Practica 1 - Preparación de medios y esterilización - José Alejandro Del Campo Vázquez

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Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
 
PRACTICA 1. INTRODUCCION: PREPARACION DE MATERIAL, MEDIOS DE 
CULTIVO Y METODOS DE ESTERILIZACION. 
 
OBJETIVO: 
Familiarizar al alumno con la preparación y el manejo de los medios de cultivo y 
material de laboratorio por medio del conocimiento de las características de los mismos y 
condiciones a establecer para el aislamiento e identificación de microorganismos en el 
laboratorio. 
 
INTRODUCCIÓN: 
 
MEDIOS DE CULTIVO 
Los medios de cultivo microbiológicos son el sustrato o solución de nutrimentos en 
que se desarrollan los microorganismos en el laboratorio para su estudio, pueden ser de 
diferentes tipos: líquidos, sólidos y semi-sólidos (Cappuccino, 2014). 
 
Los medios de cultivo sólidos contienen agar-agar que es un preparado proteico 
de especies de algas marinas el cual solidifica a 47°C y funde a 98°C, su concentración 
en estos medios de cultivo es de un 2%, la ventaja de estos medios sólidos es que 
facilitan la identificación de bacterias, levaduras y hongos aislados mediante el desarrollo 
de crecimiento colonial (Cappuccino, 2014). 
 
Los medios semisólidos se logran con la adición de un agente gelificante pero en 
un porcentaje menor del que se usa para los medio sólidos. Estos son útiles para 
determinar si ciertas bacterias son móviles (Cappuccino, 2014). 
 
Los medios de cultivo líquidos no contienen agar-agar, por lo que se les denomina 
caldos de cultivo y están constituidos exclusivamente por nutrimentos específicos 
dependiendo del tipo de microorganismos que se desee cultivar, son usados para la 
propagación de un gran número de organismos, estudios de fermentación y otras pruebas 
(Cappuccino, 2014). 
 
Para que un medio de cultivo ofrezca los resultados esperados en el crecimiento 
de microorganismos debe tomarse en cuenta las necesidades básicas de los mismos; 
existen varios factores a considerar en la elaboración de un medio de cultivo idóneo: 
fuente de carbono, fuente de nitrógeno, minerales, factores de crecimiento y pH. Muchos 
de los componentes son digeridos ácidos o enzimáticos de diversos tejidos vegetales, 
carnes, caseína y células de levadura, que según la substancia de que se trate, 
proporciona fuentes ricas en polipéptidos, aminoácidos, vitaminas o sales minerales. 
Ejemplos específicos de tales componentes son las peptonas o triptonas, las cuales son 
hidrolizados enzimáticos de proteínas animales y el extracto de levadura, que es un 
autolizado de levadura rico en vitaminas del complejo B. En estos digeridos crudos suelen 
estar presentes algunos carbohidratos o bien estar suplementados con azúcares 
adicionales en la formulación. Otros medios contienen productos químicos a una 
concentración conocida los cuales varían de acuerdo con las necesidades nutricionales 
de cada microorganismo en particular (Fernández, 1981). 
 
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Los medios deberán ser preparados con las cantidades recomendadas de manera 
que pueda conocerse su composición exacta. Estos medios están elaborados a partir de 
compuestos químicos que se encuentran en forma purificada y definida de manera que 
sean fácilmente reproducibles y se denominan medios sintéticos. La forma en que se 
presentan estos medios de cultivo comerciales es como productos deshidratados, 
generalmente con un pH ajustado y en cuyo envase se indica la composición química del 
medio, así como la cantidad de gramos necesarios para reconstituirlo y las precauciones 
que se deben tomar en consideración durante su elaboración y esterilización. 
 
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 
 
1. MEDIOS NO SELECTIVOS: Son ricos en nutrientes y comúnmente usados para 
enumerar microflora total o para transferir o mantener microorganismos purificados, 
ejemplos: Agar nutritivo, Agar para métodos estándar (Fernández, 1981). 
 
2. MEDIOS SELECTIVOS: Permite el crecimiento de un tipo en particular de 
microorganismos y suprime el crecimiento de la flora competitiva, por medio de 
agentes selectivos apropiados que forman parte de la composición del medio, 
ejemplos: Agar papa dextrosa (acidificado con ácido tartárico - agente selectivo), Agar 
eosina y azul de metileno - EMB (colorante cristal violeta - agente selectivo) 
(Fernández, 1981). 
 
