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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Centro de Desarrollo de Productos Bióticos Departamento Académico EFECTO DEL PROCESO DE NIXTAMALIZACIÓN SOBRE EL CONTENIDO DE CAROTENOIDES EN DIFERENTES HÍBRIDOS DE MAÍZ. T E S I S Que para obtener el Grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos PRESENTA Aldo Rosales Nolasco Directores de Tesis: Dra. Edith Agama Acevedo Dra. Natalia Palacios Rojas Yautepec de Zaragoza, Morelos; Octubre 2014. El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Edith Agama Acevedo en el Laboratorio de Control de Calidad; en el Laboratorio de Calidad Nutricional de Maíz del Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo bajo la supervisión de la Dra. Natalia Palacios Rojas; en el Laboratorio 18 de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad Autónoma de Sinaloa bajo la supervisión del Dr. Roberto Gutiérrez Dorado; y en el Laboratorio de Calidad de Maíz del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias bajo la supervisión de la Dra. Gricelda Vázquez Carrillo. Para la realización de los estudios se obtuvo el apoyo económico de la beca CONACyT (417567) y de la beca del Programa Institucional de Formación de Investigadores. La investigación fue realizada con el financiamiento económico del proyecto CONACyT 417567, del programa MasAgro y del programa Harvest Plus. AGRADECIMIENTOS El presente escrito es el resultado del trabajo y colaboración de muchas personas sin las cuales no se habría podido realizar y quiero agradecerles sinceramente: A la Comisión Revisora por sus valiosos comentarios y consejos durante el desarrollo del proyecto. A mi directora de tesis, Dra. Edith Agama, por su paciencia, comprensión y disposición de ayudar y aconsejar en todo momento. A mis compañeros de la generación de la maestría por el tiempo de convivencia y los trabajos realizados en distintas materias y cursos, especialmente a Maribel García Mahecha y a María Antonia Hernández Aguirre por su ayuda en todos los trámites y sobre todo por su valiosa amistad. A los profesores que durante los cursos de la maestría me dejaron grandes enseñanzas: Dra. Kalina Bermúdez, Dra. Silvia Evangelista, M. en C. Roberto Briones, M. en C. Isabel Cortés, Dr. José Luis Trejo, M. en C. Francisco J. García Suárez, Dra. Gabriela Sepúlveda y Dr. Mario Rodríguez. A la Dra. Gricelda Vázquez y su equipo de trabajo del INIFAP (Luz, Miguel y Lino) por permitir el uso de sus instalaciones y por su guía en diversos experimentos. Al Dr. Roberto Gutiérrez y a la M. en C. Julieta Espinoza por su ayuda y colaboración durante las pruebas realizadas en la Universidad Autónoma de Sinaloa. A la Sra. Reina Flores Corona por su experiencia y ayuda en lo elaboración de las tortillas. Agradecimiento especial a todos los miembros del Laboratorio de Calidad Nutricional de Maíz del CIMMyT (en particular a Jorge González, Miguel Bojorges y Rubén Basilio y Agustín Aguilar) por su gran ayuda en los años durante los que cuales estuve cursando la maestría. A quienes ya no forman parte del equipo de trabajo del CIMMyT: Octavio Custodio, quien mostró disposición y auxilió en el análisis de carotenos y a Luis Galicia por sus sugerencias y su valiosa colaboración en esta etapa, ya que todo fue más sencillo gracias a su ayuda y que sigue colaborando con CIMMyT. A la Lic. Elvia Sosa López y a la Lic. Vanessa Yañez Gálvez por su tremendo apoyo en todos los trámites burocráticos. A Aide Liliana Molina Macedo por su amistad y apoyo durante los recientes dos años en lo que se desarrolló la tesis. A Ana Sofía Medina Larqué porque apareció en un momento crucial y sin ella hubiera sido muy complicado terminar con este proceso y sobretodo con el trabajo escrito. A mis padres por su apoyo constante de toda la vida. Y un agradecimiento muy especial a la Dra. Natalia Palacios, por las grandes oportunidades y el apoyo que me ha brindado desde que la conocí, no solo fue codirectora de la tesis, ha sido piedra angular en mi desarrollo profesional. “Uno puede devolver un préstamo de oro, pero está en deuda de por vida con aquellos que son amables”. -Proverbio I ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL I ÍNDICE DE FIGURAS III ÍNDICE DE CUADROS V RESUMEN VI ABSTRACT VII 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN DE LITERATURA 3 2.1 Maíz 3 2.1.1 Origen e importancia 3 2.1.2 Razas e híbridos en México 4 2.1.3 Producción y consumo en México 6 2.1.4 Estructura del grano 8 2.1.5 Composición química 11 2.1.6 Biofortificación de maíz 15 2.2 Carotenoides 15 2.2.1 Estructura 15 2.2.2 Fuente de carotenoides en la dieta 16 2.2.3 Deficiencia de vitamina A 17 2.2.4 Incremento en la concentración de carotenoides 18 2.2.5 Degradación de carotenoides 19 2.2.6 Efecto del secado y almacenamiento en los carotenoides del maíz 20 2.2.7 Efecto del procesamiento en los carotenoides del maíz 21 2.3 Procesamiento del maíz para la elaboración de tortillas 24 2.3.1 Nixtamalización tradicional 24 2.3.2 Nixtamalización por extrusión 28 3. JUSTIFICACIÓN 31 4. OBJETIVOS 32 4.1 Objetivo general 32 4.2 Objetivos específicos 32 5. METODOLOGÍA 33 5.1 Diagrama experimental 33 5.2 Material biológico 33 5.3 Caracterización física de los híbridos de maíz. 35 5.3.1 Humedad 35 5.3.2 Peso hectolítrico 36 5.3.3 Dureza 37 II 5.3.4 Color 38 5.3.5 Peso de cada cien granos (PCG) 39 5.4 Análisis químicos 39 5.5 Nixtamalización tradicional 46 5.6 Nixtamalización por extrusión 48 5.7 Elaboración de tortillas 50 5.8 Análisis estadístico 52 5.9 Cálculo del porcentaje de retención verdadera 53 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 54 6.1 Caracterización física de los híbridos de maíz 54 6.2 Caracterización química de los híbridos de maíz 56 6.3 Análisis de correlación entre los componentes químicos de los híbridos de maíz 59 6.4 Análisis de correlación entre propiedades físicas y composición química de los híbridos de maíz. 61 6.5 Efecto del procesamiento en la concentración de proteína 62 6.6 efecto del procesamiento en la concentración de extracto etéreo y la formación de almidón resistente 65 6.7 Efecto del procesamiento en la concentración de almidón disponible 72 6.8 Efecto del secado en la concentración de CAPA 75 6.9 Efecto del procesamiento en la concentración de CAPA 76 6.10 Análisis de correlación entre la composición química de las tortillas 81 7. CONCLUSIONES 83 8. PERSPECTIVAS 85 9. LITERATURA CITADA 86 III ÍNDICE DE FIGURAS Número Figura Página 1 Diversidad del maíz mexicano. 5 2 Algunos productos elaborados a base de maíz. 6 3 Producción y consumo nacional de maíz, 1985-2010. 7 4 Estructura del grano de maíz. 9 5 Vitamina A preformada y carotenoides con actividad de provitamina A. 16 6 Deficiencia de vitamina A alrededor del mundo en el 2005. 18 7 Diagrama de flujo de la nixtamalización. 27 8 Diagrama de flujo del trabajo experimental.33 9 Híbridos biofortificados en contenido de provitamina A. 34 10 Ilustración del cuarteo de granos para obtener una muestra representativa. 34 11 Muestras almacenadas a -80 °C. 35 12 Medidor de humedad. 36 13a Balanza para peso hectolítrico. 37 13b Recipiente de 250 mL. 37 14 Determinación del índice de flotación. 38 15 Colorímetro Hunter-Lab. 38 16a Molino Thomas Wiley. 39 16b Molino Foss Tecator. 39 16c Tubos con harina. 39 17 Digestión de muestras. 40 18 Soxtec 2050. 41 19 UPLC Acquity. 43 20 Preparación de los cartuchos. 44 21 Extractor continuo. 44 22 Lector de microplacas. 45 23 Nixtamalización tradicional. 46 24 Recipientes contenedores de la masa muestreada. 47 25 Estufa utilizada para secar grano y tortillas. 47 26 Envases contenedores. 48 27 Liofilizador VirTis BenchTop. 48 28 Extrusor Brabender modelo 20DN. 49 29 Nixtamalización por extrusión. 50 30 Elaboración de tortillas. 51 31 Muestreo de tortillas. 51 32 Corte realizado a las tortillas para el muestreo. 52 33 Contenido de extracto etéreo del grano, harina nixtamalizada por extrusión (HNE) y de tortillas (recién elaboradas y almacenadas durante 48 h). 66 34 Contenido de almidón resistente del grano, harina nixtamalizada por extrusión (HNE) y de tortillas (recién elaboradas y almacenadas durante 67 IV 48 h). 35 Contenido de extracto etéreo del grano, harina nixtamalizada de manera tradicional (HNT) y de tortillas (recién elaboradas y almacenadas durante 48 h). 69 36 Contenido de almidón resistente del grano, harina nixtamalizada de manera tradicional (HNT) y de tortillas (recién elaboradas y almacenadas durante 48 h). 70 37 Contenido de carotenoides con actividad de provitamina A (CAPA) durante la nixtamalización por extrusión. 77 38 Contenido de carotenoides con actividad de provitamina A (CAPA) durante la nixtamalización tradicional. 77 39 Porcentaje de retención verdadera. 80 V ÍNDICE DE CUADROS Número Cuadro Página 1 Composición química proximal de las partes del grano de maíz (%). 11 2 Concentración de carotenoides totales en distintas variedades de maíz. 19 3 Pérdidas de carotenoides por efecto del procesamiento. 21 4 Propiedades físicas de los híbridos de maíz. 54 5 Color de los granos de los híbridos de maíz. 56 6 Características químicas de los híbridos de maíz. 58 7 Contenido de carotenoides de los híbridos de maíz. 58 8 Coeficientes de correlación entre los componentes químicos de los híbridos de maíz. 59 9 Coeficientes de correlación entre carotenoides en los híbridos de maíz. 60 10 Coeficientes de correlación entre las propiedades físicas y composición química de los híbridos de maíz. 61 11 Contenido de proteína en grano, HNT y tortillas elaboradas mediante nixtamalización tradicional. 