Práctica 5 Técnica de recuento por vaciado en placa-2 - José Alejandro Del Campo Vázquez

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (BT1007) 
 
PRACTICA 5. ​TÉCNICA DE RECUENTO POR VACIADO EN PLACA. 
 
OBJETIVO: 
Aplicar la técnica de vertido en placa para el recuento de microorganismos, por medio de 
diluciones múltiples para estimar la carga microbiana en una muestra problema. 
 
INTRODUCCIÓN: 
Dentro de los métodos existentes para llevar a cabo el recuento, algunos son 
directos, en el sentido de contar directamente cada microorganismo; este tipo de 
recuento permite distinguir las células viables de las células muertas. Otros métodos son 
indirectos; en ellos no se observa directamente el microorganismo, sino algún producto 
del mismo, que guarda relación con su presencia en el material de estudio. 
 
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en una 
muestra problema, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no 
pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las 
condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten ​seleccionar grupos de 
bacterias ​cuya presencia es importante. 
 
En la técnica por vertido o vaciado en placa se pueden cambiar las condiciones de 
incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles que determinarán el tipo de 
microorganismos a cuantificar. Para microorganismos con características específicas se 
modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento 
previo, como microorganismos anaerobios o esporulados. 
 
En ésta técnica únicamente participan los microorganismos viables capaces de 
formar colonias, las cuales se interpretan como asociaciones o grupos de microorganismos 
unicelulares macroscópicos visibles. La técnica se basa en la presuposición de que cada 
célula dará lugar a la formación de una colonia. El recuento se lleva a cabo al contar las 
colonias macroscópicas que se expresan como “​Unidades Formadoras de Colonias​” o ​UFC 
presentes en un gramo o en un mililitro de muestra. 
 
Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones 
decimales necesarias de la muestra y de cada dilución se inoculan alícuotas en cajas de 
Petri; sobre estas se adiciona un medio de cultivo fundido y se llevan a incubar en 
condiciones definidas. Al cabo del período de incubación se cuentan las colonias, 
calculándose el número presente en la muestra original de acuerdo al factor de dilución 
establecido. 
 
Esta técnica es afectada en su ​precisión, exactitud y especificidad en los recuentos 
diferenciales por una variedad de factores tanto inherentes a la propia técnica, así como 
resultantes de su ejecución. Conviene destacar los siguientes: 
a) La destreza del operador. 
b) El tiempo transcurrido desde la preparación de las diluciones y la adición del medio 
de cultivo a las cajas, ​que no debe de exceder más de 20 minutos. 
c) El tiempo y la temperatura de incubación. 
d) La desigual distribución de los microorganismos en la muestra. 
e) Las condiciones de agitación de los frascos o tubos que contengan las diluciones. 
f) El tamaño de la alícuota original y la pureza de los medios utilizados. 
g) La opalescencia del medio de cultivo con algunos alimentos, en las primeras 
diluciones. 
h) Condiciones de estrés en algunos microorganismos debido a tratamientos 
antimicrobianos a los que se ha sujetado el alimento o el material bajo estudio. 
 
RECUENTO DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS POR VACIADO EN PLACA 
Uno de los exámenes microbiológicos de rutina y de mayor importancia es la 
cuenta bacteriana total, específicamente el recuento de bacterias aerobias en placa o 
bacterias mesófilas aerobias (BMA) se desarrollan a temperatura ambiente (30-37 °C). 
Este recuento aporta información sobre la flora total existente en una muestra, 
permitiendo conocer la calidad sanitaria, evidenciando deficientes métodos de 
manipulación y advirtiéndonos de una posible presencia de microorganismos patógenos, 
dado que éstos suelen ser mesófilos. 
 
Las BMA pueden ser consideradas como organismos indicadores, aunque 
representan una medida mucho menos precisa y fiable del peligro de intoxicación 
alimentaria que otros indicadores. El recuento de BMA tiene algunas aplicaciones de 
interés tales como evidenciar la exposición a fuentes de contaminación, las condiciones de 
almacenamiento, el nivel de frescura, la eficiencia de tratamientos antimicrobianos y las 
condiciones higiénicas prevalecientes en la obtención, preparación, transporte o 
comercialización de un producto (Fernández, 2000). 
 
