Vista previa del material en texto
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS “Evaluación de la actividad farmacológica de Swietenia humilis Zucc en un modelo de diabetes en ratón” PROYECTO DE INVESTIGACIÓN (TESIS) QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL P R E S E N T A: Jessica Guadalupe Lobato Torres Asesor: Dr. Tomás Alejandro Fregoso Aguilar (Depto. de Fisiología, ENCB) Co-Asesor: Dr. José Antonio Morales González (Escuela Superior de Medicina) Ciudad de México Octubre 2016 JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES I INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL El presente trabajo se desarrolló en el Instituto Politécnico Nacional, en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Unidad Zacatenco Wilfrido Massieu s/n, Unidad Profesional Adolfo López Mateos, Gustavo A. Madero, 07700 Ciudad de México, en el laboratorio de Hormonas y Conducta, del departamento de Fisiología, bajo la supervisión del asesor Dr. Tomás Alejandro Fregoso Aguilar y coasesor Dr. José Antonio Morales González con el financiamiento parcial de proyecto SIP (20150595) de la Secretaria de Investigación y Posgrado del IPN. JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES II INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Agradecimientos Gracias Dios por ésta vida, por el sin fin de bendiciones y por el camino que me has dado. Espero me brindes y llenes de sabiduría y fuerzas para todas las siguientes pruebas, que estoy segura, me faltan por vivir. Gracias a mis padres, por ser mi inspiración para seguir en la batalla, por su apoyo infinito, por su comprensión y su amor día tras día. Gracias a mis hermanos, por ser un ejemplo a seguir ante todas las obligaciones y responsabilidades. Gracias a mi asesor Dr. Tomás Fregoso por ser mi guía, por ser tan paciente y dedicado en el desarrollo de este proyecto. Por permitirme sentir amor a mi trabajo, y por permitirme tener su laboratorio, el laboratorio de hormonas y comportamiento, como mi segunda casa. Gracias a las asesorías y ayuda de mi coasesor Dr. José Morales, por permitirme integrar los conocimientos de la Escuela Superior de Medicina. Gracias a la Dr. Estela Meléndez, al Dr. Jorge Mendoza, y al Dr. Ricardo Pastén, por su grata presencia como sinodales, y su gran ayuda en las correcciones de esta tesis. Gracias la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, por ser mi alma mater. En el 2011, tan sólo necesitaba una oportunidad para demostrar todo lo que soy capaz de lograr, y esa pequeña oportunidad me la brindaste. Tras cinco años de carrera, hoy puedo portar con gran orgullo tu escudo, y decir que provengo de la gran Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES III INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Su ayuda ha sido fundamental, ha estado conmigo incluso en los momentos más difíciles. Este proyecto no fue fácil, pero estuvo motivándome y ayudándome hasta donde sus alcances lo permitían. Muchas Gracias. Dedicado a las personas que siempre estuvieron conmigo, a las que ya se fueron, y a las que están por venir… Fuiste mi motivación más grande para concluir con éxito esta tesis. Con amor, Jessica ♡ “Los sueños parecen al principio imposibles, luego improbables, y luego, cuando nos comprometemos, se vuelven inevitables” – Mahatma Gandhi. JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES IV INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES V INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Parte del presente trabajo fue presentado en la 12va Reunión Internacional de Investigación en Productos Naturales en Xalapa, Veracruz del 18 al 20 de Mayo del 2016. 5 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES ÍNDICE GENERAL Índice……………………………………………………………………………………………...5 Índice de figuras…………………………………………………………………………………7 Índice de tablas…………………………………………………………………………………..8 Abreviaturas……………………………………………………………………………………...9 Resumen………………………………………………………………………………………..10 Introducción……………………………………………………………………………………..11 Regulación de la secreción de insulina de las células β del páncreas y su acción……………………………………………………………………………………………13 Fisiopatología de la diabetes mellitus…………………………………..…..……………14 Diabetes tipo 1…………………………………………………..………………………….15 Diabetes tipo 2………………………………………………………..…………………….16 Diabetes gestacional……………………………………………..………………………..16 Estrés oxidativo y radicales libres………………………………………..………………17 Actividad antioxidante…………………………………….……………………………….17 Determinación de la actividad antioxidante por la técnica in vitro del DPPH…..……17 Modelo químico de diabetes………………………..…………………………………….18 Mecanismo de acción de la estreptozotocina………………………….……………….18 Semillas de Swietenia humilis Zucc………………………………………….…………..20 Justificación……………………………………………………………………………………..21 Hipótesis………………………………………………………………………………………...21 Objetivos………………………………………………………………………………………...22 Objetivo general…………………………………………………………………………..22 Objetivos particulares…………………………………………………………………….22 Metodología…………………………………………………………………………………….23 Extracción metanólica de la semilla de Swietenia humilis Zucc………………….....23 Análisis fitoquímico cualitativo…………………………………………………………..23 6 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Espectroscopia FT IR y RMN ¹H…………………………………………………………..24 Actividad antioxidante de Swietenia humilis Zucc……………………………………….24 Curva de calibración………………………………………………………………….24 Curva de absorbancia del extracto metanólico de Swietenia humilis Zucc……24 Actividad genoprotectora de Swietenia humilis Zucc………....…………………………25 Evaluación farmacológica de la semilla de Swietenia humilis Zucc…………………….26 Actividad hipolipemiante y efecto sobre el peso corporal………………………………..26 Actividad hipoglucemiante…………………………………………………………………...26 Modelo de diabetes con estreptozotocina…………………………………………26 Medición de glucosa en sangre……………………………………………………..27 Preparación de la suspensión con el extracto…………………………………….27 Grupos experimentales………………………………………………………………27 Análisis de parámetros metabólicos en sangre……………………………………………28 Análisis estadístico……………………………………………………………………………28 Resultados…………………………………………………………………………………………29 Fitoquímica cualitativa………………………………………………………………………29 Espectroscopia FT IR y RMN ¹H…………………………………………………………..29 Actividad antioxidante……………………………………………………………………….31 Actividad genoprotectora…………………………………………………………………...31 Actividad hipoglucemiante………………………………………………………………….32 Actividad hipolipemiante y registro de peso corporal……………………………………33 Niveles séricos de glucosa, triglicéridos, albúmina, colesterol y creatinina…………. 34 Discusión………………………………………………………………………………………….35 Conclusiones……………………………………………………………………………………..40 Bibliografía…………………………………………………………….………………………….41 Anexos…………………………………………………………………………………………….45 Anexo 1………………………………………………………………………………………45 Anexo 2………………………………………………………………………………………47 7 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Índice de figuras Figura 1.- Estructura química del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH)……………………………………………18 Figura 2.- Estructura química de la estreptozotocina (STZ)……………………………………………………... 18 Figura 3.- Fruto y semillas provenientes del árbol del Zopilacahuite…………………………………………… 20 Figura 4.- Diagrama general de la metodología experimental……………………………………………………23 Figura 5.- Espectro de FT IR del extracto metanólico de la semilla de Swietenia humilis Zucc………………..30 Figura 6.- Espectro de RMN H del extracto metanólico de la semilla de Swietenia humilis Zucc……………..30 Figura 7.- Gráfica de Actividad Antioxidante a diferentes concentraciones contra porcentaje de Inhibición del radical de DDPH……………………………………………………………………………………………………... . 31 Figura 8.- Gráfica de la actividad genoprotectora ante la administración de antraceno………………………..31 Figura 9.- Niveles de glucosa sanguínea de 5 tratamientos durante 6 semanas……………………………….32 Figura 10.- Niveles de glucosasanguínea de 4 tratamientos durante 6 semanas……………………...……… 33 Figura 11. - Variación de peso corporal de 5 tratamientos durante 6 semanas…………………………………33 8 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Índice de tablas Principales hormonas implicadas en la regulación de los niveles de glucosa en sangre………………….12 Ejemplos de plantas con propiedades antidiabéticas confirmadas…………………………………………..19 Metabolitos secundarios encontrados…………………………………………………………………...