63 12 Comparación de los procesos de nixtamalización en el contenido de proteína de HNE, HNT y tortillas. 64 13 Comparación de los procesos de nixtamalización en el contenido de extracto etéreo. 71 14 Comparación de los procesos de nixtamalización en el contenido de almidón resistente. 71 15 Contenido de almidón disponible en grano, HNE y de tortillas (recién elaboradas y almacenadas durante 48 h). 72 16 Contenido de almidón disponible durante la nixtamalización tradicional. 73 17 Comparación de los procesos de nixtamalización en el contenido de almidón disponible. 74 18 Pérdidas de carotenoides con actividad de provitamina A durante el secado. 75 19 Pérdida de carotenoides con actividad de provitamina A durante la extrusión. 78 20 Pérdida de carotenoides con actividad de provitamina A durante la nixtamalización tradicional. 79 21 Coeficientes de correlación entre la composición química de las tortillas elaboradas mediante nixtamalización tradicional. 82 VI RESUMEN El mejoramiento de híbridos de maíz amarillo para incrementar el contenido de carotenoides con actividad de provitamina A (CAPA) es una de las estrategias para solucionar problemas de salud en poblaciones que presentan deficiencia de vitamina A y que basan su dieta en el maíz. En México, el maíz tiene que ser procesado para ser consumido en forma de tortilla, lo cual tendría un efecto significativo en el contenido de los CAPA. Hay evidencia que la nixtamalización, el método al que se somete el maíz, podría afectar de manera negativa la concentración de carotenoides totales. Una opción es utilizar métodos alternativos como la nixtamalización por extrusión (NE). Los estudios que evalúan el efecto del proceso de nixtamalización tradicional (NT) sobre los niveles de carotenoides en maíz y las tortillas son limitados; por otro lado, no existe información acerca del contenido de carotenoides en el maíz sometido a NE, como en las tortillas. Otro factor importante, y menos conocido, es el efecto del tiempo de almacenamiento de las tortillas en el contenido de CAPA. El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de CAPA después de los procesos de nixtamalización, cocción y almacenamiento de las tortillas, con el fin de conocer cuál ocasiona menores pérdidas. Para ello, 8 híbridos mejorados en el contenido de CAPA fueron sometidos a NT y a NE, posteriormente se elaboraron tortillas a partir de la harina extrudida y masa nixtamalizada y se determinó, mediante cromatografía, el contenido de CAPA en cada etapa del proceso y en las tortillas recién hechas y después de almacenarse durante 48 h a 4°C. La NE produjo mayor disminución en la concentración de CAPA que la NT. En la etapa de cocción de las tortillas elaboradas mediante NT fue en donde se presentaron las mayores pérdidas de CAPA. Los CAPA de las tortillas elaboradas por ambos métodos, no se vieron afectados durante el almacenamiento. Aunque el secado no forma parte del proceso de elaboración de tortillas, se realizó para acondicionar el maíz utilizado, y fue la etapa durante la cual se perdió la mayor cantidad de CAPA. Los resultados sugieren que emplear la NT para la producción de tortillas con híbridos de maíz biofortificados evita la pérdida de CAPA, lo cual contribuiría a una mayor ingesta de CAPA durante el consumo de estas. VII ABSTRACT Improve yellow maize hybrids to increase carotenoid content with provitamin A activity (CPAA) is one of the strategies to solve health problems in populations with vitamin A deficiency and their diet based on maize. In Mexico, maize must be processed to be consumed in the form of tortillas, which would have a significant effect on the content of the CPAA. There is evidence that nixtamalization, the method that maize is subjected, could adversely affect the concentration of total carotenoids. One option is to use alternative methods such as extrusion. Studies evaluating the effect of the process of traditional nixtamalization (NT) on the levels of carotenoids in corn tortillas are limited; on the other hand, there is no information about the content of carotenoids in maize subjected to NE, and tortillas. Another important and least known factor is the effect of storage time on the content of CPAA in tortillas. The aim of this study was to determine the content of CAPA processes after nixtamalization cooking and storage of tortillas, in order to know what causes least losses. Eight improved maize hybrids were processed by conventional nixtamalization and extrusion cooking, then tortillas were prepared from the extruded flour and nixtamalized mass, and was determined the content of CPAA by chromatography at each stage of the process, in the fresh tortillas and after storage for 48 h at 4 ° C. The extrusion process decrease more the concentration of the CPAA than the traditional nixtamalization. During the cooking of tortillas made by traditional nixtamalization was where the greatest losses of CPAA occurred. The CPAAin tortillas prepared by extrusion were not affected during storage. Although drying is not part of the process of making tortillas, was made to condition the corn used, and was the stage during which the largest number of CPAA was lost. The results suggest that the traditional nixtamalization used to produce tortillas with biofortified maize hybrids prevents loss of CPAA, which would contribute to a higher intake of CPAA during the consumption of tortillas. - 1 - 1. INTRODUCCIÓN Una de las estrategias para solucionar problemas de salud en poblaciones que presentan deficiencia de vitamina A y que basan su dieta en el maíz, ha sido el mejoramiento de híbridos de maíz amarillo para incrementar el contenido de carotenoides (α-caroteno, β-caroteno y β-criptoxantina), que presentan actividad de provitamina A (CAPA) (Hess et al., 2005; Howe y Tanumihardjo, 2006a). Sin embargo, hay que tener en cuenta que antes de consumir el maíz éste tiene que ser procesado. Los métodos de cocción tienen un efecto significativo en el contenido de los CAPA. Uno de los procesos más comunes en México, al que se somete el maíz antes de su consumo es la nixtamalización. El maíz nixtamalizado es utilizado para preparar tortillas y más de 300 productos alimenticios (Ortega-Paczka, 2003). Durante la nixtamalización, el maíz es sometido a altas temperaturas (alrededor de 90 °C) y a pH alcalino (pH entre 9 y 13) debido al uso de hidróxido de calcio (1-2 %, del peso del maíz). Es bien conocido, que la nixtamalización produce cambios en los principales constituyentes del grano de maíz, como son el almidón, las proteínas y la fibra dietética (Bressani, 2008). Hay evidencia de que la nixtamalización, podría afectar de manera negativa la concentración de carotenoides totales. Lozano-Alejo et al. (2007), utilizaron diferentes variedades de maíz para elaborar totopos y evaluaron pérdidas en el contenido de carotenoides totales, las cuales fueron del 15 al 81 % dependiendo de la variedad del maíz, pero no reportan lo que sucede en cada etapa del proceso. Dichos resultados son similares a lo reportado por Coutiño-Estrada et al. (2008) en frituras elaboradas a partir de maíz mejorado en contenido de carotenoides totales, reportando pérdidas del 66 %. De la Parra et al. (2007) evaluaron la pérdida de carotenoides totales después de la nixtamalización, cocción de la tortilla y freído en la elaboración de frituras de dos variedades de maíz (comercial y alta en carotenoides); encontraron que la nixtamalización es la parte del proceso que más afecta a estos metabolitos, ya que se perdió el 50 % de los carotenoides y en el producto final se perdió hasta el 80 %. - 2 - Una opción para evitar la pérdida de carotenoides durante la nixtamalización, es utilizar métodos alternativos a la nixtamalización convencional, como la nixtamalización por extrusión. En este método la harina de maíz crudo es acondicionada a una humedad del 25 a 60 %, con una concentración de hidróxido de calcio de 0.1 a 0.25 %, extrudida a temperaturas de 60 °C a 95 °C, con un tiempo de residencia de 1 a 2 minutos (Martínez-Bustos, 2011). Este método retiene componentes del grano de maíz que están en el pericarpio, con menor daño a las proteínas, lípidos y almidón (Arámbula- Villa et al., 2001; Yañez-Ortega, 2005). El proceso final para la elaboración de las tortillas es la cocción, donde la tortilla es sometida a temperaturas de 270 °C durante 1.5 min, lo cual podría disminuir el contenido de carotenoides, ya que estos son sensibles al calor. Otro factor importante, y menos conocido, es el efecto del tiempo de almacenamiento de las tortillas en el contenido de carotenoides. Los estudios que evalúan el efecto del proceso de nixtamalización tradicional sobre los niveles de carotenoides en maíz y las tortillas son limitados; por otro lado, no existe información acerca del contenido de carotenoides en el maíz nixtamalizado por extrusión, como en las tortillas. El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de CAPA después de los procesos de nixtamalización y cocción de las tortillas, con el fin de conocer cuál de los dos procesos de nixtamalización, tradicional o por extrusión, produce menores pérdidas. - 3 - 2. REVISIÓN DE LITERATURA. 