Practica6 Discusion y conclusiones-XMZR - Ximena Monserrat Zapata Rodriguez

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Universidad Autónoma de San Luis Potosí 
Facultad de Ciencias Químicas 
Laboratorio de Bioquímica Metabólica I 
Zapata Rodríguez Ximena Monserrat 
 
Practica 6. Determinación de la actividad enzimática Succinato deshidrogenasa, 
Citrocomo oxidasa y ATPasa 
 
4. Discuta los resultados obtenidos en el experimento de succinato deshidrogenasa, Citrocomo 
oxidasa y fosforilación oxidativa. 
En esta practica se realizaron tres experimentos para la determinación de la actividad de las 
enzimas Succinato deshidrogenasa (primer experimento), Citocromo oxidasa (segundo 
experimento) y la ATPasa (tercer experimento) respectivamente. 
En el primer experimento se lleva una reacción de oxido-reducción en donde el agente 
reductor es el succinato y el agente oxidante es el azul de metileno, se preparan 3 tubos de 
ensaye como se indica en la marcha experimental utilizando azul de metileno, succinato, 
extracto de corazón homogenizado en amortiguador de fosfatos pH 7.4 y aceite. En este 
experimento podemos observar como resultado un cambio en la coloración del tubo 1 (debido 
a que es en este en el que se lleva a cabo de manera correcta la reacción), este cambio de 
coloración se debe a que el azul de metileno se reduce y en este estado pierde su coloración y 
se vuelve blanco/transparente. 
Mientras que en el tubo 2 observamos que no hay cambio debido a que no hay presencia de la 
enzima y, en el tubo 3 a pesar de que si hay presencia de la encima el color sigue siendo azul 
como en el inicio debido a que no se le añade aceite y por lo tanto el oxigeno interfiere y se esta 
oxidando y reduciendo constantemente. 
En el segundo experimento se lleva a cabo una reacción de oxidación de la p-fenilendiamina 
por acción de la citocromo oxidasa. Se preparan del mismo modo 3 tubos de ensaye como se 
indica en la marcha experimental con extracto de corazón, p-fenilendiamina, cianuro de potasio 
y agua destilada, se dejan reposar los tubos por media hora a temperatura ambiente. En este 
experimento podemos observar como resultado un cambio en la coloración del tubo 1 debido 
a que en este se lleva a cabo la reacción de oxidación, la p-fenilendiamina presenta un color 
claro casi incoloro en su forma reducida y al oxidarse presenta una coloración vino/rojo. 
 Pudimos observar que en el tubo 2 si hay un cambio de coloración, pero no es la esperada 
debido a la presencia del cianuro de potasio (KCN) que actúa como un inhibidor de la citocromo 
oxidasa por lo que no se lleva a cabo la reacción correctamente; y en el tubo 3 no se observa 
ningún cambio debido a que no hay presencia de la enzima y por lo tanto no hay ninguna 
reacción. 
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En el tercer experimento se lleva a cabo una reacción de hidrolisis de ATP; se prepararon 
varios tubos de ensaye según la marcha experimental utilizando tris HCl, ATP, extracto de 
hígado homogenizado con sacarosa 0.25M (aquí se encuentra la enzima) y agua destilada. 
Estos tubos se trabajan para obtener el sobrenadante que contendrá fosforo inorgánico que es 
lo que buscamos cuantificar lo cual hacemos al realizar una curva patrón. 
Al realizar los cálculos correspondientes para obtener la concentración de fosfato de potasio en 
los tubos para la realización de esta curva observamos que esos valores de concentración van 
de 0.1 a 0.4 Mm, y gráficamente observamos la formación de la curva de tipo bimodal con dos 
máximos; al realizar los siguientes cálculos para la obtención de la concentración de fosforo 
inorgánico libre por la acción de la ATPasa utilizando la ecuación obtenida a partir de la gráfica, 
estas concentraciones de fosforo inorgánico obtenidas son: 0.1442, 0.1778 y 0.0865 mM, 
observamos que en el tubo 2 la concentración de fosforo inorgánico es mayor debido a la 
presencia de la enzima y el ATP pues es el único tubo en donde ambos están presentes esas 
magnitudes se dan debido a que las absorbancias de estos tubos están por debajo de los de la 
curva patrón. 
 
