Lorena-MunguAa-Verdi

Vista previa del material en texto

Munguía Verdi Lorena Página 1 
 
 
 
 
 
 
 
 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
 
 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA UPIBI 
 
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA CINVESTAV 
 
 
 
 
PRODUCCIÓN DE INVERTASA DE Cellulomonas flavigena Y AVANCES EN 
LA SINTESIS QUIMICA ENZIMATICA DE IMINOAZÚCARES 
 
 
Tesis que presenta: 
Munguía Verdi Lorena 
Para obtener el grado de: 
“MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS” 
Director interno: 
Dr.Marco Augusto Brito Arias 
Director Externo: 
Dr. Maria del Carmen Montes Horcasitas 
 
 
 
 
 
México DF Septiembre del 2010 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 2 
 
 
ÍNDICE 
 
 RESUMEN 
 1. INTRODUCCIÓN 
 1.1 INHIBIDORES DE α-GLICOSIDASA 
 1.2 MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LAS GLICOSIDASAS 
 1.3 PREPARACIÓN DE IMINOAZUCARES 
 1.4 SINTESIS QUÍMICO ENZIMÁTICA CABOHIDRATOS 
 1.5 SACAROSA E INVERTASA 
 1.6 FUENTES DE AISLAMIENTO DE LA INVERTASA 
 1.7 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LA INVERTASA 
 1.8 MECANISMOS DE HIDRÓLISIS DEL ENLACE O-GLICOSIDICO 
 2. JUSTIFICACIÓN 
 3. HIPÓTESIS 
 4. OBJETIVOS 
 4.1 OBJETIVO GENERAL 
 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 6. METODOLOGÍA 
 6.1 MICROORGANISMO 
 6.1.2 PREPARACION DEL INOCULO 
 6.1.3 OBTENCION DE LA ENZIMA 
 6.1.4 AISLAMIENTO DE LA ENZIMA 
 6.1.5 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
 
 1 
3 
3 
5 
7 
 
8 
 
10 
 
11 
 
12 
 
14 
 
17 
 
18 
 
19 
 
19 
 
19 
20 
 
21 
21 
 
21 
 
22 
 
22 
 
23 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 3 
 
 6.2 CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA 
6.2.1 EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA DE INCUBACION SOBRE LA 
ACTIVIDAD ENZIMATICA 
6.2.3 DETERMINACION DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS (KM Y VMAX
6.2.4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIDRÓLITICA DE LA INVERTASA DE 
C.FLAVIGENA SOBRE EL INTERMEDIARIO. 
) 
6.2.5 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIDRÓLITICA DE LA INVERTASA 
COMERCIAL DE SACHAROMYCES CEREVISAE SOBRE LOS INTERMEDIARIOS 
OBTENIDOS EN LA RUTA SINTÉTICA. 
6.2.4 TERMO ESTABILIDAD 
6.3 OBTENCIÓN DE LOS AMINO AZÚCARES 
7. DESARROLLO EXPERIMENTAL 
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
8.1 PRODUCCIÓN 
8.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA 
8.2.1 PH Y TEMPERATURA ÓPTIMA 
8.3 TERMO ESTABILIDAD 
8.4 PARAMÉTROS CINÉTICOS 
8.5 OBTENCIÓN DE LOS IMINOAZÚCARES 
9. EVALUACIÓN ENZIMÁTICA 
10.CONCLUSIONES 
12. BIBLIOGRAFÍA 
 
 
 
 23 
 
23 
 
 
 
24 
 
 
24 
 
 
 
 
24 
 
25 
 
25 
 
 31 
 
35 
 
35 
 
37 
 
41 
 
43 
 
44 
 
42 
 
59 
 
63 
 
65 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 4 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
 
Figura 1. 
Figura 2. 
Figura 3. 
 
 
 
Figura 4. 
Figura 5. 
Figura 6. 
Figura 7. 
Figura 8. 
Figura 9. 
Figura 10. 
 
Figura 11. 
 
Figura 12. 
 
Figura 13. 
Figura 14. 
Figura 15. 
Figura 16. 
Figura 17. 
 
Algunas glicoresinas aisladas de plantas del género Ipomoea tricolor 
Desconexión entre la subunidad disacárida macrocíclica de la Tricolorina A 
I.- Representación ORTEP de una de las conformaciones de la tricolorina 
A en estado sólido; II.-Representación gráfica de la celda unitaria. Las 
moléculas de la tricolorina A se indican como Mol1-Mol4 y las de agua 
como W1-W18 
Método de Michael 
Método de Fischer 
Método de Koenigs-Knorr 
Síntesis de O-glicosil-α-tricloroacetimidato 
Estrategia general para inducir la formación de enlaces O-glicosídicos 
Esquema de la secuencia de la metodología. 
Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-6) 
lactonizado y condiciones de reacción 
Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-4) 
lactonizado y condiciones de reacción 
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3
Espectro de RMN de 
) de penta-
acetato de glucosa. 
1
Espectro de RMN de 
H en cloroformo deuterado del intermediario 1 
1
Espectro de RMN de 
H en cloroformo deuterado del intermediario 3 
1
Espectro de RMN de 
H en cloroformo deuterado del intermediario 4 
1
Espectro de RMN de 
H en cloroformo deuterado del intermediario 7 
13
 
C del intermediario 7 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 5 
 
1. RESUMEN 
La diabetes es una enfermedad que representa un problema de salud de alto 
impacto debido a su incidencia y mortandad. Aunque existen diversas estrategias 
terapéuticas que permiten controlar este padecimiento, se observan 
complicaciones como la falta de respuesta en la producción de insulina por parte 
del páncreas, o bien efectos indeseables asociados a tratamientos con estos 
agentes hipoglucemiantes. En la búsqueda de alternativas terapéuticas más 
eficientes y con mínimos efectos indeseables se plantea la obtención de 
iminoazúcares empleando una aproximación quimioenzimática. Este proyecto 
plantea en su primera etapa la obtención de la enzima invertasa a partir de una 
cepa diferente a las ya reportadas de Cellulomona flavigena que será empleada 
en el paso crítico de hidrólisis de los derivados de aminosacarosa 7, 17 para 
generar los iminoazúcares 10 y 20 de potencial actividad hipoglucemiante. 
La primera etapa del proyecto consistió en obtener invertasa de una fuente 
diferente a las ya reportadas (cepa de Cellulomona flavigena) mediante un cultivo 
por lote en un reactor tipo tanque agitado, caracterizando la enzima (pH, 
Temperatura, parámetros cinéticos y termo estabilidad), seguido del desarrollo de 
intermediarios de iminoazucares a partir de sacarosa planteados en tres diferentes 
esquemas, los cuales difieren en que el primero y tercero plantean la 
incorporación de un grupo amino a la posición 4’ de fructosa y la segunda a la 
posición 6 de glucosa de la sacarosa. La estrategia general propone la protección 
selectiva de algunas posiciones hidroxílicas del disacárido y posterior secuencia 
de tosilación, intercambio por azida y posterior reducción y desprotección para 
generar los correspondientes derivados de sacarosa 7 y 17. Una vez instalado el 
 
Munguía Verdi Lorena Página 6 
 
grupo amino en las posiciones antes mencionadas se propone la hidrólisis 
enzimática de los derivados de sacarosa modificados para lo cual se emplea 
invertasa comercial y aislada de Cellulomona flavigena. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
Munguía Verdi Lorena Página 7 
 
1.1 SACAROSA E INVERTASA 
Todos los organismos vivos (desde microorganismos hasta el hombre) dependen 
de miles de diferentes enzimas que catalizan gran cantidad de diferentes 
reacciones en las células, su uso ha nivel industrial se ha incrementado durante 
los últimos 20 años aplicándose en alimentos, detergentes, métodos analíticos, 
medicina,etc. 
Las enzimas son catalizadores naturales que al desnaturalizarlas provoca perdida 
de sus propiedades catalíticas cuando se exponen a altas temperaturas, alta 
acidez o alcalinidad o a solventes orgánicos . 
Las fuentes de aislamiento pueden ser de origen vegetal, animal o de algún 
microorganismo y actualmente se procura producir enzimas de microorganismos 
por disponibilidad, flexibilidad y economía 
 
La sacarosa es un disacárido abundante y accesible que se obtiene de la caña de 
azúcar y México ocupa el sexto lugar como productor a nivel mundial y de donde 
se extrae del 8 al 15% de sacarosa a partir de la zafra de la caña de azúcar 
(www.perafan.com). 
La sacarosa es hidrolizada enzimáticamente por la invertasa. El nombre oficial de 
la invertasa es β-fructofuranosidasa fructohidrolasa (E.C. 3.2.1.26) también 
conocida como beta-fructosidasa o sacarasa. Actúa sobre el enlace 0 - glicosídico 
de la sacarosa produciendo una mezcla equimolar de los monosacáridos 
α-D-glucopiranosay α-D-fructofuranosa en cantidades equivalentes (figura 3). Su 
nombre se debe a que producto de su hidrólisis cambia su rotación óptica de la 
 
Munguía Verdi Lorena Página 8 
 
sacarosa [+ 66.5] a una rotación negativa, que es promedio de la rotación de la 
glucosa [+52.7] y de la fructosa [-92.4]. 
 
