Labo 1 - Parte 2 - Métodos - agustina martin

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MÉTODOS DE
EXAMEN MICROSCÓPICO
Conjunto de procedimientos a los que 
se somete el material en estudio para 
poder realizar su examen microscópico
MÉTODOS DE EXAMEN MICROCÓPICO
• INMEDIATO (Tejidos vivos):
• Sin cambios: en fresco
⚫ Con coloración vital:
⚫ Intravital
⚫ Supravital
MEDIATO (Post mortem):
Tejidos fijados y coloreados
EXAMEN INMEDIATO
SIN CAMBIOS (EN FRESCO)
• Se basa en los diferentes índices de refracción que
presentan células y tejidos.
• Se utiliza para el estudio de animales microscópicos (ej:
protozoos) y células descamadas de los epitelios de
revestimiento (ej: epitelio vaginal), suspendidas en un medio
líquido apropiado.
EXAMEN INMEDIATO 
CON COLORACIÓN VITAL
• Las coloraciones vitales se basan en la propiedad de
determinadas células para incorporar ciertas
sustancias coloreadas.
•No se utilizan reactivos.
• INTRAVITAL: A un animal vivo se le administra una sustancia que se distribuye en
todo su organismo y es captada por determinadas células. Luego se obtiene el
material a estudiar, cuyas células se revelan indirectamente por el depósito de
colorante.
⚫ Azul pirrol.
⚫ Rojo neutro.
⚫ Tinta china.
SUPRAVITAL: Se practica sobre células y tejidos separados del organismo al que
pertenecen y continúan vivos un tiempo variable, lapso en el que deben ser
coloreados.
⚫ Verde jano B
EXAMEN MEDIATO 
POST FIJACIÓN Y COLORACIÓN
Implican un conjunto de procesos a los que son sometidos células y/o tejidos para
la obtención de preparaciones histológicas.
⚫ Corte histológico para MO:
Técnica convencional
Técnica rápida
⚫ Corte histológico para MET
⚫ Extendido
⚫ Frotis
⚫ Impronta
CORTE HISTOLÓGICO PARA MO
TÉCNICA CONVENCIONAL
⚫ 1-Obtención del espécimen.
⚫ 2-Fijación.
⚫ 3-Inclusión en parafina.
⚫ 4-Cortes.
⚫ 5-Colado.
⚫ 6-Coloración.
⚫ 7-Deshidratación.
⚫ 8-Aclaración.
⚫ 9-Montaje.
1-OBTENCIÓN DEL ESPÉCIMEN:
Para su obtención necesario utilizar instrumental bien afilado.
El tejido debe cortarse en trozos pequeños.
2- FIJACIÓN:
Evita en los tejidos los fenómenos de autólisis y el daño por
putrefacción.
Conserva las estructuras tisulares semejantes a como se
encontraban en vivo.
Los fijadores pueden ser:
⚫ Físicos.
⚫ Químicos.
FIJADORES FÍSICOS
✓CALOR:
Seco
Húmedo
✓ DESECACIÓN
✓ FRÍO: No es un verdadero fijador. Fuera de su influencia el tejido
se altera. Sólo actúa como conservador.
FIJADORES QUÍMICOS
SIMPLES:
⚫ FORMOL AL 10%
⚫ Tetróxido de osmio
⚫ Alcohol etílico
⚫ Ácido acético
COMPUESTOS o MEZCLAS FIJADORAS:
⚫ Líquido de Bouin: ác. Pícrico + formol + ác. acético
⚫ Líquido de Zenker
⚫ Líquido de Helly
⚫ Alcohol-éter
FORMOL AL 10%
⚫ Se prepara con nueve (9) partes de agua y una (1) de
formol al 40%, que es el denominado “formol puro” o
“comercial”
⚫ Se lo denomina fijador universal: Conserva todas las
estructuras y permite la refijación posterior con otros
fijadores.
PASOS EN LA REMISIÓN DE MATERIALES PARA ESTUDIO:
⚫ Obtención del espécimen con instrumento cortante bien afilado.
⚫ Cortes en piezas pequeñas, no más de 3 mm de espesor.
⚫ Utilización de frasco de boca ancha.
⚫ El volumen del fijador en el que se sumerje la muestra debe ser 40 a
50 veces mayor que la misma.