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias que se desarrollan en el 
medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, 
presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo 
estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, 
pero sujetas a la influencia de varios factores (NOM-092-SSA1-1994). Normalmente 
muestras de 10 gramos de alimento se utilizan para ser analizadas. Las muestras líquidas 
deben mezclarse por inversión, antes de ser transferidas con pipeta estéril al frasco de 
dilución; los alimentos sólidos deben ser muestreados con utensilios estériles (cucharas, 
cuchillos). Una vez homogeneizado el alimento se recomienda hacer las diluciones y el 
vertido en las cajas en menos de 30 minutos. El vaciado en placa, consiste en colocar 1 ml 
de suspensión bacteriana en una caja de Petri, enseguida verter agar a una temperatura 
de 45-48 °C y mezclar ambos, con movimientos de rotación para conseguir un 
homogeneizado completo del inóculo en el medio de cultivo. 
 
Para obtener resultados precisos sobre el número de células es necesario hacer 
una serie de diluciones seriadas, por ejemplo, una dilución 1/10 consiste en 1 mL o gramo 
de muestra adicionados en 9 mL de diluyente, 10 mL o g de muestra en 90 mL de 
diluyente; los diluyentes más empleados en Microbiología son el buffer de fosfatos de 
Butterfield’s, el cloruro de sodio fisiológico y el diluyente de peptona (McLandsborough, 
2005). 
 
 
PROCEDIMIENTO: 
Preparación de la dilución primaria​. 
● A partir de ​muestras líquidas​: 
 Agitar la muestra cuidadosamente con la ayuda de un agitador mecánico tipo 
“vortex” entre 8 y 10 segundos consecutivos, para que ésta sea homogénea. Tomar 
1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una 
temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la punta de la micropipeta y 
el diluyente. 
● A partir de ​muestras sólidas o semisólidas​. 
Pesar una cantidad de 10 g de la muestra por analizar en una bolsa plástica estéril 
de tamaño adecuado. 
Adicionar un volumen de 90 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a 
la de la muestra. Seleccionar un diluyente apropiado (solución salina, buffer de 
fosfatos, diluyente de peptona, etc.). 
Operar el homogeneizador peristáltico (mezclador de paletas) 1 minuto hasta 
obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica 
correspondiente para cada alimento. 
Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada 
tomando de las capas superiores de la suspensión. 
 
 
Preparación de las dilucionesdecimales adicionales. 
1. Transferir 1 mL de la dilución primaria (10​-1​), en un tubo con 9 mL de diluyente 
estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el 
diluyente. 
2. Mezclar cuidadosamente cada dilución empleada con la ayuda de un agitador 
mecánico tipo “vortex” entre 8 y 10 segundos consecutivos, para que ésta sea 
homogénea. 
3. La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a 
inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con 
base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del 
personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, 
trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 
 
 
Inoculación de placas y vertido de medio 
- Inocular 1 mL de las diluciones a ensayar en las cajas correspondientes. 
- Añadir de 15 a 20 ml del agar fundido y mantenido a 45°C, mezclarlo mediante 6 
movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en 
sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta 
lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no 
moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. 
- Distribuir las cajas de Petri estériles en la mesa de trabajo de manera que la 
inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar 
cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes 
previamente a su inoculación y correr por duplicado. 
- Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo 
de esterilidad. 
 
NOTA IMPORTANTE: El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se 
incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo fundido a las 
cajas ​no debe exceder de 20 minutos​. 
 
Incubación 
- Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo que se requiera, según el tipo 
de alimento y microorganismos que se trate, como se indica en el Cuadro 1. 
 
Cuadro 1. ​Condiciones de incubación para el recuento de microorganismos aerobios. 
* En el análisis de agua potable y agua purificada se debe incubar a 35 ± 2 °C durante 24 h. 
 
Recuento de colonias 
✔ Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 
colonias, usando el contador de colonias. Las placas de al menos una de tres diluciones deben 
estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, 
véase el cuadro 2, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha 
dilución y reportar. 
Grupo Bacteriano Temperatura 
Tiempo de 
incubación 
Termofílicos 
aerobios 
55 ± 2 °C 48 ± 2 h 
Mesofílicos 
aerobios​* 35 ± 2 °C 48 ± 2 h 
Psicrotróficos 20 ± 2 °C 3 - 5 días 
Psicrofílicos 5 ± 2 °C 6 – 10 días 
✔ Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada 
por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en 
placa por gramo o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2. 
✔ Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes 
guías: 
o Placas con menos de 25 colonias: Cuando las placas corridas para la menor dilución 
muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes 
en dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de 
dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el 
cuadro 2, ejemplo 3. 
o Placas con más de 250 colonias: Cuando el número de colonias por placa exceda de 
250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de 
la distribución de colonias. Contar, por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área 
de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente 
pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de ​una caja de Petri de 100 
mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador​. Aclarar en el 
informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, 
ejemplo 4. 
o Colonias extendidas: Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes 
formas: 
a. ​Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas 
por la desintegración de un cúmulo de bacterias. 
b. ​Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja. 
c. ​Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del 
agar. 
d. ​Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de 
inhibición del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión 
del crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja. 
e. ​Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no 
están incluidas en ​d​., contar cualquiera de los tipos ​a., b ó c​, como provenientes 
de una sola fuente. Los crecimientos tipo ​d.​, reportarlos como crecimiento 
extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra 
dilución presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que 
se pueden contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5. 
o Placas sin colonias: Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, 
reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja 
usada, véase el cuadro 2, ejemplo 6. 
o Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra 
con más de 250 colonias: Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado 
más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para 
determinar la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 7. 
o Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 
colonias. Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de 
colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas 
para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 8. 
o Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 
250 y sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas incluyendo 
aquélla con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, véase el 
cuadro 2, ejemplo 9. 
o Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa 
de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. 
Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos 
significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al número 
inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 
128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazarel tercer dígito con 
cero y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400). 
 