O O
O OH
OH
OH
HO
HO
OH
OH
OH
Invertasa O
OH
HO OH
OH
OH
O OH
HO
HO
OH
OH
+
 
 Sacarosa α-D-glucopiranosa α-D-fructofuranosa 
 
 
Figura 4. Reacción de hidrólisis de sacarosa por la enzima invertasa. 
 
 
 
1.2 FUENTES DE AISLAMIENTO DE LA INVERTASA 
 
La invertasa puede ser extraída tanto de plantas como de microorganismos. En 
plantas se ha estudiado en arroz (Oryza Sativa), Bamboo (Chia-Chen Liu, 2005), 
pera (Hiroshi Hashizume, 2003), Durazno (Moriguchi, 1991), Papa (Burch, 1992) y 
zanahoria (Isla, 1996). 
Ha sido aislada de diferentes microorganismos como: Zymomonas mobillis, 
Neuroespora crasa, Aspergillus nidulans, Aspergillus Níger, Aspergillus phicum, 
Sacharomyces cerevisia, Candida utilis, Fusarium oxyporum, Cellulomonas 
flavigena, entre otros. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 9 
 
 
 
1.3 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LA INVERTASA 
 
La invertasa puede estar presente en diversas isoformas, las cuales desempeñan 
la misma función de hidrólisis; pero, difieren en tamaño, propiedades bioquímicas 
y localización celular. Por su localización subcelular, la invertasa puede 
clasificarse en: extracelular; intracelular, peri plasmática ò vacuolar, en el caso de 
plantas (www.brenda.unikoeln.de). 
Las invertasas dependiendo de su pH óptimo se pueden clasificar en: acidas, 
básicas o neutras. El rango de pH óptimo reportado en la literatura es de 3.5-7.8; 
su temperatura óptima se encuentra entre 50-60ºC. (www.brenda.unikoeln.de). 
 
Tanto en bacterias como hongos la invertasa puede ser intracelular o extracelular. 
En Saccharomyces cerevisiae la enzima extracelular tiene un peso molecular 
aproximado de 270 KDa y la intracelular es de 60 KDa (jee-Songy col. 1996). 
 
La diferencia que existe en el peso molecular se debe a que la invertasa 
extracelular es una glicoproteína que tiene asociada a su cadena polipeptídica 
monosacáridos. El porcentaje de estos monosacáridos con respecto a la proteína 
total se le conoce como grado de glicolisación que en el caso de la invertasa 
puede variar entre 20 y 45%. El grado de glicolisación depende de la fuente de y 
localización celular. Estos monosacáridos son generalmente galactosa, N-acetil 
http://www.brenda.unikoeln.de/�
http://www.brenda.unikoeln.de/�
 
Munguía Verdi Lorena Página 10 
 
glucosamina, glucosa, manosa, este ultimo es el mas abundante en algunos tipos 
de invertasa (jee-Song y col.1996). 
 
En la siguiente tabla se muestran datos acerca del pH óptimo para las invertasas 
provenientes de hongos, bacterias y plantas; su temperatura óptima, la afinidad 
por el sustrato para sacarosa, (www.brenda.unikoeln.de). 
Tabla 2. Características Bioquímicas de invertasas provenientes de bacterias, hongos 
levaduras y plantas 
 
 
Esta enzima presenta generalmente inhibición por metales pesados. El mercurio 
tiene un fuerte efecto inhibitorio para muchas enzimas; sin embargo algunas son 
menos sensibles, la invertasa proveniente de Aspergillus niger a concentración 
1mM puede conservar entre un 62 a 72% de su actividad enzimática (Hocine y col. 
2000) 
 
 
1.4 MECANISMOS DE HIDRÓLISIS DEL ENLACE O-GLICOSIDICO 
 
Bacterias 
Intracelulares y 
Extracelulares Hongos y Levaduras Plantas 
 Intracelular Extracelular 
Vac. y 
Extarcelular Citosol 
pH 3.5 - 5.5 4.5 - 5.5 4.5 - 5.5 4.5- 5 7 - 7.8 
Temp(ºC) 40 - 60 50 - 60 50 - 60 
Peso molecular 45 - 60 45 - 60 50 - 60 55 - 70 54 -65 
Inhibición por 
metales 
pesados Si Si Si No 
http://www.brenda.unikoeln.de/�
 
Munguía Verdi Lorena Página 11 
 
 
Las glicosilhidrolasas son definidas como (EC 3.2.1.x), donde los tres primeros 
dígitos indican la propiedad de hidrolizar el enlace O-glicosídico, y el cuarto (x) 
indica el tipo de substrato. La hidrólisis del enlace glicosídico catalizada por las 
distintas variedades de glicosilhidrolasas está mediada por la acción de dos 
residuos catalíticos presentes en el centro activo, uno de los cuales actúa como 
donador de protones y el otro como nucleófilo o base. En la mayor parte de los 
casos son dos residuos carboxílicos. El enlace glicosídico puede hidrolizarse de 
dos formas distintas, atendiendo a cual sea la configuración del carbono 
anomérico resultante de la hidrólisis. Una primera posibilidad es que la 
configuración anomérica cambie. A la reacción hidrólitica que se desarrolla de esta 
forma se la designa como mecanismo de inversión (Figura 2A). La posibilidad 
alternativa es que la configuración anomérica se mantenga. Es lo que se 
denomina mecanismo de retención (Figura 2B). En las glicosidasas que operan 
mediante inversión, la distancia de separación de los dos carboxilos catalíticos es 
de aproximadamente 10 Å, mientras que en las enzimas que retienen la 
configuración del enlace, la separación es alrededor de 5 Å. El mecanismo de 
inversión tiene lugar en una sola etapa, mediante un proceso catalítico ácido-base. 
Uno de los dos residuos catalíticos opera como base, facilitando el ataque de una 
molécula de agua al carbono anomérico y el otro, como ácido, asistiendo la 
separación del oxígeno. El mecanismo de retención tiene lugar mediante un doble 
desplazamiento. En este proceso tiene lugar el ataque del residuo nucleófilo al 
carbono anomérico. Como resultado tiene lugar la formación transitoria de un 
enlace covalente entre la enzima y el glicósido. Este enlace es lo suficientemente 
 
Munguía Verdi Lorena Página 12 
 
estable como para permitir la separación del centro activo de la parte liberada y su 
reemplazamiento por una molécula de agua, con asistencia de un segundo 
residuo catalítico ácido/base que actúa en la primera etapa como ácido, 
protonando el oxígeno glicosídico, y como base en la segunda, sustrayendo un 
protón de una molécula de agua que deshace el enlace covalente transitorio y 
regenera a la enzima (Flores, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 13 
 
 
 
Figura 5. Mecanismos de hidrólisis del enlace glicosídico. El esquema representa la 
reacción que ocurre en el sitio catalítico de las glicosil hidrolasas que operan mediante: A, 
mecanismo de inversión .B, Mecanismo de retención. Adaptado de Rye and Withers. 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 14 
 
1.5 INHIBIDORES DE α-GLICOSIDASA 
 
Los inhibidores de α-glicosidasa son compuestos de naturaleza glicosídica que 
contienen en su estructura nitrógeno intra o extracíclico. Estos derivados han 
cobrado una gran importancia en la terapéutica debido a que al inhibir α-
glicosidasa producen un efecto hipoglucemiante y por consiguiente son de gran 
utilidad en el control de glucosa sanguínea en pacientes con diabetes mellitus. 
Actualmente el pseudotetrasacárido Acarbosa y el iminoazúcar Miglitol el cual es 
un derivado de 1-desoxynojirimicina, son 2 inhibidores de α -glicosidasa 
aprobados para su uso en pacientes con diabetes tipo II (Jacob, 1995). Otros 
candidatos que se encuentran en fase clínica avanzada son castanopermina, 
swainsonina, kifunensina, y desoximanojirimicina entre otros representados en la 
figura 1. 
N
OH
HO
HO
HO
castanospermina
NH
OH
HO
HO
HO
desoximannonojirimicina
N
HO
N
HO
HO
OH
swainsonina
NH
O
O
OHOH
HO
kifunensina 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 15 
 
OHHO
HO
OH
N
H
O
OH
OH
HO
O O
OH
OH
HO
O O
OH
OH
HO
OH
Acarbosa
N
OH
OH
HO
OH
OH
Miglitol
 
Figura 1. Estructura de inhibidores de α-glicosidasa usados en el tratamiento de diabetes 
mellitus tipo II. 
1.6 MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LAS GLICOSIDASAS 
Las glicosidasasson enzimas que desempeñan un papel importante en el 
procesamiento de varias glicoproteínas y glicolípidos, y se ha postulado que el 
mecanismo de inhibición procede a través de un estado de transición de media 
silla cargado positivamente que interactúa con los residuos de ión carboxilato y 
GDP (Guanin Difosfato) en el sitio activo de la enzima como se observa en la 
figura 2 (Ichikawa, 1992). 
B
H
O
NH2
OH
HO
OH
OH
PO
O
O
O P
O
O
O
O
G OH
OH
 
Figura 2. Mecanismo de inhibición de iminoazúcares en el sitio de acción de 
α-glucosidasa. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 16 
 
 
 
Asimismo, como se observa en la figura 3 se han determinado las posiciones 
dentro de la secuencia glicosídica sobre los cuales los inhibidores de α-
glucosidasa ejercen su actividad inhibitoria (Wong and Kajimoto, 1995). 
 
