adquiridos en los laboratorios DIBICO, S.A. DE C.V., ubicado en Oriente 182 No. 131 Lote-1, Colonia Santa Cruz Aviación, México D.F., C.P.15540. Las características del medio de cultivo (Figuras 13, 14 y 15) se observan en el Anexo 1. Figura 13 Muller Hinton preparado en placas Figura 14 Caldo de soya Tripticaseina 37 Figura 15 Frasco de sangre de cordero Figura 16 Mercurius vivus El medicamento homeopático en solución Mercurius vivus 6c, 12c, 30c y 200c (Figura 16), se obtuvo en Propulsora de Homeopatía, S.A. de C.V., ubicada en Mirto 26, Colonia Santa María la Ribera, Delegación Cuauhtémoc C.P. 06400, México, D.F., siendo la característica principal que las 4 potencias provienen de una misma línea con código 190907. La cepa bacteriológica Streptococcus pyogenes ATCC 19615 con la que setrabaja fue adquirida en el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, INDRE. Prolongación Carpio 470, Colonia Santo Tomás, Delegación Miguel Hidalgo 11340. México, D.F., México. El certificado de dicha cepa se encuentra en el Anexo 2. 2.8. Método 1. Con un asa se tomaron cuatro o cinco colonias del mismo tipo morfológico y se inoculó cada una en tubo de caldo Todd Hewitt. Se incubaron 24 horas hasta que la turbidez fue la indicada. 2. Se incubó el caldo Todd Hewitt a 37ºC hasta que apareció una leve opacidad (dos a cinco horas) (Figura 17). 38 Figura 17 Inoculación de S. pyogenes Figura 18 Esterilización de sensidiscos ATTC 19615 en medio cultivo Todd Hewitt de papel filtro 3. Se esterilizó papel filtro cortado en forma de sensidiscos dentro de una caja Petri y pinzas de disección para su manipulación (Figura 18). 4. Se impregnaron sensidiscos con el medicamento Mercurius vivus a las potencias de 6c, 12c, 30c y 200c. Así como sensidiscos control impregnados con agua destilada y alcohol homeopático. Esperamos que el alcohol homeopático se evaporara. Cada sensidisco se impregnó con 10 microlitros de medicamento (Figura 19, 20 y 21). Figura 19 Ordenamiento de sensidiscos 39 Figura 20 Impregnación de sensidiscos Figura 21 Sensidiscos impregnados con medicamento homeopático 5. Preparó el inoculo. Ajustando la turbidez del caldo Todd Hewitt con solución salina estéril a McF 0,5 con luz adecuada según la tabla de patrones de McFarland (Figura 22, 23 y 24). Densidad óptica Patrón Concentración bacteriana por 10/ml Densidad óptica teórica a 550 nm 0.5 150 0.125 1 300 0.25 2 600 0.50 3 900 0.75 4 1200 1.00 5 1500 1.25 Tabla 3 Figura 22 Celdas del Figura 23 Espectrofotómetro Figura 24 Medición de Espectrofotómetro Longitud de Onda 40 6. Se preparó el medio de cultivo Agar caldo de Soya Tripticasa (medio enriquecido) más sangre de carnero. Se pesaron 10 gr del medio en polvo (para preparar 250 ml) y se requirió de 12.5 ml de sangre de carnero. Se mezclaron los 10 gramos de Agar caldo de Soya Tripticasa en 250 ml de agua embotellada, se llevó a la autoclave por 15 min a 15 libras a 121 ºC, trascurrido el tiempo se deja enfriar de 15 a 20 min, se le agrega la sangre de carnero y se vierte el medio a cajas Petri estériles y se deja refrigerar de 1 a 2 horas antes de utilizarlos. Se le realiza pruebas de esterilidad llevándolo a la incubadora por 24 horas (Figura 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y 33). Figura 25 Pesa medio en polvo Figura 26 Agregación de medio en 250 ml de agua Figura 27 Mezcla de agua con medio Figura 28 Esterilización de preparación 41 Figura 29 Enfriado de mezcla por 20 min Figura 30 Agrega sangre de carnero Figura 31 Mezcla de medio Figura 32 Llenado de cajas Figura 33 Medio preparado con sangre de carnero Petri en cajas Petri 7. El caldo de cultivo se registró con la absorbencia de 0.125 a una longitud de onda de 550 nm y así se procedió a la inoculación de placas que contienen Agar caldo de soya Tripticosa. Esta inoculación se realizó dentro de 15 min de hecho el ajuste de la turbidez. • Se humedeció el hisopo en la suspensión bacteriana quitándole el exceso del caldo presionando y girando sobre la pared interna del tubo por arriba del nivel del caldo (Figura 34). 