Diplomado de Cromatografia

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DIPLOMADO EN QUÍMICA
CROMATOGRAFÍA DE GASES Y 
CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS
2021
DRA. EVANGELINA CAMACHO FRÍAS 1
CROMATOGRAFÍA DE GASES Y 
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
2
Temario:
• Introducción
• Parámetros cromatográficos
• Cromatografía de gases
• Cromatografía de líquidos
• Cuantificación
3
INTRODUCCIÓN
4
Técnicas de separación:
• Decantación.
• Filtración.
• Destilación.
• Precipitación.
• Intercambio iónico.
• Extracción líquido-líquido
• Cromatografía.
5
¿Qué es la cromatografía?
“cromatos” color “grafia” escritura
• “Método fisicoquímico de separación, basado en la
distribución de una muestra entre dos fases, una
móvil (gas o líquido) y otra estacionaria (líquido o
sólido), la cual retendrá selectivamente los
componentes de una muestra”.
6
Cromatografía
• M. Tsweet (1906), separó diversos colorantes de un extracto 
vegetal (clorofilas y carotenos), por elución sobre un lecho de 
sulfato de calcio con un disolvente orgánico (éter de petróleo).
• Martin y Synge (1941). Cromatografía de reparto en columna.
• Kirchner (1951). Cromatografía en capa fina.
• Martin y James (1952). Cromatografía de gases.
• Ward y Pelter (1974). Aplicación HPLC al análisis de
flavonoides.
• En la actualidad es una de las técnicas de separación, 
identificación y cuantificación más utilizadas en la industria.
7
CLASIFICACIÓN
• Por su tipo de fase móvil.
• En función del mecanismo de separación.
• En función de la operación del sistema.
• Por su forma de separación
8
Clasificación por su fase móvil.
• Cromatografía de gases. La fase móvil es un gas y la fase estacionaria
puede ser un sólido, un líquido absorbido en un soporte sólido o una
capa adherida a un soporte sólido.
• Cromatografía de líquidos. La fase móvil es un líquido y la fase
estacionaria es un sólido.
• Cromatografía de fluidos supercríticos. La fase móvil es un fluido
supercrítico, la fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido
absorbido en un soporte sólido o una capa adherida a un soporte
sólido.
• Cromatografía de partición centrífuga. Las dos fases son dos líquidos
inmiscibles y una de las fases permanece “estacionaria” gracias a una
fuerza centrífuga.
9
Clasificación por mecanismo de separación.
• Cromatografía de adsorción. Adsorción-desorción de los compuestos
dependiendo de su polaridad y de la actividad de las fases.
• Cromatografía de reparto. Separación de los compuestos mediante el
reparto entre la fase móvil y estacionaria.
• Intercambio iónico. Separación en función de la carga y tamaño de
iones.
• Exclusión. Separación por tamaño de molécula
10
CLASIFICACIÓN
Clasificación por forma de separación.
• Análisis por desplazamiento. El frente del disolvente avanza
hasta el final del lecho estacionario (cromatografía en papel y
en capa fina)
11
CLASIFICACIÓN
Clasificación por forma de separación.
• Análisis por elución. El frente del disolvente es continuo y
todos los compuestos emergen del lecho cromatográfico.
12
• CLASIFICACIÓN
• Análisis frontal. Se satura una fase con la mezcla a separar,
eluyendo el primer componente puro hasta que empiece a
emerger la mezcla (purificación).
13
CLASIFICACIÓN
14
Proceso Craig:
• Fraccionamiento en etapas múltiples, permite separar analitos 
entre dos fases con coeficiente de distribución similar.
15
Proceso Craig:
Fracción total del compuesto que se tiene en cada tubo en ambas 
fases.
16
Proceso Craig:
Evolución de la distribución del compuesto en función del 
número de tubos.
17
Proceso Craig
Al aumentar el número 
de Transferencias…
• El reparto tiende a una 
distribución normal.
• El máximo de la 
distribución avanza.
• El máximo es cada vez más 
pequeño.
• El analito se reparte entre 
más tubos
18
El proceso cromatográfico
• El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado 
(columna).
• La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto 
con la fase estacionaria.
• La velocidad de los analitos es inversamente proporcional a su 
afinidad por la fase estacionaria.
• Los analitos con diferente constante de distribución se separan
• La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos.
• Los solutos se reparten entre ambas fases.
https://www.youtube.com/watch?v=4IyGp6tqFqA
https://www.youtube.com/watch?v=4IyGp6tqFqA
19
Elución
• La muestra se aplica al principio de la columna como 
una banda fina.
• El eluyente tiene una menor afinidad por la fase 
estacionaria que los solutos.
• Los solutos avanzan por el sistema a velocidades 
diferentes, menores a la de la fase móvil.
• Los solutos se separan en bandas y éstas salen (eluyen) 
por el final de la columna.
20
Elución
21
PARÁMETROS 
CROMATOGRÁFICOS
22
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Tiempo muerto tM (t0)
• Tiempo que tarda un compuesto no retenido en
recorrer el sistema cromatográfico.
Tiempo de retención tR
• Tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatográfico. Esta retención se ejerce en
función de las características moleculares de cada
compuesto.
23
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Tiempo de retención ajustado tR‘
• Tiempo en que el analito permanece en la fase
estacionaria.
Tiempo de retención relativo tRrel‘
• Relación de los tiempos de retención ajustados del
compuesto de interés i (tRi’) y el de referencia (tRp’)
0' ttt RR −=
'
'
Rp
iR
Rrel
t
t
t =
24
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Volumen de retención VR
• Es el volumen de fase móvil necesario para transportar
la banda de soluto desde la inyección hasta el detector.
