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manipulacion-de-acidos-nucleicos
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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN 
Etapas Básicas de un Procedimiento Gral. P/ 
Extracción y Purificación de ADN
Disgregación o fragmentación del Tejido, medio de cultivo1.
Lisis celular2.
Clarificación 
Separa restos celulares para obtener muestra de 
interés.
a.
3.
Purificación
Asegurar que el ADN o ARN a.
4.
Análisis:
Electroforesis --> cualitativoa.
Espectrofotometría --> cuantitativob.
5.
Acompañadas de medidas 
que inactiven nucleasas 
celulares Durante todo el procedimiento se 
deben usar soluciones y material 
estéril, además de guantes
Métodos de Fragmentación y Lisis 
celular para la extracción de ADN
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para 
romper el material de inicio (cél o tejidos) pero la delicadeza para 
preservar las moléculas de interés.
•
MÉTODOS FÍSICOS
Homogenización mecánica◊
Homogenización en solución
Desestabilizan membranas o pH○
◊
Molienda manual en mortero◊
Bolitas de vidrio
Arena de cuarzo○
◊
Sonicación
Por medio de ondas○
◊
Análisis por espectrofotómetro 
y electroforesis en gel
ELECTROFORESIS
Separación de mol. mediante un campo eléctrico
Se realiza en Gel de Agarosa (Matriz)
SDS-PAGE --> Proteínas
Se hacen "pozos" y en cada poso se carga la muestra 
de Adn

Se carga c/colorante (Azul de Bromogenol) p/seguir 
el corrimiento del ADN

Teñir gel con Bromuro de Etidio 
Teratogénico--> Se intercala entre el ADN○
Fluórese en luz UV○

También se utiliza colorante Sybr green
NO teratogénico○

ESPECTROFOTOMETRÍA
260nm (máxima absorbancia de ácido nucleicos)
Se multiplica con el volumen○
Para dar la muestra directa del ADN○
Obtener la concentración en mg ○
•
280nm (máxima absorbancia de proteínas)•
MÉTODOS QUÍMICOS
Detergentes
SDS--> Desestabiliza membranas celulares
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Lisozima
Acompañan a la homegenización de Sol.
Rompe enlaces b-1,4- entre N-acetil murámico 
y N-acetil glucosamina de peptidoglicano de la 
pared celular de bacterias
Liticasa
Rompe enlaces b-1,3 de glucano de levaduras
Proteasas
Rompe enlaces peptídicos de proteínas de 
pared (Proteasa K) y membrana plasmática e 
interacciones cél-cél.
El ADN y ARN puede perseverarse 
aun utilizando 4 métodos
1. Componentes de una solución de lisis
Etilen Diamino Tetracético (EDTA)
Quelante (secuestra) de iones Mg2+
Inhibe nucleasas
Minimiza la degradación de ADN durante 
la extracción/purificación

Amortiguador pH (7-8)
Depende del tipo de la muestra
2. CLARIFICACIÓN
Eliminación de restos celulares*
Organelos, ARN o ADN, proteínas Lípidos, CH, etc*
Centrifugación•
Filtración
De 4.2 micras•
•
Método mixto
Enzimas + centrifugación•
•
3. PURIFICACIÓN
Fenol
Desnaturaliza proteínas precipitándolas○
◊
Precipitación de proteínas con sales "Salting out"◊
Cloroformo◊
Etanol◊
Extracción de ADN desde gel de agarosa◊
Purificación mediante columna de afinidad
Pasar el precipitado a través una columna de Oligo dT○
◊
Para precipitar el ADN que es soluble en agua pero cuando 
se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la 
interfase entre el alcohol y el agua
ADN--> Tiene carga negativa
Se agregan para indicar hasta donde se debe 
detener el voltaje/corrimiento de la muestra
Marcadores de pares de bases--> 
electroforesis de Ácidos Nucleicos
•
Marcadores de peso molecular-->
electroforesis de Proteínas
•
Las muestras más largas se retienen
Les cuesta migrar a través del gel○
▪
Las muestras más pequeñas avanzan más▪
Mientras más concentrado sea el gel de 
Acrilamida o Agarosa, más cerrado es el poro, y 
si es más cerrado, más le cuesta avanzar a las 
muestras
▪
No es muy específica para la 
cuantificación
Bases nitrogenadas•
Purinas--> Dos anillos
Absorben Luz UV a 260nm○
•
Tirosina, Triptófano y Fenilalanina▫
Tienen anillos bencénicos
Dobles enlaces--> Absorben 
luz UV a 280nm
▫
▫
En Agarosa es Marcador 
de Pares de Bases
Factores que Afectan el 
Rendimiento, Calidad y 
Pureza de la Purificación 
de ADN o ARN
Cantidad de material de partida.
No. De copias de la mol de ADN.○
Cantidad de tejido.○
•
Condiciones en la que se encuentra el material de inicio.
(Fresco, Congelado, Fijado).○
•
Contaminantes o interferentes en el material biológico.•
Compromiso entre:
Rendimiento/Calidad/Pureza.○
•
Manipulación de Ácidos Nucleicos
 Biomed II página 1 
Talia Karen Tenorio Salazar
Talia Karen Tenorio 
Salazar
Talia Karen Tenorio 
Salazar
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Minimizar la actividad de RNAsas liberadas desde la cél lisadas durante la extracción
La cantidad de RNAsa depende del tipo de células•