………29 Niveles séricos de glucosa, triglicéridos, albúmina, colesterol y creatinina…………………………………34 Reactivos de los kits enzimáticos SPINREACT………………………………………………………………...47 9 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Abreviaturas STZ Estreptozotocina GLUT 4 Transportador de Glucosa tipo 4 DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidracilo ERO’s Especies Reactivas de Oxígeno UV Ultravioleta RMN Resonancia Magnética Nuclear RMN 1H Resonancia Magnética de Hidrógeno 1 RMN 13H Resonancia Magnética de Carbono 13 10 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES RESUMEN La diabetes mellitus es una gama de trastornos metabólicos, que originan un nivel alto de glucosa en sangre que pueden ocasionar síntomas agudos y anomalías metabólicas. Con la finalidad de encontrar un tratamiento natural contra la diabetes, se realizó el aporte de datos científicos de la semilla Swietenia humilis Zucc por medio de estudios químicos (fitoquímica cualitativa, espectroscopía y actividad antioxidante por el método in vitro del DPPH) y farmacológicos (actividad hipoglucemiante, hipolipemiante, y genoprotectora). La semilla Zopilote o Zopilacahuite como es conocida, es utilizada de manera empírica para el tratamiento de la diabetes en el estado de Morelos, Guerrero, Sinaloa y Chiapas. Se evaluó la actividad farmacológica mediante la creación de 8 grupos de ratones machos NIH (n=6- 8, 25-30g) a los cuales se les administró el extracto: I) Normoglucémicos (H2O destilada, vía ig); II) Normoglucémicos+ S. humilis Zucc (750mg/Kg, vía ig); III) Diabéticos, tratados con estreptozotocina (120mg/Kg, vía ip); IV) Diabéticos + Acarbosa (300mg/kg, vía ig); V) Diabéticos + Acarbosa (300mg/kg, vía ig) + S. humilis Zucc (750mg/Kg, vía ig); VI, VII, y VIII) Diabéticos + S. humilis Zucc (500 mg/kg, 750mg/Kg, 1000mg/kg, vía ig). Los extractos fueron administrados cada dos días por un periodo de seis semanas registrando los niveles de glucosa en sangre periférica y el peso corporal, así como la toma de plasma de la sangre periférica al finalizar el tratamiento para el análisis clínico de los niveles de glucosa, colesterol, triglicéridos, creatinina y albúmina por espectroscopia. La semilla S. humilis Zucc presentó alcaloides, azúcares reductores, saponinas, flavonoides, cumarinas y quinonas y exhibió baja actividad antioxidante, pero buena actividad genoprotectora; así como actividad antihiperglicemiante a partir de la primera semana con 500mg/Kg y de la tercera semana con 750 mg/kg, y tuvo efecto hipoglucemiante a partir de la segunda semana con 1000mg/Kg y efecto sinérgico con la administración de una dosis media (750 mg/kg) y un fármaco de referencia (acarbosa 300 mg/kg); con todas las dosis el efecto protector ante la disminución de peso se presentó durante todo el tratamiento. El extracto disminuyó los niveles séricos de glucosa, triglicéridos y creatinina. 11 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES INTRODUCCIÓN México ocupa actualmente el octavo lugar mundial en la prevalencia de diabetes. En cuanto a mortalidad por diabetes, México ocupa el sexto lugar mundial y el tercer lugar en el continente americano. Desde el 2000, la diabetes es la principal causa de muerte en México, ocasionando el 17.2% de las muertes, a cada hora se diagnostican 38 nuevos casos de diabetes y cada dos horas mueren 5 personas a causa de complicaciones originadas por la diabetes. Las complicaciones derivadas por la diabetes son las renales, daño en el sistema nervioso, las enfermedades de la vista que terminan en ceguera y el padecimiento de pie diabético que debido al daño es la primera causal para amputación de miembros. Ningún país escapa a la epidemia de diabetes, y en los estados y territorios de todo el mundo son los pobres y los desfavorecidos quienes más sufren (FID, 2014). La diabetes mellitus consiste en una gama de trastornos metabólicos comunes, que se originan de diversos mecanismos patógenos y todos tienen por consecuencia la hiperglucemia, es decir, un nivel alto de glucosa en sangre, que puede ocasionar síntomas agudos y anomalías metabólicas (FID, 2014). Las biomoléculas como grasas, proteínas e hidratos de carbono provenientes de los nutrientes ingeridos pueden ser utilizados o almacenados, teniendo como uno de los fines proveer de energía al cuerpo humano (Silverthorn, 2009). En el caso de la glucosa sanguínea, ésta se mantiene en un intervalo estrecho, conservando una homeostasis de la glucosa, realizando con esto una función de gran importancia con múltiples niveles de comunicación entre órganos a través de hormonas (insulina), nervios y sustratos. La normatividad mexicana indica realizar pruebas clínicas para recabar datos con la finalidad del diagnóstico de la diabetes, que se describen a continuación: presencia de síntomas clásicos y una glucemia plasmática casual > 200 mg/dl; glucemia plasmática en ayuno > 126 mg/dl; o bien glucemia >200 mg/dl a las dos hrs. después de una carga oral de 75 g de glucosa anhidra disuelta en agua, sin olvidar que en la prueba de ayuno o en la PTOG, o en ausencia de síntomas inequívocos de hiperglucemia, estos criterios se deben confirmar repitiendo la prueba en un día diferente (NOM 015, 2010). La insulina es una hormona producida en el páncreas que permite que la glucosa de los alimentos entre a las células del cuerpo, donde se convierte en la energía necesaria para que funcionen los músculos y tejidos (FID, 2014). El páncreas es una glándula elongada anexa al aparato digestivo, con una función digestiva exocrina y una endócrina basada en los islotes de Langerhans. Contiene tres tipos de células: α (alfa), productoras de glucagón; β (beta), productoras de insulina; δ (delta), productoras de somatostatina (Jácome, 2005). 12 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Las células β pancreáticas ajustan la cantidad de insulina secretada para favorecer la captación de glucosa, principalmente contribuyen a la regulación de las concentraciones de glucosa plasmática; se estimulan desde el momento de la presentación de los alimentos, a lo largo de la absorción de nutrientes y hasta que la glucosa regresa a las cifras de ayuno. Las necesidades de glucosa en ayuno son suministradas principalmente por el hígado. Las reservas de glucógeno hepático proporcionan parte de esta glucosa gracias a la conversión de precursores de gluconeogénesis. La regulación de la glucogenólisis y gluconeogénesis hepáticas depende de la insulina y del glucagón, hormonas secretadas en los islotes pancreáticos (Tabla 1). La insulina inhibe la producción de glucosa en varios niveles mientras que el glucagón mantiene la glucemia al estimular la gluconeogénesis y la glucogenólisis en el hígado. Tabla 1.- Principales hormonas implicadas en la regulación de los niveles de glucosa en sangre. Regulación de la Glucosa Hormona Glándula Estímulo Acción Insulina Páncreas Aumento de la glucosa en la sangre. Ayudar a transportar la glucosa hacia las células; reduce los niveles de glucosa en la sangre. Glucagón Páncreas Disminución de la glucosa en la sangre; esfuerzo debido al ejercicio. Estimula la gluconeogénesis del hígado; aumenta los niveles de glucosa en la sangre. Adrenalina Suprarrenal Esfuerzo debido al ejercicio; disminución de laglucosa en la sangre. Estimula la degradación del glucógeno y la liberación de glucosa por el hígado; aumenta los niveles de glucosa en la sangre. Cortisol Suprarrenal Esfuerzo debido al ejercicio; disminución de la glucosa en la sangre. Estimula la degradación de las proteínas y la gluconeogénesis resultante; aumenta los niveles de glucosa en la sangre. Fuente: Williams, 2002. El papel central de la insulina en el metabolismo de la glucosa es resaltado por el hecho de que todas las formas de diabetes humana tienen una causa básica de alguna anomalía en la secreción o acción de la insulina. El incremento de la concentración de insulina circulante disminuye la glucosa en sangre al inhibir la producción hepática de glucosa y estimular la captación y metabolismo de la misma por el músculo y tejido adiposo. La insulina tiene efectos potentes para disminuir la lipólisis de los adipocitos, principalmente a través de la inhibición de la lipasa 13 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES sensible a hormona e incrementa el almacenamiento de lípidos al favorecer la síntesis de lipoproteína lipasa y la captación de glucosa por los adipocitos, así como también estimula la captación de aminoácidos y la síntesis de proteínas e inhibe la degradación de proteínas en músculo y otros tejidos causando la disminución en las concentraciones circulantes de la mayor parte de los aminoácidos (Powers y D’Alessio, 2012). Regulación de la secreción de insulina de las células β del páncreas y su acción La glucosa es transportada dentro de la célula β a través de un transportador GLUT2, el cual es el transportador principal de glucosa en las células del páncreas. Al interior, la glucosa sufre fosforilación con rapidez por una glucocinasa (GK) dicho paso es el limitante de la velocidad en el metabolismo de la glucosa. La glucosa-6- fosfato producida entra a la vía glucolítica y produce cambios en la relación de NADPH y la proporción ADP/ATP. El incremento de ATP bloquea los conductos de K+ sensibles a ATP, ocasionando despolarización de la membrana celular. Dichos canales son proteínas heteroméricas que consisten en un conducto rectificador de K+ que permite el paso de este ión hacia el interior de la célula, gracias a la interacción con una subunidad denominada proteína Kir6.2, también conocida como receptor de sulfonilureas; las mutaciones en éste conducto son causantes de algunos tipos de diabetes o hipoglucemia neonatales. La despolarización de membrana que ocasiona abertura de los conductos de Ca2+ dependientes de voltaje y el incremento de Ca2+ intracelular, provocará la exocitosis de insulina de las vesículas de almacenamiento (Powers y D’Alessio, 2012). El receptor de insulina se encuentra en el hígado, músculo estriado y en tejido adiposo, y está compuesto por un dímero de sub-unidades α/β unidos por enlaces disulfuro formando una glucoproteína heterotetramérica: Dos subunidades α y dos subunidades β que atraviesan la membrana. La unión de insulina a las subunidades α permite la transfosforilación de una subunidad β por la otra, y la autofosforilación en sitios específicos de la región yuxtamembranosa a la cola intracelular del receptor. Así mismo, el transportador GLUT4 se expresa en los tejidos que responden a la insulina, como músculo estriado y tejido adiposo, los cuales constituyen sitios importantes para la captación de glucosa. El GLUT4 sobresale entre estos transportadores como el más dependiente de los estímulos aislados por insulina o por otros efectores; en estado basal, la mayor parte del transportador GLUT4 se encuentra en el espacio 14 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES intracelular; después de la activación de los receptores de insulina, el transportador GLUT4 