 
Glc Glc Glc Man Man Man
Man
Man
ManMan
ManMan
GlcNAc GlcNAc Asn
castanospermina
desoxinojirimicina
N-metildesoxinojirimicina
glucosidasa I
desoxinojirimicina
glucosidasa II
desoximannonojirimicina
mannosidase I
desoximannonojirimicina
mannosidase I
mannosidase II
swainsonina
kifunensina
 
 
Figura 3. Sitios de acción de inhibidores de glicosidasa en la biosíntesis de proteínas. 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 17 
 
 
 
1.7 PREPARACIÓN DE IMINOAZUCARES 
 
El desarrollo de métodos de síntesis asimétrica tanto químicos como enzimáticos 
para la obtención de iminoazúcares ha tenido un significativo desempeño y 
potencial, generando una importante variedad de sustancias activas en el 
tratamiénto del HIV, diabetes, enfermedad de Gaucher, y cáncer. (Brito-Arias, 
2006). Algunas de las rutas sintéticas descritas con éxito incluyen aproximaciones 
tipo azida a partir de monosacáridos (Ichikawa, 1998; Roy, 2006), así como por 
síntesis enantioselectiva de tipo química y enzimática. Para el primer caso se ha 
reportado la síntesis enantioselectiva en presencia de (S)-Prolina como 
organocatalizador (Liao, 2006), y para el segundo de aldolasas (Gijsen, 1996) y 
lipasas (Look, 1993) a partir de diversos sustratos donantes entre los que se 
mencionan 2-azido aldehídos (Hung, 1991), epoxidos (Kanerva, 1993), 
cinamaldehido (Wong, 1995), y dihidroxi acetona fosfato (DHAP), seguido por 
aminación reductiva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 18 
 
 
 
1.8 SINTESIS QUÍMICO ENZIMÁTICA DE CABOHIDRATOS 
 
La síntesis químico enzimática de sustancias de potencial uso terapéutico es una 
poderosa herramienta combinatoria ya que aprovecha los beneficios de ambas, es 
decir a través de la síntesis orgánica se pueden preparar una amplia variedad de 
precursores de manera accesible, y a través de la biocatálisis enzimática para 
llevar a cabo 
transformaciones con una elevada estéreo especificidad y estéreo selectividad. El 
uso de enzimas para llevar transformaciones químicas ha tenido un desarrollo 
notable principalmente en la síntesis asimétrica y la resolución cinética de mezclas 
racémicas. Recientemente, la desimetrización entendiéndose como la 
modificación enzimática que elimina uno o más elementos de simetría como 
estrategia para obtener sustancias óptimamente puras, se revela como otra 
estrategia de gran potencial (García-Urdiales, 2005). 
 
La síntesis enzimática de carbohidratos requiere principalmente del uso de 
aldolasas. Estas enzimas generan hexosas a partir de componentes de tres 
carbonos a través de una condensación aldólica. Existen alrededor de 30 
aldolasas identificadas y aisladas siendo estas clasificadas en aldolasas tipo 1 y 
tipo 2 dependiendo del mecanismo involucrado. Desde el punto de vista sintético 
las aldolasas se clasifican en 5 grupos dependiendo del donante y el producto 
formado (H.M. Gijsen y colaboradores (1996): Dihidroxiacetona fosfato aldolasa, 
 
Munguía Verdi Lorena Página 19 
 
Piruvato aldolasa, 2-Desoxiribosa 5-fosfato aldolasa, Glicina aldolasa y Otras 
aldolasas. 
Para el desarrollo de la alternativa química enzimática con la que se desarrollo 
este proyecto, se produjo invertasa a partir de una bacteria llamada Cellulomonas 
flavigena, la cual es una bacteria gram positiva, sus colonias son de color marfil y 
tienen forma de bastón. Posteriormente se probo su actividad hidrólitica en los 
intermediarios del sustrato modificado partiendo de sacarosa, que conducen a la 
obtención de un iminoazúcar de posible potencial efecto inhibitorio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 20 
 
 
Tabla 1. Substratos naturales para aldolasas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 21 
 
 
2. JUSTIFICACIÓN 
Debido al papel central que tiene la invertasa en la liberación de fructosa y glucosa 
a partir de sacarosa se buscan métodos alternativos de purificación de esta 
enzima a partir de cepas alternativas a las ya reportadas. Asimismo, su 
purificación servirá para llevar a cabo estudios de reconocimiento enzimático 
empleando derivados de aminosacrosa los cuales son sintetizados y 
caracterizados espectroscópicamente y serán a su vez evaluados como posibles 
agentes hipoglucemiantes a través de la inhibición de alfa glucosidasa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 22 
 
 
3. HIPÓTESIS 
 
La invertasa obtenida de C. flavigena ejercerá su actividad hidrólitica sobre el 
enlace O-glicosídico de los derivados de sacarosa modificada 7 (Esquema 1, 
pagina 27), 17 (Esquema 2, pagina 29) y 26 (Esquema 3, pagina 30), los cuales 
contienen un grupo amino en lugar de hidroxilo en las posiciones 4’ de fructosa y 
6’ de glucosa. Esta actividad hidrólitica generará los intermediarios 9 (Esquema 1) 
y 18 (Esquema 2), los cuales llevarán a cabo un cierre de anillo para generar los 
iminoazúcares 10 y 20 respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 23 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1 OBJETIVO GENERAL 
 
 Producción de la invertasa de C.flavigena 
 Desarrollar intermediarios vía químico enzimática que conduzcan a un 
iminoazúcar de potencial actividad inhibitoria de (-glucosidasa a partir de 
sacarosa. 
 
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 Caracterización cinética de la enzima 
 Obtención de los intermediarios de la ruta sintética empleada en la 
transformaron de la sacarosa hasta el iminoazúcar. 
 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre 
los intermediarios 7,17 y 26. 
 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de 
Sacharomyces cerevisae sobre los intermediarios obtenidos en la ruta 
sintética 7,17 y 26. 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 24 
 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Los reactivos empleados son de grado analítico obtenidos comercialmente 
(Sigma-Aldrich Co.) y los disolventes usados fueron destilados previos a su uso. 
La purificación de los intermediarios fue llevada a cabo usando como fase 
estacionaria silica gel 60 (Merck Co.) y el curso de las reacciones fue monitoreada 
por cromatografía en capa fina usando cromatofolios de silica gel 60 y como 
sistema revelador solución de sulfato cerico amoniacal seguido por calentamiento. 
Los espectros de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN) y carbono 
(13
 
C RMN) fueron registrados en un espectrómetro Varían 300 Gemini usando 
cloroformo deuterado como disolvente. 
Para la producción del extracto enzimático se utilizo un reactor de 10 L en un 
cultivo por lote, el sustrato fue sacarosa grado reactivo así como todos los 
componentes del medio de cultivo. Para su caracterización también se utilizaron 
reactivos de grado analítico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 25 
 
 
 
6. METODOLOGÍA 
6.1.1 Microorganismo 
 
Cellulomonas flavigena CDBB 531, obtenida de la Colección microbiana del 
CINVESTAV. La cepa de este microorganismo se resembró cada mes en tubos 
deagar inclinados con un medio de conservación específico. 
 