Se obtiene al multiplicar el tiempo de retención por el
flujo del eluyente (F)
Ancho a la base del pico Wb 
• Parte de la línea de base interceptada por las tangentes
al pico. Para un pico gaussiano es igual a 4s
𝑉𝑅 = 𝑡𝑅𝐹
25
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Ancho a la mitad de la altura del pico W½
• Permite evaluar mejor la eficiencia del sistema.
26
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Eficiencia de la columna
• Número de platos teóricos. Cada plato representa un
equilibrio teórico de distribución entre las fases. Depende de
factores experimentales entre ellos, la velocidad del flujo y la
carga de la muestra.
• A mayor número de platos teóricos.
o Se logra mejor separación
o Se pueden separar mezclas más complejas
o Se pueden separar solutos más parecidos
𝑁 = 16
𝑡𝑅
𝑊𝑏
2
= 5.54
𝑡𝑅
𝑊 ൗ1 2
2
27
Velocidad lineal media de las moléculas de FM.
• Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las
moléculas de soluto a lo largo de una columna
cromatográfica.
Velocidad lineal media de migración de soluto.
• Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las
moléculas de soluto a lo largo de una columna
cromatográfica.
lj𝜈 =
𝐿
𝑡𝑜
lj𝜈 =
𝐿
𝑡𝑅
28
Altura del plato teórico H.
• Longitud de la columna (L) dividida entre el número de
platos teóricos.
𝐻 =
𝐿
𝑁
Indicador de la eficiencia de una columna cromatográfica
29
𝑯 = 𝑨 +
𝑩
ഥ𝒖
+ 𝑪ഥ𝒖
• ത𝑢 es la velocidad de la
fase móvil
• A representa la elución
multicanal
• B representa la difusión
longitudinal
• C representa la
resistencia a la
transferencia de masa
Ecuación de Van Deemter.
A mayor N, menor H
30
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Ecuación de Van Deemter.
31
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Constante de reparto
• En equilibrio:
AFM AFE
𝐾𝐸𝑞𝑢𝑖𝑙𝑖𝑏𝑟𝑖𝑜 = 
𝐴 𝐹𝐸
𝐴 𝐹𝑀
Constante de distribución.
Factor de capacidad
• No equilibrio (equilibrio dinámico):
k′=
𝑡𝑅−𝑡0
𝑡0
32
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Factor de simetría (T)
• Se determina con la relación entre el ancho del pico al 5 %
de altura (w0.05) y la distancia del máximo del pico hasta
el borde inicial del pico al 5 % de altura.
f
w
T
2
05.0=
33
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Factor de asimetría (FA) .
Se determina con la relación entre el ancho del pico al 10 %
de altura (b) y la distancia del máximo del pico hasta el
borde inicial del pico al 10 % de altura (a).
a
b
FA =
34
Factor de asimetría(FA) .
Pico cabeceado: posiblemente la concentración de muestra es
muy grande.
Pico coleado: el empaque de la columna no es el adecuado
35
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Factor de selectividad α.
• Capacidad del sistema para separar dos picos adyacentes.
𝛼 =
𝑘′2
𝑘′1
=
𝑡𝑅2 − 𝑡0
𝑡𝑅1 − 𝑡0
=
𝑡′𝑅2
𝑡′𝑅1
≥ 1
• Muestra las diferencias de afinidad por los solutos de las fases
involucradas.
• Mide las diferencias relativas en las fuerzas de interacción de
dos solutos con la fase estacionaria. A mayor valor de α la
columna es más selectiva y por lo tanto se tiene una mejor
resolución.
• Indica el potencial de separación de esos solutos en el sistema,
pero no mide la separación real.
36
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Selectividad y eficiencia.
• Aunque ambos influyen en la separación, por sí solo ninguno
de estos parámetros indica si ésta se logró.
37
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Resolución
• Es el cociente de la distancia entre los centros de las dos bandas
y el valor medio del ancho de las mismas.
𝑅𝑠 =
2(𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1)
𝑊𝑏1 +𝑊𝑏2
• En la resolución cromatográfica influyen tres factores:
retención, selectividad y eficiencia.
𝑅𝑠 =
𝑘′2
1+𝑘′2
∗
𝛼−1
𝛼
∗
𝑁
4
Retención selectividad eficiencia
38
Resolución
39
Resolución
40
Resolución y retención
• Si los solutos no se retienen no hay separación
• Conforme aumenta la retención, la separación
mejora
• Si los solutos se retienen demasiado, sólo tarda más
el análisis sin mejorar la separación.
• Para mezclas de pocos compuestos, el óptimo es:
3 ≤ k’ ≤ 6
4t0 ≤ tR ≤ 7t0
41
Resolución y selectividad
• A mayor selectividad, mejor separación
• En cromatografía de gases, la selectividad depende sólo de las
interacciones específicas de la fase estacionaria con los solutos.
o Para mejorar la selectividad se necesita cambiar la columna
por otra con una fase estacionaria diferente.
• En cromatografía de líquidos, la selectividad depende de las
interacciones de los solutos con la fase estacionaria y con la fase
móvil.
o Para mejorar la selectividad se necesita modificar la fase
móvil y/o la fase estacionaria.
42
Tiempo total de análisis y resolución.