se desplaza con rapidez y en abundancia a la membrana plasmática, donde facilita el transporte de glucosa de la circulación hacia el interior de la célula. La señalización de insulina también reduce la endocitosis del transportador GLUT4 al incrementar el tiempo de permanencia de la proteína en la membrana plasmática. Después de la difusión facilitada al interior de las células, siguiendo un gradiente de concentración, la glucosa sufre fosforilación por acción de la glucosa-6-fosfato (G6PD) por una familia de hexocinasas. Al igual que el transportador GLUT4, la hexocinasa II es regulada por la insulina a través de la transcripción. La G-6-P es un sustrato que puede entrar a varias vías. Puede ser isomerizado a G-1-P por acción de la fosfoglucomutasa y más tarde se almacena como glucógeno (la insulina incrementa la actividad de la glucógeno sintasa; la G6PD puede entrar a la vía glucolítica (lo que da origen a la producción de ATP); la G-6-P también puede entrar a la vía de pentosa-fosfato (Powers y D’Alessio, 2012). Fisiopatología de la diabetes mellitus El diagnóstico de diabetes mellitus se basa en la correlación de las complicaciones específicas de la diabetes con una cifra de glucemia en particular. Las organizaciones como la American Diabetes Association (ADA, 2015), la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2016) y en nuestro país la normatividad mexicana (NOM 015,2010) ya antes mencionada, han adoptado criterios para el diagnóstico de diabetes, con base en la glucemia en ayuno, las cifras de glucosa después de la administración de glucosa oral o la concentración de hemoglobina A1C (HbA1C; Powers y D’Alessio, 2012). Las cuatro categorías principales de diabetes incluyen la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, otras formas de diabetes y la diabetes gestacional. Aunque la hiperglucemia es común a todas las formas de diabetes, el mecanismo patofisiológico que conduce a la diabetes es muy diferente (Nolte, 2013). Existen pruebas clínicas para diagnosticar la diabetes; las cuales se realizan en un entorno médico, ya que el doctor será quien brinde el diagnóstico final. A continuación, se indican las pruebas (ADA, 2015): Prueba de Hemoglobina A1C. La prueba A1C mide el nivel promedio de glucosa en la sangre durante los últimos 2 o 3 meses. Las ventajas de recibir un diagnóstico de esta manera es que no se tiene que ayunar ni beber nada. Se diagnostica diabetes cuando: A1C ≥ 6.5% (ADA, 2015). Glucosa plasmática en ayunas. Ésta prueba generalmente se realiza a primera hora en la mañana, antes del desayuno, y mide su el nivel de glucosa 15 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES en la sangre cuando se está en ayunas. Ayunar significa no comer ni beber nada (excepto agua) por lo menos 8 horas antes del examen. Se diagnostica diabetes cuando: glucosa plasmática en ayunas ≥ 126 mg/dL (ADA, 2015). Prueba de tolerancia a la glucosa oral. Esta es una prueba de dos horas que mide el nivel de glucosa en la sangre antes de beber una bebida dulce especial y 2 horas después de tomarla. Le indica a su médico cómo el cuerpo procesa la glucosa. Se diagnostica diabetes cuando: glucosa en la sangre a las 2 horas ≥ 200 mg/dL (ADA, 2015). Prueba aleatoria (o casual) de glucosa plasmática. Esta prueba es un análisis de sangre en cualquier momento del día cuando se presentan síntomas de diabetes severa. Se diagnostica diabetes cuando: glucosa en la sangre ≥ 200 mg/dL (ADA, 2015). Diabetes tipo 1 Es causada por una reacción autoinmune, en la que el sistema de defensa del cuerpo ataca las células β productoras de insulina en el páncreas. Como resultado, el cuerpo ya no puede producir la insulina que necesita. No se sabe muy bien por qué ocurre esto. La enfermedad puede afectar a personas de cualquier edad, pero generalmente se presenta en niños o adultos jóvenes. Las personas con este tipo de diabetes necesitan insulina todos los días para controlar los niveles de glucosa en sangre. Sin insulina,una persona con diabetes tipo 1 muere. La diabetes tipo 1 suele desarrollarse repentinamente y puede producir síntomas tales como: sed anormal y sequedad de boca, micción frecuente, falta de energía, cansancio extremo, hambre constante, pérdida repentina de peso, heridas de cicatrización lenta, infecciones recurrentes y visión borrosa. Los individuos con diabetes tipo 1 y sus familiares tienen un incremento en la prevalencia de enfermedades autoinmunitarias como la enfermedad de Addison, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, la enfermedad de Graves y la de Hashimoto (Powers y D’Alessio, 2012). 16 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Diabetes Tipo 2 Es el tipo de diabetes más común y por lo general ocurre en adultos, pero cada vez más aparece en niños y adolescentes. En la diabetes tipo 2, el cuerpo puede producir insulina pero, o bien esta no es suficiente, o bien el cuerpo no puede responder a sus efectos; dando lugar a una acumulación de glucosa en sangre. Muchas personas con diabetes tipo 2 no son conscientes de su enfermedad durante mucho tiempo, ya que los síntomas pueden tardar años en aparecer o ser reconocidos. Durante este tiempo, el cuerpo está siendo dañado por el exceso de glucosa en sangre. Estas personas suelen ser diagnosticadas sólo cuando las complicaciones de la diabetes ya se han desarrollado (FID, 2014). Hay varios factores de riesgo como: La obesidad, la mala alimentación, la inactividad física, la edad avanzada, los antecedentes familiares de diabetes. A diferencia de las personas con diabetes tipo 1, la mayoría de las personas con diabetes tipo 2 no requieren, por lo general, dosis diarias de insulina para sobrevivir. Muchas personas pueden controlar su enfermedad a través de una dieta sana y una mayor actividad física, y medicación oral. Sin embargo, si no son capaces de regular sus niveles de glucosa, pueden necesitar insulina (FID, 2014). Diabetes gestacional Las mujeres que desarrollan una resistencia a la insulina y, por tanto, una alta concentración de glucosa en sangre durante el embarazo, se dice que tienen diabetes gestacional. La condición se produce debido a que la acción de la insulina es bloqueada, probablemente por las hormonas producidas por la placenta, provocando insensibilidad a la insulina. La diabetes gestacional no controlada puede tener graves consecuencias, tanto para la madre como para el bebé, puede dar lugar a un bebé con un tamaño significativamente superior a la media (macrosomía fetal), lo que hace que un parto normal se convierta en difícil y de riesgo. El recién nacido correrá el riesgo de sufrir lesiones en los hombros y problemas respiratorios. También existe el riesgo de pre-eclampsia, una condición en la que la alta presión arterial repentina representa un peligro para la salud de la madre y su bebé. La diabetes gestacional en las mujeres normalmente desaparece después del nacimiento. Sin embargo, las mujeres que han tenido diabetes gestacional tienen un mayor riesgo de desarrollar diabetes gestacional en embarazos posteriores y de desarrollar diabetes tipo 2 más adelante en la vida. Las mujeres con diabetes gestacional tienen que vigilar y controlar sus niveles de glucosa en sangre para reducir al mínimo los riesgos para el bebé (FID, 2014). 17 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Estrés oxidativo y radicales libres El estrés oxidativo resulta de un desequilibrio entre la generación de radicales y sistemas de barrido de radicales donde se ha incrementado la producción de radicales libres o se ha reducido la actividad de las defensas antioxidantes o ambos. Como una implicación del estrés oxidativo en la patogénesis de la diabetes mellitus, se sugiere no sólo la generación de radicales libres de oxígeno, sino también debido a la glicosilación no enzimática de proteínas, la auto-oxidación de la glucosa, el metabolismo del glutatión, alteración de las enzimas antioxidantes y formación de peróxidos de lípidos. Los radicales libres pueden encontrarse en el interior o en el exterior de las células o incluso diseminados por todo el organismo, manteniendo actividad biológica al oxidarse, dañando principalmente tejido conjuntivo, proteínas, enzimas, lípidos, membranas celulares, ADN y ARN, entre otros; y su acción también la pueden ejercer sobre los leucocitos favoreciendo su activación anómala, por lo cual están implicados en la producción de enfermedades degenerativas como el cáncer, enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares (Hernández, 2004). Actividad antioxidante La forma en cómo funcionan los antioxidantes es terminando las reacciones en cadena que provocan los radicales libres e inhiben otras reacciones de oxidación, oxidándose ellos mismos (Zamora, 2007). Determinación de la actividad antioxidante por la técnica in vitro del DPPH Esta determinación se basa en la utilización de la molécula del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) in vitro. El DPPH es un radical libre débil que presenta un electrón desapareado en su último orbital (figura 1), lo cual le confiere la capacidad de oxidar a diferentes macromoléculas tratando de estabilizar su última capa orbital; como consecuencia de esto, puede provocar la muerte de diferentes organelos, alterar la estructura de la membrana celular y por consiguiente causar la muerte de las células (e.g., las células β-pancreáticas). Físicamente, el radical DPPH presenta una coloración morada y cuando se expone a la presencia de alguna sustancia capaz de donarle electrones para completar su última capa orbital, se reduce y pasa a una coloración amarilla o transparente. Esto se puede evaluar a través de la medición de la absorbancia en una longitud de onda de 517nm, mediante el uso de un espectrofotómetro (Dibyendu, 2013). 