4 Tecnicas de diagnostico molecular

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TECNICAS MOLECULARES 
 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA 
PCR 
(polymerase chain reaction) 
ISSN 2451-6406 ISSN 2469-2123
PCR 
Es una técnica de replicación enzimática “in vitro” que permite identificar y 
caracterizar organismos mediante el análisis de sus ácidos nucleicos. 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
La amplificación de secuencias específicas de ADN mediante PCR y la posterior observación 
de los productos de amplificación en un gel de agarosa es un método muy utilizado, con el 
cual se logra un diagnóstico rápido, con altos niveles de sensibilidad y especificidad. 
Las secuencias blanco utilizadas deben ser regiones conservadas y 
específicas de los microorganismos para que permitan su identificación y 
caracterización. 
Gen de interés 
! 
AND molde 
1er ciclo 2do ciclo 
3er ciclo 
4to ciclo 
5to ciclo 
6to ciclo 
Amplificación exponencial del AND por PCR 
El objetivo de la técnica es obtener “in vitro” a partir de una pequeña 
cantidad de ADN, millones de copias de la secuencia blanco de interés en 
unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas. 
Secuencia blanco de interés 
hsp65 
IS6110 
IS1245 PRA 
Género Mycobacterium 
Complejo M. tuberculosis 
Mycobacterium avium Identificación de especie de 
Mycobacterias no tuberculosas 
Spoligotyping 
VNTR 
IS901 
IS900 
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN MICOBACTERIAS 
Diferenciación inter 
e intra especie del 
complejo 
M. tuberculosis 
Secuencias blanco más utilizadas 
para la identificación y tipificación 
molecular de micobacterias. 
M. avium subsp. avium 
M. avium subsp. paratuberculosis 
Diferenciación intra 
especie del complejo 
M. Tuberculosis y 
MAC 
Técnicas basadas en PCR para la 
tipificación molecular de 
micobacterias. 
 Micropipetas calibradas  Microtubos 
 Tips con filtro 
 Guantes de latex 
ELEMENTOS NECESARIOS PARA REALIZAR LA 
REACCION DE PCR 
 Termociclador 
 Fuente de poder y cuba para electroforesis 
 Transiluminador de luz UV 
ELEMENTOS NECESARIOS PARA REALIZAR LA 
REACCION DE PCR 
 Para detectar a las micobcaterias que pertenecen al complejo 
Mycobacterium tuberculosis una de las secuencias blanco más utilizada es 
la secuencia de inserción IS6110. 
La reacción se lleva a cabo en un volumen final de 50µL. La mezcla de la 
reacción consiste en: buffer1x (GoTaq Green Buffer, Promega), MgCl2, 
(2,5mM); 200µM de cada dNTP, 10 pmoles de cada oligonucleótido 
iniciador, 10ng de templado; 
1,25U de Taq ADN Polimerasa, completando el volumen final con agua. 
Secuencia blanco Oligonucleótidos iniciadores Referencia Tamaño en pares de bases Ciclos en el termociclador 
IS6110 INS-1 / INS-2 
Hermans y col., 
(1990) 
245 96(3’) / 96(1’) 65(1’) 72(2’)=30c / 72(8’) 
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN MICOBACTERIAS 
La reacción se realiza en un microtubo de 0,2-0,5mL de capacidad 
http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=eppendorf&source=images&cd=&cad=rja&docid=MSOnWMb6_9auVM&tbnid=orWTJmE584qiIM:&ved=0CAUQjRw&url=http://articulo.mercadolibre.com.ar/MLA-448771797-microtubo-con-tapa-15-ml-eppendorf-marca-kartell-italia-_JM&ei=TJLXUbKdD8qTiALY8oCIBw&bvm=bv.48705608,d.cGE&psig=AFQjCNFng999myZaPB9XdnmtoQyW1TOg_A&ust=1373168548001759
 Muestra de ADN 
 
 
 
 Oligonucleótidos iniciadores (primers) 
 
 Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) 
 
 Enzima DNA Polimerasa 
 
 Buffer 
 
 H2O 
 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
 MgCl2 
 
 Oligonucleótidos iniciadores (primers) 
 
 Secuencias cortas de ADN (18-25 bases) 
 
 Complementarias a la secuencia de ADN 
blanco 
 
 Son reconocidos por la polimerasa y definen 
el inicio de la reacción 
 
 Deben estar situados enfrentados 
 y delimitan la zona de ADN a amplificar 
 
Los cebadores determinan la 
especificidad de la reacción 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
Cebador 1 
Cebador 2 
AND polimerasa 
 Enzima ADN polimerasa 
 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, 
nombrada de esta forma debido a que fue obtenida a partir de la 
bacteria Thermus aquaticus, caracterizándose por soportar las 
condiciones de alta temperatura requeridas durante el proceso de PCR 
sin desnaturalizarse. 
 Desoxinucleótidos trifosfato 
 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
Las bases nucleotídicas son 
moléculas orgánicas formadas por 
la unión covalente de un 
monosacárido de cinco carbonos 
(pentosa), una base nitrogenada y 
un grupo fosfato 
 
 
• Constituyen la materia prima para la copia y elongación de la cadena de 
ADN durante la reacción 
• Su concentración óptima evita reacciones inespecíficas 
 
 Buffers 
 
• Es un amortiguador que mantiene el pH 
óptimo para que la enzima actúe 
 
• Proporcionan la fuerza iónica adecuada 
para una máxima actividad de la enzima 
ADN polimerasa. 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
 MgCl2 
 
 
 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
•Actúa como cofactor de la polimerasa, 
es esencial para su actividad. 
 