42 Figura 34 Inoculación de Streptococcus pyogenes de Todd Hewitt • La siembra se efectuó en tres direcciones inoculando toda la placa, dando giros de 60° para obtener un sembrado uniforme sobre toda la superficie de la placa (Figura 35). Figura 35 Inoculación de placas 8. Se colocaron sensidiscos desecados. Se ubicaron en una cantidad de 4 a 12 unidades en placas de 150 mm y 5 unidades en placas de 100 mm, con una separación de 24 mm (del centro de un sensidisco al otro más cercano), esto se recomienda en los estudios bacteriológicos. En nuestro experimento sólo se aplicaron cuatro sensidiscos por placa ya que los cuatro se encontraban impregnados con la misma potencia medicamentosa. La difusión del fármaco es instantánea por lo cual no se 43 deben reubicar los sensidiscos después de haberlos depositado en la superficie del Agar (figura 36 y 37). Figura 36 y 37 Colocación de sensidiscos impregnados 9. Se invirtieron las placas e incubaron a 37 ºC durante 8 a 18 horas. 10. Se observaron las placas, y se procedió a realizar medición de los halos de inhibición en mm con regla o plantilla, observando el fondo de la caja en caso de que aparecieran (figura 38). Figura 38 Crecimiento bacteriano sin inhibición 44 2.9. Recopilación de Datos Los datos se recolectaron después de 18 horas de la incubación, midiendo los halos de inhibición de crecimiento. Los cuales se anotaron en la bitácora para su posterior análisis. De acuerdo con los resultados obtenidos se procedió a un análisis estadístico para valorar la significancia de estos mismos. 2.10. Resultados Se observó un crecimiento bacteriano uniforme en todas las placas sembradas con clara hemolisis de la bacteria Streptococcus pyogenes, en ninguna de ellas se observaron halos de inhibición con sensidisco impregnado a diferentes dinamo-diluciones (figura 39). 45 Figura 39 Crecimiento bacteriano de Streptococcus pyogenes sin inhibición El control positivo con sensidisco de antibióticos fue en el que se obtuvo halo de inhibición de 2.8 cm con ceftriaxona (figura 40). Figura 40 Control positivo antibiograma Resultados de las 8 muestras usadas en los experimentos Medicamento Inhibición Bacteriana en MM Sensidiscos 1 2 3 4 5 6 7 8 Mercurius vivus 6c 0 0 0 0 0 0 0 0 Mercurius vivus 12c 0 0 0 0 0 0 0 0 Mercurius vivus 30c 0 0 0 0 0 0 0 0 Mercurius vivus 200c 0 0 0 0 0 0 0 0 Alcohol homeopático 0 0 0 0 0 0 0 0 Agua destilada 0 0 0 0 0 0 0 0 Antibiótico (ampicilina, ceftriaxona) 28 28 0 0 0 0 0 0 Tabla 4 46 3.0 Discusión En las Cajas Petri con los sensidiscos impregnados con el medicamento Mercurius vivus en sus diferentes potencias homeopáticas (6c, 12c, 30c y 200c) no se observó inhibición del crecimiento bacteriano. Las cajas que tenían los sensidiscos (alcohol homeopático y agua que con los medicamentos homeopáticos, es decir, no registraron inhibición de crecimiento bacteriano, algo que se esperaba). Se pudo comprobar una de las hipótesis de este experimento ya que en ella se esperaba que no hubiese inhibición de crecimiento bacteriano con los medicamentos homeopáticos debido a su actuar dinámico. Con los resultados obtenidos se pudo comprobar la hipótesis de este estudio para hacer hincapié sobre la forma de actuar que tienen los medicamentos homeopáticos, para apoyar un poco más esta aseveración hago presente de forma textual el parágrafo 16 (§ 16) del Organon de la Medicina: “Nuestra fuerza vital, siendo un poder dinámico, no puede ser atacada ni afectada por influencias nocivas sobre el organismo sano y producidas por fuerzas externas hostiles que perturban el armonioso funcionamiento de la vida, más que de un modo inmaterial (dinámico); y de igual manera tales perturbaciones mórbidas (enfermedades), no pueden ser eliminadas del organismo por el médico si no es recurriendo a los poderes recíprocos de índole espiritual (virtual y dinámico) de las medicinas que correspondan ser administradas, cuyos poderes actúan sobre nuestra fuerza vital de 47 índole espiritual que los percibe por medio de la facultad senciente de los nervios distribuidos por todo el organismo; de modo que sólo debido a su acción dinámica sobre la fuerza vital que los remedios son capaces de restablecer la salud yla armonía vital y eso por cierto que se logra una vez que los cambios en la salud del paciente, discernibles por medio de nuestros sentidos (la totalidad de los síntomas), hayan revelado la enfermedad al médico investigador y cabal observador, tan íntegramente cuanto sea necesario para que él llegue a ser capaz de curarla.” 