18 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Figura 1.- Estructura química del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH), Fuente: The Merck Index, 2001. Modelo químico de diabetes Mecanismo de acción de la estreptozotocina (STZ) Este fármaco (figura 2) es usado para inducir la diabetes mellitus tipo 1 y tipo 2; la STZ entra en la célula β a través de un transportador de glucosa (GLUT2) y causa daño al DNA por alquilación de las cadenas de este ácido, también induce la activación de un proceso llamado poli ADP-ribosilación, que conduce al agotamiento celular de NAD+ y ATP que llevara a la célula a la apoptosis. Otro mecanismo paralelo es la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs), que a vez también causarán daño en la célula. Por otro lado, los radicales libres se producen continuamente en el cuerpo como resultado de procesos metabólicos normales y la interacción con estímulos ambientales. El estrés oxidativo provocado por la generación de radicales libres puede constituir el evento clave y común en la patogénesis de complicaciones diabéticas secundarias (Szkudelski, 2001). En muchos países se han obtenido extractos de plantas y fitoquímicos (Tabla 2), que llaman la atención por su potencial para el uso de tratamiento y prevención de la diabetes mellitus que han sido probados tanto in vivo como in vitro, los cuales podrían ser aprobados como refuerzo para el tratamiento de ésta enfermedad. De manera general el mecanismo que realizan estos metabolitos es, que influyen en la secreción de la insulina, aumentar la expresión de receptores para insulina, aumentar la expresión de enzimas, receptores y transportadores relacionados con el metabolismo de la glucosa (Coman, 2012). Figura 2.- Estructura química de la estreptozotocina (STZ). Fuente: The Merck Index, 2001. 19 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Tabla 2.- Ejemplos de plantas con propiedades antidiabéticasconfirmadas. Fuente: Coman, 2012. 20 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Semillas de Swietenia humilis Zucc El árbol Swietenia humilis Zucc pertenece a la familia Meliaceae, del género Swietenia y especie humilis. Crece en áreas tropicales y subtropicales en toda América. En México se localiza en los bosques tropicales de Sinaloa, Colima, Michoacán, Guerrero y Chiapas (Standley, 1920). El árbol es conocido como zopilote, zopilacahuite, vanadillo o caobilla, y a las semillas se les denomina con el mismo nombre (figura 3). En dichos estados de la República Mexicana, su etnobotánica sugiere el uso para tratamiento de diversas enfermedades. En otros géneros de la familia Meliaceae, se han reportado efectos hipoglucemiantes; sin embargo, para Swietenia humilis Zucc no se tenían reportes científicos hasta el 2014, sobre la actividad hipoglucemiante e hipolipemiante, ni sobre su toxicidad (Rico, 2014). Cabe recalcar que el presente estudio se realizó durante febrero 2015 a junio de 2016, donde a inicios del año 2015 fue publicado un artículo científico de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en donde redactan el efecto hipoglucemiante y antihiperglucémico de los limonenos provenientes de Swietenia humilis (Ovalle, 2014). Figura. 3.- Fruto y semillas provenientes del árbol del Zopilacahuite. Fuente: Rojas, 2011. 21 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES JUSTIFICACIÓN La Federación Internacional de la Diabetes estima que aproximadamente 387 millones de personas padecen diabetes a nivel mundial y esta cifra va en aumento en todos los países (FID, 2014); igualmente se sabe que los tratamientos alopáticos son costosos y algunas veces inaccesibles para las personas que padecen esta enfermedad, además de presentar numerosos efectos adversos en la mayoría de los casos. Por tal razón, es necesario encontrar un tratamiento efectivo y natural, que sea económico y relativamente más seguro como terapia alternativa para este tipo de trastornos crónico-degenerativos. En este sentido se propone aportar datos científicos que avalen el uso de Swietenia humilis Zucc en el tratamiento de este tipo de padecimientos. HIPÓTESIS Si se le atribuye a la planta Swietenia humilis Zucc el uso tradicional para el tratamiento de la diabetes mellitus, entonces se esperará que los extractos metanólicos de ésta planta presentarán actividades farmacológicas de tipo hipoglucemiante, hipolipemiante, y antioxidante en un modelo químico de diabetes en ratón. 22 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES OBJETIVOS Objetivo General: Determinar la actividad hipoglucemiante, hipolipemiante y antioxidante del extracto metanólico de la semilla de Swietenia humilis Zucc en un modelo químico de diabetes en ratón. Objetivos Particulares: 1. Determinar la presencia de metabolitos secundarios en el extracto metanólico de semilla de Swietenia humilis Zucc mediante un estudio fitoquímico cualitativo. 2. Determinar los principales grupos funcionales de los metabolitos secundarios en el extracto metanólico de semilla de Swietenia humilis Zucc mediante estudios espectroscópicos convencionales. 3. Evaluar la actividad antioxidante del extracto metanólico de la semilla Swietenia humilis Zucc por método in vitro del DPPH. 4. Determinar la actividad genoprotectora del extracto metanólico de Swietenia humilis Zucc 5. Evaluar el efecto del extracto metanólico de Swietenia humilis Zucc sobre el peso corporal en ratones tratados con estreptozotocina. 6. Comprobar la actividad hipolipemiante e hipoglucemiante del extracto metanólico de la semilla Swietenia humilis Zucc en un modelo químico de diabetes en ratón inducido por estreptozotocina. 7. Cuantificar los niveles de glucosa, colesterol, triglicéridos, albumina y creatinina en el plasma de la sangre periférica de ratón al término del tratamiento. 23 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES METODOLOGÍA El presente trabajo se dividió en dos grandes procesos metodológicos, fase química: fitoquímica cualitativa, espectroscopia y actividad antioxidante in vitro. Fase farmacológica: actividad hipoglucemiante, hipolipemiante y genoprotectora. La semilla Swietenia humilis Zucc fue adquirida en un establecimiento comercial debidamente autorizado. Figura 4.- Diagrama general de la metodología experimental. Extracción metanólica de la semilla de Swietenia humilis Zucc La semilla está contenida en una cáscara, la cual se retiró primero la cáscara y se separó. Se trituró la semilla, se pesó y se transfirió a un frasco de vidrio previamente etiquetado y rotulado (Nombre del colector, Nombre de la semilla y Fecha) y se le adicionó el volumen de metanol necesario para cubrir las semillas. En este envase se dejó macerar durante dos semanas, realizando un cambio de disolvente cada semana, logrando obtener dos cambios de disolvente en total. Así pues, se juntaron ambos volúmenes del macerado para su posterior concentració n mediante destilación a presión reducida con ayuda de un rotavaporador (Prendo, Modelo 1750) obteniéndose el extracto crudo (Berdeja et al., 2015). Análisis fitoquímico cualitativo Una vez obtenido el extracto metanólico concentrado, se re suspendió en metanol para ayudar a la manipulación y se realizaron las pruebas fitoquímicas cualitativas, basadas en la metodología descrita en el manual de laboratorio de fitoquímica para la carrera Químico Farmacéutico Industrial (Berdeja et al., 2015). 24 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Se seleccionaron las pruebas más sencillas y se describen en este trabajo (Ver Anexo1). Espectroscopia FT IR y RMN ¹H Una vez obtenido el extracto metanólico crudo concentrado y cuando se evaporó el disolvente, la pasta resultante se colocó en un envase de vidrio debidamente rotulado (nombre del colector, nombre de la semilla y fecha), de donde se tomó una muestra representativa y se colocó en un tubo eppendorf, debidamente rotulado (nombre del colector, nombre de la semilla y fecha) y se envió para su análisis por espectroscopia FT-IR y RMN ¹H al Centro de Nanociencias y Micro Nanotecnología (CNMN) del Instituto Politécnico Nacional, ubicado en Av. Luis Enrique Erro s/n, Nueva Industrial Vallejo, 07738 Ciudad de México, D.F. Actividad antioxidante de Swietenia humilis Zucc Curva de calibración Se preparó una solución del reactivo DDPH (2,2-difenil-picrihidrazil) y se pesó 0.1 g adicionando metanol y aforando a 25 mL, una vez envasada se protegió de la exposición directa a la luz y se etiquetó debidamente. La solución se dejó reposar durante 10 minutos y se preparó tres tubos por duplicado de 40, 140 y 200 μL de DDPH y 1960, 1860, 1800 μL de metanol, respectivamente. Se leyó la absorbancia a cada tubo al espectrofotómetro (modelo Velab VE-5100UV) de UV-Visible a una longitud de onda de 517 nm. Posteriormente se determinó el promedio de las absorbancias y se graficó, utilizando la ecuación de la recta para calcular el valor de la concentración de DDPH en función de la absorbancia (Singh, 2011). Curva de absorbancia del extracto metanólico de Swietenia humilis Zucc En un tubo de ensayo se adicionó metanol (1855 μL), se cubrió con papel aluminio, y se leyó la absorbancia, siendo éste el tiempo 0. Después se adicionó y mezcló DPPH (140 μL) y 5 μL del extracto disuelto en metanol, siendo éste el tiempo 1. Este procedimiento se realizó a los tiempos 5, 10, 15, 30, 60, 90 minutos. Esto se realizó por duplicado. Se determinó el promedio de ambas absorbancias y el error estándar; en la ecuación de la curva de calibración se sustituyó dichos valores y se graficó el promedio de absorbancia contra el tiempo de medición de la reacción.Los valores de los promedios de las absorbancias se sustituyeron en la siguiente fórmula para conocer la actividad antioxidante o él % de inhibición de la presencia del radical DPPH, y se grafica el % de inhibición de la presencia del radical DPPH contra el tiempo de reacción (Singh, 2011). 