5. Escriba sus conclusiones. 
En esta practica se realizan una serie de experimentos con el objetivo de conocer y entender el 
mecanismo de obtención de energía que se da a nivel celular como resultado del transporte de 
electrones por medio deshidrogenasas nicotin y flavin dependientes. Para la realización de 
todos los experimentos se hace uso de extracto de corazón de ratón homogenizado con en 
amortiguador de fosfatos pH 7.4 y también se usa extracto de hígado homogenizado con 
sacarosa 0.25 M estas homogenizaciones se realizan para darle las condiciones adecuadas a 
la enzima y que trabaje de manera correcta. 
En el primer experimento vemos la actividad enzimática de la Succinato deshidrogenasa que 
se encuentra en el extracto de corazón de ratón, y gracias a la teoría sabemos que esta enzima 
es la que cataliza la oxidación del succinato a fumarato en donde se transfieren dos electrones 
y dos protones al FAD para formar FADH; se lleva a cabo una reacción de oxido reducción entre 
el azul de metileno (agente oxidante) y el succinato (agente reductor). 
Entonces el azul de metileno se reducirá y en este estado sabemos que pierde su coloración y 
se vuelve de color blanco, además de usar estos dos en la preparación de los tubos también se 
hace uso de aceite el cual actúa como un aislante del oxígeno de exterior y evita que este 
interfiera con la reacción. Al observar nuestros resultados obtenidos podemos concluir que 
únicamente en el tubo 1 se lleva a cabo la reacción de manera correcta y optima debido a que 
es en el único en el que se observa el cambio de coloración de la mezcla. 
En el segundo experimento vemos la actividad de la citocromo oxidasa la cual participa en el 
complejo IV y también se encuentra en el extracto de corazón, gracias al fundamento teórico 
 
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sabemos que esta enzima cataliza la reducción del oxigeno molecular a agua el cual es el ultimo 
paso de la fuerza reductora a través de los componentes de la cadena respiratoria; se lleva a 
cabo una reacción de oxidación de la p-fenilendiamina por acción de la enzima citocromo 
oxidasa. 
L p-fenilendiamina tiene un color claro, casi incoloro en su forma reducida y al oxidarse sabemos 
que cambia su coloración y se vuelve mas oscura presenta un color vino, si observamos y 
analizamos nuestros resultados en este experimento nos damos cuenta de que este cambio se 
da en el tubo 1 por lo que concluimos que es en este en el que se lleva a cabo la reacción de 
manera correcta. También podemos concluir que esta reacción se lleva a cabo gracias a que 
no hay en este tubo presencia de KCN ya que este actúa como un inhibidor de la citocromo 
oxidasa impidiendo que la reacción se lleve a cabo tal y como sucede en el tubo 2. 
Y para concluir el en tercer experimento observaremos la actividad hidrolítica de la ATPasa la 
cual participa en el complejo V y permite el flujo de protones en la fracción F0 de este complejo, 
esta enzima se encuentra en el extracto de higado. Estructuralmente se ve que en el espacio 
intermembranal se forma un gradiente de concentración de protones muy alto cuando están las 
reacciones de oxido-reducción del complejo I al IV, al llegar al complejo V debe haber un 
transporte de protones del espacio intermembranal hacia la matriz mitocondrial y para que esto 
suceda se necesita energía, es entonces cuando se activa el F0 por lo cual se necesita la 
ATPasa para obtener energía para este flujo de protones ya que sin este ya no se produciría 
más ATP, todo esto lo sabemos gracias al fundamento teórico. 
Al analizar nuestros resultados obtenidos al realizar los cálculos y la curva patrón de la 
concentración, podemos observar que los datos de lasabsorbancias obtenidas no entran dentro 
de la curva patrón realizada quedan por debajo por lo que concluimos que los valores obtenidos 
de la concentración de fosforo inorgánico libre por acción de la enzima son pequeños y varían 
con respecto a las concentraciones de la curva patrón, y observamos que en el tubo 2 la 
concentración de fosforo inorgánico es mayor debido a la presencia de la enzima y el ATP pues 
es el único tubo en donde ambos están presentes.