•Su concentración óptima evita 
reacciones inespecíficas 
 H2O 
 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
Debe ser libre de ADNasa y ARNasa 
 
No olvidar que la mezcla de reacción debe realizarse en hielo para 
evitar que la polimerasa actúe y se formen hibridaciones inespecíficas 
• Para completar el volumen final de 
reacción 
La mezcla de la reacción se realiza en un recinto acondicionado; separado 
del lugar donde se realiza la incorporación del ADN, del termociclador y 
del cuarto de electroforesis. 
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN MICOBACTERIAS 
Existen diferentes medidas para 
evitar contaminaciones que 
generen resultados falsos 
positivos 
- Y ENCENDER LA LUZ UV 
INDICACIONES GENERALES PARA EL CUARTO LIMPIO DE PCR 
 La extracción de ADN 
 se realiza a partir de : 
 
Colonias desarrolladas en los medios diferenciales 
Tejidos, pus, lavajes, linfónodulos (requiere de 
procesamiento previo de la muestra) 
 
Protocolos de extracción de ADN 
¿QUÉ NECESITAMOS PONER EN EL MICROTUBO? 
Luego de haber relizado la mezcla en otro espacio del laboratorio se procede a 
incorporar la muestra de ADN 
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN MICOBACTERIAS 
 Termociclador 
Una vez completada la mezcla final el microtubo es llevado al 
En el termociclador se desarrollan una serie de ciclos térmicos repetitivos, donde 
cada uno está compuesto por tres etapas: 
 
 Desnaturalización: 94 0C, 960C donde se produce la separación de la doble 
hélice 
 
 Hibridación: temperaturas específicas determinada por los primers, éstos se 
unen a los sitios específicos de cada hebra de ADN 
 
 Síntesis de ADN: Extensión de la cadena de ADN 680C- 720C 
 
TERMOCICLADOR 
Los ciclos se repiten entre 25 a 40 veces 
CICLOS DEL TERMOCICLADOR 
T
e
m
p
e
ra
tu
ra
 0
C
 
Tiempo 
 
Denaturalización del ADN 
Extención de la cadena 
Union de los cebadores 
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN MICOBACTERIAS 
 Gel de electroforesis 
Electroforesis 
 Las moléculas cargadas negativas migran al polo positivo por aplicación de un 
campo eléctrico. 
 
Una vez finalizada la etapa de amplificación de ADN en el termociclador, el ADN 
amplificado es separado mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa: 
 Las moléculas más pequeñas atraviesan la matriz de agarosa más rápidamente 
que las de mayor tamaño. 
GEL DE ELECTROFORESIS 
Agarosa en polvo 
 Primero se procede a la realizacion del gel de agarosa 
Se disuelve en una solución buffer TAE 1x 
al 1% (dependiendo del tamaño del 
producto amplificado) y se calienta hasta 
la disolución completa de la agarosa 
 Una vez enfriada la solución aproximadamente a 500C se agrega bromuro de 
etidio (0,5µg/mL) que permitirá la visualización del ADN amplificado en el 
transiluminador de luz UV. Luego se coloca la solución en la cama de la cuba de 
electroforesis previa colocación de los peines que actuan como moldes, que 
formarán los posillos en los que se depositaránlos productos de PCR. 
 Los productos de PCR se siembran en cada posillo 
formado. Para determinar el tamaño del fragmento 
amplificado se utilizan marcadores de peso molecular. 
Siempre debe usarse un control positivo y uno negativo. Asimismo también debe 
incorporarse un control de inhibición para identificar falsos negativos por 
inhibición de la polimerasa. 
 La electroforesis horizontal se realiza a una potencia de 90-100 voltios durante 
aproximadamente una hora, en el mismo buffer con el que fue preparado el gel. 
GEL DE ELECTROFORESIS 
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN MICOBACTERIAS 
 Transiluminador de luz UV 
 Una vez terminada la electroforesis, el gel de agarosa al que se le adicionó 
bromuro de etidio, es visualizado en un transiluminador de luz UV y luego es 
registrado fotográficamente. 
 Equipo para captar y digitalizar 
imágenes. 
 El bromuro de etidio se intercala entre las hebras 
de ADN y fluorece ante la luz ultravioleta 
INTERPRETACION DEL GEL DE AGAROSA 
El tamaño del producto amplificado es estimado utilizando un marcador de peso molecular, 
en este caso de 100pb, y comparado con el control positivo de la secuencia blanco amplificada. 
 
 
 
También se incluye un control negativo de reacción que en caso de ser positivo determina 
contaminación en la reacción de amplificación ya que solamente posee agua en vez de la 
muestra de ADN. 
 
M: marcador molecular, (tienen pesos moleculares de referencia) 
m: muestra amplificada 
c+: control positivo 
c-: control negativo 
 El fragmento de IS6110 amplificado es de 245 pb 
pb: pares de bases 
 Diferenciación de las distintas especies de micobacterias. 
 
 Detección de micobacterias de difícil aislamiento por cultivo. 
 
 Detección de micobacterias directamente a partir de muestras clínicas sin 
necesidad del cultivo. 
 Detección de rodeos infectados a partir de pooles de leche de tanque de 
tambo. 
 Tipificación molecular de micobacterias, estudios de epidemiología 
molecular. 
 Establecer relaciones genéticas y rutas de transmisión. 
 
 
ALGUNO DE LOS USOS DE LA PCR EN TUBERCULOSIS