25 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES % 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = ( 𝐴𝑏𝑠 𝐷𝑃𝑃𝐻𝑡=0 − 𝐴𝑏𝑠 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡=0) 𝐴𝑏𝑠 𝐷𝑃𝑃𝐻𝑡=0 𝑋 100 Donde: % inhibición= El porcentaje de inhibición de la presencia del radical DPPH. Abs DDPH t=0 = Absorbancia del DDPH al tiempo cero. Abs Muestra t=0 = Absorbancia de la muestra al tiempo cero. Actividad genoprotectora de Swietenia humilis Zucc Se utilizaron tres grupos de ratones NIH macho con un peso aproximado de 25 a 30 g, manejando una n= 6 ratones para cada grupo. Los animales se alojaron en las cámaras de animales de la ENCB, campus Zacatenco (IPN) del depto. de Fisiología, con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. (luces encendiéndose a las 8:00 AM) y con agua y alimento adlibitum. El manejo experimental de los animales estuvo basado en la norma NOM-062-ZOO1-1999 para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio y NOM-087-ECOL-1995 para la disposición final de productos biológicos, excretas y cadáveres. En todo momento se siguieron los protocolos de ética internacionales para el diseño de experimentos. Al primer grupo denominado control negativo, se le administró vehículo (aceite mineral) por vía intragástrica (IG); al grupo control positivo, se le administró antraceno (10 mg/kg) por vía intragástrica (IG) y al grupo con tratamiento se le administró antraceno (10 mg/kg) previo extracto de Swietenia humilis Zucc (500 mg/kg) por vía intragástrica (IG). El periodo total para la evaluación de esta actividad fue de cuatro semanas, donde la administración de dichos tratamientos fue sólo durante las dos primeras semanas, cada segundo día. Durante estas cuatro semanas, se tomó una muestra de sangre periférica de ratón para realizar un frotis cada dos días a partir del día cero (sin ningún tratamiento). El procedimiento para realizar los frotis fue, a partir de un corte del extremo distal de ratón se obtiene sangre periférica realizando frotis en portaobjetos, y se fijó en metanol durante seis minutos. Posteriormente, se introdujo en colorante de Giemsa, para poner de manifiesto los micronúcleos durante una hora; a continuación, se lavó a la llave de agua corriente para quitar exceso de colorante. Se dejó secar y se procedió a su evaluación al microscopio (modelo Carl Zeiss, J- 08096697) al aumento 100X; en todos los casos se contaron los micronúcleos presentes en 10 campos. La estadística se menciona en el apartado de análisis estadístico. 26 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Evaluación farmacológica de la semilla de Swietenia humilis Zucc Actividad hipolipemiante y efecto sobre el peso corporal Se utilizaron ratones NIH macho con un peso aproximado de 25 a 30 g, manejando una n= 8 a 10 ratones para cada grupo. Los animales se alojaron en las cámaras de animales de la ENCB, campus Zacatenco (IPN) del depto. de Fisiología, con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. (luces encendiéndose a las 8:00 AM) y con agua y alimento adlibitum. El manejo experimental de los animales estuvo basado en la norma NOM-062-ZOO1-1999 para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio y NOM-087-ECOL-1995 para la disposición final de productos biológicos, excretas y cadáveres. En todo momento se siguieron los protocolos de ética internacionales para el diseño de experimentos. Semanalmente se midió el peso de los ratones, con la finalidad de observar si el extracto tuvo un efecto protector contra la pérdida de peso corporal provocado por la STZ (Kaleem, 2006); se realizó el pesaje con una balanza (modelo Adam, DCT5000) y se registró los datos. Actividad hipoglucemiante Se utilizaron ratones NIH macho con un peso aproximado de 25 a 30 g, manejando una n= 8 a 10 ratones para cada grupo. Los animales se alojaron en las cámaras de animales de la ENCB, campus Zacatenco (IPN) del depto. de Fisiología, con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. (luces encendiéndose a las 8:00 AM) y con agua y alimento adlibitum. El manejo experimental de los animales estuvo basado en la norma NOM-062-ZOO1-1999 para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio y NOM-087-ECOL-1995 para la disposición final de productos biológicos, excretas y cadáveres. En todo momento se siguieron los protocolos de ética internacionales para el diseño de experimentos. Modelo de diabetes con estreptozotocina (STZ) Para diabetizar a los ratones, se administró STZ con una dosis de 120mg/kg por vía IP disuelta en Buffer de citratos como vehículo (pH= 4.5 0.1M); posteriormente para verificar el estado hiperglucémico de los ratones, se midieron los niveles de glucosa en sangre después de una semana de la administración con STZ (Shinde, 2003). 27 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Medición de glucosa en sangre Se manipuló al ratón de forma que se permitiera realizar un pequeño corte en el extremo distal de la cola, con la finalidad de obtener una gota de sangre, la cual se drenó y se desechó; de manera que la segunda gota de sangre se depositó en una tira reactiva previamente colocada en el dispositivo (Glucómetro, Optium FreeStyle, Abbott), y se procedió a hacer lectura del nivel de glucosa en sangre (mg/dL), el valor se encuentra en la pantalla del dispositivo. Preparación de la suspensión con el extracto Una vez obtenido el extracto metanólico crudo concentrado y cuando se evaporó el disolvente, se realizó una prueba de disolución con agua destilada y/o buffer de citratos para determinar el vehículo más adecuado para administrar la suspensión. El extracto de Swietenia humilis Zucc tuvo como vehículo agua destilada. La suspensión se realizó entonces con 2g del extracto crudo en 40 mL de agua destilada, dejando en agitación 12 h, obteniéndose una suspensión de 50 mg/dL. Grupos experimentales Para determinar la actividad hipoglucemiante e hipolipemiante se formaron los siguientes grupos de ratones (n = 6 – 8 animales), donde al grupo control absoluto sólo se le administró el vehículo (agua destilada) por vía intragástrica (IG), mientras que al grupo control positivo se diabetizó con el método antes mencionado. Los grupos experimentales se diabetizaron y posteriormente se administraron con la suspensión del extracto metanólico de Swietenia humilis Zucc vía IG, por medio de una cánula metálica para ratón. La administración se realizó cada dos días durante 36 días (6 semanas); semanalmente se midieron el peso corporal y los niveles de glucosa en sangre previo ayuno de 12-18 h, quedando los grupos de la siguiente manera: 1. Normoglucémicos, control absoluto (sin diabetizar) administrados con vehículo. 2. Control positivo, diabetizados con STZ (120 mg/kg, i.p.). 3. Diabéticos + Tx500; diabetizados más el tratamiento con extracto metanólico de S. humilis (500 mg/kg, vía IG). 4. Diabéticos + Tx750; diabetizados más el tratamiento con extracto metanólico de S. humilis (750 mg/kg, vía IG). 28 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES 5. Diabéticos + Tx1000; diabetizados más el tratamiento con extracto metanólico de S. humilis (1000 mg/kg, vía IG). 6. Diabéticos + Acarb300; diabetizados más el tratamiento de Acarbosa (300 mg/Kg, vía IG). 7. Diabéticos + Acarb300 + Tx750; diabetizados más el tratamiento con Acarbosa (300 mg/kg, vía IG) y extracto metanólico de S. humilis (750 mg/kg, vía IG). Análisis de parámetros metabólicos en sangre Una vez terminado el tratamiento, se procedió a sacrificara los ratones por decapitación, obteniendo la mayor cantidad posible de sangre. Esta se colectó en tubos con anticoagulante (BD Vacutainer / SST). Se procedió a centrifugar a 3400 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante se separó con ayuda de una pipeta pasteur; la muestra obtenida se guardó en tubos eppendorf y se mantuvieron en congelación. En el momento de las determinaciones, las muestras se colocaron en recipientes con hielo y se siguió la metodología descrita en los kits correspondientes (ver anexo 2). Análisis estadístico Los datos generados en esta parte del diseño experimental fueron analizados con ayuda del software Sigmastat 3.5. Para las mediciones semanales de peso y glucosa sanguínea se utilizó la prueba paramétrica ANOVA bifactorial de medidas repetidas; mientras que para la evaluación cuantitativa de los parámetros con kits de reactivos se realizó una ANOVA Unifactorial. Cuando fue necesario, se utilizó la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls para buscar diferencias significativas entre factores. En todos los casos, se utilizó un nivel α = 0.05 como criterio para establecer diferencias significativas. 29 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES RESULTADOS Fitoquímica cualitativa A continuación, se muestran los ensayos fitoquímicos cualitativos realizados en el extracto metanólico de la semilla Swietenia humilis Zucc y se mencionan las pruebas que resultaron positivas (Tabla 3). Se encontraron alcaloides, azúcares reductores, saponinas, flavonoides, cumarinas y quinonas como metabolitos secundarios. Tabla 3.