ARN total o sub-celular (citosólico o nuclear)
RNAsas
Son muy resistentes a
T° ebullición◊
Autoclavado◊
Desnaturalización c/desnaturalizantes fuertes◊

Por ello deben ser eliminadas, NO inhibidas
Tx del material de vidrio y de las soluciones▪
Uso de guantes▪
Ambiente libre de RNAsas▪
Uso de inhibidores de RNAsas▪
Desnaturalizantes fuertes
HCl Guanidina▫
Tiocianato de Guanidinina c/agentes reductores▫
▪
EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL
Lisis con desnaturalizantes de prot. Fuertes.
Ticionato de Gunidina --> Desnaturaliza RNAsas○
Fenol ácido--> Desnaturaliza RNAsas○
Trizol--> Desnaturaliza prot.○
Agua DEPC○
•
Para inactivar RNAsas•
Extracción c/ Fenol ácido (pH 4.5)1.
Precipitación con Isopropanol2.
Se obtiene una mezcla de ARNm, ARNr y 
ARNt
ARNm tiene cola de PoliA y los otros noa.
3.
Purificación de ARNm x Cromatografía de 
afinidad poli-dT
4.
CROMATOGRAFÍA x AFINIDAD
Mezcla de todos los ARN1.
Tomamos un columna2.
Dentro de ellos tienen una cola de Timinas3.
El ARN que tenga colas poliA se adhiere a las 
colas de Timinas
4.
PURIFICACIÓN DE ARN TOTAL
Electroforesis y Espectrofotometría
COMPROBACIÓN
1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DNA diana 3. PREPARACIÓN DE LA MEZCLA POR PCR
(Amplificación/Replicación)
Para identificar un fragmento de ADN 
diana de la muestra que extrajimos
Primers--> Inician replicación•
Taq polimerasa --> Amplifica
Pol de Termofillus acuaticum○
Resisten temp. extremas○
•
dNTPs --> Nucleotidos
Deoxinucleotidos○
Ya están purificados p/ aplicarse○
•
Buffer de amplificación
pH adecuado○
Sales necesarias○
•
Reacción en Cadena de la Polimerasa
4. AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS○
2. COMPROBACIÓN DE LA EXTRACCIÓN
Desnaturalización
Abrir hebras de ADN○