2.1. Maíz. 2.1.1. Origen e importancia. El maíz (Zea mays L.) tuvo un papel central en el origen y la difusión de la agricultura en todas las civilizaciones indígenas de Mesoamérica, las cuales dependieron en gran medida de este cultivo agrícola. Hoy es aún el cultivo más importante del país desde el punto de vista alimentario, industrial, político y social, ya que representa la base alimenticia y caracteriza a la cultura mexicana (Cruz et al., 2012; INE-CONABIO- SAGARPA, 2008; Sánchez, 2011). Aunque el origen del maíz aún es tema de debate, la teoría que tiene mayor aceptabilidad es la que propone que fue domesticado a partir de las poblaciones de su ancestro silvestre el teocintle de la raza Balsas (Zea mays ssp. parviglumis), localizadas en el centro de la cuenca del Balsas, y que posteriormente se difundió por el continente Americano, Asia y África, representando en estos lugares la principal fuente de calorías para más de 1.2 billones de consumidores (INE-CONABIO- SAGARPA, 2008; Kato et al., 2009; Prasanna, 2012). El maíz se siembra en diferentes regiones agroecológicas, que van de altitudes de 0 m hasta cerca de los 4,000 metros (Ortega-Paczka, 2003; Roberts et al., 1957). Se cultiva desde el ecuador hasta altas latitudes en los dos hemisferios, se siembra en regiones de precipitación pluvial desde menos de 400 mm hasta los 3,000 mm, en suelos y climas muy variados. La mejor producción se logra en climas en donde las temperaturas medias en los meses calurosos varían entre 21 y 27°C, con un periodo libre de heladas en el ciclo agrícola variable de 120 a 180 días (Reyes, 1990). - 4 - 2.1.2. Razas e híbridos en México. El término raza se ha utilizado en el maíz y en las plantas cultivadas, para agrupar individuos o poblaciones que comparten características en común, de orden morfológico, ecológico, genético y de historia de cultivo, que permiten diferenciarlas como grupo. Las razas se agrupan a su vez en grupos o complejos raciales, los cuales se asocian a una distribución geográfica y climática más o menos definida y a una historia evolutiva común (CONABIO, 2013). Las condiciones que han favorecido la diversificación, se deben por una parte a la amplia variación ambiental del territorio mexicano, y por otra a que es una especie de polinización abierta, la cual presenta la mayor variación genética conocida dentro de los cultivos agrícolas. Estos aspectos han sido explotados por los agricultores para conservar materiales nativos, así como, adaptar y generar germoplasma nuevo (INE- CONABIO-SAGARPA, 2008). Diferentes estudios demuestran que el flujo genético entre razas es común y que la diversidad fenotípica se da por el manejo de los agricultores campesinos, los cuales desempeñan un papel importante en la selección al elegir, durante la cosecha y en el transcurso del año, las mazorcas cuyas semillas se sembrarán en el próximo ciclo agrícola. Esto lo hacen a partir de la idiosincrasia y atributos que el maíz tenga, su poder de compra e intercambio en las localidades rurales, así como su rendimiento, facilidad de manejo, la tolerancia a la sequía, capacidad de adaptación a suelos pobres y condiciones climáticas extremas, resistencia a insectos, su capacidad para ser almacenadas, el peso del grano y el sabor que dan a las tortillas y a los diferentes platillos tradicionales, como pozole, tamales y pinoles (INE-CONABIO-SAGARPA, 2008) - 5 - Figura 1. Diversidad del maíz mexicano. Variedades conservadas en el Banco deGermoplasma del Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMyT) (2010). De las 64 razas que se reportan para México, 59 se pueden considerar nativas y 5 que fueron descritas inicialmente en otras regiones (Cubano Amarillo, del Caribe, y cuatro razas de Guatemala -Nal Tel de Altura, Serrano, Negro de Chimaltenango y Quicheño- ), pero que también se han colectado o reportado en el país. Como variantes dentro de las razas, se ha propuesto la clasificación por tipos o por coloración de grano (Figura 1). El color se determina por los pigmentos encontrados, como los carotenoides en los granos amarillos (Egesel et al., 2003) y antocianinas y flobafenos en los azules o rojos (Irani et al., 2003), estás variedades pigmentadas están presentes en 41 razas (Ortega et al., 1991). Las características que poseen las razas de estos maíces, han sido aprovechadas por fitomejoradores para generar mediante cruzas selectivas, híbridos de alto rendimiento y tolerantes a suelos improductivos (erosionados, deficientes en nutrientes), sequía, plagas y enfermedades. Adicionalmente, se han desarrollado híbridos que son superiores nutricionalmente a sus contrapartes nativas y ayudan a combatir - 6 - deficiencias nutricionales en sectores de la población que basan su alimentación en este cultivo (Howe y Tanumihardjo, 2006b; Prasanna, 2012). 2.1.3. Producción y consumo en México. El cultivo de maíz en México se caracteriza por la producción de una gama amplia de variedades, por lo que es posible generar una gran cantidad de productos finales como tortillas, tostadas, tamales, pozole, atoles, botanas y varios platillos tradicionales (Figura 2), lo cual depende en gran medida de la composición química y tipo de maíz, así como de su dureza (vítreo o harinoso) (Cruz et al., 2012). Figura 2. Algunos productos elaborados a base de maíz. Es importante destacar que el maíz en la actualidad se consume en todo el mundo de diversas formas; sin embargo, en los países desarrollados el maíz es un componente importante de muchos alimentos, bebidas y productos industriales. Se ha calculado que en los supermercados modernos, cerca de 2,500 productos contienen maíz en alguna forma (Perales, 2009). - 7 - En México, se consumen anualmente cerca de 30 millones de toneladas de maíz, de las cuales 74% representan la totalidad de la producción nacional de maíz blanco (21.8 millones de toneladas), el restante 26% se trata de maíz amarillo importado, principalmente de los EE.UU (Secretaría de Economía, 2012). La producción de maíz se ha incrementado considerablemente, sobre todo por el aumento de la superficie sembrada y en menor medida por los rendimientos, en el 2010 se produjeron 25 millones de toneladas. A pesar de lo anterior, desde hace ya varias décadas, la producción nacional ha sido insuficiente para cubrir las necesidades de consumo interno (Figura 3), en especial porque desde el 2005 el consumo nacional de maíz ha mostrado un crecimiento importante (32 millones de toneladas en el 2010) (Secretaría de Economía, 2012). Figura 3. Producción y consumo nacional de maíz, 1985-2010 (millones de toneladas). (Secretaría de Economía, 2012). La producción de maíz incluye diversas variedades, siendo el maíz blanco la variedad más importante, cuya producción total de maíz fue del 95% promedio en el período - 8 - 2009-2010; en tanto que la producción de maíz amarillo representó solo el 5% en el periodo de referencia (Secretaría de Economía, 2012). El maíz blanco se produce y consume en su totalidad en el país, es utilizado principalmente para consumo humano a través de diversos alimentos tradicionales, como: atole, pan, tamales, entre otras; y como tortilla procedente de la harina de maíz a base de nixtamalización y deshidratación; y masa de nixtamal a base de nixtamalización y molienda (Secretaría de Economía, 2012). En el caso del maíz amarillo (7.8 millones de toneladas importadas principalmente de los EE.UU.), este es consumido por la industria productora de alimento pecuario balanceado, la industria cerealera, de frituras y botanas y de féculas y almidones (Secretaría de Economía, 2012). 2.1.4. Estructura del grano. Los granos de maíz se desarrollan mediante la acumulación de los productos de la fotosíntesis, la absorción a través de las raíces y el metabolismo de la planta de maíz en la inflorescencia femenina denominada espiga. Esta estructura puede contener de 300 a 1000 granos, según el número de hileras, así como el diámetro y longitud de la mazorca. El peso del grano varia de aproximadamente 19 a 30 g por cada 100 granos (FAO-ONU, 1993a). Las cuatro estructuras físicas fundamentales del grano son: el pericarpio o salvado (5-6 %), el endospermo (82-83%), el germen o embrión (10-11%), y la piloriza o pedicelo (0.8-1.0 %) (Singh et al., 2011) (Figura 4). - 9 - Figura 4. Estructura del grano de maíz (Figura adaptada de http://sevilla.dacsa.com/spa/mundo-maiz/caracteristicas-y-tipos-de-maiz/el-grano-del- maiz.html). El pericarpio es la parte estructural más externa del grano, es una película cuyo espesor normalmente varía de 60 a 80 µm, formado por un tejido denso y maleable, cuya composición es 77.7 % fibra, 9.1 % proteína, 7.3 % almidón, 1 % grasa y 4.4 % de otras sustancias, todas las partes del pericarpio están compuestas por células muertas que son de forma tubular (Bartolo-Pérez et al., 1999). El pedicelo es la estructura celular con la que el grano se encuentra unido al olote. Está compuesto de haces vasculares que terminan en la porción basal del pericarpio, consta de una capa exterior de abscisión que sella la punta del grano maduro. A esta capa le sigue una serie de células parenquimatosas en forma de estrellas, ligadas por sus puntas, formando una estructura frágil y porosa, conectada con la capa de células cruzadas del pericarpio. Esta estructura es responsable de la absorción de líquidos del pedicelo al pericarpio (Jackson y Shandera, 1995). El endospermo está compuesto por células alargadas con paredes delgadas de material celulósico, empacadas con gránulos de almidón (de 5 a 30 µm) sumergidos en una matriz proteínica (almidón-proteína), es depositada y contenida en grandes http://sevilla.dacsa.com/spa/mundo-maiz/caracteristicas-y-tipos-de-maiz/el-grano-del-maiz.html