𝑡𝑅 = 16𝑅𝑆
2
1 + 𝑘′2
3
𝑘′2
2 ∗
𝛼
𝛼 − 1
2
∗
𝐻
𝜇
• Los análisis son más rápidos si:
o 1.5 ≤ Rs ≤ 2
o α >> 1
o 3 ≤ k’ ≤ 6
• Se logran altas eficiencias (H pequeño) a velocidades
altas de gas acarreador.
43
Resolución y eficiencia
• A mayor número de platos teóricos, mejor
separación
• La separación mejora apreciablemente solo si el
aumento en N es de varios órdenes de magnitud.
• Los aumentos pequeños no son importantes, por
ejemplo, duplicar el largo de la columna duplica el
tiempo de análisis y solo mejora en 40 % la
resolución.
• Las mejoras notables solo se logran mejorando las
técnicas cromatográficas.
44
CROMATOGRAFÍA DE GASES
45
Cromatografía de gases:
• Es una de las técnicas cromatográficas más utilizada.
o La fase móvil es un gas (gas acarreador)
o La fase estacionaria es sólido o un líquido adsorbido en 
un sólido (columnas empacadas) o
o La fase estacionaria es una líquido formando una capa 
adherida a una superficie (columnas capilares).
o Analitos volátiles o volatilizables (pe < 300 ºC)
o Termoestables (hasta 400 ºC)
o La separación de los analitos se basa en las interacciones
entre las moléculas y la fase estacionaria.
46
Factores que afectan la separación
• Estructura química del compuesto
• Naturaleza de la fase estacionaria
• Temperatura de la columna: A mayor temperatura, menor
retención.
Equipo:
• Fuente de gas.
• Sistema de inyección
• Horno y columna cromatográfica.
• Sistema de detección
• Sistema de registro
47
Equipo:
https://www.youtube.com/watch?v=9nYpjtRx0Zs
https://www.youtube.com/watch?v=9nYpjtRx0Zs
48
Características:
• Inerte. No debe reaccionar con la atmósfera, con la FE ni con
las superficies del instrumento.
• Puro. Debe ser libre de impurezas que puedan degradar a la
FE o las superficies del instrumento. Las impurezas más
comunes son:
o Agua
o Oxígeno
o Hidrocarburos
Gas Acarreador:
49
Características:
• Compatible con el detector. Cada detector requiere un gas
acarreador específico para su mejor funcionamiento.
o Conductividad térmica. He, H2
o Conductividad iónica. H2, N2
o Ionización de llama. He, H2
Gas Acarreador:
50
Características:
El gas acarreador debe ser lo más puro posible.
• Precio. Sin embargo, los gases de altísima pureza pueden ser
muy caros:
Gas Acarreador:
51
Componentes de una línea de gas:
• Cilindro de gas.
• Controladores de presión de gas.
• Trampas de purificación del gas.
Gas Acarreador:
52
Gas Acarreador:
Análisis de 
plaguicidas 
cambiando el tipo 
de gas acarreador
53
Introducción de la muestra:
• Microjeringa.
o Inyección manual
o Inyección automática
• Válvulas.
54
Introducción de la muestra:
Inyección manual:
• Después de purgar la jeringa, se toma el volumen de
inyección deseado.
• La aguja, que estaba llena antes de la inyección, queda llena
después de la inyección y el volumen introducido es el
comprendido entre marcas del cilindro que es el calibrado
verdadero, sin contar el volumen del interior de la aguja.
Errores por evaporación en el inyector.
55
Introducción de la muestra:
Inyección manual con volumen de aire:
• Después de purgar la jeringa, se toma el volumen de
inyección deseado.
• Se toma un volumen de aire.
• Inyección rápida.
• Permanencia de la aguja en el inyector unos segundos para
evaporación de su contenido.
Mayor exactitud.
56
Microjeringa:
• Es el dispositivo más
común.
• Consiste en un cilindro
de vidrio calibrado con
émbolo interior metálico
usado para dispensar un
volumen seleccionado
de muestra por
desplazamiento a través
de una aguja.
• Volúmenes, de 0 a 10
µL, a 5 µ, a 2 µL y 1 µL.
Introducción de la muestra:
57
Introducción de la muestra:
Inyección manual:
58
Introducción de la muestra:
Inyección automática
59
Introducción de la muestra:
Inyección automática
60
Introducción de la muestra:
Inyección automática
61
Introducción de la muestra:
Sistema de válvulas (gases):
62
Introducción de la muestra:
Parámetros que afectan la inyección:
• Velocidad de inyección.
• Viscosidad de la muestra.
• Volumen muerto
• Temperatura
• Técnica de inyección
• Adaptación émbolo – cilindro
• Estado de la jeringa
63
Inyector:
Es la parte del cromatógrafo por donde se introduce la muestra a
la columna.
• El disolvente y los compuestos son vaporizados.
• Se mezcla el vapor de la muestra con el gas de arrastre
• La mezcla se transfiere a la columna cromatográfica.
Está compuesto por:
• Cámara de calentamiento
• Inserto de vidrio
• Líneas de flujo del gas
64
Cualidades del inyector:
• Incorporación de la muestra a la fase móvil sin provocar
dispersión (ensanchamiento de los picos).
• Evaporar todos los analitos instantáneamente sin
descomposición térmica.
• Evitar la difusión de los componentes de la muestra en la fase
móvil.
• No provocar contaminación de la muestra
• No provocar pérdida de la muestra.