6.1.2 Preparación del inóculo 
 
La producción del extracto enzimático, se realizó en un cultivo por lote. El 
crecimiento de Cellulomonas flavigena de un tubo de agar, se resuspendió en 3.3 
ml de regulador de fosfatos (1.22 M pH 7) y se transfirió a un matraz Erlenmeyer 
nefelométrico de 500 ml con 100 ml de medio conteniendo: 10 g/L Glicerol, 3 g/L 
(NH4)2SO4, 0.16 g/L MgSO47H2O, 0.075 g/L NaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O, 800 
µg/L ZnSO47H2O, 21µg/L MnCl2 4H2O2
 
, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina, el 
cual se incubó a 150 rpm, a 37ºC por 24 h. El crecimiento fue medido por 
densidad óptica y se utilizó como inóculo 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 26 
 
 
 
6.1.3 Obtención de la enzima 
 
Se realizó un cultivo por lote, en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de 
10 L, conteniendo 5 L con la siguiente composición: 10 g/L Sacarosa,3 g/L 
(NH4)2SO4,0.16 g/L MgSO47H2O, 0.075 g/LNaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O,800 µg/L 
ZnSO47H2O,21µg/LMnCl2 4H2O2,120µg/L FeSO4 /H2O,120µg/L CoCl2 6H2O, 
0.13µg/L Na2MoO4 2H2O,0.7µg/L CuCl2 H2O,1.1µg/L BaCl2 2H2O,1.25µg/L NiSo4 
6H2O,0.75µg/L Na2B4O7 10H2
 
O,0.65µg/L Kl, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina 
y Fosfatos 2 mMoles. El cultivo se incubó durante 32 h a 37°C. Las células se 
separaron por centrifugación a 10000 revoluciones por minuto por 40 min a 4°C, y 
se utilizaron para el aislamiento, caracterización de la enzima y su uso en la 
obtención de los intermediarios de sacarosa modificados. 
6.1.4 Aislamiento de la enzima 
 
Como la enzima es intracelular, las células se lavaron con buffer de acetatos y se 
adicionó un inhibidor de proteasas (PMSF (Fenilmetilsulfonil floruro) a 1mM). 
Posteriormente se rompieron en una prensa francesa (French preassure cell 
press. American Instrument.co.inc.) a una presión de 1500 psig (libras por pulgada 
cuadrada) . Las células rotas fueron centrifugadas a 10000 revoluciones por 
minuto y lavadas con buffer de acetatos, para su posterior caracterización y 
utilización en los intermediarios de sacarosa modificada. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 27 
 
 
 
6.1.5 Determinación de la actividad enzimática 
 
Se utilizó sacarosa al10% p/v, como sustrato en la determinación de la actividad 
enzimática. 
La actividad fue determinada incubando una cantidad apropiada del extracto 
enzimático, sustrato y regulador de Tris HCl 0.1M pH 7, en un volumen final de 
1750µL e incubando a 55ºC por 5 min. La liberación de azúcares reductores se 
siguió por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959) usando una 
mezcla equimolar de glucosa y fructosa como estándar. La actividad se expresó 
en unidades internacionales (UI). Una unidad internacional (UI) de actividad se 
definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de azúcares 
reductores equivalentes a fructosa en las condiciones mencionadas. Todos los 
ensayos fueron hechos por triplicado y se reportó el valor promedio. 
 
6.2 Caracterización enzimática 
6.2.1 Efecto del pH y de la temperatura de incubación sobre la actividad de 
invertasa 
Se observó el efecto del pH sobre la actividad de la enzima a valores de pH entre 
5.5 y 8 en buffer de Tris - HCl 0.1M a la temperatura óptima previamente 
determinada. Para la temperatura óptima para la actividad enzimática, se 
determinó incubando la enzima en presencia del sustrato por 5 min a 
 
Munguía Verdi Lorena Página 28 
 
temperaturas entre 50-65 ºC. en el buffer antes mencionado al pH que resulto 
óptimo para la enzima. 
 
6.2.3 Determinación de los parámetros cinéticos 
 
Para la determinación del Km y Vmax
 
, se trabajo a los valores óptimos de pH y 
temperatura utilizando concentraciones variables de sacarosa (5% al 40%) y para 
el cálculo de las constantes, se empleo la representación de Lineaweaver- Burk. 
6.2.4 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre el 
intermediario. 
 
A 1750 µL de buffer de Tris HCl 0.1M pH 7 conteniendo cada uno de los 
intermediarios, disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v), se 
adicionaron 250 µL del extracto enzimático de C. flavigena. La actividad de la 
invertasa fue determinada por método de DNS (Miller, 1959). 
 
 
6.2.5 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de 
Sacharomyces cerevisae sobre los intermediarios obtenidos en la ruta sintética. 
 
A 1750 µL de buffer de acetatos 0.1M pH 5.5 conteniendo cada uno de los 
intermediarios disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v) se le 
adicionaron 250 µL de una solución enzimática de una invertasa comercial de 
 
Munguía Verdi Lorena Página 29 
 
 
 
Sacharomyces cerevisae. La actividad de la invertasa fue determinada por 
método de DNS (Miller, 1959). 
 
 
6.2.4 Termo estabilidad 
 
La estabilidad de la enzima con respecto al tiempo se midió incubando una 
cantidad de enzima constante a 55°C tomando alícuotas a diferentes tiempos y 
midiendo actividad enzimática por el método del DNS (Miller, 1959) 
 
6.3 Obtención de los Amino azúcares 
 
La metodología sintética para la obtención de los iminoazúcares objeto de nuestro 
estudio se basa en los esquemas 1 y 2 que se describe a continuación. 
 
El esquema 1 inicia con la protección selectiva de sacarosa 1 en las posiciones 
hidroxílcas 6 y 4 de glucosa para los cual se utiliza benzaldehído dimetilacetal en 
medio ácido (Garegg, 1995, Robyt, 1997), generando el intermediario protegido 2. 
El siguiente paso consiste en la reacción de tosilación en piridina para incorporar 
el ester sulfónico en la posición 4’ de fructosa conteniendo la posición hidroxílica 
primaria (Rai, 2005), para generar el intermediario 3. Posterior peracetilación con 
anhídrido acético en piridina conduce a la obtención del intermediario 4, este 
 
Munguía Verdi Lorena Página 30 
 
último paso tiene la finalidad de permitir la separación de las señales de los 
hidrógenos del disacárido en su espectro de resonancia magnética nuclear de 
 
hidrógeno (1
subsecuente de este intermediario bajo condiciones de hidrogenación catalítica 
conduce a la formación intermediario 6 el cual contiene una amina primaria en la 
posición 4’ de la fracción de fructosa del disacárido. La remoción final de los 
grupos protectores bencilinen y acetato se llevara a cabo con Yodo en metanol y 
solución de metóxido de sodio respectivamente para generar el intermediario de 
sacarosa isostérico 7. 
H RMN) así como favorecer la purificación del disacárido en sistemas 
no polares. El intermediario resultante se hace reaccionar con azida de sodio en 
DMF para mediante una reacción de sustitución nucleofílica reemplazar el grupo 
tosilo por el grupo azida y dar lugar a la formación del intermediario 5. La reacción 
 
El siguiente paso es crítico y consiste en someter el intermediario 7 a la acción de 
la enzima hidrólitica invertasa la cual presumiblemente debe reconocer el sustrato 
modificado conteniendo el grupo amino en la posición 4’ de fructosa que es un 
isóster clásico del alcohol primario del sustrato natural. Si el reconocimiento no es 
posible se someterá el intermediario de sacarosa antes mencionado a condiciones 
de hidrólisis ácida con la finalidad de separar los monómeros constitutivos, 
aunque como se ha documentado existe el riesgo de modificación estructural de 
los carbohidratos cuando están sujetos a condiciones ácidas (Brito-Arias, 2006). 
Para esta ruta sintética la hidrólisis del disacárido modificado representa la 
 
Munguía Verdi Lorena Página 31 
 
liberación del intermediario de fructosa 9 conteniendo el grupo amino el cual 
llevara a cabo una reacción de adición nucleofílica intramolecular (Ichikawa, 1998) 
 
 
dando lugar a la formación de la imina cíclica la cual por reducción catalítica 
conducirá a la formación del imino azúcar 10 que constituye uno de los productosde interés como sustancia activa de potencial actividad hipoglucemiante. 
 