http://sevilla.dacsa.com/spa/mundo-maiz/caracteristicas-y-tipos-de-maiz/el-grano-del-maiz.html - 10 - estructuras celulares. La unión e integridad estructural entre la proteína y los gránulos de almidón hace completamente duro al grano de maíz. El endospermo está compuesto de dos regiones: una harinosa y otra vítrea, generalmente en una relación de 2 a 1. La región harinosa del endospermo es caracterizada por gránulos grandes y casi redondos de almidón, están débilmente empaquetados y asociados a una matriz proteínica delgada y con muchos espacios de aire entre ellos (Mu-forster y Wasserman, 1998). El endospermo vítreo tiene células pequeñas con gránulos de almidón pequeños, que adquieren estructura poligonal y están fuertemente empaquetados por una matriz de proteínas sin espacios de aire entre los gránulos (INTA, 2006). La relación entre el endospermo vítreo y harinoso determina uno de los parámetros de calidad de grano más importantes, la dureza, la cual contribuye a otorgarle al maíz resistencia mecánica, propiedad deseable para mantener la integridad del grano durante las operaciones de cosecha y post-cosecha. El maíz de endospermo vítreo, así como las variedades de maíz cristalino y reventador, tienen granos duros, en tanto que las variedades de maíz amiláceas y harinosas tienen granos blandos (Véles-Medina, 2004). La industria de la molienda seca requiere materia prima de grano duro, para obtener fracciones de los tamaños adecuados a las distintas aplicaciones.La industria tortillera necesita conocer este parámetro para dar el tiempo de cocción adecuado al maíz al momento de nixtamalizar (Robutti et al., 2000). El germen de maíz es un componente con un alto contenido de grasa (15 a 30%), proteína (10 a 18%) y sales minerales, funciona como un órgano o almacén de nutrientes y hormonas que son movilizados por enzimas sintetizadas durante la etapa inicial de germinación (Jackson y Shandera, 1995). 2.1.5. Composición química. Las partes principales del grano de maíz difieren considerablemente en su composición química. La cubierta seminal o pericarpio se caracteriza por un elevado contenido de fibra cruda, aproximadamente el 87 %, la que a su vez está formada fundamentalmente - 11 - por hemicelulosa (67 %), celulosa (23 %) y lignina (0.1 %) (Burge y Duensing, 1989). El grosor del pericarpio varía en los diferentes tipos de maíz. El endospermo, en cambio, contiene un nivel elevado de almidón (87 %), aproximadamente 8 % de proteínas y un contenido de grasa cruda relativamente bajo. El germen se caracteriza por un elevado contenido de grasa cruda, en promedio 33 %, y contiene también un nivel relativamente elevado de proteínas (alrededor del 20 %) y minerales (Cuadro 1). La distribución ponderal de las partes del grano, su composición química y su valor nutritivo, tienen gran importancia cuando se procesa el maíz para consumo (FAO-ONU, 1993b). Cuadro 1. Composición química proximal de las partes del grano de maíz (%). Componente/Estructura Pericarpio Endospermo Germen Pedicelo Proteínas 3.7 8 18.4 9.1 Extracto etéreo 1 0.8 33.2 3.8 Fibra cruda 86.7 2.7 8.8 78.6 Cenizas 0.8 0.3 10.5 1.6 Almidón 7.3 87.6 8.3 5.3 Azúcares 0.34 0.62 10.8 1.6 Carbohidratos simples (azúcares). Al igual que todos los cereales, el maíz es una fuente importante de carbohidratos, encontrándose entre los principales tejidos del maíz pero principalmente en el endospermo. Estos compuestos químicos se dividen en simples y complejos. Los azúcares constituyen aproximadamente el 2% del peso total del grano y cerca del 65% de los azúcares del grano se encuentran en el germen y, de ellos, el 69% son glucosa (Jackson y Shandera, 1995). Además, contienen monosacáridos (D-fructuosa y D-glucosa en igual proporción); disacáridos como sacarosa y maltosa; trisacáridos como rafinosa, y oligosacáridos. En los granos en vías de maduración, hay niveles más elevados de monosacáridos, disacáridos y trisacáridos (FAO-ONU, 1993b). - 12 - Carbohidratos complejos (polisacáridos). Generalmente, representan un poco más del 71.5% del peso total del grano. Los polisacáridos de mayor importancia en el maíz son los estructurales y los de reserva. Los carbohidratos estructurales son aquellos componentes que forman parte de la estructura de las paredes celulares del grano. Estos carbohidratos son sustancias como las pectinas, hemicelulosa, celulosa y lignina. Los carbohidratos de reserva (almidón) son polisacáridos de almacenamiento energético de gran importancia en el maíz (FAO-ONU, 1993b; Jackson y Shandera, 1995; Singh et al., 2011). Almidón. El componente químico principal del grano de maíz es el almidón, al que corresponde hasta el 72-73 % del peso del grano. (FAO-ONU, 1993b). Es el principal carbohidrato de reserva sintetizado por las plantas superiores. Constituye una fuente de energía esencial para muchos organismos principalmente el humano. Químicamente el almidón es un polímero de glucosa y está compuesto de dos macromoléculas de diferentes estructuras: la amilosa que es el componente esencialmente lineal y la amilopectina que es el componente ramificado. Dentro de los gránulos, el almidón se encuentra en un arreglo semicristalino, en que el carácter cristalino se debe al ordenamiento de las cadenas de amilopectina (Zobel, 1988). En productos a base de maíz como tortillas, botanas, cereales para desayuno, postres, etc., el almidón tiene un papel muy importante en las propiedades fisicoquímicas, funcionales y nutricionales (Agama-Acevedo et al., 2004). Almidón resistente. El almidón resistente se puede clasificar en cinco grupos: almidón resistente tipo I (RS1) es almidón físicamente inaccesible y se encuentra en cereales parcialmente molidos (triturados), granos y hortalizas. El almidón resistente tipo II (RS2) son gránulos de almidón nativo o gránulos de almidón no gelatinizado que son altamente resistentes a la α-amilasa y se encuentra en papas cocidas, plátano verde, y maíz con alto contenido de amilosa. El almidón resistente tipo III (RS3) es el almidón retrogradado y se forma por la cocción y enfriamiento después de la gelatinización durante el procesamiento de alimentos (Alsaffar, 2011; Leszczynski, 2004; Singh et al., 2011). El almidón resistente tipo IV (RS4) es el almidón que ha sido químicamente - 13 - modificado para mejorar sus atributos tecnológicos y funcionalidad. Una nueva clasificación de almidón resistente tipo V (RS5), se forma a partir de lípidos polares y complejos de amilosa (Alsaffar, 2011; Leszczynski, 2004). El maíz es una buena fuente de almidón resistente, el cual puede ser usado en varios productos alimenticios por sus beneficios a la salud. El almidón resistente ha sido asociado con una mejora en el metabolismo del colesterol y reducción de riesgo de cáncer de colón y diabetes tipo II (Alsaffar, 2011; Singh et al., 2011). Fibra dietética. Después de los hidratos de carbono (principalmente almidón), las proteínas y las grasas, la fibra dietética es el componente químico del maíz que se halla en cantidades mayores. Los hidratos de carbono complejos del grano de maíz se encuentran en el pericarpio y la pilorriza, aunque también en las paredes celulares del endospermo y, en menor medida, en las del germen (FAO-ONU, 1993b). Proteína. Después del almidón, las proteínas constituyen el componente químico del grano por orden de importancia. En las variedades comunes, el contenido de proteínas puede oscilar entre el 8 y el 11 % del peso del grano, encontrándose principalmente en el endospermo (74%) y el germen (26%) (FAO-ONU, 1993b; Jackson y Shandera, 1995). La distribución de las proteínas en el maíz es de 8% albúminas (proteínas solubles en agua), 9% de globulinas (solubles en soluciones salinas), 40% de glutelinas (solubles en hidróxido se sodio) y 39% de prolaminas (zeína) (Rojas-Molina et al., 2008). El maíz es deficiente en lisina (1.4-1.6 mg/g en base seca) y triptófano, dos de los ocho aminoácidos esenciales, que el hombre no puede sintetizar (Dickerson, 1996). Sin embargo, variedades de maíces modificados o híbridos presentan un aumento del doble o más del valor de lisina respecto a un maíz normal y también un aumento considerable en triptófano (FAO-ONU, 1993b). Adicionalmente, las proteínas del maíz presentan un alto contenido del aminoácido esencial leucina (Jackson y Shandera, 1995). - 14 - Aceites y ácidos grasos. El aceite del grano de maíz está fundamentalmente en el germen y viene determinado genéticamente, con valores que van del 3 al 18 %. El aceite de maíz tiene un nivel bajo de ácidos grasos saturados: ácido palmítico y esteárico, con valores medios del 11 % y el 2 %, respectivamente. En cambio, contiene niveles relativamente elevados de ácidos grasos polinsaturados, fundamentalmente ácido linoleico, con un valor medio de cerca del 24 % (FAO-ONU, 1993b). Aunque el maíz no es considerado una oleaginosa, es una excelente fuente de ácidos grasos. Aunque altamente poliinsaturados, los lípidos en maíz son muy estables porque contienen altos niveles de antioxidantes naturales (antocianinas en maíz azul y rojo, carotenoides en maíz amarillo y compuestos fenólicos en todas las razas e híbridos) y muy poco ácido linolénico, el cual es fácilmente oxidable (Jackson y Shandera, 1995) Minerales. Aunque los factoresambientales influyen en este contenido, la concentración de cenizas en el grano de maíz es aproximadamente del 1.3 %, sólo ligeramente menor que el contenido de fibra cruda. El germen es relativamente rico en