3. MEDIOS DIFERENCIALES: Son utilizados para diferenciar poblaciones de 
microorganismos con base en una característica bioquímica, ejemplos: Agar bilis rojo 
violeta (para diferenciar microorganismos fermentadores y no fermentadores de 
lactosa), Agar Estreptococo – KF (Fernández, 1981). 
 
4. MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES: Contienen agentes que proveen una 
eficiente forma de seleccionar y diferenciar microorganismos, cuando están presentes 
en una microflora mixta o compleja, ejemplos: Agar de sal y manitol, Agar Baird 
Parker, Agar Sulfito Bismuto (Fernández, 1981). 
 
 
PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 
1) Leer cuidadosamente las instrucciones indicadas para la preparación del medio 
indicadas en la etiqueta de los recipientes conteniendo los medios de cultivo. 
2) Utilizar agua destilada o des ionizada medida con una probeta. 
3) Utilizar recipientes con el doble de capacidad en volumen de la cantidad que se va a 
preparar, ya que durante el calentamiento para disolución, hervido y esterilización el 
medio se expande. 
4) Pesar cuidadosamente la cantidad requerida, al medio de cultivo desecado que ha 
sido pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y 
se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se 
incorpora la cantidad de agua restante, para desprender e incorporar las partículas de 
medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a las paredes del recipiente. 
 
5) Los medios nutritivos que contienen agar o gelatina deben ser calentados y hervidos 
para obtener su disolución, la cual se obtiene cuando el medio se torna más 
transparente y se forman burbujas en la parte inferior del recipiente, durante el tiempo 
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de calentamiento el matraz se debe estar agitando periódicamente para evitar que el 
medio se deposite en el fondo se caramelice y se queme. 
 
6) Una vez alcanzada la disolución los medios se retiran de la estufa ya que puede 
continuar hirviendo y derramarse. Es importante tomar en consideración lo siguiente: 
a. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento. 
b. Por este motivo, no deben calentarse más de lo estrictamente necesario. 
 
7) Los medios nutritivos que no contienen agar-agar ni gelatina (caldos de cultivo) son 
soluble en agua fría o templada sin necesidad de calentamiento, solo se agitan para 
obtener una disolución homogénea. 
8) Tapar los recipientes con tapones de algodón y protegerlos con papel Kimberly. 
Someterlos a esterilización 
 
ESTERILIZACIÓN 
La esterilización se define como la eliminación de cualquier forma de vida 
patógena o inocua de un objeto o material. 
Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo 
en autoclave (olla de presión) hasta que se alcanza la temperatura de 121°C (presión 
de 15lb/in2) que se mantiene constante durante 15 minutos. La esterilidad solo se 
consigue con seguridad cuando se ha desalojado correctamente el aire de la cámara 
de vaporización de la autoclave y de los recipientes en ella contenidos. Tras la 
esterilización y una vez que el manómetro marque 0, los medios de cultivo deben dejarse 
enfriar y almacenarse a temperatura ambiente o refrigeración o bien mantenerse en un 
baño maría a una temperatura de 50°C, para mantenerlos líquidos y poder ser utilizados 
en ese momento. 
Las temperaturas más altas y los calentamientos más prolongados que lo 
prescrito, perjudican la calidad del medio de cultivo. 
Existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, la selección de uno u 
otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar, véase la Tabla 1 
(Cappuccino, 2014). Por ejemplo, la esterilización con calor húmedo generalmentese 
realiza en una autoclave a 121 °C durante 15 min, la temperatura se alcanza utilizando 
vapor de agua a una presión de 15 lb/pulg2. Estas condiciones de esterilización con calor 
húmedo pueden variar de acuerdo con el volumen, tipo de autoclave y naturaleza del 
material por esterilizar. Los recipientes que se esterilizan en autoclave no deben estar 
herméticamente cerrados para permitir el acceso del vapor al material. La muerte de los 
organismos contaminantes ocurre principalmente por desnaturalización de 
macromoléculas (DNA y RNA) y coagulación de proteínas. 
 
Tabla 1. Técnicas de esterilización (Cappuccino, 2014). 
Métodos 
físicos 
Calor 
Húmedo 
Vapor a presión 
(autoclave) 
 
Medios de cultivo, 
soluciones 
termoestables, jeringas 
Seco Aire caliente (horno) Material de vidrio (vacío) 
Filtración 
Filtros celulosa-acetato 
de membrana con 
poros entre 8.0 µm y 
0.05 µm 
Sustancias termolábiles 
Radiaciones 
No 
ionizantes 
Rayos ultravioleta 
Rayos infrarrojos 
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Ionizantes 
Rayos X 
Rayos (cobalto-60) 
Métodos químicos 
Gases Óxido de etileno 
Cajas de Petri de 
plástico y pipetas 
Líquidos B-propiolactona Tejidos vivos 
 
La esterilización con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y 
materiales sólidos estables al calor, requiere mayor duración e intensidad porque la 
conducción del calor es menos rápida que en un ambiente húmedo. La temperatura que 
se utiliza es generalmente entre 160 °C y 180 °C durante 1.5 horas, destruyen bacterias 
esporuladas (Fernández, 1981). 
 