 
Esquema 1 
 
 
O
R1O
R1O
R2O
OR2 O O
OR3
OR3
R4
R3O
O
R1O
R1O
R2O
OR2 OH
O
OR3
OR3
OR4
R3O
1 R1, R2, R3= H, R4 = OH
2 R1 = CH(Ph), R2, R3 = H, R4 = OH
i
vii
4 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = OTs
5 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
6 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
iv
HO
+
7 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
v
O
HO
OH
H2NNHO
OH
HO
H
HO
vii
8 9
10
3 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = H, R4 = OTs
vi
 
i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.
vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH. 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 32 
 
 
 
El esquema 2 propone la protección inicial de sacarosa 1 con benzaldehído 
dimetilacetal en medio ácido generando el intermediario 11 el cual es sometido a 
condiciones de peracetilación dando lugar al intermediario 12. El siguiente paso 
consiste en la remoción del grupo benciliden de las posiciones 4 y 6 de glucosa 
para lo cual se emplea yodo en metanol a reflujo (Robyt, 1996) generando el 
intermediario parcialmente protegido 13 el cual se hace reaccionar con cloruro de 
tosilo en piridina con la finalidad de producir el intermediario 14, el cual contiene el 
éster sulfónico en la posición 6 de glucosa. Posteriormente se sigue una 
secuencia de pasos similares al esquema 1 consistentes en la reacción con azida 
de sodio en DMF e hidrogenación catalítica para dar lugar a la obtención de los 
intermediarios 6 y 7 respectivamente. La reacción de desacetilación para generar 
el intermediario 15 será un paso previo para la reacción de hidrólisis enzimática 
del disacárido modificado antes mencionado el cual contiene el grupo amino en la 
posición 6 de glucosa. La acción hidrólitica de invertasa liberará el intermediario 
aminado de glucosa 16 el cual llevara a cabo la ciclización intramolecular para 
conducir a la imina cíclica que generara después de ser sometida a hidrogenación 
catalítica a la formación del iminoazúcar 17 siendo este el producto de interés en 
esta síntesis. 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 33 
 
 
 
 
Esquema 2 
 
O
R1
R2
R3O
OR3 O O
OR4
OR4
OR5
R4O
O
R1O
R1'O
R2O
OR2 OH
O
OR3
OR3
OR4
R3O
1 R1, R2 = OH, R3, R3, R4, R5 = H
11 R1, R2 = O2CH(Ph), R3, R4, R5 = H
i
viii
ii
iii
iv
HO
+
v
ix
18 19
20
H
NH2
O
OH
OH
OH
N
OH
OH
HO
H12 R1, R2 = O2CH(Ph), R3, R4, R5 = Ac
13 R1, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
14 R1 = OTs, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
15 R1 = N3, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
16 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
17 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = H
vi
vii
 
 
 
i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) Ac2O, Py, t.a. iii) I2, MeOH reflujo iv) TsCl, Py, t.a., 7 h. v) NaN3, DMF, reflujo 
6 h. vi) H2, Pd-C, EtOH. vii) MeONa, MeOH. viii) Invertasa. o H3O+. ix) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH. 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 34 
 
 
Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la 
secuencia de reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como 
grupo protector de las posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden. 
 
Esquema 3 
 
 
O
R1O
R1O
R2O
OR2 O O
OR3
OR3
R4
R3O
1 R1, R2, R3 = H, R4 = OH
21 R1 = CMe2, R2, R3=H, R4 = OH
i
22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = OTs
24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
iv
v
23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = OTs
26 R1 , R2 , R3 = H, R4 = NH2 
i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.
vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH. 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 35 
 
 
7. DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
Obtención de 4,6-O-Benciliden sacarosa (2). 
 
 
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
HO
O
HO
HO
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
HO
 
 
En un matraz bola de 250 mL se mezclan en el siguiente orden sacarosa (grado 
reactivo) (5 g, 14.6 mmol), benzaldehído dimetilacetal (6 mL, 39.4 mmol), 
dimetilformamida (50 mL), y ácido paratoluensulfónico (0.5 g) y la reacción se 
coloca en un evaporador rotatorio a una temperatura de 50o
 
C durante 1 hora, 
monitoreando la reacción por cromatografía en capa fina. Se adiciona trietilamina 
(2.4 mL) y se evapora usando una bomba de alto vacío. El residuo se purifica por 
cromatografía en columna usando sílica gel 60 como fase estacionaria y un 
sistema de elusión hexano-acetato de etilo-metanol (8:2:0.1) para generar el 
intermediario 2 (5.0 g, 79.6 %) como melaza. 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 36 
 
 
 
Obtención de 4,6-O-Benciliden-6’-tosil sacarosa (3). 
 
 
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
HO
Ph
O
O
O
O
O
OTs
OH
OH
OH
OH
HO
Ph
 
 
En un matraz bola de 250 mL se mezclan en el siguiente orden 4,6-O-Benciliden 
sacarosa (5.00 g, 11.6 mmol), piridina (135 mL), cloruro de tosilo (6.79 g, 11.6 
mmol), y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El 
producto de reacción se purifica por cromatografía en columna usando sílica gel 
60 como fase estacionaria y como fase movil un gradiente de una mezcla hexano-
acetato de etilo, para generar el intermediario 3 (5.4 g, 80 %) como un sólido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 37 
 
 
 
Obtención de 4,6-O-Benciliden-1’,3’,4’-tri-O-acetil-6’-tosil sacarosa (4). 
 
 
O
O
O
O
O
OTs
OH
OH
OH
OH
HO
Ph O
O
O
O
O
OTs
OAc
OAc
OAc
OAc
AcO
Ph
 
 
En un matraz bola de 100 mL se mezclan el intermediario 3 (2.00 g, 5.84 mmol), 
piridina (12.6 mL, 159.4 mmol), y anhídrido acético (10 mL, 97.9 mmol) y la 
reacción se agita durante 24 horas a temperatura ambiente. El producto de 
reacción se coevapora con tolueno (3 x 20 mL) y el residuo se purifica por 
cromatografía en columna usando sílica gel como fase estacionaria y como 
sistema de elusión un gradiente de hexano-acetato de etilo para generar el 
intermediario 4 (2.1 g, 80 %) como sólido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 38 
 
 
 
Obtención de 4,6-O-Benciliden-1’,3’,4’-tri-O-acetil-6’-azida sacarosa (5). 
 
 
O
O
O
O
O
OTs
OAc
OAc
OAc
OAc
AcO
Ph O
O
O
O
O
N3OAc
OAc
OAc
OAc
AcO
Ph
 
 
En un matraz bola de 100 mL se mezclan el intermediario 4 (2.00 g, 2.5 mmol), 
dimetilformamida (13 mL), y azida de sodio (3.3 g, 5.0 mmol), llevando la 
reacción a 80o
 
C durante 8 horas. El producto de reacción se diluye con acetato 
de etilo (50 mL) se lava con agua (50 mL), se seca con sulfato de sodio anhidro y 
se evapora en rotavapor. El residuo se purifica por cromatografía en columna 
usando sílica gel como fase estacionaria y como sistema de elusión un gradiente 
de hexano-acetato de etilo para generar el intermediario 5 (2.3 g, 70 %) como 
sólido. 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 39 
 
 
 
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
8.1 PRODUCCIÓN 
La cinética de crecimiento para la producción de invertasa de C.flavigena se llevo 
acabo en una fermentación por lote. 
 
 
 
Figura 6. Cinética de crecimiento de Cellulomonas flavigena en sacarosa al 1%. 
Actividad hidrólitica ( ), crecimiento ( ) 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 40 
 
 
Se puede observar en la figura 6 el crecimiento de Cellulomonas flavigena CDBB 
531, obtenida de la Colección microbiana del CINVESTAV, realizada en un cultivo 
por lote, en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de 10 L. 
Durante las primeras 22 h el crecimiento fue lineal. Posteriormente se presentó un 
crecimiento exponencial de 22 a 37.5 h. A partir de las 37.5 h el crecimiento se 
mantiene constante y aproximadamente a las 38 h empieza a decaer. 
El máximo de actividad hidrólitica se obtuvo al inicio de la fase estacionaria de 
crecimiento e inmediatamente empezó adecaer. 
 
En la literatura es reportado que que la invertasa proveniente de Aspergillus Níger 
presenta una fase exponencial de crecimiento en un rango de 35 a 48 horas 
(Romero 2000). 
La invertasa producida por fermentación de Penicillium chysogenum y 
Saccharomyces cerevisae reporta que el crecimiento es lento hasta las 120 horas, 
encontrando invertasa intracelular y extracelular (Poonawalla, 1965). 
Esta reportado que tanto en hongos como bacterias, la invertasa puede ser 
extracelular e intracelular (Jee-Song y col.1996), en esta bacteria fue intracelular, 
por lo que se procedió a romper las células, en el sobrenadante se detectó 
actividad y con este extracto se procedió a su caracterización. 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 41 
 
 
8.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA 
8.2.1 pH y Temperatura óptima 
Para la determinación de pH óptimo se hicieron ensayos con diferentes buffers: 
acetatos 0.1 M, fosfatos 0.1 M, citratos fosfatos, maleato 0.1 M y tris HCl 0.1 M. 
Los datos de pH óptimo que se encuentran reportados para las invertasas en la 
literatura son en su mayoría en el rango ácido. Las invertasas dependiendo de su 
pH se clasifican en: acidas, básicas y neutras. La invertasa producida por 
Cellulomonas flavigena es una invertasa neutra. Esta mostró actividad a 
diferentes pH, alcanzando su máxima actividad en un buffer de Tris HCl a pH 
=7. En la siguiente tabla se muestran las máximas actividades en cada uno de los 
buffers probados: 
 
Tabla 3. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena en 
buffers diferentes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Buffer Actividad UI/ml 
Tris HCl 1.4 
Tris Maleato 0.57 
Fosfatos no presento actividad 
Acetatos 0.734 
Citratos Fosfatos no presento actividad 
 
Munguía Verdi Lorena Página 42 
 
 
 
En la figura 7, se observa que a intervalos muy cerrados de pH la actividad 
disminuye aproximadamente un 50%. 
 