65
Inyector:
66
Parámetros del inyector:
Temperatura del inyector
• Debe ser lo suficientemente elevada para que la 
muestra se evapore, sin descomposición.
o En general la temperatura del inyector debe 
ser 50 °C arriba del componente menos 
volátil.
67
Parámetros del inyector:
Volumen de inyección.
• Depende del tipo de columna y del estado físico de 
la muestra.
• Columna empacada (3.2 µm): 
o 0.2 µL a 20 µL para muestras líquidas
o 0.1 mL a 50 mL para muestras gaseosas.
• Columna capilar (0.25 µm): 
o 0.02 µL a 3 µL para muestras líquidas
o 0.001 mL a 0.5 mL para muestras gaseosas.
68
Tipos de inyector:
Inyector Tipo Uso
Split/Splitless Vaporización Inyección en caliente
Wide bore (grandes 
cantidades)
Vaporización Inyección en caliente
On-column Inyección en frío Adecuado para 
compuestos térmicamente 
inestables.
Vaporización con 
temperaturaprogramada
Inyección en frío Adecuado para 
compuestos térmicamente 
inestables, de alto punto 
de ebullición o para 
grandes volúmenes de 
muestra
69
Inyector Split/splitless:
Ventajas.
• Previene la introducción
de compuestos no 
volátiles a la columna.
Desventajas.
• Discriminación de los 
compuestos con alto 
punto de ebullición y 
térmicamente inestables.
70
Inyección split:
• Para muestras con 
concentraciones altas.
• Relación Split = 
𝐹𝑠𝑝𝑙𝑖𝑡
𝐹𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎
Ventaja.
• Obtención de picos más 
finos.
71
Inyección splitless:
• Para muestras con 
concentraciones a nivel de 
trazas.
Ventaja.
• Adecuado para muestras 
semi-volátiles (analitos
con pb > 150 °C,
72
Inyección on-column:
• Toda la muestra se introduce directamente a la
columna.
• La muestra puede introducirse a temperatura
relativamente baja.
• La temperatura del inyector puede ser programada.
• No hay división de la muestra.
• Se minimiza la descomposición de compuestos
térmicamente inestables.
• Rápida contaminación de la columna por compuestos
no volátiles.
73
Inyección on-column:
74
Inyección de vaporización con temperatura 
programada (PTV):
• La muestra puede ser inyectada con temperatura
relativamente baja.
• La temperatura del inyector puede ser programada.
• La muestra se introduce a través de un inserto de
vidrio tipo PTV.
• Puede usarse en modo split o splitless
• Sin descriminación para compuestos de alto punto de
ebullición.
• Minimiza la descomposición de compuestos
térmicamente inestables.
• Posibilidad de inyectar grandes volúmenes de muestra
75
Inyección PTV:
76
Inyección PTV:
77
Insertos de 
vidrio
• Elimina el 
contacto de la 
muestra con el 
metal
• Calentamiento 
uniforme para 
mejor 
evaporación 
de la muestra.
78
Columna cromatográfica
Clasificación
• Empacadas
• Caplilares
79
Columna cromatográfica
80
Columna cromatográfica
Tipos de empaque
81
Columnas cromatográficas
82
83
Columnas cromatográficas
84
Columnas cromatográficas
85
Columnas cromatográficas
Cuando no se utilizan se 
guardan con las puntas 
cubiertas
Cuando se conecta una 
columna hay que verificar 
que no haya fugas
86
Columnas cromatográficas
benzo(b)fluoranthene and benzo(k)fluoranthene. Thermo
Scientific TRACE TR-5MS 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm 
column
Columna nueva Pérdida de 
resolución
87
Columnas cromatográficas
88
Columnas cromatográficas
89
Detectores
El detector convierte la medida amplificada de una magnitud 
física, indicando el momento en que eluyen los componentes 
de la columna.
Clasificación
• Universal
• Selectivo
90
Detector de conductividad térmica (TCD)
El detector convierte la medida amplificada de una magnitud 
física, indicando el momento en que eluyen los componentes 
de la columna.
Catatómetro
• Se basa en los cambios en la conductividad térmica de 
gas ocasionados por la presencia de moléculas de 
analito.
• Filamento de Pt o de Au calentado eléctricamente.
• Su resistencia térmica depende del gas eluyente.
• Mejores gases acarreadores: Hidrógeno o Helio
91
Detector de conductividad térmica (TCD)
Características:
• Respuesta 
universal
• Respuesta lineal 
en un amplio 
intervalo
• Fácil de utilizar
• No destructivo
• Baja sensibilidad
92
Detectores de ionización de llama (FID)
• La respuesta se produce como resultado de la combustión 
de los compuestos orgánicos en una pequeña llama de 
aire-hidrógeno, con desprendimiento de iones (CHO+) y 
electrones
• Si se aplica una diferencia de potencial entre el extremo del 
quemador y el cátodo colector, se genera una corriente 
eléctrica que, amplificada, constituye la señal analítica. 
• Ésta señal es proporcional al número de átomos de 
carbono por unidad de tiempo. 
• Gas acarreador: Hidrógeno
93
Detector de ionización de llama (FID)
94
Detector de ionización de llama (FID)
Características:
• Sensible a compuestos orgánicos (excepto 
carbonílicos y carboxílicos)
• Elevada sensibilidad
• Respuesta lineal en un gran intervalo
• Estabilidad y resistencia
• Fácil manejo
• Bajo ruido
• Es destructivo
95
Detector de captura de electrones (ECD)
• El gas que eluye de la columna atraviesa un 
emisor de electrones (Ni-63), los cuales provocan 
su ionización. 