La flama directa es utilizada para la esterilización de asas de platino o nicromo 
para cultivo, flamear toda la extensión del alambre, evitando llevar grandes cantidades de 
material, pues se propiciaría su diseminación antes de ser incinerado totalmente. Calentar 
hasta la incandescencia (Cappuccino, 2014). 
 
La filtración a través de membranas se usa para esterilizan soluciones de 
sustancias termolábiles en donde los microorganismos son retenidos en el filtro. El filtrado 
estéril debe recibirse en un recipiente también estéril (Fernández, 1981). 
 
 
Para determinar la eficiencia del proceso de esterilización se emplean indicadores 
biológicos de esterilización. Cuando se esteriliza con calor húmedo, calor seco o con 
óxido de etileno se utilizan, junto al material que se esteriliza, ampolletas que contienen 
esporas viables de Bacillus sterothermophilus que son inactivadas a 121 °C durante 12 
min (Fernández, 1981). Después de la esterilización, se incuban las esporas a 55°C y se 
analiza si estas sobrevivieron o no al proceso. 
 
También existen cintas testigo que con el cambio de un indicador químico 
muestran si se alcanzaron las condiciones de la esterilización. 
 
 
 
MATERIALES: REACTIVOS: 
 
 Balanza analítica * Agar métodos estándar 
 Cajas Petri (30 por equipo) * Agar soya tripticaseína 
 Tubos de ensayo 125 x16 mm * Peptona de caseína 
con tapa de rosca (50 por equipo) * Agar papa dextrosa 
 12 Pipetas de vidrio 1 ml y 25 de 10 mL. * Agua destilada 
 3 Matraz Erlenmeyer 1 L * Acido tartárico 
 Tubos metálicos (3 por equipo) * Etanol 
Para guardar pipetas de vidrio. * Cloro 
 Gradilla metálica (1) * Yodo 
 18 Frascos de dilución 
 1 Vaso de precipitados de 1 L 
 1 Probeta graduada de 100 mL 
 3 Agitadores magnéticos. 
 Parrillas de calentamiento 
 Potenciómetro 
 Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 Guantes de carnaza 
 Papel aluminio. 
 Algodón 
 Papel de estraza 
 Cinta testigo 
 Marcadores 
 1 Aspersor de plástico 
 2 pisetas 
 
 
 
METODOLOGÍA 
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación impresas en las etiquetas de 
los recipientes de los medios de cultivo. Cada frasco de medio indica la masa en 
gramos a requerir para preparar un litro de éste. Determinar con una regla de 3 la 
cantidad de medio deseado. Para mayor información sobre Medios de Cultivo e 
Ingredientes puede consultar el Anexo (formato pdf): Manual de Medios de Cultivo 
Microbiológicos de Difco & BBL. 
 
2. Utilizar agua destilada medida con una probeta. 
 
3. Utilizar recipientes con el doble de capacidad en volumen de la cantidad que se va a 
preparar, ya que durante el calentamiento para disolución, medición de pH y 
ebullición pues el medio se expande. Para la preparación de agares es preferible 
utilizar matraces Erlenmeyer previo a la esterilización y para medios líquidos, 
soluciones y/o buffers se prefiere prepararlos en vasos de precipitado, de cristal si es 
necesario calentarlo y de plástico si solo se requiere disolverlo. 
 
4. Pesar cuidadosamente la cantidad requerida, al medio de cultivo desecado que ha 
sido pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y 
se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se 
incorpora la cantidad de agua restante, para desprender e incorporar las partículas de 
medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a las paredes del recipiente. 
 
5. Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados hasta ebullición para 
obtener su disolución, la cual se obtiene cuando el medio se torna más transparente y 
se forman burbujas en la parte inferior del recipiente, durante el tiempo de 
calentamiento el matraz se debe estar agitando periódicamente de manera 
moderada, adicionar un agitador magnético al recipiente, para evitar que el medio se 
deposite en el fondo, se caramelice y/o se queme. 
 