Informe de la prueba: 
 
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa. 
 
CUADRO 2. ​Cálculo de los valores de la cuenta en placa​ ​(ensayos por duplicado). 
a​ Cuenta por arriba de 250 colonias. 
b​ Debe aclararse "valor estimado" por encontrarse los valores fuera del intervalo de 25 a 250. 
c​ Debe informarse de acuerdo a la menor dilución ensayada y contada, en este caso 1:100. 
 
ACTIVIDADES: 
1. Ver el siguiente vídeo ​https://www.youtube.com/watch?v=fg8oY300cvk ​donde 
podrás observar el procedimiento para la técnica de vaciado en placa. 
No. ejemplo 
Colonias contadas 
UFC/g ó mL 
1:100 1:1,000 1:10,000 
1 
> 250a 178 16 
180000 
> 250 190 17 
2 
> 250 220 25 
250000 
 238 28 
3 
18 2 0 
1600b 
14 0 0 
4 
> 250 > 250 512 
5000000b 
> 250 > 250 495 
5 
> 250 240 34 
290000 
> 250 235 
Crecimiento 
extendido 
6 0 0 0 < 100c 
7 
> 250 240 24 
250000 
> 250 268 19 
8 
> 250 216 23 
280000 
> 250 262 42 
9 
> 250 215 20 
230000 
> 250 235 26 
> 250 275 32 
270000 
> 250 225 26 
https://www.youtube.com/watch?v=fg8oY300cvk
2. De manera individual deberás realizar tu diagrama de manera digital con imágenes 
donde se entiendan claramente de manera secuencial los pasos para realizar la 
práctica. Deberás utilizar algún programa para crear tu diagrama (Paint, power 
point, biorender, etc.) Deberás subirlo a canvas en el espacio asignado por tu 
profesor. La fecha de entrega será la misma que para el reporte. 
3. En equipo deberás realizar un reporte donde incluyas los siguientes puntos: 
● Para el conteo de UFC en una placa ver el vídeo 
https://www.youtube.com/watch?v=-eNhnpIDsDo a partir del tiempo 4:35. 
Realizar el conteo de las siguientes cajas siguiendo la metodología 
adecuada. Posteriormente utilizar dos aplicaciones (podrás bajarla en tu 
celular ejemplo: Promega colony counter, APD colony counter) para el 
conteo y comparar los resultados. Deberás generar una discusión al 
respecto y decidir cuáles son las implicaciones de estos resultados si la 
muestra procesada fue jitomate. 
 
https://www.youtube.com/watch?v=-eNhnpIDsDo
 
 
● Investigar sobre el uso de placas petrifilm de 3M para recuento de Aerobic 
count (AC), como se usan, ejemplos, ventajas y desventajas e incluirlos 
también en su reporte. 
 
● Contestar el cuestionario: 
 
1. Indique el fundamento de la técnica por vertido en placa para el recuento de 
microorganismos. 
 
2. Mencione 4 puntos con respecto al significado de un recuento de bacterias aerobias 
mesófilas. 
 
3. Explique brevemente 2 ventajas y 2 desventajas con respecto a la técnica por vertido en 
placa para el recuento de microorganismos. 
 
4. Enumere brevemente las principales recomendaciones generales en la toma y 
transporte de muestras para un análisis microbiológico. 
 
5. Indique la norma microbiológica con respecto a bacterias mesófilas aerobias para 
considerar al agua como potable y agua para bebida. 
 
*​Deberán entregar su reporte en las mismas fechas estipuladas en el calendario de 
entregas del curso. No olviden seguir los mismos lineamientos como incluir la portada, 
coevaluación, resumen, objetivo, puntos especificados en la parte de arriba, bibliografía.