• Al aplicar una diferencia de potencial se crea una 
corriente eléctrica que constituye la señal. 
• En presencia de compuestos orgánicos la 
corriente disminuye por su tendencia a captar 
electrones. 
• Se emplea nitrógeno o argón como gas 
acarreador, con un 5 % de metano.
96
Detector de captura de electrones (ECD)
Características:
• Detector selectivo 
(moléculas con grupos 
electronegativos)
• Elevada sensibilidad
• No destructivo (no 
altera la muestra de 
manera significativa)
• Pequeño intervalo de 
respuesta lineal
97
Respuesta relativa del (ECD) a compuestos orgánicos
• Hidrocarburos 1
• Éteres, Ésteres 10
• Alcoholes, cetonas y aminas alifáticas
Compuestos con un Cl o F 100
• Compuestos con un Br, dos Cl, F, 1 000
• Anhídridos y compuestos tri-Cl 10 000
• Compuestos mono-I, di-Br y
poli-Cl, F 100 000
98
Detector de ionización termoiónica (TID) (NPD)
• Es un detector selectivo para los compuestos orgánicos que 
contienen fósforo. 
• El gas eluyente se quema en presencia de hidrógeno y 
fluye alrededor de una perla de cloruro de rubidio 
calentada eléctricamente (600-800 ºC), formando un 
plasma de electrones que generan una corriente bajo una 
diferencia de potencial aplicado (unos 180 V). 
• La intensidad de la corriente será proporcional al número 
de iones formados, es decir, a la cantidad de analito. 
• No se puede usar nitrógeno como gas acarreador. 
• Es destructivo y tiene una elevada sensibilidad.
99
Detector de ionización termoiónica (TID) (NPD)
Características:
• Detector selectivo 
(moléculas con grupos 
electronegativos)
• Elevada sensibilidad
• No destructivo (no 
altera la muestra de 
manera significativa)
• Pequeño intervalo de 
respuesta lineal
100
Detector de fotoionización (PID)
• En este detector el eluyente de la columna se irradia con 
un haz intenso de radiación ultravioleta, que provoca la 
ionización de las moléculas. 
• Al aplicar un potencial a través de la celda que contiene los 
iones producidos se origina una corriente de iones, la cual 
es amplificada y registrada.
• Pueden detectar rápidamente muchos Compuestos 
Orgánicos Volátiles en niveles bajos de concentración.
• Detecta todos los gases con potencial de ionización 
inferiores al nivel de energía de la lámpara.
101
Detector de fotoionización (PID)
Características:
• La lámpara necesita 
limpieza frecuente 
por estar expuesta a 
la muestra, por lo que 
no es práctica para 
utilizarla en continuo. 
• Sistema no destructivo
102
Detector fotométrico de llama (FPD)
• Mide la emisión óptica procedente, principalmente, del 
fósforo y del azufre. 
• Cuando el eluyente pasa por una llama mezclado con 
hidrógeno y aire, de manera análoga al detector FID, los 
átomos excitados emiten una radiación característica (536 
nm y 394 nm) que se puede aislar con un filtro y detectar 
con un tubo fotomultiplicador.
• El azufre forma una molécula metaestable S=S
• El fósforo forma una molécula metaestable HPO
• El filtro óptico se usa para darle selectividad hacia uno u 
otra longitud de onda
103
Detector fotométrico de llama (FPD)
Características:
•Es un detector 
selectivo (P y S; 
también Pb, Sn, 
halógenos)
•Es destructivo
•Menos sensible al 
azufre que otros 
detectores
•Menor intervalo lineal 
para el azufre que 
otros detectores
104
Detector de emisión atómica (AED)
• El gas eluido procedente de la columna se introduce en un 
plasma de helio obtenido por microondas, que atomiza y 
excita los elementos de la muestra, obteniéndose sus 
espectros de emisión atómica característicos. 
• Los espectros son recogidos en un espectrómetro provisto 
de dos diodos en serie.
105
Detector de emisiónatómica (AED)
106
Detector Quimioluminiscente de azufre
• Permite detectar compuestos que contienen 
sulfuro (alimentos, bebidas, petróleo). 
• Primero se oxida a SO2, luego en presencia de H2
se transforma en SO, que reacciona con ozono 
formando SO3 excitado, que emite luz al volver a 
su estado basal. 
• Permite detectar bajas concentraciones, de hasta 
picogramos.
107
Detector Quimioluminiscente de azufre
108
Detector acoplado a espectrometría de masas
• La GC-MS permite separar, identificar y 
cuantificar mezclas complejas de sustancias 
químicas.
• El gas utilizado como acarreador es Helio.
• El eluyente entra a una fuente de energía en donde se 
ionizan las moléculas.
• Una vez ionizado se usa un pequeño dispositivo 
para repeler los iones de la cámara de ionización.
• Impacto electrónico (EI) (más utilizado)
• Ionización química (IC). 
109
Detector acoplado a espectrometría de masas
Ionización por impacto electrónico
• Un haz de electrones ioniza las moléculas de la 
muestra y da como resultado la pérdida de un 
electrón. 
• Una molécula con un electrón faltante se llama 
ion molecular y está representada por M +. 
• El ion molecular generalmente se fragmenta 
produciendo iones más pequeños con abundancias 
relativas características que proporcionan una "huella 
dactilar" para esa estructura molecular. 