6. Una vez alcanzada la disolución los medios se retiran de la parrilla de calentamiento 
ya que puede continuar hirviendo y derramarse. En este paso es importante evitar el 
sobrecalentamiento del medio pues esto sería perjudicial para la integridad de los 
componentes del medio. 
 
7. Los medios nutritivos que no contienen agar-agar ni gelatina (caldos de cultivo) son 
soluble en agua fría o templada sin necesidad de calentamiento, solo se agitan para 
obtener una disolución homogénea. 
 
8. Transferir los medios de cultivo: 
 Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
a. Medios sólidos (Agares): Frascos con tapa de rosca o frascos de dilución conforme 
al volumen preparado. Llenar los frascos hasta un 80% de su capacidad total, 
cerrar completamente el frasco y luego regresar las tapas una media vuelta para 
permitir el intercambio de aire caliente en la fase de esterilización. 
b. Medios líquidos (caldos de cultivo, soluciones, buffers): distribuirlos en tubos con 
tapa de rosca, frascos de dilución o frascos de vidrio con tapa de rosca (vidrio de 
borosilicato) dependiendo de la finalidad de uso de los medios. 
c. Someterlos al proceso de esterilización mediante vapor húmedo (en una autoclave 
vertical de gas o eléctrica) a una temperatura de 121 °C con 15 lb de presión por 
cm2 durante 15 min (Zimbro et al., 2009). Para conocer detalladamente la manera 
de operar y precauciones para utilizar una autoclave de gas revisar las 
instrucciones de operación de las autoclaves no eléctricas de presión All American 
en la siguiente liga de internet: 
http://www.allamerican-chefsdesign.com/admin/fileuploads/product_43.pdf 
 
Actividades colaborativas en sesión: 
 
Resolver el siguiente cuestionario (este deberá estar en tu reporte de práctica) 
 
CUESTIONARIO: 
1. Define medio de cultivo y ¿cuáles son los constituyentes habituales de los medios de 
cultivo? 
2. Define el proceso de esterilización y en qué difiere de la desinfección. 
3. ¿Para qué se utiliza un yodoforo? ¿Cuáles desinfectantes se utilizan en superficies? 
4. Indica cuál de las siguientes afirmaciones te parece más correcta: 
a. El calor seco es más efectivo que el calor húmedo. 
b. El calor húmedo es más efectivo que el calor seco. 
c. El calor seco es igual de efectivo que el calor húmedo (sólo depende de la 
temperatura). 
5. De los medios que se mencionan en la introducción de la práctica, escribe 3 tipos de 
microorganismos que puedan desarrollar en cada uno que tipo de medio (no selectivo, 
selectivo, diferencial,selectivo-diferencial). 
6. ¿Cuál es el propósito de los indicadores de pH en los medios de cultivo? 
7. ¿Cuáles son las fuentes de requerimientos energéticos que serán utilizados por los 
microorganismos para su crecimiento en un medio de cultivo? Mencione ejemplos. 
8. ¿Cuántos y cuáles son las formas de expedición más usuales de los medios de cultivo 
según presentación? 
9. Como regla general: 
a) Caldos y agares deben hervirse al preparase antes de esterilizarse. 
b) Caldos y agares no deben hervirse al prepararse antes de esterilizarse. 
c) Los caldos no deben hervirse y los agares sí deben hervirse al prepararse y antes 
de esterilizarse. 
10. Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es, como mínimo, 
necesario: una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese 
microorganismo. ¿Cuáles con las condiciones fisicoquímicas de crecimiento necesarias 
para el desarrollo microbiano en un medio de cultivo? 
 
 
 
 
 
 Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
Actividades individuales fuera de sesión 
 
1. Revisar la introducción y procedimientos de la práctica provista por el profesor. 
2. Realizar un diagrama paso a paso del procedimiento para aislar e identificar la 
morfología de algún tipo de microorganismo siguiendo los lineamientos 
mencionados el primer día de clase. 
 
 
Actividades alternativas en casa 
 
 
 
 
 
1 cubo de caldo de pollo 
•1 sobre de grenetina 
•1 litro de agua 
•2 Envases de cristal 
•1 Olla 
•2 cucharas 
 
Procedimiento: 
1. Esterilizar vasos de plastico 
2.Hervir agua 
3.Añadir caldo de pollo y grenetina, homogenizar 
4.Reposar hasta alcanzar temperatura ambiente 
 Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
5.Verter medio de cultivo en vasos 
6.Con una cuchara tomar muestra de saliva 
7.Realizar técnica de extensión en superficie 
8.Incubar durante 48hrs, analizar resultados