 
 
Figura 7. Gráfico de actividad hidrólitica en Buffer Tris HCl 0.1 M, 5 minutos 
Para la determinación de la temperatura óptima se sometió la enzima a un rango 
de entre 55°C y 65 °C de temperatura, en buffer de tris HCl 0.1 M. La máxima 
actividad fue obtenida a la temperatura de 55°C. En la siguiente tabla se muestran 
las actividades de la enzima a diferentes temperaturas. En la literatura se reporta 
para una invertasa de Aspergillus Níger una temperatura optima de 50º C 
(L’Hocine et al., 2000). 
La invertasa obtenida de esta bacteria proveniente de una planta muestra las 
caracteristicas de pH reportadas en la literatura (www.brenda.unikoeln). 
 
Munguía Verdi Lorena Página 43 
 
 
Tabla 4. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena a 
diferentes temperaturas 
 
Temperatura °C Actividad UI / ml 
50 No presento 
55 1.388478582 
60 0.437223043 
65 No presento 
 
 
El siguiente grafico muestra el rango de temperaturas probadas y las actividades 
correspondientes cada una. 
 
Figura 8. Gráfico de Temperatura óptima en Buffer Tris HCl 0.1 M, 5 minutos 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 44 
 
 
La temperatura óptima se encuentra dentro del intervalo reportado para esta 
enzima (www.brenda.unikoeln). 
 
8.3 Termo estabilidad 
 
Una característica deseable en las enzimas es que sean estables. La siguiente 
grafica muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima con la 
temperatura óptima (55oC) previamente analizada. Puede observarse que la 
actividad disminuye significativamente a los 30 minutos. 
 
Figura 9. Gráfico de Termo estabilidad 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 45 
 
 
Se considera una alternativa para hacer más termoestable a una enzima 
adicionar glicerol y manitol a diferentes concentraciones. 
8.4 PARAMÉTROS CINÉTICOS 
Km y Vmax 
La cinética de sustrato contra velocidad muestra un comportamiento totalmente 
hiperbólico. El valor de Km determinado mediante la representación Lineweaver- 
Burk es de 62.5 mmoles / mL. Este valor es más alto a los ya reportados; en la 
literatura se encuentra que la afinidad por el sustrato va desde 30 a 45 mmoles 
para sacarosa. En cuanto a la Vmax el valor obtenido es de 1.6 mmoles / min 
mg. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 46 
 
 
8.5 Obtención de los iminoazúcares 
 
El desarrollo experimental para la obtención de los iminoazúcares inició con la ruta 
propuesta en el esquema 1 y consistió en la reacción de protección selectiva de 
las posiciones 4 y 6 de la glucosa con benzaldehído dimetilacetal para lo cual se 
llevaron a cabo diferentes condiciones experimentales que se muestran en la 
siguiente tabla: 
Tabla 5. Condiciones experimentales 
 Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 
Reactivos Benzaldehído 
dimetilacetal, ácido 
paratoluensulfónico, 
dimetilformamida 
Benzaldehído, 
cloruro de 
zinc 
Benzaldehído 
dimetilacetal, ácido 
paratoluensulfónico, 
dimetilformamida 
Condiciones Temperatura 
ambiente, 24 horas 
Temperatura 
ambiente, 24 
horas 
1 hora, 60ºC 
Referencia R. Khan, K.S. Mufti, 
M.R. Jenner, 
Carbohydrate 
Research 65 
(1978), 109-113 
Lipták, 
Carbohydrate. 
Research 116 
(1983) 217-
225 
 
H.M.I. Osborn, 
Carbohydrates, ed. 
Academia Press, 
2003, 62 
 
Munguía Verdi Lorena Página 47 
 
 
Los resultados obtenidos mostraron similitud en sus espectros de RMN de 
hidrógeno y en la cromatografía de capa fina. El espectro de 1H RMN del 
intermediario 2 parcialmente purificado muestra señales en la región alifática, 
vinílica y aromática. En la región entre 3.3 y 4.5 ppm se observa un patrón de 
señales multiples sobrepuestas que corresponden a los hidrógenos de la 
sacarosa. En 5.4 ppm una señal simple que corresponde al hidrógeno bencílico, y 
en la región entre 7.2 y 7.6 una señal múltiple correspondiente a los hidrógenos 
aromáticos (figura 1). 
 
 
Figura 10.- Espectro de 1H RMN del intermediario 2 en CDCl3. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 48 
 
 
El siguiente paso consistió en la reacción de tosilación del intermediario 2 
utilizando cloruro de tosilo y piridina a temperatura ambiente durante 24 horas 
para generar el intermediario 3. El espectro de 1H RMN del intermediario 3 
presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. En campo alto 2.42 
ppm se observa una señal simple correspondiente al metilo del grupo tosilo. Entre 
4.0 y 4.7 ppm se observa un sistema complejo de señales correspondientes a los 
hidrógenos no intercambiables de la sacarosa, así como en 6.0 ppm una señal 
simple para el hidrógeno bencílico, y en 6.06 ppm una señal doble (J= 8.4) 
correspondiente al hidrógeno de la posición anomérica de glucosa. En 7.6 se 
observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82 ppm una señal doble que 
corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y a los hidrógenos del 
grupo tosilo característico de un sistema A2X2
 
 para-sustituido (espectro 2 ). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 49 
 
 
 
Figura 11.- Espectro de 1H RMN del intermediario 3 en CDCl3
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 50 
 
El espectro de 13
 
C RMN del intermediario 3 muestra señales en la región vinílica 
para los carbonos de los monosacáridos y en la región aromática (figura 3). 
 
Figura 12.- Espectro de 13C RMN del intermediario 3 en CDCl3
 
. 
La reacción de peracetilación se llevó a cabo bajo condiciones de anhídrido 
acético en piridina a temperatura ambiente obteniéndose el intermediario 4 aunque 
parcialmente acetilado. El espectro de 1
 
H RMN del intermediario 4 presenta 
señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0 ppm de 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 51 
 
 
Observan 2 señales simples que integran para 9 hidrógenos lo que supone que la 
Protección se dio solo en posiciones hidroxílicas. En 2.42 ppm se observauna 
señal simple correspondiente al metilo del grupo tosilo. De 4.2 a 4.6 ppm se 
observa un sistema de señales múltiples correspondientes a 7 hidrógenos no 
intercambiables de la sacarosa, en 5.1 ppm una señal múltiple, en 5.5 una señal 
doble, en 6.0 una señal doble y en 6.1 ppm una señal simple para el hidrógeno 
bencílico. En 7.2 se observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82 ppm 
una señal doble que corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y 
a los hidrógenos del grupo tosilo característico de un sistema A2X2
 
 para-sustituido 
(espectro 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 52 
 
 
 
 
Figura 13.- Espectro de 1H RMN del intermediario 4 en CDCl3
 
. 
 
El espectro de 13
 
C RMN del intermediario 4 muestra señales en la región alifática 
para los grupos metilo de acetato y tosilo, en la región vinílica para los carbonos 
de sacarosa y aromática para los carbonos del grupo benciliden y tosilo. En 170 
ppm se observan señales características de carbonilos pertenecientes a los 
grupos acetato. (figura 5). 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 53 
 
 
 
 
Figura 14.- Espectro de 13C MN del intermediario 4 en CDCl3
 
. 
El intermediario 4 se hace reaccionar con azida de sodio en dimetilformamida bajo 
condiciones de reflujo generando el intermediario 5. El espectro de 1
 
H RMN 
presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0 
ppm de observa 1 señal simple que integra para 9 hidrógenos lo que supone que 
la protección se dio solo en 3 posiciones hidroxílicas. Entre 3.4 y 3.8 ppm se 
observan 2 señales doble de doble correspondiente a 2 hidrógenos. Entre 4.4 y 
4.6 ppm una señal doble de doble y una señal doble que integran para 2 
 
Munguía Verdi Lorena Página 54 
 
 
hidrógenos. En 5.16 ppm se observa una señal múltiple que integra para 1 
hidrógeno. En 5.6 ppm, 6.1 ppm y 6.2 ppm se observan 2 señales dobles y 1 
señal simple que integran para 3 hidrógenos. En campo bajo se observa en 7.4 
ppm una señal múltiple que corresponde al anillo aromático del grupo benciliden, 
no observándose las señales correspondientes al grupo tosilo lo cual demuestra la 
sustitución por el grupo azida (figura 5). 
 
 
Figura 15.- Espectro de 1H RMN del intermediario 5 en CDCl3
 
. 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 55 
 
 
Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la 
secuencia de reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como 
grupo protector de las posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden. 
 
Esquema 3 
 
 
 
i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.
vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH. 
 