- Metabolitos secundarios encontrados Espectroscopia FT IR y RMN ¹H La información espectral de la técnica FT-IR (Figura 5) coincide al determinar el espectro RMN 1H (Figura 6), considerando que hay tres regiones del espectro que son de una importancia particular, la de los protones aromáticos que resuenan en 7.50 ppm, grupos metoxilos en 3.5 y 4 ppm, donde la región de 4 ppm son protones orto protegidos y en 1.0 ppm cadenas alifáticas. En la señal 5 y 5.5 grupos vinílicos y en 1750 ppm característico de la forma carbonilo o éster; además de la banda ancha en 3500 ppm característico de los alcoholes. Las señales entre 3.70 a la 5.35 ppm indican la presencia de monómeros diferentes atribuibles a la existencia de azucares reductores; entre 0.5 y 4.5 ppm indican la presencia de sacáridos, que son estructuras características de las saponinas; se observó una fuerte señal entre 3.42 y 3.89 ppm, indicando presencias de cadenas de carbono enlazadas a grupos fenilos en la señal de 6,46 ppm; además de identificarse grupos sulfato con lo que se sugiere una estructura general de flavonoides. 30 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Figura 5.- Espectro de FT IR del extracto metanólico de la semilla de Swietenia humilis Zucc. Se muestran principales grupos encontrados. Se empleó la técnica de espectroscopia de infrarrojo con transformación de Fourier (FT-IR). Figura 6.- Espectro de RMN 1H del extracto metanólico de la semilla de Swietenia humilis Zucc. Se muestran en números grandes de color negro los desplazamientos químicos obtenidos. 31 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Actividad antioxidante Los resultados obtenidos de la prueba del efecto antioxidante establecieron que las muestras que se analizaron llegaban a su punto máximo del porcentaje de inhibición del radical de DDPH en el minuto 30, demostrando una disminución en la inhibición después de haber pasado este tiempo; se debe enfatizar que el extracto metanólico de 50 mg/mL tuvo el mayor porcentaje de inhibición del radical libre DDPH (Figura 7); además, mantuvo los valores más grandes hasta el minuto 60, demostrando que el extracto metanólico desarrolló un mayor efecto antioxidante y más prolongado que el extracto crudo y acuoso. Figura 7.- Gráfica de Actividad Antioxidante a diferentes concentraciones contra porcentaje de Inhibición del radical de DDPH. Donde se manejan dos concentraciones del extracto crudo, un extracto metanólico y un extracto acuoso contra el porcentaje de inhibición del radical DDPH. Actividad genoprotectora De los resultados obtenidos (Figura 8) se observó que, a partir del primer día hasta el tercer día de administración del extracto en el grupo experimental, redujeron significativamente la cantidad de micronúcleos en sangre periférica de ratón a comparación del grupo control (Anova bifactorial de medidas repetidas, prueba de Student Newman Keuls, F10/75= 6.53; P<0.001), mostrando un efecto genoprotector ante la administración del antraceno. Figura 8.- Gráfica de la actividad genoprotectora ante la administración de antraceno . ANOVA bifactorial de medidas repetidas. *P<0.001, Student-Newman-Keuls, Control positivo VS Tx 500mg/kg a partir del primer hasta el tercer día. 32 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Actividad hipoglucemiante En condiciones normales se registraron niveles de glucosa sanguínea entre 90 y 130 mg/dL. Tras una semana de la administración de estreptozotocina, se consideraron animales diabéticos aquellos individuos que presentaron glicemia mayor o igual a 150 mg/dL. Se muestran los niveles de glicemia presentados en los tres grupos de ratones diabéticos (Figura 9) que fueron administrados con el extracto de la semilla Swietenia humilis Zucc con 500, 750, 1000 mg/kg respectivamente, con la comparación de los grupos control (normoglucémicos) y diabéticos absolutos en el transcurso de 6 semanas (ANOVA bifactorial de medidas repetidas, Student-Newman-Keuls, F4/217=57.67; P<0.001), dejando ver que los grupos con administración del extracto tuvieron menores niveles de glucosa en sangre en comparación con el grupo de diabéticos absolutos, cabe destacar que el grupo con extracto de 1000 mg/Kg fue capaz de bajar los valores de glucosa hasta los niveles normales obtenidos en el grupo control a partir de la segunda semana de administración, con lo cual se puede decir que presentó actividad hipoglucémica; sin embargo en los grupos tratados con 500 y 750 mg/Kg que mantuvieron los niveles de glucosa entre 180 – 300 mg/dL a partir de la segunda semana, dichos niveles de glucosa permanecieron por debajo de los niveles de glucosa del grupo diabético absoluto; a esto se le puede denominar actividad anti-hiperglicémica (Student-Newman-Keuls, P<0.005; Figura 9). Con la administración de acarbosa 300 mg/Kg a ratones diabéticos, se observó la disminución de los niveles de glucosa, en comparación del grupo diabético absoluto (ANOVA bifactorial de medidas repetidas, Student-Newman-Keuls, F3/126=25.92; P<0.00; Figura 10); mientras que el grupo diabético más el tratamiento con extracto 750 mg/kg y acarbosa 300mg/kg exhibió una disminución de los valores de glucosa de manera significativa a partir de la tercera semana (Student-Newman-Keuls, P<0.005; Figura 10), con lo cual se observó el efecto sinérgico de la administración del extracto a una dosis media (750mg/Kg) junto con un fármaco de referencia. Figura 9.- Niveles de glucosa sanguínea (Media ± EEM) de 5 tratamientos durante 6 semanas. ANOVA bifactorial de medidas repetidas. *P<0.005, Student-Newman-Keuls, Dabs VS D500 hasta la 2da semana y después de la 4ta semana. *P<0.005, Student-Newman-Keuls, Dabs VS D750 a partir de la 3ra semana. 33 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Figura 10.- Niveles de glucosa sanguínea (Media ± EEM) de 4 tratamientos durante 6 semanas. ANOVA bifactorial de medidas repetidas. *P<0.005, Student-Newman-Keuls, Dabs VS D750 y D750 más Acarbosa a partir de la tercera semana. Actividad hipolipemiante y registro de peso corporal Los ratones tratados con STZ, tiendena bajar de peso. Al respecto, como se observó en los 3 grupos experimentales que fueron tratados con las tres dosis del extracto de S. humilis (500, 750, y 100 mg/Kg) respectivamente, presentaron una variación de peso similar a la de los ratones normoglucémicos, mientras que el grupo diabético absoluto presentó una disminución de peso importante (ANOVA bifactorial de medidas repetidas, Student-Newman-Keuls, F4/203=18.41; P<0.001; Figura 11) presentando um efecto protector ante la pérdida de peso causada por STZ. Figura 11. - Variación de peso corporal (Media ± EEM) de 5 tratamientos durante 6 semanas. ANOVA bifactorial de medidas repetidas. *P<0.005, Student-Newman-Keuls, Dabs VS 3 Grupos en la 6ta semana. 34 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Niveles séricos de glucosa, triglicéridos, albúmina, colesterol y creatinina. Los niveles séricos de glucosa, triglicéridos, albúmina, colesterol y creatinina se muestran a continuación, donde se utilizaron 7 grupos experimentales (ANOVA unifactorial de medidas repetidas; P<0.005; Tabla 4); los grupos tratados con el extracto de la semilla y que presentaron efecto hipoglucemiante, fueron aquellos con las dosis del extracto de 750 mg/Kg y a dosis del extracto de 1000 mg/Kg más Acarbosa de 300 mg/kg (P<0.005); con lo cual se demuestra que los resultados son coherentes con los registros realizados cada semana durante 6 semanas en el estudio crónico de este trabajo; observándose niveles de glucosa parecidos al grupo normoglucémico. En los niveles séricos de triglicéridos, se observó una disminución significativa tras el tratamiento con el extracto (500, 750, y 1000 mg/Kg) respectivamente presentando un efecto hipolipemiante, mientras que los niveles séricos de colesterol si bien no hay diferencia significativa, se puede observar la tendencia de todos los grupos con el tratamiento del extracto de tener los niveles de colesterol parecidos al grupo normoglucémico; por otro lado, en los niveles de creatinina disminuyeron con el tratamiento del extracto a dosis 500 mg/Kg y 750 mg/Kg (P<0.005). Tabla 4.- Niveles séricos de glucosa, triglicéridos, albúmina, colesterol y creatinina (Media ± EEM). Niveles séricos en sangre periférica de ratón al término del tratamiento. ANOVA unifactorial *(P<0.005) VS Diabéticos Absolutos. 35 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES DISCUSIÓN Se encontraron alcaloides, azúcares reductores, saponinas, flavonoides, cumarinas y quinonas como metabolitos secundarios. La información aportada por la técnica FT-IR y principalmente por RMN 1H, auxiliaron a la identificación de metabolitos, donde en éste último, indica la posición en el espectro (desplazamiento químico) que determina el entorno químico del núcleo, y por tanto da información de grupos funcionales a los que pertenecen o que están cerca (Neira, 2009). Cabe recordar que no se hizo columnas de cromatografía para obtener diferentes fracciones, y después identificar las estructuras de cada una de ellas con su respectivo RMN 1H y RMN13C, por lo que los resultados de la espectrofotometría reportada forman parte de un todo y, por lo tanto, varias entidades químicas se pueden sobreponer una de otra. En caso de los flavonoides es característico los desplazamientos de protones como metoxilos, aromáticos, fenoles y carbonilo (Neira, 2009); para alcaloides protones aromáticos, vinílicos, la presencia de carbonilo y nitrógeno (Vargas, 2011); para azúcares reductores, por supuesto los grupos alcoholes, metilenos y carbonilos característicos de los anillos que forman unidades de monosacáridos (Prieto, 1992), para saponinas, las cadenas alifáticas que forman ciclos característicos (Holger, 2012), para cumarinas, la presencia de carbonilo de éster de ácido carboxílico posiblemente de la estructura característica de benzopironas (Garibello, 2010) y para quinolinas, los protones quinolínicos y carbonilos posiblemente provenientes de la estructura benzoquinona (Vargas, 2011). Se ha demostrado que los extractos etanólicos y acuosos de semillas de Fennel (Foeniculum vulgare), tienen actividad antioxidante contra especies reactivas de oxígeno como el peróxido, inhibiendo por arriba del 77% para ambos tipos de extracto. Su actividad es dependiente de la concentración a partir de 100 mg y esto se debe a la presencia de fenoles y ácido gálico (Münir, 2003). En caso del extracto metanólico de la semilla de zopilacahuite (Swietenia humilis Zucc), la mayor actividad se presentó a la concentración de 50 mg con un 15% de inhibición; teniendo en cuenta que para determinar como buena actividad antioxidante la inhibición del 50% o más, entonces la semilla presentó una baja actividad antioxidante en éste experimento. Por lo anterior, se justificó no probar concentraciones mayores; además como comentario personal, se encontró problemas en cuanto al manejo del extracto debido a que una vez rotoevaporado el extracto metanólico, la re-dispersión de la pasta resultante, sólo se logró en agua destilada. 