⚫ Fijación inmediata, para evitar autólisis y putrefacción.
⚫ Uso de fijador apropiado, de acuerdo a lo que se quiera estudiar.
⚫ Rotular el frasco.
3-INCLUSIÓN EN PARAFINA:
Sustancia lipídica para darles la firmeza y elasticidad necesarias
de modo que puedan cortarse en láminas finas y transparentes.
Pasos:
⚫ Deshidratación: Pasajes sucesivos en alcoholes de
concentración creciente y acetona.
⚫ Aclaración: Con xilol (xileno) o toluol (tolueno). Son sustancias
solubles tanto en acetona como en parafina.
⚫ Inclusión propiamente dicha: Se realiza con parafina caliente
(56 - 60º C) que se mantiene líquida mediante la utilización de
estufas. La parafina ocupa el lugar que tenía el agua en los
tejidos. Se enfrían a temperatura ambiente y se desmoldan. El
resultado es un bloque de parafina con el material en su interior
(taco).
ESTUFA
TACOS DE PARAFINA 
Y
MOLDES PARA EL ARMADO DE 
TACOS
4-CORTES:
Se utilizan micrótomos que logran secciones muy delgadas,
homogéneas y translúcidas, del material a estudiar.
Los micrótomos tienen cuchillas fijas y soporte de taco móvil.
5- COLADO:
Los cortes obtenidos con el micrótomo se colocan en un
baño de agua caliente para eliminar los pliegues.
Luego se los adhiere a un portaobjetos al que previamente
se le colocó albúmina glicerinada de Mayer.
6- COLORACIÓN:
Se utilizan sustancias coloreadas, por lo general
hidrosolubles.
Las distintas estructuras tisulares y/o celulares tienen
captación selectiva para diferentes colorantes, lográndose
cambios relativos de densidad óptica y de color.
PASOS:
⚫ Desparafinización: Pasajes susecivos en xilol (o toluol),
acetona y alcoholes en concentración decreciente.
⚫ Hidratación con agua: Favorece la acción del colorante
hidrosoluble.
⚫ Coloración propiamente dicha: Se basa en la formación de
sales entre los colorantes y los componentes celulares.
COLORANTES ÁCIDOS:
⚫ Eosina.
⚫ Fucsina punzó.
COLORANTES BÁSICOS:
⚫ Hematoxilina.
⚫ Hemalumbre
COLORANTES NEUTROS:
⚫ Azul de metileno
INDIFERENTES (no forman sales):
⚫ Rojo escarlata
ACIDOFILIA Y BASOFILIA
Colorantes BÁSICOS (por ej. hematoxilina): se fijan a 
los componentes celulares ÁCIDOS (por ej. ácidos 
nucleicos), que tienen afinidad por los mismos: son 
BASÓFILOS.
Colorantes ÁCIDOS (por ej. eosina): se fijan a los 
componentes celulares BÁSICOS (por ej. proteínas), 
que tienen afinidad por los mismos: son ACIDÓFILOS. 
BASOFILIA: Afinidad por los colorantes básicos. Marca
presencia en las células de componentes ácidos (como
ARN vinculado a síntesis proteica). Los citoplasmas
basófilos se correlacionan funcionalmente con la
síntesis proteica. Los núcleos siempre son basófilos.
ACIDOFILIA: Afinidad por los colorantes ácidos. Marca
presencia, en el citoplasma de las células, de
componentes básicos (proteínas).
ACIDOFILIA Y BASOFILIA
Las coloraciones pueden ser:
ORTOCROMÁTICAS:
⚫ Los tejidos adquieren igual color que el de la sustancia 
empleada. Ej. Hematoxilina, eosina, verde luz.
METACROMÁTICAS:
⚫ El color que adquiere la estructura que se tiñe es 
diferente al de la sustancia empleada. Ej. azul de 
toluidina coloreando de rojo.
COLORACIONES COMUNES:
BICRÓMICAS:
⚫ Hematoxilina / Eosina (H&E).
⚫ Los núcleos se tiñen con hematoxilina y los citoplasmas
y la sustancia intercelular, con la eosina.
TRICRÓMICAS:
⚫ Hematoxilina / Fucsina punzó / Verde luz o azul de
anilina.
⚫ Los núcleos se tiñen con hematoxilina, los citoplasmas,
con la fucsina punzó y la sustancia intercelular, con
verde luz o azul de anilina.