minerales, con un valor medio del 11 %, frente a menos del 1 % en el endospermo. El germen proporciona cerca del 78 % de todos los minerales del grano. El mineral que más abunda es el fósforo en forma de fitato de potasio y magnesio, encontrándose en su totalidad en el embrión, con valores de aproximadamente 0.90 %. Como sucede con la mayoría de los granos de cereal, el maíz tiene un bajo contenido de calcio y de oligoelementos (Bressani et al., 2004). Vitaminas hidrosolubles y liposolubles. Las vitaminas hidrosolubles se encuentran sobre todo en la capa de aleurona del grano de maíz, y en menor medida en el germen y el endospermo. Se han encontrado cantidades variables de tiamina y riboflavina en el grano del maíz; su contenido está determinado en mayor medida por el medio ambiente y las prácticas de cultivo, más que la genética, aunque se han encontrado diferencias en el contenido de estas vitaminas entre las distintas variedades. El contenido de niacina es distinto según las variedades, con valores medios de aproximadamente 20 µg/g (FAO-ONU, 1993b). - 15 - El grano de maíz contiene dos vitaminas liposolubles: carotenoides con actividad de provitamina A (CAPA) y la vitamina E. La vitamina E se halla principalmente en el germen. La fuente de la vitamina E son cuatro tocoferoles; el más activo biológicamente es el tocoferol-alfa; aunque el tocoferol-gamma es probablemente más activo como antioxidante (FAO-ONU, 1993b). 2.1.6. Biofortificación de maíz Una estrategia para aliviar la malnutrición es a través de la agricultura, específicamente aumentando la concentración de micronutrientes (como hierro, zinc y CAPA) en los cultivos básicos a través del mejoramiento (Zhang et al., 2012). Esta estrategia se conoce como biofortificación, y es la primera herramienta agrícola que se emplea en todo el mundo para hacer frente a este problema. Consiste en el desarrollo y diseminación de las principales variedades de cultivos con mayor contenido de micronutrientes (Meenakshi et al., 2010). 2.2 Carotenoides. 2.2.1 Estructura. La estructura química general de los carotenoides consta de un esqueleto de 40 carbonos conformado por unidades de isopreno, esta cadena puede tener terminaciones cíclicas en las que puede haber grupos funcionales que incluyen oxígeno, así, los carotenos son carotenoides hidrocarbonados, en tanto que los derivados oxigenados se denominan xantofilas (Meléndez-Martínez et al., 2004). En ambos casos, la presencia de dobles enlaces alternados en la cadena de isoprenos les permite absorber excesos de energía de otras moléculas, por lo cual poseen propiedades antioxidantes. Por estas propiedades, el consumo de luteína y zeaxantina, que son xantofilas presentes en el grano de maíz, se ha asociado con la prevención de la degeneración de la mácula del ojo, que en personas de edad avanzada produce ceguera (Seddon et al., 1994). - 16 - 2.2.2 Fuente de carotenoides en la dieta. Los CAPA son una de las dos fuentes de vitamina A que existen en los alimentos, la otra es el retinol y esteres de retinol preformados (como el acetato y palmitato de retinol), aunque estos últimos solo se encuentran en alimentos de origen animal como hígado, huevos y productos lácteos. Los tres CAPA son el β-caroteno, que teóricamente puede generar dos moléculas de retinol, el α-caroteno y β-criptoxantina, que generan una molécula de retinol al ser hidrolizados en la mucosa intestinal (Figura 5). De hecho los alimentos de origen vegetal proveen gran parte de la vitamina A consumida por la gente de menores recursos que vive en países en vías de desarrollo (Hess et al., 2005). La absorción de estos carotenoides, al ser ingeridos, varía dependiendo de la matriz de la planta y se incrementa con la presencia de aceites y por procesamientos térmicos (Rock et al., 1998). Figura 5. Vitamina A preformada y carotenoides con actividad de provitamina A. - 17 - 2.2.3 Deficiencia de vitamina A. A pesar de algunos éxitos en los programas de suplementación y/o fortificación, la deficiencia de vitamina A (VAD por sus siglas en inglés) sigue siendo un problema de salud pública ampliamente extendido (Figura 6). La VAD se ha relacionado con problemas para la salud, sobre todo la visual, incrementa las tasas de mortalidad infantil y la incidencia y severidad de enfermedades infecciosas (Ortiz-Monasterio et al., 2007). Ha sido reconocida por la Organización Mundial de la Salud como un problema mayor de salud pública que afecta a más de 100 millones de personas en países en vías de desarrollo, especialmente niños y mujeres (Zhang et al., 2012). Existen dos indicadores que son comúnmente utilizados para determinar la VAD en la población: evaluación clínica de signos oculares y determinaciones bioquímicas de las concentraciones de retinol en plasma o suero (WHO, 2009). Se considera que existe deficiencia de vitamina cuando las concentraciones de retinol son inferiores a 10 µg/dL, y que existe deficiencia subclínica cuando estas concentraciones son menores a 20 µg/dL (Secretaría de Salud, 2009; Villalpando et al., 2003). En México, poco más del 25% de los niños menores de 8 años presentan deficiencia subclínica de vitamina A, y no se observan diferencias significativas entre los niños de zonas urbanas y los de zonas rurales, aunque se nota una mayor prevalencia en las regiones norte (22.5%) y centro (26.5%) (Villalpando et al., 2003). Aunque no existen cifras oficiales actualizadas, el Instituto Nacional de Salud Pública atribuye a la VAD como una causa de las causas de desnutrición infantil en México (Shamah-Levy et al., 2012). Astiazaran-García et al. (2010), estudiaron los niveles de vitamina A en niños del Hospital Infantil del Estado de Sonora y encontraron deficiencia moderada en el 36.7 % de los casos. Por su parte, Lopez-Teros et al. (2013), determinaron los niveles de vitamina A en niños de escasos recursos del estado de Sonora y reportaron que el 48 % de los niños presentaron VAD de leve a moderada. - 18 - Figura 6. Deficiencia de vitamina A alrededor del mundo en el 2005 (imagen adaptada de: http://www.who.int/vmnis/vitamina/prevalence/vita_fig2b.pdf). 2.2.4 Incremento en la concentración de carotenoides. La coloración amarilla o naranja del maíz se debe a dos clases de carotenoides presentes: carotenos y xantofilas (Egesel et al., 2003). Blessin et al. (1963), encontraron que la distribución total de carotenoides es la siguiente: pericarpio: 1%, germen: 3%, endospermo harinoso 16%, endospermo vítreo: 80%. Estudios posteriores mostraron que estas distribuciones y cantidades en los granos dependen del genotipo, aunque hay una tendencia general de que existe una mayor concentración de carotenoides en el endospermo (Buckner et al., 1996; Egesel et al., 2003; Moros et al., 2002). La mayoría de las variedades de maíz amarillo contienen menos de 2 µg/g de CAPA, mientras que el maíz blanco no los contiene. Después de una extensa búsqueda y http://www.who.int/vmnis/vitamina/prevalence/vita_fig2b.pdf - 19 - caracterización, se han encontrado algunas líneas de maíz que tienen concentraciones mayores a 15 µg/g de CAPA, concentración que ha sido fijada como meta por paneles de científicos de diferentes disciplinas en proyectos de mejoramiento (Ortiz-Monasterio et al., 2007). Incrementar en el maíz la concentración de CAPA, como el β-caroteno, podría mejorar los niveles de vitamina A en los consumidores, lo cual tendría un gran impacto dado que el maíz provee de alimento a gran parte de la población del mundo. Al mismo tiempo, se busca que el maízcon estas concentraciones de CAPA sea de alto rendimiento y aceptado por los consumidores (Howe y Tanumihardjo, 2006a; Pixley et al., 2013). En el cuadro 2 se reportan las concentraciones de carotenoides en variedades de maíz encontradas en algunas investigaciones y se observa la gran variabilidad que existe. Es importante mencionar que se reportan cantidades totales, lo que incluye carotenoides con y sin actividad de provitamina A. Cuadro 2. Concentración de carotenoides totales en distintas variedades de maíz. Tipo de maíz Concentración de carotenoides totales (mg/kg) Referencia Dulce inmaduro 0.45 – 33.11 (Kurilich y Juvik, 1999) Amarillo dentado 8.12 (de la Parra et al., 2007) Nativos mexicanos 4.3 – 23.6 (Lozano-Alejo et al., 2007) Mejorados 9.8 – 22.5 Genotipos tropicales 2.42 – 81.3 (Ortiz-Monasterio et al., 2007) 2.2.5 Degradación de carotenoides. Para que el maíz sea consumido debe ser procesado, y este procesamiento incluye tratamientos (secado, molienda, cocción, escaldado, horneado, etc.) que pueden afectar la integridad de los carotenoides, esto es porque los CAPA son compuestos altamente insaturados que son propensos a isomerizarse y oxidarse (Bechoff et al., 2011). Las pérdidas de carotenoides por oxidación dependen de la disponibilidad de oxígeno y se incrementan por la luz, calor, presencia de metales y varias enzimas (Rodríguez- - 20 - Amaya, 2001). La temperatura de secado y almacenamiento, la disponibilidad de oxígeno y las condiciones de luz, son importantes en la determinación de la estabilidad de los carotenoides; sin embargo, estos factores recién comienzan a ser investigados en maíces con elevado contenido de CAPA (Pixley et al., 2013). 