Práctica 4 Hongos y Levaduras-1 - José Alejandro Del Campo Vázquez

Vista previa del material en texto

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (BT1007) 
 
PRACTICA 4. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS. 
 
OBJETIVO: 
Aislar e identificar hongos filamentosos o mohos y levaduras (hongos unicelulares) 
por medio de su aislamiento, cultivo y microcultivo para el estudio de sus características 
morfológicas y de reproducción. 
 
INTRODUCCIÓN: 
Los hongos son organismos eucarióticos unicelulares o pluricelulares heterótrofos, 
quimiorganotróficos, aerobios o anaerobios facultativos que se nutren por absorción. Con 
base en sus características morfológicas, forma de reproducción y modo de crecimiento, 
los hongos se dividen en dos grandes grupos: hongos filamentosos y levaduras. 
 
Los hongos filamentosos están constituidos por células cuyo diámetro puede variar 
de 1 mm a 30 mm y tienen una pared celular constituida por polisacáridos (quitina, glucano 
y celulosa), y forman filamentos o hifas, las cuales son estructuras tubulares en cuyo 
interior fluyen todos los organelos contenidos en el citoplasma. Estos filamentos muestran 
crecimiento apical (por las puntas o ápices). 
 
El conjunto de hifas se ramifica y forma una red denominada micelio. A lo largo de 
la hifa pueden presentarse invaginaciones, que se derivan de la pared y forman tabiques 
con orificios centrales denominados poros. Cuando un micelio presenta estos tabiques se 
dice que está septado; si las hifas no presentan divisiones se dice que el micelio es 
cenocítico o continuo. En ambos tipos de micelio se pueden encontrar células mono o 
multinucleadas. La presencia o ausencia de estos tabiques es un criterio taxonómico. 
 
Algunos hongos son capaces de producir pigmentos que, cuando se acumulan al 
interior de las hifas dan origen a un micelio coloreado. Estos pigmentos pueden ser de 
origen carotenoide o bien fuliginoso (derivado de la melanina). El micelio hialino se pude 
observar en los hongos que no producen ni acumulan pigmentos. Los hongos son 
inmóviles, aunque algunas especies poseen zooesporas móviles. 
 
Las esporas de los hongos, aunque son ligeramente más resistentes que el micelio 
vegetativo a las condiciones de estrés, (temperatura, desecación, radiaciones, etc.), no son 
formas de resistencia como las endoesporas bacterianas, sino más bien formas de 
propagación. 
 
Los hongos son microorganismos ubicuos que viven como saprofitos, simbiontes, 
parásitos e hiperparásitos. Cuando actúan como parásitos, causan enfermedades en el 
hombre, plantas y animales denominadas micosis. 
 
 
EXAMEN MORFOLÓGICO DE LOS MOHOS (HONGOS FILAMENTOSOS) 
 
Para el aislamiento y cultivo de los mohos (hongos filamentosos), se utilizan medios 
de cultivo específicos que favorezcan su desarrollo, por el tipo de nutrientes que contienen, 
(Agar papa dextrosa, Agar sabouraud dextrosa, Agar extracto de malta) generalmente con 
elevadas concentraciones de azúcar, pH ácido, condiciones aerobias y temperatura entre 
20° y 30°C. Se pueden utilizar placas o tubos con agar inclinado para su cultivo. Puesto que 
la identificación de los hongos depende en gran parte de sus características morfológicas, 
como el tipo de agrupación de las esporas, deben de tomar precauciones al hacer 
preparaciones para el examen microscópico. En general. Los cultivos líquidos no se utilizan 
para este propósito. En los cultivos en medios sólidos en placa se observan las 
características físicas del cultivo y las esporas como: 
 Color del micelio. 
 Color de las esporas 
 Aspecto (terroso, húmedo, cremoso. 
 
Bajo estas condiciones no es posible realizar preparaciones microscópicas ya que la 
manipulación rompe y desorganiza las estructuras y características del micelio, que 
determinan su identificación y clasificación con base a su tipo de reproducción. 
 
Los hongos se estudian y clasifican a través de las diferencias en su morfología y 
tipos de reproducción. Las colonias o talo difieren en tamaño, aspecto y color. Su desarrollo 
puede ser en colonias aisladas o desarrollo extensivo sobre toda la superficie del medio de 
cultivo, limitado solo por los bordes o paredes de la caja o tubo. El color característico de 
los mohos se debe al color de masas de esporas asexuales. Otra característica útil es el tipo 
de hifas que constituyen el micelio vegetativo, las cuales pueden ser septadas (con paredes 
transversales) o cenocíticas (sin paredes transversales) 
 
Un método para examinar los hongos filamentosos o mohos es el microcultivo o 
técnica de cultivo en portaobjetos, ya que permite manejar y observar la especie sin 
modificar su desarrollo, el arreglo y acomodo de sus estructuras de manera que 
permanezcan intactas. 
 
 
MORFOLOGÍA Y REPRODUCCIÓN DE LAS LEVADURAS. 
La mayoría de las levaduras se reproducen, principalmente, mediante el proceso 
asexual de gemación. Para ello, la célula madre forma una zona de crecimiento hacia el 
exterior, la cual finalmente se separa como una célula hija. La reproducción sexual en las 
levaduras que producen esporas sexuales se lleva a cabo por la conjugación de dos 
ascosporas, formando una célula vegetativa diploide. Luego el núcleo se divide en cuatro o 
menos núcleos, que maduraran en cuatro ascosporas. Las ascosporas son retenidas en la 
célula madre, posteriormente el asca (saco) se rompe y libera las ascosporas, para repetir el 
ciclo. 
 