110
Detector acoplado a espectrometría de masas
111
Detector acoplado a espectrometría de masas
• Detección 
universal
• Elevada 
sensibilidad
• Buenos resultados 
en mezclas 
orgánicas 
complejas
• Elevado costo
• Complejidad de 
uso
112
Detector acoplado a espectrometría de masas
Ionización química.
• Se ioniza el metano (u otro gas adecuado), 
creando un radical que a su vez ionizará la 
molécula de muestra para producir [M + H] + 
iones moleculares. (M+1)
• La energía de ionización es menor por lo tanto, 
se produce menos fragmentación por lo que se 
obtiene menos información sobre la estructura 
detallada de la molécula.
113
Detector acoplado a espectrometría de masas
• A veces, el ion molecular no se puede detectar 
utilizando EI
• Los dos métodos se complementan entre sí. 
114
Acoplamiento de detectores.
Referencia: Fundamentos de la cromatografía de gases: Hardware. Agilent 
Technologies
TCD FID
FID
ECD
En serie
El detector no destructivo se debe colocar antes del otro 
detector
En paralelo
El efluente de la columna se divide entre los diferentes 
detectores
115
Sensibilidad de los detectores cromatográficos
fg pg ng µg mg
TCD
NCD (N)
NCD (P)
ECD
FID
FPD (S)
FPD (P)
Referencia: Fundamentos de la cromatografía de gases: Hardware. Agilent 
Technologies
116
Derivatización
• Es un proceso que consiste en modificar 
químicamente un compuesto para producir un 
derivado con nuevas propiedades que faciliten o 
permitan su análisis
• Mejora la volatilidad, estabilidad térmica y/o la 
detección del analito
Referencia:
Métodos cromatográficos: Derivatización de analitos. 
IQI Ulises Graciada Álvarez
117
Derivatización
Características.
• Condiciones de operación lo más simple posibles
• Rendimiento máximo de la reacción y que sea 
reproducible
• El origen químico de los productos formados debe 
ser predecible.
• Correspondencia entre el número inicial de analitos 
y sus derivados.
118
Derivatización
Se puede aplicar a:
• Compuestos poco volátiles
• Compuestos termolábiles.
• Compuestos insolubles para su análisis por HPLC.
• Compuestos que presentan fuerte interacción con la fase 
estacionaria.
• Compuestos muy pequeños.
Resolución pobre y/o picos asimétricos.
119
Derivatización
Tipos de Derivados
• Sililación. Reemplazo de un hidrógeno ácido con un grupo 
alquilsililo.
• Acilación. Reemplazo de un hidrógeno activo como -OH, -SH 
y -NH en ésteres. tioésteres y amidas respectivamente
120
Tipos de Derivados
• Alquilación. Reemplazo de un hidrógeno activo como 
R-COOH, R-OH, R-SH y R-NH2 con un grupo arilo o alquilo
Extracto de nuez Juglans Regia
Cromatógrafo Thermo Scientific Focus
Columna: TRACE TR-WAX 
(polietilenglicol, polar) de 60 m x 
0.25 mm x 0.25 µm
Gas acarreador: Helio 1 mL/min
Compuestos esterificados con 
metanol en medio básico.
V inyección= 1 µL
Gradiente de T: 50°C a 220 °C a 5 
°C/min
121
Gradiente de elución
• En cromatografía de gases la retención de los analitos está 
dado por el valor de k’.
• La retención de un analito puede disminuir si se aumenta la 
temperatura, debido a que el valor de k’ disminuye.
• La elución de los analitos en un análisis cromatográfico 
puede modificarse aumentando la temperatura, es decir, 
haciendo un gradiente de temperatura.
• Se empieza el análisis con una temperatura relativamente 
baja y durante el análisis se va aumentando con una 
velocidad de calentamiento controlada.
• En un mismo análisis puede haber una o varias rampas de 
calentamiento.
122
Gradiente de elución
Proceso isotérmico 45 °C
Proceso isotérmico 140 °C
Gradiente térmico,
T inicial 30 °C
T final 180 °C
V de calentamiento 10 °C/min
123
Aplicaciones
• Cromatograma de Gases representativo de las tabletas de Abexol. 
C20: 1-eicosanol (Patrón interno), C24: 1-tetracosanol, C26: 1-
hexacosanol, C28: 1-octacosanol, C30: 1-triacontanol, C32: 1-
dotriacontanol y C34: 1- tetratriacontanol, todos como derivados 
trimetilsilil, y E: excipiente.
124
Detector de captura de electrones
125
Selección de la columna
• Si no se dispone de información acerca de qué 
columna debe utilizarse, probar primero una columna 
apolar (tipo DB-1 ó DB-5)
• Las columnas de bajo sangrado suelen ser más inertes 
y tener límites de temperatura superiores.
• Utilizar la fase estacionaria lo menos polar posible que 
ofrezca una resolución y tiempo de análisis 
satisfactorios.
• Utilizar una fase estacionaria con polaridad similar a la 
de los solutos (no siempre permite encontrar la fase 
estacionaria idónea).
126
Selección de la columna
• Si un soluto se separa mal y presenta dipolos o fuerzas 
de enlace de hidrógeno diferentes, probar la 
separación con características distintas en cuanto a 
dipolos o interacción asociadas a los enlaces de 
hidrógeno.
El cambio de fase estacionaria podría dar lugar a otras 
coeluciones, por lo que la nueva fase estacionaria 
puede no aportar una mejor resolución total.