2.2.6 Efecto del secado y almacenamiento en los carotenoides del maíz. Quackenbush en 1961 demostró que los niveles de carotenoides disminuyen cuando el maíz se somete a secado en estufa (100°C) y es almacenado, ya sea a temperatura ambiente (25 °C) o a baja temperatura (4 °C). Burt et al. (2010) trabajaron con 6 líneas de maíz y midieron 2 variables: el efecto del tiempo y el efecto del tipo de almacenamiento. Para evaluar el efecto del tiempo, cosecharon el maíz y lo secaron a temperatura ambiente con poca luz, almacenaron las muestras a 4 °C a una humedad relativa del 35% y evaluaron la concentración de carotenoides en grano completo a los 0, 3, 6 y 18 meses. Encontraron que la concentración permanece estable durante los primeros 3 meses, pero decae a los 6 meses aproximadamente un 33%; sin embargo, se estabiliza nuevamente y no hay pérdidas significativas de los 6 a los 18 meses. En un segundo experimento analizaron 3 condiciones de almacenamiento: -80, 25 y 90 °C. Determinaron la concentración de carotenoides a los 0 y a los 4 meses. A -80 °C observaron que la concentración de carotenoides se mantiene. A 25 °C encontraron pérdidas de carotenoides hasta del 50 %, sin embargo, algunas líneas conservaron la cantidad de carotenoides. A 90 °C hubo pérdidas en todos los casos, hasta del 40%, aunque algunas líneas tuvieron pérdidas mínimas (alrededor del 5%). De acuerdo a estos resultados, se sugiere que las diferencias genéticas causan un diferente comportamiento en la cinética de degradación de carotenoides durante el almacenamiento. - 21 - 2.2.7 Efecto del procesamiento en los carotenoides del maíz. En el cuadro 3, se resumen los resultados encontrados en distintos trabajos que evaluaron el efecto de algún tipo de proceso en el contenido de carotenoides del maíz. Cuadro 3. Pérdidas de carotenoides por efecto del procesamiento. Producto Tipo de maíz (número de genotipos) Proceso Carotenoides Pérdida (%) Referencia Conserva Comercial (2) Enlatado α-caroteno 62.4 (Scott y Eldridge, 2005) β-caroteno 25.7 β-criptoxantina -35.4 luteína -1.8 zeaxantina -3.3 Congelado α-caroteno 41.9 β-caroteno -6.3 β-criptoxantina -4.7 luteína -9.5 zeaxantina -1.6 Porridge (gacha o atole) Mejorado (1) Remojado y molienda α-caroteno 7.1 (Li et al., 2007) β-caroteno 7.3 β-criptoxantina 9.5 luteína 5.7 zeaxantina 4.8 Cocción (93 °C, 3 min) α-caroteno 25.3 β-caroteno 24.8 β-criptoxantina 25.3 luteína 29.1 zeaxantina 33.7 Porridge (gacha o atole) fermentado (ogi) Fermentación α-caroteno 21.5 β-caroteno 17.5 β-criptoxantina 23.4 luteína 24.4 zeaxantina 26.3 Cocción (93 °C, 3 min) α-caroteno 28.9 β-caroteno 24.4 β-criptoxantina 29.2 luteína 32.5 zeaxantina 35.6 - 22 - Masa Comercial (1) Nixtamalización y molienda β-caroteno 28.4 (de la Parra et al., 2007) β-criptoxantina 84.3 luteína 68.2 zeaxantina 62.5 Tortilla Cocción (280 °C, 60 s) β-caroteno 67.0 β-criptoxantina 90.5 luteína 73.4 zeaxantina 71.2 Frituras Freído (175 °C, 1 min) β-caroteno ND β-criptoxantina 99.4 luteína 81.0 zeaxantina 81.6 Masa Mejorado (1) Nixtamalización y molienda β-caroteno 43.4 β-criptoxantina 50.2 luteína 69.5 zeaxantina 65.1 Tortilla Cocción (280 °C, 60 s) β-caroteno 68.1 β-criptoxantina 46.3 luteína 70.5 zeaxantina 67.3 Frituras Freído (175 °C, 1 min) β-caroteno 81.7 β-criptoxantina 79.6 luteína 75.1 zeaxantina 71.3 Frituras Locales (4) Nixtamalización, molienda y freído (Ebullición, 5 min y freído a 200 °C, 60 s). Totales 14.8 - 36 (Lozano-Alejo et al., 2007) Sintético (1) 42.9 Híbridos (8) 20 – 81.8 Frituras Mejorado (2) Nixtamalización, molienda y freído (Ebullición, 10 min y freído a 210 °C, 60 s). Totales 67.0 (Coutiño- Estrada et al., 2008) Pan Comercial (1) Horneado (250 °C, 25 min) Totales 38.0 (Kean et al., 2008) Extrudidos Extrusión Porridge (gacha o atole) Hervido (Ebullición, 3 min) Sadza (tipo de atole) Mejorado (1) Cocimiento (100 °C) β-caroteno -22.68 (Muzhingi et al., 2008) β-criptoxantina -0.62 luteína -30.3 - 23 - zeaxantina -11.5 Porridge (gacha o atole) β-caroteno -12.53 β-criptoxantina 11.19 luteína -12.4 zeaxantina -0.27 Mangai (platillo parecido al pozole) β-caroteno -9.55 β-criptoxantina 7.77 luteína -15.4 zeaxantina 10.66 Muffin Horneado β-caroteno 72.54 β-criptoxantina 48.76 luteína 3.29 zeaxantina 21.53 Harina Comercial (1) Escaldado (70 °C, 5 min) β-caroteno -1.1 (Mamatha et al., 2010) luteína -94.6 zeaxantina -126.4 Secado β-caroteno 45.3 luteína -116.3 zeaxantina -184.3 Molienda β-caroteno 27.46 luteína -73.9 zeaxantina -179.6 Phutu (tipo de atole) Mejorado (3) Molienda y cocción (baja temperatura (sic)) β-caroteno -8.6 – -17.6 (Pillay et al., 2014) β-criptoxantina -7 – -40.5 zeaxantina -8.6 – -149 Porridge (gacha o atole) Molienda y cocción (temperatura media (sic)) β-caroteno 2.9 – 22.2 β-criptoxantina 8.3 – 24.3 zeaxantina 12.1 – 22.3 Samp (platillo parecido al pozole) β-caroteno -8.3 – -29.4 β-criptoxantina -6.3 – 10.8 zeaxantina -1.9 – -15.6 Masa Mejorado (2) Nixtamalización y molienda β-caroteno 44.59 (Islas- Caballero, 2011) β-criptoxantina 12.29 luteína 56.87 - 24 - zeaxantina 75.52 Totales 27.72 Tamales sin relleno Cocimiento β-caroteno 38.57 β-criptoxantina -14.57 luteína 35.17 zeaxantina 71.9 Totales 40.6 Se puede observar que los resultados son sumamente variables, lo que indica que las características de cada tipo de maíz y el proceso utilizado influyen directamente en la pérdida de carotenoides. Los valores negativos indican que al final del procesamiento se encontró una mayor cantidad de carotenoides. Cabe resaltar, que en base a los trabajos que se han realizado, hay evidencia de que la nixtamalización así como el proceso utilizado para la elaboración de tortillas y otros productos alimenticios, podría afectar de manera negativa la concentración de CAPA. 2.3 Procesamientodel maíz para la elaboración de tortillas. 2.3.1 Nixtamalización tradicional. La nixtamalización del maíz es un proceso precolombino que consiste en cocer el grano de maíz en una solución alcalina usando hidróxido de calcio. Actualmente es utilizado para preparar tortillas y otros productos alimenticios elaborados a partir del maíz; se estima que éste proceso data desde hace 3500 años atrás aproximadamente (Castillo et al., 2009; Martínez-Bustos, 2011). De manera tradicional, el maíz cosechado se almacena y se deja secar, para después desgranarlo y someterlo al proceso de nixtamalización, siguiendo las mismas etapas del proceso ancestral: usando ollas de barro, maíz, cal y agua son calentados sin alcanzar la ebullición del agua y posteriormente se dejan en reposo generalmente toda la noche. En algunos casos el tiempo de cocimiento varía de acuerdo a la dureza del - 25 - maíz, llevando a cabo una prueba subjetiva denominada la prueba del diente para verificar el cocimiento del nixtamal o mediante pruebas subjetivas de desprendimiento del pericarpio frotando el nixtamal con los dedos. Posteriormente, el nixtamal se separa del nejayote (agua de cocimiento) y luego se lava. El nixtamal es molido usando un metate de piedra volcánica. La masa se evalúa de manera subjetiva presionándola con los dedos (Martínez-Bustos, 2011). La masa obtenida es una mezcla constituida por los polímeros del almidón (amilosa y amilopectina) mezclados con gránulos de almidón parcialmente gelatinizados, gránulos intactos, partes de endospermo y lípidos. Todos estos componentes forman una malla compleja heterogénea dentro de una fase acuosa continua (Gómez et al., 1987). Una de las grandes desventajas de este proceso es que algunas partes del grano (pericarpio y otros sólidos solubles) son removidas y descartadas en el nejayote. El nejayote es el agua de cocción, la cual, además de algunas partes del pericarpio y otros sólidos solubles provenientes de los granos, contiene la mayoría de la cal usada en el proceso, por lo que también resulta una fuente importante de contaminación (Arámbula-Villa et al., 2001; Yañez-Ortega, 2005). Posteriormente, se moldea la masa para preparar las tortillas en forma de discos de diámetro y espesor variable. A continuación, la tortilla se cuece sobre un comal caliente, se calienta y se voltea de dos a tres veces hasta que infle debido al vapor interno atrapado entre ambas capas externas de la tortilla. El producto resultante era llamado “tlaxcalli” por los aztecas y posteriormente fue nombrado tortilla por los españoles. La tortilla tradicional es la masa de maíz nixtamalizado formateada o torteada en forma de disco aplanado que puede variar de 12 a 18 cm de diámetro y de 1 a 2 mm de espesor que es cocida sobre una superficie metálica caliente (260-280 °C) denominada comal (Martínez-Bustos, 2011). Actualmente los molinos/tortillerías usan básicamente el mismo proceso ancestral. El ciclo se inicia con inyección de vapor en una mezcla que contiene grano de maíz, óxido de calcio y una cierta cantidad de agua. El vapor inyectado por el fondo de las tinas, - 26 - agita al maíz para promover un cocimiento uniforme. La temperatura se eleva gradualmente hasta ebullición, una vez en este punto se corta el flujo de vapor y se hace circular agua hasta que la temperatura desciende a la temperatura ambiente. El nixtamal preparado se deja reposar durante 10 a 14 horas, se separa el líquido de cocimiento y se lava el nixtamal con agua y molido en molinos de piedras tradicionales para obtener la masa con la consistencia deseada. El cocimiento de las tortillas se realiza en un sistema de bandas transportadoras calentadas con gas (Arámbula-Villa et al., 2001; Martínez-Bustos, 2011). En la figura 7, se muestra un diagrama de flujo del proceso de nixtamalización empleado para elaboración de tortillas y también para la elaboración de harina nixtamalizada. Es importante mencionar, que a pesar de que el segmento de harina de maíz nixtamalizado ha crecido de modo significativo, la elaboración de tortilla de manera tradicional abarca el 65% del mercado (repartido entre la industria de la masa y la tortilla de establecimientos formales –tortillerías- y la producción de tortilla a nivel familiar) (Cruz et al., 2012). Se estima que un kilogramo de maíz grano rinde en promedio 1.37 kilogramos de tortilla en el proceso tradicional de nixtamalización, mientras que en la producción de harina rinde 1.650 kilogramos de tortilla. El consumo anual de tortilla en el país asciende a 13.6 millones de toneladas (Cruz et al., 2012). - 27 - Figura 7. Diagrama de flujo de la nixtamalización, imagen tomada de: Gutiérrez-Cortez y Cornejo Villegas, 2012. 