MATERIALES: REACTIVOS: 
 Mechero Bunsen 
 Cajas Petri * Placas con agar papa dextrosa 
 Asa metálica 
 Portaobjetos 
 Cubreobjetos 
 Microscopio óptico 
 Navaja de rasurar 
 Trozos de varilla de vidrio 
 
PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS. 
 
1. Esterilizar el área de trabajo con una solución de yodoforo. 
2. Organizar el material y medios de cultivo dentro del área de esterilidad del mechero 
de Bunzen encendido. 
3. Preparar cajas de Petri o tubos con agar inclinado conteniendo el medio de cultivo 
para el desarrollo de hongos (Agar papa dextrosa, Agar sabouraud dextrosa, Agar 
extracto de malta,). 
4. A partir de la muestra problema, inocular las cajas o placas de Petri y/o los tubos 
con agar inclinado selectivo para el desarrollo de hongos por picadura. 
5. Incubar las cajas de Petri y/o tubos con agar inclinado a temperatura ambiente por 
7 días. 
6. Identificar las siguientes características de cultivo. 
 Color del micelio. 
 Aspecto del cultivo (terroso, húmedo, aterciopelado, rugoso) 
 Tipo de desarrollo (extensivo, en colonias). 
 
PROCEDIMIENTO PARA EL MICROCULTIVO. 
 
1. Esterilizar área de trabajo con una solución de yodoforo. 
2. Organizar el material y medios de cultivo dentro del área de esterilidad del mechero 
de Bunzen encendido. 
3. Preparar cajas de Petri conteniendo el medio de cultivo para el desarrollo de 
hongos (Agar papa dextrosa, Agar sabouraud dextrosa, Agar extracto de malta,). 
4. Cuadricular las cajas con un exacto, de manera de poder extraer bloques del agar. 
5. Esterilizar cajas de Petri conteniendo un portaobjeto y cubreobjetos. 
6. Abrir la caja dentro del área de esterilidad y colocar con pinzas estériles un bloque 
del agar cuadriculado. 
7. A partir de la muestra problema conteniendo mohos en desarrollo, inocular o 
sembrar por picadura el bloque de agar en las cuatro caras del bloque. 
8. Incubar los microcultivos a temperatura ambiente por 7 días. 
9. Identificar al microscopio la especie de hongo desarrollado, colocando el 
portaobjeto en la platina y enfocar con el objetivo de seco débil (10X) y seco fuerte 
(40X). 
10. Identificar características de cultivo y morfológicas: 
Características de cultivo. 
 Color del micelio. 
 Aspecto del cultivo (terroso, húmedo, aterciopelado, rugoso) 
 Tipo de desarrollo (extensivo, en colonias). 
Características morfológicas. 
 Tipo de hifas (tabicadas o cenocíticas) 
 Tipo de esporas (artrosporas, conidiosporas, clamidosporas, 
esporangiosporas, blastospora o blastoconidia) 
 Morfología o estructura de desarrollo.. 
11. Incluir fotografía de la identificación microscópica en el reporte. 
 
PROCEDIMIENTOPARA EL AISLAMIENTO DE LEVADURAS: 
 
1. A partir de un cultivo de 24 h. en caldo nutritivo de la levadura Saccharomyces se 
inoculan placas de Petri conteniendo el medio de cultivo para el desarrollo del 
microorganismo. 
2. Sembrar por estría en tres planos sobre la superficie del medio de cultivo, para 
obtener colonias aisladas. 
3. Incubar a temperatura ambiente por 48 hrs. 
4. Identificar las siguientes características de cultivo: 
 Forma de las colonias. 
 Color de las colonias. 
 Aspecto (cremosas, brillantes, opacas, rugosas). 
 Tamaño. 
 Borde (liso, rugoso). 
 
PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA. 
 
1. A partir del cultivo de 24 h de Saccharomyces hacer preparaciones húmedas. 
2. Esterilizar una asa de cultivo y enfriarla, colocar una asada del cultivo de 24 h de 
Saccharomyces sobre un portaobjetos limpio y adicionar una gota de lugol. 
3. Colocar un cubreobjetos sobre la preparación. 
4. Colocar la preparación húmeda sobre la platina del microscopio y observar con los 
objetivos en seco, seco débil 10X y seco fuerte 40X. 
5. Identificar las características morfológicas por medio de una fotografía e incluirlo en 
el reporte de laboratorio. 
 
 
 
 
CUESTIONARIO: 
1. Describe las diferencias que hay entre bacterias y hongos según los siguientes criterios 
a) Tipo de microorganismo. 
b) Forma 
c) Tamaño 
d) Tipo de reproducción. 
 
2. ¿Qué características macroscópicas se pueden observar en un cultivo de hongos en el 
laboratorio? 
 
3. ¿Cuál es el medio de cultivo para el desarrollo de hongos, que valor de pH debe tener y 
la temperatura de incubación? 
 
4. Describe las diferencias que hay entre bacterias y levaduras según los siguientes 
criterios 
a) Tipo de microorganismo. 
b) Forma 
c) Tamaño 
d) Tipo de reproducción. 
 
5. ¿Qué características macroscópicas se pueden observar en un cultivo de levaduras en 
el laboratorio? 
 
6. ¿Cuál es el medio de cultivo para el desarrollo de levaduras, que valor de pH debe tener 
y la temperatura de incubación?