 
 
 
 
iv
vi
O
R1O
R1O
R2O
OR2 O O
OR3
OR3
OR4
R3O
1 R1, R2, R3, R4 = H
21 R1 = CMe2, R2, R3, R4 = H
i
22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = Ts
24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
26 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
v
23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = Ts
 
Munguía Verdi Lorena Página 56 
 
 
La ruta sintética consistió en la preparación inicial del intermediario 21 al hacer 
reaccionar sacarosa comercial con acetona y 2,2- dimetoxipropano en medio 
ácido. En el espectro de 1
 
H RMN se observan señales en la región alifática y 
vinílica. A campo alto se observan 3 señales simples en 1.2 ppm y 2.7 y 2.8 ppm 
que corresponden a los metilos del grupo acetónido y dimetilformamida 
respectivamente. En la región de 3.6-4.2 se observa un sistema sobrepuesto de 
señales correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa 
(espectro 6). 
 
 
Figura 16.- Espectro de 1H RMN del intermediario 21 en CDCl3. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 57 
 
 
El siguiente paso consistió en hacer reaccionar el intermediario 21 con cloruro de 
tosilo y piridina a temperatura ambiente durante 24 horas para generar el 
intermediario 22. El espectro de 1
 
H RMN presenta señales en la región alifática, 
vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se observan 3 señales simples que 
corresponden a los metilos del grupo acetónido y al grupo metilo unido al benceno. 
Entre 3.4 y 4.2 ppm se observa el sistema complejo de señales correspondientes 
a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la región aromática 7.2 y 
8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a los hidrógenos unidos 
al anillo aromático típicos de un sistema A2X2
 
 para-sustituido. 
 
Figura 17.- Espectro de 1H RMN del intermediario 22 en CDCl3. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 58 
 
 
El intermediario 22 se sometió a condiciones de acetilación bajo condiciones de 
anhídrido acético y trietilamina para generar el intermediario 23 a temperatura 
ambiente durante 24 horas. El espectro de 1
señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se 
observan 3 señales simples que corresponden a los metilos del grupo acetónido y 
al grupo metilo unido al benceno. En 2.1 se observan señales asignables a los 
grupos acetato. Entre 3.7 y 4.7 ppm se observa el sistema complejo de señales 
H RMN del intermediario 23 presenta 
 
correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la 
región aromática 7.2 y 8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a 
los hidrógenos unidos al anillo aromático típicos de un sistema A2X2
 
 para-
sustituido. 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 59 
 
 
Figura 18.- Espectro de 1H RMN del intermediario 23 en CDCl3
 
. 
El siguiente paso consistió en la reacción de sustitución nucleofílica del grupo 
tosilo por el grupo azida seguido por una hidrogenación catalítica para generar el 
intermediario reducido 25. El espectro de 1
 
H RMN muestra señales dobles que 
corresponden al acetónido, en 2.0 ppm se observan 3 señales simples para los 
grupo acetato, y de 3.2 a 5.0 ppm se muestra un sistema múltiple de señales para 
los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa (figura 7). Para verificar la 
reducción del grupo azida al amino se obtuvo el espectro de infrarrojo 
correspondiente, observándose la aparición de una banda ancha entre 3280 y 
 
Munguía Verdi Lorena Página 60 
 
 
3460 cm-1, así como la ausencia de la banda característica del grupo azida entre 
2080 y 2160 cm-1 (ver anexo). 
 
Figura 19.- Espectro de 1H RMN del intermediario 25 en CDCl3
 
. 
Con la finalidad de explicar el porque no se llevaba a cabo la acetilación completa 
del intermediario tosilado 3 se sometió a condiciones de peracetilación el 
intermediario 2 obteniéndose en este caso el producto peracetilado 12 (esquema 
2). El espectro de 1
 
H RMN de este intermediario muestra 6 señales simples que 
integran para 18 hidrógenos lo cual demuestra la acetilación completa del 
 
Munguía Verdi Lorena Página 61 
 
 
 
intermediario 2. Entre 3.6 4.4 ppm se observan 3 señales múltiples que integran 
para 7 hidrógenos. Entre 5.0 y 5.6 ppm se muestran 3 señales múltiples que 
integran para 4 hidrógenos. En 5.8 y 6.4 se muestran 2 señales dobles que 
integran para 2 hidrógenos. En campo bajo entre 7.2 y 7.6 ppm se encuentra una 
señal múltiple para los hidrógenos aromáticos (figura 8). 
 
Figura 20.- Espectro de 1H RMN del intermediario 12 en CDCl3
 
. 
El correspondiente espectro de 13CRMN del intermediario 12 muestra señales de 
carbono en la región alifática, vinílica y aromática, resaltando la presencia de 
señales en 170 ppm asignables a los carbonilos de los grupos acetato (figura 9). 
 
Munguía Verdi Lorena Página 62 
 
 
 
 
Figura 21.- Espectro de 13C RMN del intermediario 12 en CDCl3
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 63 
 
 
9. Evaluación enzimática de los intermediarios 
Se llevaron a cabo ensayos de evaluación enzimática de losintermediarios 2 y 21 
los cuales contienen las posiciones 4 y 6 de glucosa protegidas con el grupo 
benciliden e isopropiliden respectivamente con invertasa comercial y con el 
extracto parcialmente puro de Invertasa aislada de Cellulomonas flavígena, como 
parte del desarrollo de la primera etapa del proyecto. 
Así, los intermediarios 2 y 21 fueron tratados por separado con ácido 
dinitriosalicílico (DNS) por 5 min. A 55o
O O
O OH
OH
OH
HO
HO
OH
OH
OH
Invertasa O
OH
HO OH
OH
OH
O OH
HO
HO
OH
OH
+
C y posteriormente enfriados con hielo. Los 
ensayos fueron negativos, lo cual se observó por la ausencia en el cambio de 
coloración. El fundamento de este método indirecto se basa en la capacidad de la 
invertasa de reconocer e hidrólizar la sacarosa o algún derivado de esta, 
liberando un equivalente de glucosa y fructosa siendo la primera un azúcar 
reductor. 
 
Sacarosa α-D-glucopiranosa (reductor) α-D-fructofuranosa 
 
Munguía Verdi Lorena Página 64 
 
Una vez liberado el azúcar reductor (glucosa), este reacciona con ácido 
dinitrosalicílico el cual se reduce al ácido 3-amino-5-nitro salicílico, observándose 
un cambio de coloración de amarillo a rojo que se cuantifica colorimétricamente a 
540-570 nm . 
OH
HO
O2N NO2
O
Acido 3,5-dinitrosalicílico
+
CHO
OHH
HHO
OHH
OHH
CH2OH
D-Glucosa
OH
HO
O2N NH2
O
Acido 3,5-dinitrosalicílico
+
COOH
OHH
HHO
OHH
OHH
CH2OH
Acido glucónico
amarillo rojo 
La figura muestra un primer vial que contiene el intermediario 2, conteniendo 
invertasa comercial y DNS y el segundo glucosa, invertasa y DNS. La ausencia 
del cambio de coloración en el primer vial muestra inequívocamente el resultado 
negativo para los derivados 2 y 21 tanto con invertasa comercial así como del 
extracto parcialmente puro. 
 
Figura. Ensayo de hidrólisis de los intermediarios 2 y 21 por acción de invertasa. 
 
Munguía Verdi Lorena Página 65 
 
 
 
A partir de este resultado podemos plantear que la enzima no llevo a cabo la 
hidrólisis del enlace glucosídico en ninguno de los intermediarios evaluados 
debido a un efecto de impedimento estérico, o bien a la imposibilidad de 
interacción de los residuos de aminoácidos del sitio activo con las posiciones 4 y 6 
del fragmento de glucosa 
Generalmente las hidrolasas actúan mediante un mecanismo ácido – base, donde 
el acido aspártico y glutámico actúan como acido y el OH como base. Se 
encuentra reportado en la literatura los sitios de la molécula de sacarosa en los 
que se da la unión con el sitio activo de la invertasa, estos sitios son: los oxígenos 
4′ y 6 ′ de la fructosa y el oxigeno 4 de la glucosa. 
Con lo anterior, se puede justificar el que la invertasa de Cellulomonas flavigena y 
la invertasa comercial de S.cerevisae no reconocieron el enlace glucosídico para 
los intermediarios 2 y 21 ; ya que las posiciones señaladas para la hidrólisis han 
sido ocupadas por otras moléculas químicas, lo que ha obstruido el sitio de unión; 
o bien ha roto con el mecanismo de ácido - base. 
En la siguiente figura se muestran las posiciones de los oxígenos que participan 
con el sitio activo. 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 66 
 
 
 
 
 
Figura 22. Representación de una molécula de sacarosa por difracción de rayos X en la 
que se representan los oxígenos en los que se lleva acabo la unión del sitio activo de la 
enzima con la molécula de sacarosa ( ο glucosa y ο fructosa). 
 