36 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES La semilla, es el principal órgano reproductivo de la gran mayoría de las plantas y desempeña una función fundamental en la renovación, persistencia y dispersión de las poblaciones de plantas; pueden almacenarse vivas por largos periodos, asegurándose así la preservación de especies y variedades de plantas valiosas. Para ello presentan características como son: la dureza e impermeabilidad de la cubierta de la semilla; el contenido de agua inicial con el que se disemina la semilla y el que se puede lograr disminuir por deshidratación sin matarla; la tolerancia a la temperatura de congelación del agua, ya que los cristales de hielo de ésta pueden alterar las células de la semilla; la naturaleza de la latencia, la tasa metabólica o respiración mínima o interrumpida que se pueda alcanzar sin matarla; el tipo de reservas y su propensión al deterioro químico; el tipo de metabolitos secundarios y su ubicación dentro de las células de la semilla; la disposición del agua sub-celular, o sea la que está unida a macromoléculas como proteínas, que forman las células; la composición de los lípidos de las membranas celulares; la resistencia a la invasión de microorganismos y la resistencia al deterioro del material genético (Vázquez, 1997); esto explicaría que la semilla de S. humillis, a pesar de ser baja, presenta actividad antioxidante y genoprotectora debido a la acción de los metabolitos con función de preservación ante efectos externos. La actividad hipoglucemiante de los taninos y flavonoides ha sido reconocida (Bustamante et al., 2002); y se explica en gran parte por la habilidad de interactuar con los radicales libres y acomplejarse con ellos (Pietta, 2000; Corral et al., 1997), no sólo incluye a los metabolitos anteriormente mencionados sino además a los polisacáridos. En cuanto a los alcaloides, se ha reportado su acción como antioxidante (Soon, 2013). Dado que no fueron detectados taninos en el extracto metanólico, podría entonces pensarse que la actividad revelada por la semilla es proveniente, en principio, a la presencia de alcaloides y flavonoides, debido al posible mecanismo como secretagogo de insulina, además del incremento de la glucogénesis, inhibición de la gluconeogénesis y la inhibición de la absorción de la glucosa en el intestino (Islam, 2009). Sugiriendo como responsable de ésta actividad a la presencia de metabolitos secundarios como flavonoides y alcaloides; recordando que la actividad de STZ es específica, y que no se pudo determinar que absolutamente todas las células β del páncreas hayan sido destruidas, debido a que no se hicieron pruebas histológicas para tal fin. Las células que hayan sobrevividopodrían haber compensado para liberar insulina, lo cual, junto con la administración del extracto, ejercería el mecanismo de acción para disminuir los niveles de glucosa, ya sea aumentando la absorción de glucosa o inhibiendo la proteína tirosina fosfatasa PTP-1B, la cual potencia la acción de la insulina y leptina (Zhang, 2013). 37 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Con la administración de Acarbosa 300 mg/Kg a ratones diabéticos, se observó la tendencia a disminuir los niveles de glucosa, en comparación del grupo diabético absoluto (figura 10); mientras que el grupo diabético más el tratamiento con extracto 750 mg/kg y Acarbosa 300mg/kg exhibió una disminución de los valores de glucosa de manera significativa a partir de la tercera semana, con lo cual se comprueba el efecto sinérgico de la administración del extracto a una dosis media (750mg/Kg) junto con un fármaco de referencia. El posible mecanismo el cual se potencia la actividad anti-hiperglicémica, está relacionado con la inhibición de la α- glucosidasa presente en el borde en cepillo del epitelio interstinal; está enzima desdobla los carbohidratos de la dieta, pero al ser inhibida por la acarbosa, se retrasa este proceso, provocando la disminución de la absorción de glucosa en el tracto digestivo, ésta situación, se podría sumar a la actividad de los alcaloides y otros metabolitos secundarios de provocar el aumento de la absorción de glucosa y con la inhibición de la PTP-1B; también se debería considerar la actividad de los flavonoides para activar la síntesis de glucógeno así como la activación de la enzima hexocinasa (Bhava, 2008). Es de resaltar que el grupo tratado con el extracto (750 mg/kg) y acarbosa (300 mg/kg), presentó muertes durante el tratamiento, posiblemente causado por la administración conjunta de acarbosa y el extracto en dosis ya mencionadas, sin embargo, no se hizo ninguna modificación en la dosificación. Las anormalidades en el metabolismo de los lípidos acarrean una elevación en los niveles séricos de lípidos y lipoproteínas que juegan un papel importante en la ocurrencia prematura y severa de arterosclerosis, que afecta a las personas diabéticas (Ravi, 2005). El posible mecanismo para contrarrestar la disminución de peso causada por la administración STZ, tal vez se debió a la presencia de alcaloides, flavonoides y cumarinas con actividad antioxidante ante las especies reactivas de oxígeno o inhibir la oxidación de la LDL (Palomo, 2010) reduciendo así el daño de STZ; aunado con la reducción de lípidos por el mecanismo de inhibición hepática de la biosíntesis de colesterol, el incremento de la excreción de ácidos biliares y la actividad de la colesterol aciltransferasa (Khanna, 2002), que podría explicar la reducción significativa de triglicéridos. Las personas con diabetes, tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, relacionadas con los niveles de triglicéridos y colesterol. Para los pacientes con diabetes se recomienda tener un nivel de colesterol por debajo de 100 mg/dL y en personas sanas menor a 200 mg/dL, mientras que de triglicéridos menor a 150 mg/dL para personas diabéticas y en 160 mg/dL para personas sanas; las complicaciones de hipertrigliceridemia son el sobrepeso, niveles altos de glucosa, hipotiroidismo, y enfermedades del riñón 38 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES (Cambell, 2007). En cuanto a triglicéridos, los grupos tratados con la semilla a las dosis de 500 y 1000 mg/kg mostraron reducción de los niveles de triglicéridos en comparación del grupo diabético absoluto, llegando a presentar niveles de triglicéridos parecidos a los exhibidos por el grupo normoglucémico. En cuanto colesterol, se recomienda para personas sanas, tener niveles por debajo de 200 mg/dL; sin embargo, en este trabajo experimentalmente no se encontraron diferencias significativas en los grupos de ratones. Cabe aclarar que no se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo diabético absoluto debido a que éste presentó niveles promedio de 18.52 mg/dL, mientras que en los demás grupos se observó un nivel por arriba de dicha cifra, así pues, se procedió a comparar con el grupo normoglucémico y se observó que todos los tratamientos (500, 750, 1000 mg/kg y 750 mg/kg más 300 mg/Kg de acarbosa) presentaron niveles similares a los normoglucémicos, por lo que se puede indicar que el extracto mantuvo los niveles de colesterol dentro de lo normal. El mecanismo para disminuir y regular los niveles de triglicéridos y colesterol, proviene posiblemente de la actividad que realizan los alcaloides y flavonoides; se ha demostrado que los alcaloides pueden regular el metabolismo de lípidos (Wu, 2014) mientras que los flavonoides, regulan los receptores activados por el factor proliferador de peroxisomas (PPAR) en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas (Bhavna, 2008). El control de la hiperglicemia en los pacientes diabéticos es importante, se deben evaluar los niveles de riesgo de enfermedades cardiovasculares, así como daño en los riñones tales como nefropatía diabética e insuficiencia renal. Si existe un daño renal, se detecta la presencia de proteínas en la orina. En el presente estudio, cuanto a los niveles de albúmina, no se observó diferencia significativa entre ninguno de los grupos experimentales, de lo cual se puede hacer la observación que la determinación de albúmina se debió de complementar con un análisis y determinación de albúmina en orina. Los niveles altos de creatinina, son un indicativo de posibles enfermedades renales (McClatchey, 2001). En cuanto a la determinación de creatinina, existió disminución significativa de sus niveles séricos cuando se comparó el grupo diabético absoluto con los grupos experimentales de 500 mg/kg del extracto y del extracto de 750 mg/kg más Acarbosa (300 mg/kg). Como ya se mencionó antes, dicho extracto contiene alcaloides y flavonoides; éstos últimos podrían ejercer su acción antioxidante bloqueando la disminución de superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa, así como la disminución de la expresión de los factores de crecimiento TGF-β1 y CTGF, previniendo el daño renal en la nefropatía diabética (Zou et al., 2014). 