4. Conclusiones Los medicamentos homeopáticos tienen un mecanismo de acción que hasta el momento es conocido como una acción dinámica o energética, que actúa sobre la fuerza vital de los seres vivos, es decir, aquella energía que da a la materia (organismo) la capacidad de sentir y ejecutar todas las funciones vitales y posibilidad de ser únicos, así como también nos da una forma característica de enfermar. Por lo anterior no es lógico pensar que sustancias que actúan energéticamente tenga una función mecánica en este caso bacteriostática o bactericida, motivo por el cual no es posible observar un efecto físico como la ciencia moderna esperaría, sin embargo quedan mucho por investigar. 5. Recomendaciones y sugerencias para trabajo futuro Conforme a los resultados obtenidos en este estudio, sería favorable pensar en la utilización de otras sustancias (no dinamizadas) como tinturas o sustancias 48 madre tratándose de metales, tal vez, buscar si la acción dinámica de los medicamentos homeopáticos tiene algún efecto sobre componentes membranales de ésta u otras bacterias así como de otro tipo de células, e incluso la medición de potencial de acción de membranas, tal vez al ponerlas en contacto con sustancias homeopáticas dinamizadas. 49 50 6. Bibliografía 1. Duerden,B., “Microbiología de Enfermedades Infecciosas” Limusa Noriega Editores. Primera edición, México, D.F., 1993. p.p. 239-242. 2. LaDou, J., “Medicina Laboral y Ambiental” Editorial Manual Moderno. Segunda edición en español de la segunda edición en inglés. México, D.F., p.p.407-408, 450-453. 3. Lathud. “Materia Médica Homeopática” Editorial Albatros. Primera edición, tercera reimpresión. Buenos Aires, Argentina, 2003 p.p. 551-556. 4. Mendiola Quezada. “Farmacodinamia Homeopática I” Editorial Altres Costa- Amic. Puebla, México. p.p. 77–78. 5. Mercadal, M., Desoille. “Medicina del Trabajo” Editorial Masson. Segunda edición. España, 1993. p.p. 139-143, 251-468. 6. Murray, K., Rosenthal, K. “Microbiología Medica”. Editorial Mosby. Cuarta edición. p.p. 213-230. 7. Secretaría de Salud. “Farmacopea Homeopática de los Estados Unidos Mexicanos”. México 1998. p.p. 14, 168. 8. Uribe, Jiménez “Farmacopea Homeopática”. México D.F. 1990. Segunda edición. Publishers Pvt. Ltd. p.p. 106. 9. Harrison. Principios de Medicina Interna. Madrid 1998. 14a edición. Mc Graw Hill. Tomo I. p.p 1011-1013. 10. Johnson, T. “Where Does Homeopathy Fit in Pharmacy Practice?” American Journal of Pharmaceutical Education February 15 2007; 71 (1) Article 07. 11. Cona, E. “Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad mediante test de difusión en Agar” Rev Chil Infect (2002); 19 (Supl. 2): S 77-81. 12. Vijnosky. “Tratado de Materia Medica Homeopática”. Buenos Aires. 1978. Tomo 2. p.p. 372-375. 13. Strange, Ahnrens, Schafermeyer, Toepper. “Manual de Medicina de Urgencias Pediátricas”. México. 2001. McGraw-Hill. p.p. 632-634. 51 14. Tierney, MacPhee, Papadakis. “Diagnóstico Clínico y Tratamiento 2004” Editorial. Manual Moderno. Edición 39. México, D.F., p.p. 1335, 1664. 15. Fracklam, R. “Manual de Procedimientos. Aislamiento e Identificación de Estreptococos”. Public Health Service. Atlanta, Georgia. p.p. 2-30. 16. Merck. Sección de Otorrinolaringología. Manual Merck. Edición 10. Edición Centenario. Sección 7 Faringe, Capitulo 87. 17. Giono, S. “Capitulo 39. Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos. Método de Bauer-Kirby”. Bacteriología Médica Diagnostica. IPN. Ediciones Cuellar, Segunda edición, México 2003. p.p. 311– 321. 18. Vannier, L. “Terapéutica Homeopática” Editorial Porrúa. 12a edición. México D.F., 2004. p.p. 57-58. 19. Escamilla, “Capitulo 35. Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Aerocuccus y Gemelia”. Bacteriología Médica Diagnostica. IPN. Ediciones Cuellar, Segunda edición, México, 2003. p.p. 279–285. 20. Diccionario Médico. 3ª edición. 1990. Ediciones Salvat Científicas y Técnicas. S.A. 21. Diccionario de Medicina. Océano Mosby con CD-ROM. 22. In vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes. K. Bosio 1, C. Avanzini 1, A. D’Avolio 1, O. Ozino 2 and D. Savoila 1. 1Departamento of Clinical and Biological Sciences and2 di.VA.P.R.A, University of Torino, Italy. 2000 The Society for Microbiology. Recibido 7 March 2000, revisado 16 May 2000 y aceptado 23 Mayo 2000.