Secuenciación masiva lúminica - Dariel Isai Soria Cordova

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-Lúminica-
Secuenciación masiva
Biología Molecular Básica
Matias Camacho Adamari Abigail
Antecedentes
La secuenciación ayuda conocer la composición de los nucleótidos dentro de una molécula de ADN.
Los métodos de secuenciación masiva que 
se desarrollaron después del método de 
Sanger, son llamados de próxima generación, 
ya que permiten secuenciar gran cantidad 
de ADN en poco tiempo y 
con un costo bajo.
Pirosecuenciación
Secuenciación por unión
Secuenciación por síntesis
Método de terminación de cadenas o secuenciación de primera generación.
Secuencia del primer genoma humano, llamada Proyecto Genoma Humano (PGH).
La secuenciación masiva, permitió la identificación de mutaciones somáticas en genomas de pacientes con cáncer.
Oncogén BRAF, identificado en genomas de pacientes con diversos tumores.
Generalidades
Todas las técnicas de secuenciación masiva de próxima generación constan de los siguientes pasos:
Preparación del templado (molde de ADN para secuenciar).
Preparación de los clones de cada fragmento de ADN (clusters).
Secuenciación (según el tipo).
Análisis de datos.
La preparación del templado, consiste en extraer el ADN analizado y romperlo en trozos pequeños, que producen millones de fragmentos; estos cuentan con extremos libres en los que se adaptan cebadores (primers), siendo de esta forma hibridados con su complementario para iniciar la reacción de amplificación clonal.
Amplificando clonalmente, cada uno de los fragmentos obtenidos mediante PCR, en emulsión o en un soporte sólido.
Dando grupos idénticos (clusters o racimos) de cada uno de los trozos de ADN.
La PCR en emulsión (ePCR) es otra variación de la PCR que se usa típicamente para la amplificación antes de la NGS (next generation sequencing, secuenciación de próxima generación). Este tipo de PCR utiliza superficies de perlas, agua y aceite. La PCR en emulsión permite la amplificación simultánea de cada secuencia sin riesgo de contaminación.
El tercer paso consiste en la secuenciación.
Posteriormente se realiza un análisis informático de los datos obtenidos.
(Mordoh, 2019).
Pirosecuenciación
Primera alternativa al método de Sanger convencional.
Nos permite determinar el orden de una secuencia de ADN mediante luminiscencia.
Técnica basada en el principio de secuenciación de síntesis.
Detección de pirofosfato cuando se incorpora a los nucleótidos, a partir de este se genera luz debido a las reacciones enzimáticas en cadena.
Los fragmentos de DNA obtenidos son adheridos a una superficie, que puede ser nanoesferas o placas, facilitando su manipulación y por lo tanto, el análisis.
Secuenciación 454.
La pirosecuenciación o secuenciación 454, es una tecnología de determinación de secuencia de DNA a gran escala, aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora, el método 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual abarata enormemente el coste del proceso.
El primer Sistema de Secuenciación 454 fue instalado el pasado mes de marzo en el Instituto de Secuenciación y Análisis del Genoma, un programa conjunto del Instituto Tecnológico de Massachussets, la Universidad de Harvard y el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica.
Hasta el momento sólo se ha secuenciado el genoma de pequeñas bacterias. En 2003 la compañía informó de que había descifrado el código genético de un adenovirus en un solo día y recientemente anunció la descodificación del ADN de la bacteria de provoca la tuberculosis, en un intento por encontrar nuevos tratamientos para esta enfermedad.
Método
Unión de hebras de DNA a una esfera (hebra por esfera) por medio de un adaptador, posteriormente sometidas a clonamiento in vitro.
Las esferas son cargadas y se agregan las enzimas DNA polimerasa, sulfurilasa, ATP luciferasa (sustrato luciferin) y apirasa (sustrato ASP) en conjunto con la solución de reacción (dNTP) en ciclos.
La cascada da inicio, con la liberación de pirofosfato, y que debido a la enzima sulfurilasa es convertido a ATP en presencia de ASP.
El ATP generado en conjunto con la luciferasa, controlan la conversión a oxiluciferina, obteniendo así, luz.
La degradación de dNTPs no incorporados y ATP genera la acción de la apirasa.
La luz que se emite es detectada por una cámara CCD y observada como un pico en el pirograma, que es proporcional al número de nucleótidos que están incorporados.
Deoxinucleósido trifosfato. Se distinguen el dATP, dCTP, dTTP y dGTP. El grupo trifosfato se encuentra siempre localizado en posición 5'. Son los precursores utilizados en reacciones de polimerización de DNA. Por ej. en replicación de DNA y ensayos de PCR.
- Más información en: dNTP (Genética) © https://glosarios.servidor-alicante.com
(Cardoso Navarro, 2020).
Aplicaciones
Análisis de Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP).
Identificación de hongos y virus.
Secuenciación de cDNA y genomas completos.
Análisis de fragmentos de DNA polimórficos.
Cuantificación de frecuencias alélicas en poblaciones.
Análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP) comprende un análisis de regiones comerciales cruciales, la situación actual de la industria, las tendencias y los desarrollos potenciales en los segmentos.
Ventajas
Método rápido.
Flexible.
Bajos costos.
Fácil preparación de la muestra.
Desventajas
Secuenciación de tramos cortos de ADN.
Dificultad para determinar número de nucleótidos en regiones homopoliméricas.
Bibliografía
¿Cómo funciona la secuenciación de Illumina? (s.f.) Sawakinome. Recuperado el 11 de marzo del 2022, de https://es.sawakinome.com/articles/science/how-does-illumina-sequencing-work.html
Alquicira, J. (10 de octubre 2017). Secuenciación de alto rendimiento (Pirosecuenciación e Illumina). Conogasi. Recuperado el 11 de marzo del 2022, de https://conogasi.org/articulos/secuenciacion-de-alto-rendimiento-pirosecuenciacion-e-illumina/
Mordoh, A. (2019). Secuenciación masiva de ADN: la próxima generación. Dermatología Argentina, 25(1), 2–8. https://www.dermatolarg.org.ar/index.php/dermatolarg/article/view/1868
Cardoso Navarro, Á. (2020, 1 enero). Esquema técnica de pirosecuenciación [Ilustración]. StuDocu. https://www.studocu.com/es-mx/document/instituto-politecnico-nacional/medicina-genomica/esquema-tecnica-de-pirosecuenciacion-cardoso-navarro-angeles/12931264
De Martos, C. (02 de agosto del 2005). Más cerca de la secuenciación personalizada del ADN. elmundo.es. Recuperado el 11 de marzo del 2022, de https://www.elmundo.es/elmundosalud/2005/08/02/biociencia/1122968523.html
Pirosecuenciación. (s.f.) Sensagent. Recuperado el 11 de marzo del 2022, de http://diccionario.sensagent.com/Pirosecuenciaci%C3%B3n/es-es/
Secuenciación de ADN. (27 de septiembre del 2019). National Human Genome Research Institute. Recuperado el 11 de marzo del 2022, de https://www.genome.gov/es/about-genomics/fact-sheets/Secuenciacion-del-ADN
Valdivieso, M. (28 de junio del 2013). Pirosecuenciación. Weebly. Recuperado el 11 de marzo del 2022, de http://tecnologiamedicaudd.weebly.com/pirosecuenciacioacuten