39 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES Por lo antes discutido, se puede comentar que el extracto S. humilis es una fuente viable para la obtención de metabolitos con actividad farmacológica. Para ello se recomendaría concretar la identificación de metabolitos con espectrofotometría de masas, desarrollar columnas de cromatografía para obtener las diferentes fracciones y su correspondiente evaluación farmacológica de cada una de ellas, logrando así, un estudio biodirigido. 40 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES CONCLUSIONES El extracto metanólico de S. humilis presentó alcaloides, azúcares reductores, saponinas, flavonoides, cumarinas y quinonas. El extracto metanólico de S. humilis presentó baja actividad antioxidante, el extracto metanólico 50 mg/kg tuvo el mayor efecto, aunque solo alcanzó un 15% inhibición del radical libre DDPH. El extracto metanólico de S. humilis (500 mg/Kg) presentó efecto genoprotector ante la administración de antraceno a partir del primer hasta el tercer día. El extracto metanólico de S. humilis a dosis de 500 mg/Kg presentó actividad anti-hiperglicémica a partir de la primera semana, con dosis de 750 mg/Kg la presenta a partir de la tercera semana y actividad hipoglucemiante con dosis 1000 mg/Kg la presenta a partir de la segunda semana. El extracto metanólico de S. humilis en las tres dosis experimentales (500 mg/Kg, 750 mg/Kg y 1000 mg/kg) presentó efecto protectorante la disminución de peso provocada por STZ durante todo el tratamiento. El extracto metanólico de S. humilis con dosis de 750 mg/Kg más acarbosa 300 mg/Kg presentó efecto sinérgico. El extracto metanólico de la semilla de S. humilis disminuyó significativamente los niveles séricos de glucosa (con dosis de 1000 mg/kg y de 750 mg/kg más acarbosa 300 mg/kg), de triglicéridos (con dosis de 500 mg/kg y 1000 mg/kg), y de creatinina (con dosis de 500 mg/kg y de 750 mg/kg más acarbosa 300 mg/kg). Por lo antes mencionado, se concluye que el extracto de metanólico de la semilla S. humilis, a pesar de la baja actividad antioxidante demostrada en éste trabajo, sería una buena opción terapéutica como coadyuvante para el tratamiento de la diabetes mellitus ya que presentó actividad hipoglucemiante, hipolipemiante y genoprotectora. 41 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES BIBLIOGRAFÍA 1. American Diabetes Association, El diagnóstico de la diabetes e información sobre la prediabetes, 2015, Disponible en: http://www.diabetes.org/es/informacion-basica-de-la-diabetes/diagnstico.html, [Consultado: 24/Junio/2015]. 2. Berdeja Blanca, Manual de Fitoquímica, 2015, Departamento de Farmacia, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas- IPN, México, pp. 20-25. 3. Bhavna S., et al., 2008, Hypoglycemic and hypolipidemic effects of flavonoid rich extract from Eugenia jambolana seeds on streptozotocin induced diabetic rats, Food and Chemical Toxicology, 46 (7): 2376-2383. 4. Bustamante, S. E.; Muñoz, J.; Galardo, R.; Figueroa, H.; Morales, M.A. El extracto de Vitis vinifera revierte la disfunción vascular aortica inducida por diabetes en ratas. Sociedad Asturiana de Fitoterapia. Actas del III Congreso Internacional de Fitoterapia y Técnicas Afines. Ciudad de Oviedo. España. 22- 24 de noviembre de 2002. 5. Campbell A., 2007, Diabetes Self-Management, En: http://www.diabetesselfmanagement.com/blog/troublesome-triglycerides-part- 1/. [Consultado en: 01/07/16] 6. Coman C., et Al., 2012, Plants and natural compounds with antidiabetic action, Notulae Botanicae, Romania. 40 (1): 314-325. 7. Corral S., et al., 1997, Tamizaje, tecnología, control de calidad y farmacología del extracto fluído de Bouganvillea spectabilis Willd, Rev Cubana Plant Med; 2(2- 3):19-25. 8. Dee Unglaub, Sivelthorn, Fisiología Humana, 2009, 4ta Edición, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, pp. 722,723. 9. Dibyendu T., 2013, Antioxidant potential and type II diabetes related enzyme inhibition properties of raw and processed legumes in indian Himalayas, Journal of applied pharmaceutical science, India, 3(3): 13-19. 10. FID, Atlas de la diabetes de la, 6ta edición, Federación Internacional de la Diabetes, En; www.idf.org/diabetesatlas. [Consultado en 05/03/15] 11. Garibello C., 2010, Estudio de Hojas de Pentacalia vaccinioides (Kunth) Cuatr como nueva fuente natural de sustâncias esteroidales y cumarinas, Tesis de maestria, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá. 12. Hernández, F., Nutrientes esenciales en la práctica deportiva, 2004, Cuadernos Psic Dep, no.1 y 2, pp.215-221. 13. Holger J., et Al, 2012, Estudio de sapogeninas esteroidales de espécies peruanas del género dioscorea, Rev. Soc. Quim., Perú, 78 (3): 208- 218. http://www.diabetes.org/es/informacion-basica-de-la-diabetes/diagnstico.html http://www.sciencedirect.com/science/journal/02786915 http://www.diabetesselfmanagement.com/blog/troublesome-triglycerides-part-1/ http://www.diabetesselfmanagement.com/blog/troublesome-triglycerides-part-1/ http://www.idf.org/diabetesatlas 42 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES 14. Islam M. A., 2009, Antidiabetic and hypolipidemic effects of diferente fractions of Catharanthus Roseus (Linn.) on normal and streptozotocin-induced diabetic rats, Journal of scientific research, Bangladesh, 1(2): 334-344. 15. Jácome R., 2005, Fisiología Endócrina, 3ra Edición, Academia Nacional de Medicina, Colombia, pág. 67. 16. Kaleem M., 2006, Antidiabetic and antioxidant activity of Annona squamosal extract in streptozotocin-induced diabetic rats, University Aligarh, India. 47(8): 670-675. 17. Khanna A., 2002, Lipid lowering activity of Phyllanthus niruri in hyperlipemic rats, Central Drug Research Institute, Journal of Ethnopharmacology, India, 82 (1): 19-22. 18. McClatchey K. D., 2001, Clinical laboratory medicine, 2nd ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, pág. 384 19. Münir, O., 2003, Determination of in vitro antioxidant activity of fennel (Foeniculum vulgare) seed extracts, LWT - Food Science and Technology Elsevier, 36 (2): 263-271. 20. Neira, A., 2009, Aislamiento e identificación de los compuestos com actividad antioxidante del extracto de cloroformo de la orquídea comestible Prosthechea michuacana, Tesis de maestria, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, México. 21. Nolte, M.; 2013, Hormonas pancreáticas y fármacos antidiabéticos. En: Katzung B.G.; Masters, S. B.; Trevor, A.J.; Farmacología básica y clínica, 11va Edición, Editorial McGraw Hill, México, pags.727- 747. 22. Norma Oficial Mexicana para la prevención, tratamento y diagnostico de la diabetes mellitus, NOM-015-SSA2-2010, México, Distrito Federal, 2010. 23. Organización Mundial de la Salud, Informe mundial sobre la diabetes, 2016, pp 1-4. 24. Ovalle B., et al, 2014, Hypoglycemic and antihyperglycemic effects of phytopreparations and limonoids from Swietenia humilis, Phytochemestry, Universidad Nacional Autónoma de México, 2015 (110): 111-119. 25. Palomo G. I, et al, 2010, Actividad antioxidante, hipolipemiante y antiplaquetaria el tomate (Solanum lycopersicum L.) y el efecto de su procesamiento y almacenaje, Universidad de Talca, Rev Chil Nutr 37 (4): 524- 533. 26. Pietta, P., 2000, Flavonoids as Antioxidants. Reviews, J. Nat. Prod. 2000 (63): 1035-1042. 27. Powers A. C.; D’Alessio D., 2012, Páncreas endocrino y farmacoterapia de la diabetes mellitus e hipoglucemia. En: Bruton L.L.; Chabner B. A.; Knollman B. http://www.sciencedirect.com/science/journal/00236438 43 ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS JESSICA GUADALUPE LOBATO TORRES C. (eds) Goodman y Gilman Las bases farmacológicas de la terapéutica, 12va Ed., Editorial McGrawHill. México, págs. 1237-1273. 28. Prieto A., 1992, Polisacáridos de Talaromyces: su aplicación en quimiotaxonomía, Tesis de Doctorado, Universidad Complutense de Madrid, España. 29. Ravi K., et al, 2005, Antihyperlipidemia effect of Eugenia jambolana seed kernel on streptozotocin-induced diabetes in rats. Food Chem Toxicol 2005, (43): 1433-1439. 30. Revista Bienestar y Salud, Guía Diabetes, Junio 2015, Disponible en: http://www.diabetesbienestarysalud.com/2013/02/cuales-son-los-niveles- optimos-de-glucosa/, [Consultado: 24/Junio/2015]. 31. Rico L., et al, Evaluación toxicológica y farmacológica del extracto etanólico de las semillas de Swietenia humilis Zucc, 2014, Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, México, 45 (2): 77-83. 32. Rojas, M., 2011, Tratamiento alternativo com cuahuilote (Guazuma ulmifolia Lam.) y zopilote (Swietenia humilis Zucc.) para diabéticos que no responden a los hipoglucemiantes orales. En: http://www.tlahui.com/medic/medic32/diabetes_cuahui_zopil.htm. [Consultado en 05/04/15]. 33. Shinde U. y Goyal R., 2003, Effect of chromium picolinate on histopathological alterations in STZ and neonatal STZ diabetic rats. J Cell Mol Med 7:322-329. 34. Singh, Jadish et al, 2001, Evaluation of in-vitro antioxidant activity of Ougeinia oojeinensis leaves, Department of Technical Education, Govt. Of Punjab, Chandigarh, India. 2:1188-1195. 35. Soon H., 2013, Antidiabetic and Antioxidant Properties of Alkaloids from Catharanthus roseus (L.) G. Don, Molecules, 18: 9770-9784. 36. Standley P., 1920, Trees and Shrubs of Mexico, United States National