BICRÓMICA (H&E)
TRICRÓMICA DE MASSON
TRICRÓMICA DE MALLORY
COLORACIONES ESPECIALES:
SALES DE PLATA (ARGÉNTICA): Tiñe de negro las fibras de reticulina.
ORCEÍNA:Tiñe de marrón rojizo las fibras elásticas.
PAS (Técnica del ácido peryódico y el reactivo de Schiff): Colorea glúcidos y
mucinas neutras de color rojo-violáceo (magenta).
AZUL ALCIANO (ALCIAN BLUE): Colorea mucinas ácidas y glucosaminoglicanos
de color azul turquesa (ortocromasia).
AZUL DE TOLUIDINA: Colorea glucosaminoglicanos de color rojo
(metacromasia).
SUDAN NEGRO, SUDAN III y ROJO ESCARLATA: Tiñen lípidos. El procesado
común elimina los lípidos de los tejidos (son arrastrados por los solventes), para
preservarlos se usan cortes por congelación.
COLORACIÓN CON SALES DE PLATA
ORCEÍNA
PAS
ALCIAN BLUE
7- DESHIDRATACION: Tándem Alcohol-Acetona
8- ACLARACIÓN: Con xilol o toluol.
9- MONTAJE: Sobre el corte coloreado se coloca una sustancia
con igual índice de refracción que el vidrio del portaobjeto, que
se consolida, no altera la coloración y sirve para la adhesión del
cubreobjetos (una lámina de vidrio muy delgada, que brinda
protección del deterioro ambiental). Se usa el Bálsamo de
Canadá.
CORTE HISTOLÓGICO PARA MO
TÉCNICA RAPIDA⚫ Se reduce el tiempo entre obtención del espécimen y observación del
corte (15 a 20') por lo que es útil para diagnóstico intraoperatorio.
⚫ Se utiliza el efecto conservador e indurante del frío (no hay fijación ni
inclusión)
⚫ Los cortes se hacen con micrótomo de congelación o con crióstomo (se
logran cortes más delgados con el segundo).
⚫ La coloración se hace en forma directa (no se deshidrató el tejido
previamente)
⚫ El montaje se hace con la gelatina glicerinada (hidrosoluble).
CORTE HISTOLÓGICO
PROCEDIMIENTO PARA MET
⚫ Fijación: Glutaraldehído y tetróxido de osmio.
⚫ Deshidratación: Alcoholes de concentración creciente.
⚫ Aclaración: Oxido de propileno.
⚫ Inclusión propiamente dicha: Resinas o Plásticos (mayor elasticidad y dureza que la
parafina)
⚫ Cortes: Se realizan con ultramicrótomos.
⚫ Colado: Sobre grillas de cobre (mallas de alambre)
⚫ NO HAY COLORACIÓN.
⚫ ELECTRODENSA: sustancia que frena el paso de los electrones, da una imagen
oscura.
⚫ ELECTROLÚCIDA: sustancia que permite el paso de los electrones, da imagen clara.
EXTENDIDO:
Dispersión sobre un portaobjetos de una sustancia homogénea (por ej.
sangre), utilizando otro portaobjetos deslizado a 45º.
Se fija (alcohol) y se colorea (May Grünwald Giemsa).
FROTIS:
Dispersión heterogénea sobre un portaobjetos de materiales
heterogéneos y grumosos, utilizando un asa o espátula.
Se utiliza para estudio de célula epiteliales de revestimiento descamadas
(bucal, bronquial,vaginal). Se fijan en alcohol-éter o secados al aire y se
colorean.
Más común: frotis de cuello uterino para detección precoz del cáncer de
cuello de útero o de lesiones precursoras. Se colorea con técnica de
Papanicolaou.
IMPRONTA:
Sellado sobre el portaobjetos con material proveniente de tejidos que
desprendan células fácilmente (médula ósea, ganglio linfático). Se fija y
se colorea.
OTROS MÉTODOS DE EXAMEN
⚫ CITOQUÍMICA e HISTOQUÍMICA
⚫ HISTOENZIMOLOGÍA
⚫ INMUNOHISTO(CITO)QUÍMICA
⚫ RADIOAUTOGRAFIA
⚫ MÉTODOS DE FRACCIONAMIENTO CELULAR