Alineamiento
Apareamiento de primers c/ADN○

Extensión
Replicación de la cadena○

Cada muestra tiene su temp y tiempos específicos
Replicación --> 1 sola copia
Amplificación --> Muchas 
replicaciones del ADN a 
identificar
ES UN CICLO
5. DETECCIÓN E INTERPRETACIÓN○
Electroforesis•
CICLO DE LA AMPLIFICACIÓN
3. Extensión
72°C x 60 seg
Desnaturalización
90-95°C x 30 seg○
1.
2. Alineamiento
Composición, tamaños y 
concentración de primers
○
50-60°C x 1 min○
*Se pueden hacer varios 
ciclos, ± 30-40 ciclos 
dependiendo el fragmento*
Técnica p/obtener una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN de 
interés, partiendo de una pequeña muestra
DE PUNTO FINAL
Extracción y Purificación de ARN
 Biomed II página 2 
Talia Karen 
Tenorio Salazar
Talia 
Karen 
Tenorio 
Salazar
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Es una PCR pero con ARN
Se hace transcripción en reversa
ARNm 1.
Transcripción reversa 
Con Primer de transcriptasa reversaa.
2.
Transcriptasa reversa3.
Copia una cadena de ADN a partir de una de ARNm
La nueva cadena es cDNAa.
4.
Eliminamos el ARNm5.
Ya hay copia de ADN6.
Se realiza la PCR y todos su procedimientos.7.
APLICACIONES
Ingeniería genética•
Estudios de expresión génica•
Secuenciación directa de secuencias amplificadas•
Detección de mutaciones•
Dx de enfermedades génicas e infecciosas•
Identificación de restos bilógicos, determinación de 
paternidad, pruebas periciales•
SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Uso de ADN POL p/sintetizar cadenas de 
ADN c/terminación específica
•
Generan fragmentos de ADN de todos 
los tamaños
Se distinguen por un marcaje o 
terminador específico
○
•
Templado (ADN a secuenciar)
Muestra del Pxa.
1.
ADN POL-I de E. coli (5'-3')2.
Primer3.
ddNTPs y dNTPs
Dideoxinucleótidos y Deoxinucleótidosa.
4.
Buffer5.
COMPONENTES
Fraccionamiento x electroforesis•
Revelación radiográfica•
INCUBACIÓN
Se utiliza una maquina especializada•
Usa detector óptico para:
Obtener la info de la secuencia○
Pasar la info directamente a unacomputadora○
•
Hay ddNTPs y dNTPs de todos los nucleótidos•
El OH de los dNTPs permite realizar enlaces 
fosfodiéster
1.
Para poder realizar la replicación2.
Una vez que se le adhiere un ddNTP termina 
la replicación
3.
Se libera la cadena4.
Cae en cualquiera de la Bases Nitrogenadas•
Electroforesis c/Nitrocelulosa
Los fragmentos que salen se leen de abajo hacia arriba•
Las + pequeñas abajo --> Inicio de la cadena/secuencia•
Las + grandes arriba--> Final de la cadena/secuencia•
*Premio Nobel 1958 y 1980*
OTRAS TÉCNICAS
Es cuantitativa•
En el momento en que se 
amplifica el fragmento, se va 
cuantificando
•
Se cuantifican el No. De copias 
que se generan
•
DE PUNTO 
FINAL
EN TIEMPO 
REAL
CUANTIFICAR
dNTPs
Marcar primer con fluorocromos
Afinidad/especificidad elevada○
•
Cada que se genera una copia--> Lanza 1 fluorescencia•
Leída en tiempo real x Un aparato c/lectores láser•
Se tienen dos muestras•
Se ven con gráficas•
No necesita Electroforesis•
Muestra de ADN1.
Amplificación (PCR)2.
Microsecuenciación3.
Hibridación4.
Se toma un "portaobjetos"
Hay un arreglo de ADNa.
Cada puntito corresponde a 1 gen específicob.
Puede haber miles de genes en 1 solo portaobjetosc.
5.
Se agrega ADN marcado6.
Si los genes se hibridan
Si las hebras de ADN se complementana.
7.
Se puede analizar muchos genes 
relacionados con enfermedades
Quiere decir que tenemos mat 
genético de lo que estamos 
estudiando
8.
Emiten fluorescencia9.
Detectadas x computadora
Colores:•
Verde --> NADAa.
Amarillo --> POCAb.
Naranja--> MUCHAc.
10.
Streptococcus pyogenes tiene esta 
estructura en:
Heterocromatina○
En la secuencias en Tandem○
•
Fago infecta--> bacteria1.
Inyecta ADN viral2.
La bacteria activa --> CRISPR3.
Copia fragmento de ADN viral y lo guarda
En el CRISPRa.
4.
Para 2da exposición activa Cas9
Complejo enzimáticoa.
5.
Reconoce ADN viral6.
Corta ADN viral7.
Impide infección8.
Charpentier y Doudna
Extraer el CRISPR/Cas9 y hacer que cortara 
el ADN viral y reparar el ya infectado
•
En cél Eucariotas•
Modificaron CRISPR p/reconocer mutaciones•
 Biomed II página 3 
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