Practica 9 - Determinación de Salmonella-VIRTUAL - José Alejandro Del Campo Vázquez

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (BT1007) 
 
PRACTICA 9. DETERMINACIÓN DE Salmonella 
 
OBJETIVO: 
Identificar al género Salmonella como un microorganismo patógeno en alimentos y 
conocer la técnica de enriquecimiento selectivo 
 
INTRODUCCIÓN: 
Salmonella es un género bacteriano, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae 
integrada por gérmenes de forma bacilar, no esporulados, habitualmente móviles mediante 
flagelos perítricos, aunque existen mutantes inmóviles. 
 
Gram negativos, aeróbios-anaeróbios facultativos, fermentan la glucosa con 
producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son citocromo 
oxidasa-negativos. 
 
Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características 
bioquímicas y serológicas definidas. 
 
Se puede afirmar que todos los productos crudos de origen animal y el ambiente en 
que se preparan pueden estar contaminados con Salmonella. De aquí que los alimentos que 
con más frecuencia dan lugar a casos de salmonelosis son: carnes y productos cárnicos, 
algunos embutidos, carne de aves y subproductos, huevos y ovoproductos, leche y 
derivados, puesto que a veces un bajo número de Salmonella (inferior a 100 gérmenes por 
gramo) puede ser causa de enfermedad, lo más importante es asegurar su ausencia en los 
alimentos listos para el consumo. 
 
Como parte de la metodología para el aislamiento e identificación del género 
Salmonella se utilizan, habitualmente, varias etapas: 
 
1. Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo. 
2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos. 
3. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos. 
4. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas. 
5. Confirmación serológica de las colonias sospechosas. 
 
 
 
PROCEDIMIENTO: 
 
1. Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo: 
1. Pesar asépticamente 25 g. de la muestra a analizar y adicionarlos a 225 ml de caldo 
peptonado. Homogeneizar la mezcla en el stomacher. 
2. Incubar a 37°C durante 24 h. 
 
2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: 
1. Inocular 1 ml del caldo de preenriquecimiento en 10 ml de caldo de tetrationato 
(adicionar 0.2 ml de una solución yodo-yoduro de potasio), e incubar a 43°C por 24 
horas. 
2. Inocular 1 ml del caldo de preenriquecimiento en 10 ml de caldo selenito cistina. 
Incubar a 43°C durante 24 hrs. 
 
3. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos: 
1. A partir de los cultivos obtenidos en los medios líquidos selectivos, sembrar por 
duplicado sobre: 
➢ Agar sulfito bismuto 
 
Incubar en estufa a 37°C por 48 horas. 
2. Observar cuidadosamente las colonias desarrolladas. Las colonias típicas de 
Salmonella presentan las siguientes características: 
Agar sulfito bismuto: Las colonias son negras con borde claro y brillo metálico, 
también cafés, grises o verdes. 
3. Aislar como mínimo 2 colonias con aspecto típico de Salmonella. 
 
4. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas. 
1. Sembrar cada colonia en agar de hierro y triple azúcar (TSI), primero en la 
superficie inclinada y luego en el fondo por picadura. Incubar a 37°C por 24 horas. 
2. Sin flamear ni recargar el asa sembrar por picadura en el fondo y en la superficie 
inclinada del medio de agar lisina hierro (LIA). Incubar a 37°C por 48 horas. 
El medio de agar TSI (hierro triple azúcar) se utiliza para determinar la capacidad 
de un organismo para atacar los carbohidratos específicos incorporados en el 
medio basal de crecimiento (glucosa, lactosa y sacarosa) con o sin producción de 
gas, observando la producción de H2S. 
 
Interpretación: 
 Fermentación solamente glucosa: 
a) En el agar inclinado: reacción alcalina (color rojo). 
b) En el fondo: reacción ácida (color amarillo); si hay producción de H2S, se 
produce un precipitado negro que puede enmascarar la acidez. 
El medio LIA (Agar de Hierro Lisina) se utiliza para medir la capacidad enzimática de 
un organismo para descarboxilar este aminoácido y formar una amina dando por 
resultado una alcalinidad en el medio. 
 
 Interpretación: 
Prueba positiva: turbidez en el medio y un color púrpura debida a una reacción 
alcalina, con producción de H2S. 
Prueba negativa: un color amarillo claro brillante (solamente fermentación de 
glucosa). 
 