127
Selección de la columna
• Si es posible, no usar fases estacionarias que contengan 
grupos funcionales que generen una respuesta 
importante en un detector selectivo. Por ejemplo, las 
fases estacionarias que contienen cianopropilo generan 
un aumento desproporcionado de la línea de base en 
los detectores NPD, debido al sangrado de la columna.
• Con un número muy pequeño de columnas: DB-5, DB-
17 y DB-WAX se puede cubrir una gran variedad de 
selectividades. 
Fuente: Agilent J&W GC Column Selection Guide
N.º de publicación: 5990-9867EN
For Research Use Only. Not for diagnostic procedures.
http://www.chem.agilent.com/Library/catalogs/Public/5990-9867EN_GC_CSG.pdf
128
Problema
• Se desean separar los siguientes compuestos ¿qué 
condiciones utilizarías?
129
Problema
• Se desean separar los siguientes compuestos ¿qué 
condiciones utilizarías?
130
CROMATOGRAFÍA DE 
LÍQUIDOS
131
HPLC
• Inicialmente se refería a :
High Pressure Liquid Chromatography
• En la actualidad es:
High Performance Liquid Chromatography.
• También se puede encontrar como:
o High patient liquid chromatography
o High priced liquid chromatography
132
HPLC, introducción
• Se tiene una fase móvil líquida que pasa a través de un
empaque sólido (fase estacionaria), contenido generalmente
en un tubo de acero inoxidable.
• El empaque debe ser lo más homogéneo posible y para ello el
tamaño de partícula debe ser reducido
Necesidad de trabajar con
presiones altas
133
HPLC, introducción
• La muestra no está fase vapor.
• Se pueden analizar muestras termolábiles.
• Las interacciones del soluto son con la fase móvil y con la
fase estacionaria.• Para cambiar la retención de los compuestos, se cambia la
composición de la fase móvil para cambiar la polaridad
(gradiente de elución).
134
HPLC, Características
La cromatografía de líquidos de alta eficiencia es:
• Selectiva
• Reproducible
• Sensible
• Rápida
Los parámetros que influyen en la HPLC son:
• Naturaleza de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula
• Composición y flujo de la FM
• Detector
135
Principales mecanismos de interacción
• Adsorción superficial
• Reparto
• Intercambio iónico
• Exclusión molecular (permeación en gel)
136
HPLC aplicaciones
137
Cromatografía de adsorción
• La fase estacionaria es sólida.
• La separación de los solutos en una mezcla se logra por las
diferencias de solubilidad con la FM y la retención por
adsorción en la FE.
• Las FE más comunes son a base de sílica (90%) y alúmina
(10%).
• Tanto las moléculas de solutos como de la FM se atraen hacia
los lugares activos polares de la FE.
• Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de
elución y la selectividad adecuadas. Normalmente un
disolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo
(acetona, cloruro de metilo, etc.).
138
Cromatografía de reparto
• La separación se basa en el reparto o distribución de los
solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria
inmiscible, soportada sobre un sólido inerte.
• La discriminación se produce por diferencias de solubilidad.
• El mecanismo de retención es similar al de un modelo de
• extracción a contracorriente.
• Las especies más retenidas serán las que presenten mayor
afinidad por la fase estacionaria que por la fase móvil.
• La separación de los solutos se basa en las diferencias en
• esta solubilidad relativa.
139
Cromatografía de reparto
Se divide en:
Fase normal
• La fase estacionaria es de naturaleza polar
• La fase móvil es de baja polaridad (disolventes orgánicos)
• Adecuado para analizar compuestos no polares.
• Inicialmente fue la más utilizada.
Fase inversa
• La fase estacionaria es de naturaleza apolar
• La fase móvil es de alta polaridad (agua y disolventes
miscibles con agua)
• Adecuado para analizar compuestos polares
• Actualmente es la más utilizada.
140
Cromatografía de reparto
• Dependiendo del tipo de fase que se emplee, se va a alterar el
orden de elución de los solutos en una muestra.
141
Cromatografía de intercambio iónico
• Tanto la FE como la FM son de naturaleza iónica. Los iones
de la FE son de carga opuesta a los de la FM.
• Se clasifican en:
o Aniónicas. Contienen grupos con carga positiva que
unen a los aniones de forma reversible. Generalmente
son grupos amino alifáticos o aromáticos.
o Catiónicas. Son portadores de cargas negativas que unen
a los cationes de modo reversible. El más utilizado es el
grupo sulfona. Otros grupos utilizados son carbonilo e
hidroxilos fenólicos.
142
Cromatografía de intercambio iónico
• Se emplea para el análisis de todo tipo de iones (inorgánicos
y orgánicos).
• Las moléculas intercambiadoras se ligan a soportes
específicos.
• El material intercambiador de la fase estacionaria es de
diámetro de partícula pequeño (1-10 μm) y estructura
microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja
respecto al material intercambiador convencional (10-2 – 10-3
meq/g).
143
Separación con columna catiónica 
144
Cromatografía de exclusión
• También se conoce como cromatografía de
permeación en gel (GPC).
• La separación se basa en el tamaño molecular.
• Como fase estacionaria se emplean sustancias de
tamaño de poro determinado.
145
Cromatografía de exclusión
• Como fase estacionaria se emplea un material
poroso inerte (gel) que permite la discriminación
entre los solutos según su tamaño.
• Los analitos de mayor tamaño no pueden penetrar
en los poros de la fase estacionaria y son excluidos,
viajando con la fase móvil en el frente de la misma.
• Es especialmente útil para determinar el intervalo
• molecular de polímeros, proteínas, etc.