En la siguiente tabla se muestra los residuos de aminoácidos que conforman el 
sitio catalítico de la invertasa de T.maritima. 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 67 
 
 
Tabla 6. Cuerpos de hidrógenos y sitios de unión entre la sacarosa y los residuos de 
aminoácidos del sitio activo de la invertasa de T.maritima 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 68 
 
 
10. CONCLUSIONES 
 
 Se obtuvo una invertasa de una fuente diferente a las ya reportadas, donde 
la caracterización de esta coincide con con lo ya reportado en la literatura 
para esta enzima 
 
 Se obtuvieron avances substanciales en la producción de intermediarios vía 
síntesis química, a partir de un sustrato accesible como es la sacarosa que 
conducirán a la obtención de un iminoazúcar con posible efecto inhibitorio 
de α-glucosidasa. 
 
 Se comprobó que los intermediarios 2 y 21 de sacarosa protegida en las 
posiciones 4 y 6 de la fracción de glucosa no fueron hidrolizados vía 
enzimática, debido a un impedimento esterico en los sitios de la sacarosa 
donde encaja el sitio activo de la invertasa. 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 69 
 
 
11. RECOMENDACIONES 
 Concluir con la síntesis química del inhibidor de α- glucosidasa, escalarlo y 
caracterizarlo. 
 Plantear a futuro un estudio comparativo entre el reconocimiento enzimático 
de invertasa hacia los aminoazúcares y la actividad hipoglucemiante de 
estos hacia alfa-glucosidasa, y que esto permita determinar la correlación 
entre reconocimiento y grado de inhibición. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 70 
 
 
12. BIBLIOGRAFÍA 
 
 Jee-Song,C.,Saxton,J.,Hemmimg,F.W.,Peberdy,J.F.1996.Purification and 
partial characterization of the high a low molecular weigth form (S-and F- 
form)of invertasa secreted by Aspergillus nidulans. BBA 1296(2):207-218 
 
 Miller,G.L.1959.Use of Dinitrosalicylic and reagent for determination of 
reducing sugar.Analytical Chem. 31:426 
 
 Ashim Roy, Bassudeb Achari,SukhenduB. Mandal.A short and simple 
synthesis of 1-Deoxynojirimycin Derivatives from D-glucose.SYNTHESIS 
2006,No.6, pp 1035-1039. 
 
 M.Isabel García Moreno, Matilde agular, Carmen Ortiz Mellet and M. Garcia 
Fernandez. Intermolecular Benzyl Protection. Organic letters 2006 Vol.8, No 
2, pp 297-299. 
 
 Nikos g. Oikonomakos, costas Tirandis, demetres D.Leonidas.Iminosugars 
as potential inhibitors of Glycogenolysis. J.Med. Chem.2006,49,5687-5701. 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 71 
 
 
 L′Hocine, L., Wang, Z., Jiang,B.,Xu S. 2000. purification and partial 
characterization of fructosyltransferase and invertasa from Aspergillus níger 
ASOO23. J. Biotechnol.81(1):73-80 
 
 The competitive Emzyme information System http://www.brenda.uni-
Koeln.de/ 
 
 Ciaran McDonnell,Linda Cronin, Julie L. O′Brien, and Paul V Murphy.A 
general synthesys of iminosugars.J.Org.Chem.2004, 69,3565-3568. 
 
 Yoshikata Ichikawa, Yasuhiro Igarashi,Mie Ichikawa and yohitomo 
Suhara.1-N-Iminosugars:Potential and selective inhibitors of β-
Glycosidades.J.Am.Chem.Soc. 1998, 120, 3007-3018. 
 
 Chia-Chen Liu, Li-Chun Huang, Chen- Tien chang and Hsien – Yi Sung. 
Purification and characterization of soluble invertasa from suspension 
cultured bamboo (Bambusa edulis) cells. Biochemical Science 2005, 64, 
1003-1007. 
 
 Initial characterization of sucrose-6-phosphate hydrolase from Streptococus 
mutans and its apparent identity with intracellular invertasa.Biochemical and 
Biophysical Communications, 1979, 89,307-314. 
http://www.brenda.uni-koeln.de/�
http://www.brenda.uni-koeln.de/�
 
Munguía Verdi Lorena Página 72 
 
 
 Walter A. Szarek, Alexander Zamojski,kamal N. Tiwari, and Eduard R .Ison 
A new, facile Method for Cleavage of acetals and dithioacetals in 
carbohydrate derivatives . Tetrahedrom Letters , 1986,27, 3827-3830. 
 
 Riaz Khizar S. Mufti, and Michael R.JennerSintesys and reactions of 4,6-
acetals of sucrose.Carbohydr. res,1978,65,109-112 
 
 C.A., Aguilar-Salinas, O., Velazquez Monroy, F. J. Gómez-Pérez, A., 
González Chávez, A., Lara Esqueda, V., Molina Cuevas, J.A., Rull-Rodrigo, 
R. Tapia Conyer, Diabetes Care 2003, 26:2021. 
 
 E. García-Urdiales, I. Alonso, V. Gotor, Chem Rev. 2005, 105, 313. 
 
 H.J.M. Gijsen, L. Qiao, W. Fitz, C.-H. Wong, Chem. Rev. 1996, 96, 443. 
 
 R.R., Hung, J.A. Straub, G.M. Whitesides J. Org. Chem. 1991, 56, 3849. 
 
 Y. Ichikawa,Y-C-Lin, D.P. Dumas, G-J. Shen, E. García-Junceda, M.A. 
Williams, R. Bayer, C. Ketcham, L.E. Walker, J.C. Paulson, C..-H. Wong, J. 
Am. Chem. Soc. 1992, 114, 9283 
 
 
 
 
Munguía Verdi Lorena Página 73 
 
 
 Ichikawa, Y., Igarashi, M., Ichikawa, Y., Suhara J. Am. Chem. Soc. 1998, 
120, 3007. 
 G. S., Jacob Current Opinión in Structural Biology 1995, 5, 605. 
 
 L.T. Kanerva, E., Vantinnen Tetrahedron Asymmetry 1993, 4, 85. 
 
 G.C., Look., C.H., Fotsch, C.-H:, Wong, Acc. Chem. Res. 1993, 26, 182. 
 
 C.-H., Wong, R.L., Halcomb, Y. Ichikara, T., Kajimoto Angew. Chem. Int. 
Ed. Engl. 1995, 34, 521. 
 
 Darío Patricio Leal, María Inés Isla, Marta Amelia Vattuone and Antonio R. 
Sampietro .A hysteretic invertase
 Bruce M. Chassy and E. Victoria Porter .Initial characterization of sucrose-6-
phosphate hydrolase from streptococcus mutans and its apparent identity 
with intracellular invertasa. 
 from Equisetum giganteum L . 
Phytochemistry, Volume 52, Issue 6, November 1999, Pages 1009-1016 
Biochemical and Biophysical Research 
Communications ,Volume 89, Issue 1 , 12 July 1979, Pages 307-314 
 C.-H. Wong Pure & Appl. Chem. 1995, 67, 1609 
 : M Brito-Arias "Synthesis and Characterization of Glycosides" editorial 
Springer 2007 
 
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=JournalURL&_cdi=6713&_auth=y&_acct=C000055409&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1929606&md5=5bff2eb399a8f3df2082ba21644ec303�
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=JournalURL&_cdi=6713&_auth=y&_acct=C000055409&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1929606&md5=5bff2eb399a8f3df2082ba21644ec303�
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=JournalURL&_cdi=6713&_auth=y&_acct=C000055409&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1929606&md5=5bff2eb399a8f3df2082ba21644ec303�
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=IssueURL&_tockey=%23TOC%236713%231979%23999109998%23534431%23FLP%23&_auth=y&view=c&_acct=C000055409&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1929606&md5=d1307f28affa13fb69ed5c98127efb7b�
 
Munguía Verdi Lorena Página 74 
 
 "http://en.wikipedia.org/wiki/Reducing_sugar 
 
 http://bq.unam.mx/mensajebioquimico 
 
 (http://bq.unam.mx/mensajebioquimico) 
 
 
 
 
http://en.wikipedia.org/wiki/Reducing_sugar�
http://bq.unam.mx/mensajebioquimico�
	LorenaMunguiaVerdiTesis2010
	Bruce M. Chassy and E. Victoria Porter .Initial characterization of sucrose-6-phosphate hydrolase from streptococcus mutans and its apparent identity with intracellular invertasa. Biochemical and Biophysical Research Communications ,Volume 89, Issue...
	CartaCesionDerechosLMV
	ActaRevisionTesisLMV
	LorenaMunguiaVerdiTesis2010
	Bruce M. Chassy and E. Victoria Porter .Initial characterization of sucrose-6-phosphate hydrolase from streptococcus mutans and its apparent identity with intracellular invertasa. Biochemical and Biophysical Research Communications ,Volume 89, Issue...