3. Descartar los cultivos que no den las reacciones típicas de Salmonella en ambos 
medios. 
 
 
ACTIVIDADES: 
1. De acuerdo con el procedimiento discutido en clase y en la práctica realizar un 
diagrama de manera individual donde especifiques de manera secuencial con 
imágenes los pasos para la determinación de Salmonella. 
 
2. Por equipos realizar una discusión con base en los siguientes resultados suponiendo 
que el equipo proceso la muestra: 
 
Resultados 
 Para la realización de esta práctica, se utilizó como muestra una salchicha, ésta 
fue añadida a caldo peptonado, homogeneizada e incubada en las condiciones 
necesarias para el preenriquecimiento. Posteriormente, se inoculó el caldo 
preenriquecido en dos medios selectivos: caldo de tetrationato y caldo selenito cistina. 
Después del tiempo de incubación correspondiente a cada medio, se sembró por 
duplicado en los medios sólidos selectivos XLD y sulfito bismuto. En el primer medio 
se sembró una placa con el caldo selenito, otra con el caldo tetrationato y una más 
mitad selenito, mitad tetrationato. Del medio sulfito bismuto, se inoculó una caja petri 
con caldo selenito y otra con caldo tetrationato. Las cinco placas se dejaron incubar 
durante dos días a 37°C, cuando hubo transcurrido este periodo, se obtuvieron los 
siguientes resultados: 
 No se presentó ningún crecimiento en el medio XLD ni en el medio sulfito 
bismuto que fueron cultivados a partir del caldo tetrationato (véase Figura 1). 
 
Figura 1. Medios selectivos cultivados a partir de caldo tetrationato no presentaron ningún 
crecimiento 
 
Por otro lado, todos los medios cultivados a partir del caldo selenito presentaron la 
formación de colonias (véase Figura 2). 
 
Figura 2. Medios XLD y sulfito bismuto cultivados a partir de caldo selenito 
En el medio sulfito bismuto se observó la formación de colonias negras con borde 
claro y brillo metálico (véase Figura 3), circulares, de entre 2 y 3 milímetros, con 
margen liso y entero, características típicas de Salmonella. Mientras que en el medio 
XLD crecieron colonias circulares de entre 5 a 7 mm, de color gris claro y con borde 
verde grisáceo (Figura 2). 
 
Figura 3. Cultivo en medio sulfito bismuto que presenta colonias con características típicas de 
Salmonella 
Para la prueba confirmativa, se seleccionó una colonia de cada medio y se inocularon 
las colonias seleccionadas tanto en agar de hierro y triple azúcar (TSI) como en agar 
lisina hierro (LIA). La siembra se realizó en superficie inclinada y luego por picadura. 
Los tubos sembrados a partir de las colonias negras del agar sulfito bismuto resultaron 
positivos para Salmonella, pues presentaron un cambio en la coloración de los medios 
(véase Figura 4). 
 
Figura 4. Confirmación bioquímica de colonias negras del agar sulfito bismuto 
 
De igual forma, los tubos que fueron inoculados con las colonias del medio XLD 
resultaron positivos para Salmonella. Mientras que los tubos correspondientes a la 
placa XLD2 fueron negativos, ya que no mostraron cambios significativos en la 
coloración de los medios confirmativos, ni producción de ácido sulfhídrico (véase 
Figura 5). 
 
XLD 
 
XLD 2 
Figura 5. Confirmación bioquímica de colonias a partir del medio XLD 
 
3. Agrega a tu reporte la resolución del cuestionario. 
 
CUESTIONARIO: 
 
1. Explique el objetivo y fundamento de cada una de las 4 etapas para el aislamiento e 
identificación del genero Salmonella. 
 
2. Con respecto al uso de pruebas rápidas para la identificación de Salmonella, explica: 
a) ¿Cuál es la que ofrece un mayor índice de confiabilidad? 
b) Ventajas con respecto al método convencional. 
c) Desventajascon respecto al método convencional. 
d) Fundamento de la técnica. 
 
4. ¿Cuáles son los fundamentos de los diferentes medios empleados en la práctica indicando 
cuáles son los inhibidores y cómo es el desarrollo típico de Salmonella en cada uno de ellos? 
 
5. ¿Por qué es importante detectar la presencia de Salmonella spp. en los alimentos? 
 
6. ¿Indique las características generales de Salmonella?