2.3.1.1 Tortillas. El consumo anual de tortilla en México asciende a 13.6 millones de toneladas (Cruz et al., 2012), es el segundo producto más importante en la canasta básica de consumo, solo después de la carne de res, lo anterior refleja la importancia que tiene este producto en la alimentación de la población del país y el efecto que tiene su precio - 28 - sobre la demanda y sobre el poder de compra de la población mexicana en general y particularmente de la de menores ingresos (Secretaría de Economía, 2012). Como atributos de una tortilla de buena calidad puede considerarse los siguientes: fácil enrollado, suavidad al tacto, olor, sabor textura y plasticidad. Tales atributos se obtienen mediante un procesamiento con concentraciones adecuadas de cal y tiempos apropiados de cocimiento, esto debido a las interacciones químicas y físicas que se dan lugar entre los diferentes componentes del grano de maíz (almidón, lípidos, fibra y proteínas) y la cal durante el proceso de cocción. Esto cambia la microestructura de la harina y la masa y las propiedades fisicoquímicas, reológicas y de textura (Arámbula- Villa et al., 2001); además es deseable lograr óptimas condiciones sanitarias y reconocida calidad nutricional (Antuna-Grijalva et al., 2008). Para la elaboración de tortillas se requiere un grano que produzca masa con alta humedad, buena extensibilidad y resistencia, entre otras características (Arámbula-Villa et al., 2001). La firmeza de la masa está determinada por el tipo de maíz, la dureza del grano, las condiciones de secado, la absorción de agua y el grado de gelatinización del almidón (Bedolla y Rooney, 1984). 2.3.2 Nixtamalización por extrusión. La extrusión es un proceso térmico que ha ganado gran popularidad para la cocción de alimentos. Involucra el flujo de un material a diferentes condiciones controladas de mezclado, cocimiento, amasado, formado, expansión y secado (Dziezak, 1989). Se utiliza para manufacturar una variedad de alimentos como cereales, botanas, alimentos precocidos para bebés, alimentos instantáneos, harinas pregelatinizadas, proteínas texturizadas, dietas para animales domésticos, y en los últimos años en la elaboración de harinas nixtamalizadas (Yañez-Ortega, 2005). Los atributos sensoriales de los extrudidos dependen en gran medida de las variables relacionadas con el equipo (velocidad de alimentación, velocidad y configuración del tornillo, geometría del dado, temperatura y presión) y con la composición química de la - 29 - materia prima (especialmente el contenido de humedad), lo cual determina la calidad del producto final (Pérez-Navarrete et al., 2006). En la nixtamalización por extrusión, la harina de maíz crudo es acondicionada a una humedad del 25 a 60 % con una concentración de hidróxido de calcio de 0.1 a 0.25 % y extrudida a temperaturas de 60 °C a 95 °C, y un tiempo de residencia de 1 a 2 minutos (Martínez-Bustos, 2011). A diferencia del método tradicional, la elaboración de botanas y tortillas de maíz por este proceso ofrece las siguientes ventajas:reduce el tiempo de cocimiento del grano de maíz, hace eficiente el consumo del agua y de la energía; no genera efluentes contaminantes; las temperaturas empleadas durante el proceso garantizan la esterilización de los materiales y el no desarrollo de microorganismos, además, el contenido de humedad de la masa es menor que el obtenido por el proceso tradicional, lo que facilita el freído de las tortillas en la elaboración de botanas. (Fonseca et al., 2008; Yañez-Ortega, 2005). En cuanto a calidad nutricional, los productos elaborados por extrusión de maíz contienen mayor contenido de fibra respecto a los elaborados mediante nixtamalización, esto es debido a que el pericarpio es retenido durante la extrusión (Arámbula-Villa et al., 2001; Fonseca et al., 2008). Arámbula-Villa et al. (2001) y Gutiérrez-Dorado et al. (2008) reportaron que el contenido de proteína es similar en harinas extrudidas respecto a las harinas sin procesar y menor en harinas nixtamalizadas. Dias-Paes y Maga (2004) y Gutiérrez- Dorado et al. (2008) midieron pérdidas de isoleucina y leucina, sin embargo, Dias-Paes y Maga (2004) reportaron también pérdidas de otros aminoácidos (isoleucina, leucina, treonina, valina y especialmente de lisina). Gutiérrez-Dorado et al. (2008) también reportaron que el contenido de lípidos disminuye un 20% durante la nixtamalización y no hay pérdida durante la extrusión. Respecto al contenido de almidón y almidón resistente, no encontraron diferencias significativas. - 30 - Se ha estudiado que la extrusión disminuye la pérdida de vitamina B y compuestos fenólicos en cereales (Athar et al., 2006; Brennan et al., 2011), además, Mora-Rochin et al. (2010) determinaron que los fenoles totales, antocianinas y actividad antioxidante en maíz blanco, azul, amarillo y rojo, sufren menor degradación durante la extrusión que durante la nixtamalización. - 31 - 3. JUSTIFICACIÓN Se han diseñado programas de mejoramiento que están incrementando la concentración de carotenoides en híbridos de maíz, no obstante, el procesamiento que este sufre para la elaboración tradicional de alimentos como las tortillas, es uno de los factores críticos que afecta el contenido de carotenoides con actividad de provitamina A. Se desconoce si la composición química de estos híbridos influye en las características físicas del grano y en la degradación de carotenoides durante el procesamiento. Los estudios que evalúan el efecto del proceso de nixtamalización tradicional sobre los niveles de carotenoides en maíz y las tortillas son limitados; por otro lado, no existe información acerca del efecto de la nixtamalización por extrusión en la concentración de carotenoides en el maíz, proceso que ha demostrado retener algunos compuestos de interés nutricional como antocianinas, compuestos fenólicos y algunas vitaminas en la elaboración de tortillas. - 32 - 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general: Conocer el efecto de los procesos de nixtamalización tradicional y por extrusión, y cocción de tortillas sobre el contenido de carotenoides de híbridos de maíz mejorado. 4.2. Objetivos específicos: - Medir la concentración de carotenoides en el maíz después de someterse a cada etapa del proceso de elaboración de tortillas para determinar en cual se presenta la mayor pérdida. - Determinar el contenido de carotenoides en las tortillas recién hechas y después de 48 horas de almacenamiento en refrigeración, para conocer si existe pérdida de estos metabolitos durante esta etapa. - Determinar mediante un análisis de correlación si la composición química de los híbridos de maíz influye en las características físicas del grano. - Realizar un análisis de correlación entre el contenido de almidón disponible, almidón resistente, proteína y extracto etéreo en masa y tortilla, para conocer si la cantidad de estos constituyentes del maíz se relacionan con una menor degradación de carotenoides durante el proceso de producción de tortillas. - 33 - 5. METODOLOGĺA 5.1. Diagrama experimental. Figura 8: Diagrama de flujo del trabajo experimental. 5.2. Material biológico. Se utilizaron 28 híbridos de maíz mejorados en el contenido de CAPA (Figura 9) proporcionadas por el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMyT). A los 28 híbridos se les determinó el contenido de CAPA por cromatografía de líquidos de ultra presión y su dureza por medio del índice de flotación. Los 8 híbridos con el mayor contenido de CAPA y dureza de intermedia a muy dura fueron elegidos para ser sembradas y así obtener el grano necesario para la investigación. De manera adicional, se incluyó un maíz amarillo comercial, el cual sirvió como un control y referencia. - 34 - Figura 9. Híbridos de maíz biofortificados en contenido de provitamina A. Los 8 híbridos escogidos fueron sembrados durante el ciclo primavera-otoño (Mayo- Noviembre) del 2012 en el Campo Experimental Bajío (CEBAJ) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), situado a los 20° 35’ latitud norte y 100° 49’ longitud oeste a 1765 msnm, la precipitación en el ciclo fue de 238.6 mm. El suelo del área es Vertisol Pélico, el clima del área corresponde al semicálido con una temperatura media de 18.4 °C (INIFAP, 2013). Una vez cosechados, los híbridos fueron desgranados y muestreados mediante el método de cuarteo, en donde los granos de cada híbrido de maíz fueron distribuidos de manera uniforme en una superficie limpia, se presionaron para formar una capa y se extendieron hasta formar un círculo. Se seleccionaron dos mitades (Figura 10) con las cuales se volvieron a formar un círculo y se repitió el procedimiento. Figura 10. Ilustración del cuarteo de granos para obtener una muestra representativa. - 35 - Se seleccionaron 100 gramos (base húmeda) de cada híbrido, para realizar su caracterización química y el contenido de CAPA, los cuales fueron inmediatamente almacenados a -80 °C. El resto del material fue secado durante 24 horas a 50 °C para prevenir contaminación por hongos y homogenizar la humedad de las muestras. Después del secado se colectaron 10 gramos para analizar su contenido de CAPA y determinar el efecto que tuvo la temperatura. Adicionalmente, se tomaron 500 gramos y fueron almacenados a temperatura ambiente para realizar la caracterización física. El material restante fue depositado en bolsas aluminizadas que fueron selladas para evitar el paso de la luz y disminuir el contacto con el oxígeno, agentes que se sabe, colaboran con la degradación de carotenoides. Las bolsas fueron almacenadas a -80 °C en un ultra congelador REVCO modelo ULT2586-5-D38 hasta su utilización (Figura 11). Figura 11. Muestras almacenadas a -80 °C. 5.3. Caracterización física de los híbridos de maíz. 5.3.1. Humedad. La humedad es uno de los criterios de calidad del maíz, siendo lo ideal para nixtamalizar, que el grano tenga una humedad del 12 % (Salinas-Moreno y Vázquez- - 36 - Carrillo, 2006). Para medir la humedad del grano se utilizó un medidor Steinlite® Modelo SS250 (Figura 12), el cual fue calibrado de acuerdo al manual de operación, posteriormente se pesaron 250 g de grano limpio y se vertieron en la cámara del aparato para realizar la medición. Figura 12. Medidor de humedad. 5.3.2. Peso hectolítrico. El peso hectolítrico se considera como la densidad aparente del grano y consiste en determinar el peso de la semilla contenida en un volumen de un litro (Salinas-Moreno y Vázquez-Carrillo, 2006), para ello se empleó una balanza de peso hectolítrico (Figura 13a) y un recipiente certificado de 250 mL (Figura 13b), el cual se llenó con los granosde maíz y se usó una espátula para eliminar el exceso de grano de la parte superior del recipiente rasando en forma de zig-zag. Posteriormente se registró el peso del maíz que estaba en el recipiente y se multiplicó por 4, el resultado se expresó en kg hL-1. - 37 - Figura 13. a) Balanza para peso hectolítrico b) Recipiente de 250 mL. 5.3.3. Dureza. La dureza del grano de maíz es la fuerza necesaria para romperlo (Bennet, 1950). Para medir esta característica se empleó el índice de flotación (IF), que es una medida relativa de la densidad del grano y se basa en el número de granos flotantes en una solución de densidad conocida (Salinas-Moreno y Vázquez-Carrillo, 2006). Se seleccionaron de manera aleatoria 100 granos libres de daños. Se realizó la preparación de una solución de nitrato de sodio (41 g en 100 mL de agua) con una densidad de 1.25 g mL-1; la densidad fue medida con ayuda de un picnómetro para líquidos. La solución se depositó en un vaso de precipitado de 1 L y se añadieron los 100 granos, se agitó suavemente y después de 1 minuto se contaron los granos flotantes (Figura 14). - 38 - Figura 14. Determinación del índice de flotación. 5.3.4. Color. El color del grano de maíz influye en forma determinante en las preferencias del industrial y del consumidor. La medición de color con instrumentos es simple, objetiva, precisa y rápida. Para la medición de color en el presente estudio, se utilizó un colorímetro Hunter-Lab miniScan XE Plus (Figura 15), que tiene la capacidad de medir el color verdadero en forma análoga al ojo humano. Figura 15. Colorímetro Hunter-Lab. - 39 - 5.3.5. Peso de cada cien granos (PCG). El peso de cien granos (PCG) permite clasificar el tamaño del grano en base a su peso (Salinas-Moreno y Vázquez-Carrillo, 2006). Para ello, fueron seleccionados de manera aleatoria 100 granos de cada híbrido y fueron pesados. 5.4. Análisis químicos. Para las determinaciones que se describen a continuación, se necesitan tamaños de partícula inferiores a 0.5 mm, por lo que los granos fueron sometidos a una trituración en un molino Thomas Wiley modelo 3303 con puntos de contacto de acero inoxidable (Figura 16a), el cual produce partículas de aproximadamente 2 mm de diámetro. Las partículas provenientes de la trituración fueron enseguida molidas en un equipo FOSS Tecator Cyclotec 1093 con malla de acero inoxidable que permite el paso solo a partículas inferiores a 0.5 mm de diámetro (Figura16b). La harina resultante fue almacenada en tubos de plástico y almacenada a -80 °C hasta su uso (Figura 16c). Figura 16. a) Molino Thomas Wiley b) Molino Foss Tecator c) Tubos con harina. - 40 - Proteína. La determinación de nitrógeno se realizó de acuerdo a Galicia et al. (2012) quienes usan como referencia el Método Industrial #334-74 (1977) desarrollado para el Autoanalizador Technicon II y se basa en un procedimiento colorimétrico en el cual se forma un compuesto de color verde esmeralda por la reacción del salicilato y del hipoclorito de amoníaco. Se pesaron 40 mg de harina desgrasada en el fondo de un tubo de digestión de 75 mL a los que se agregaron 2 g de mezcla catalítica (1 kg de sulfato de potasio y 5 g de selenio) y 2.5 mL de H2SO4 concentrado. Se dejó reposar cada tubo y posteriormente se digirieron a 380 °C durante 90 min (el digestor se encontraba dentro de una campana de extracción, figura 17). . Figura 17. Digestión de muestras. Al finalizar la digestión los tubos se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se les agregaron 75 mL de agua destilada, se mezcló por inversión la solución de cada tubo. De la mezcla resultante se colocaron 2 mL en el Analizador Technicon para determinar el contenido de nitrógeno. La cantidad de proteína se estimó multiplicando por el factor 6.25, ya que se asume que el contenido de nitrógeno de las proteínas es del 16% (Mariotti et al., 2008). - 41 - Extracto etéreo o grasa cruda. Se utilizó como referencia el método químico de la AACC 30-25, 1995, empleando un extractor continuo Soxtec 2050. Se pesaron 2 g de harina deshidratada y se colocaron en el interior de cartuchos de celulosa. Los cartuchos se colocaron en el equipo Soxtec, el cual utilizó éter de petróleo como solvente (Figura 18). Los vasos del sistema fueron pesados antes del proceso y al finalizar el mismo y se determinó por diferencia de peso el contenido de extracto etéreo, el cual está formado por aceite y otros compuestos liposolubles (Acero- Godínez, 2000). Figura 18. Soxtec 2050. Carotenoides. De la harina de cada híbrido que estaba almacenada a -80 °C, se pesaron por triplicado 600 mg y se colocaron en tubos de vidrio de 15 mL, se agregaron 6 mL de butilhidroxitolueno (BHT) al 0.1% y se agitaron vigorosamente. Posteriormente se incubaron los tubos a 85 °C durante 5 minutos a baño María. En seguida se añadieron 500 µL de KOH al 80%, se agitaron y se incubaron otros 10 minutos a 85 °C. Al salir de la incubación los tubos se colocaron en hielo y se les agregaron 3 mL de agua desionizada fría, se agitaron y se agregaron 200 µL de solución de apocaroteno y 3 mL de hexano, se agitaron vigorosamente se centrifugaron a 3000 rpm durante 2 minutos. La fase superior fue transferida a tubos nuevos. Es importante mencionar que los tubos se mantuvieron en hielo todo el tiempo. La - 42 - extracción con hexano se realizó en 3 ocasiones y se mezclaron las fracciones obtenidas. El hexano fue evaporado colocando los tubos bajo nitrógeno gaseoso y al extracto seco de cada tubo se le agregaron 500 µL de una mezcla de metanol:1,2- Dicloroetano (50:50). Las muestras fueron filtradas, colocadas en viales e inyectadas en el cromatógrafo de líquidos de ultra presión (UPLC) marca Acquity (Figura 19) bajo las siguientes condiciones: - Sistema de bombeo: o Flujo: 0.3 mL/min o Tiempo de corrida: 10 minutos o Sistema de bombeo: Gradiente o Fase móvil A: Acetato de amonio 10 mM en una mezcla de agua/isopropanol (90:10) o Fase móvil B: Acetonitrilo/isopropanol (90:10) - Sistema de inyección: o Volumen de inyección: 2 µL o Método de inyección: Partial Loop with Needle Overfill o Temperatura de columna: 35 °C o Temperatura de muestras: 10 °C o Solución de lavado débil: 900 µL de agua:metanol (90:10). o Solución de lavado fuerte: 600 µL de metanol:agua (90:10) - Sistema de detección: o Longitud de onda: Escaneo 300-498 nm o Proporción de muestra: 20 o Tiempo de filtrado: Normal - Sistema de separación: o Columna: Acquity UPLC BEH C8, 1.7 µm 2.1 x 100 mm o Pre-columna: Acquity UPLC Col. In-Line Filter. - 43 - Figura 19. Cromatógrafo de líquidos de ultra presión, Acquity. NOTA: Todo el procedimiento se realizó en condiciones controladas de temperatura (20 °C) y con luz amarilla. Almidón disponible. Se siguió el protocolo de Galicia et al. (2012), el cual es un ensayo modificado del método comercial Megazyme. El análisis de almidón requiere que la muestra sea desgrasada, ya que los aceites interfieren en su determinación, para ello, 2 gramos de muestra fueron colocados en cartuchos de celulosa (Figura 20a), los cuales se agruparon y unieron con una liga, Figura 20b) y se depositaron en un extractor continuo tipo Soxhlet marca Barnstead Lab-Line® modelo 5000 y se hizo recircular hexano durante 6 horas para remover la grasa de las muestras (Figura 20c y Figura 21). Al terminar el tiempo de recirculación, los cartuchos que contienen las muestras fueron retirados del extractor y colocados en charolas en una campana de extracción para eliminar el hexano remanente. - 44 - Figura 20. Preparación de los cartuchos. Figura 21. Extractor continuo. De cada muestra se pesaron 20 mg de harina desgrasada y se colocaron en un tubo de ensayo,
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