146
Cromatografía de exclusión
147
Cromatografía de exclusión
148
Cromatografía de afinidad
• La fase estacionaria se recubre con un ligante, generalmente
un anticuerpo.
• El ligante puede estar unido químicamente al soporte de la
fase estacionaria o
• Puede estar en la fase móvil y adsorberse en la fase
estacionaria.
• El agente ligante forma selectivamente un quelato con el
analito y de esta forma es retenido.
• Todo lo que no tenga afinidad con el ligante sale con el frente
de elución.
• Para eluir al analito retenido por afinidad, se aumenta la
fuerza iónica de la FM o aumentar la concentración del
ligante en la FM.
149
Cromatografía de afinidad
150
Instrumentación
High Performance Liquid Chromatography HPLC- UV-VIS Detector Animation – YouTube
• El equipo consta de:
o Reservorio de FM
o Bomba
o Sistema de inyección
o Columna
o Detector
o Tratamiento de datos
https://www.youtube.com/watch?v=eCj0cRtJvJg
151
Reservorio
• Puede ser de vidrio o de plástico.
• Con capacidad de un litro o 500 mL
• Algunos sistemas automatizados contienen degasificador
incluido.
• El gas que se utiliza generalmente es nitrógeno.
152
La fase móvil debe:
• Ser de alta pureza (calidad HPLC).
• Ser inerte frente a la fase estacionaria.
• Ser de baja viscosidad.
• Ser compatibles con la muestra.
• Facilitar la recuperación de la muestra.
• Ser compatible con el sistema de detección.
153
La fase móvil:
Degasificación
• Reduce el riesgo de formación de 
burbujas en la columna o en el 
detector.
• Puede hacerse por.
o Desplazamiento con un gas
menos soluble (He)
o Aplicación de vacío
o Sonicación
o Calentamiento.
154
Fase móvil:
Elución
• Elución isocrática. La composición de la fase móvil se
mantiene constante durante el análisis
• Elución en gradiente. La fase móvil varía su composición
para hacerla más o menos polar y que los solutos eluyan.
155
Filtración
• Antes de su uso, la fase móvil se filtra al vacío utilizando
membranas.
• La muestra se puede filtrar por medio de filtros para jeringa
• En ambos casos los materiales más comunes son:
• Nylon
• PES
• PTFE
• Y el diámetro de poro:
• 0.45 µm
• 0.22 µm
156
Membrana tipo jeringa
Membrana para filtración de la FM
Sistema de filtración
de la FM
157
SISTEMA DE BOMBEO
Requerimientos
• Capacidad de trabajar en un amplio intervalo de presiones
(hasta 5000 psi ó 400 atm).
• Capacidad para utilizarse con distintos flujos de fase móvil
(0.1 a 10 mL/min).
• Capaz de generar un flujo de fase móvil libre de pulsaciones.
• Ser químicamente inerte. Generalmente su interior es
• de acero inoxidable o de teflón.
• Control, exactitud y reproducibilidad de flujo
158
SISTEMA DE BOMBEO
Tipos de bombas de líquidos.
• Bombas a flujo constante
o Peristáltica
o De pistón
o De jeringa
o Rotatoria de paletas.
• Bombas a presión constante
o De presión directa mediante un gas
o De intensificador neumático
o De intensificador hidráulico.
159
Sistema de inyección
• Manual
• Automático
160
Inyector manual
161
Inyector automático
162
Precolumna
• Es una pequeña columna (0.5 – 3 cm) colocada entre el 
inyector y la columna
• Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la 
muestra o del eluyente, en la columna analítica
• Permite alargar la duración de las columnas
• Debe ser del mismo empaque que el de la columna analítica
163
Columna cromatográfica
• Gran avance en la última década por el progreso en la 
tecnología de rellenos y columnas
• Rellenos más uniformes y de menor tamaño
• Fases químicamente ligadas a los soportes aumentando su 
eficiencia y resolución
• Mejora en los métodos de empaque
164
Columna cromatográfica
• Al disminuir el tamaño del empaque aumenta la eficiencia 
pero también la presión de trabajo
• Las columnas constan de:
o Cuerpo. Normalmente es un tubo de acero inoxidable
o Empaque. Material con diámetro de partícula definido
o Algunas casas comerciales permiten la renovación del 
rellenosin tener que comprar la columna completa
o Existen columnas de compresión radial, cuyo cuerpo 
puede ser presurizado para aumentar su eficiencia
165
Columna cromatográfica
166
Columna cromatográfica
Filtro de la columna
Unión de la columna
167
Fases estacionarias
Tamaños
• Fase normal
o Sílice
o Alúmina
o Amino (-NH2)
o Ciano (-CN)
o Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
168
Fases estacionarias
Los soportes más empleados en cromatografía de adsorción 
y de reparto son:
• Fase normal
o Sílice
o Alúmina
o Amino (-NH2)
o Ciano (-CN)
o Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
169
Fases estacionarias
• Fase inversa
o C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)
o C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)
o C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
170
Fases estacionarias
https://www.biriden.com/es/productos/cromatografos-hplc-y-uhplc/sugar-sh1011
171
Fase estacionaria
172
Fase estacionaria
173
Fase estacionaria
174
Fase estacionaria
175
Fase estacionaria
176
Columnas de intercambio iónico.
• Son a base de aminas cuaternarias (aniónicas) o grupos 
sulfona (catiónicas).
177
Columnas de intercambio iónico.
178
Detector.
• Los principales detectores empleados en HPLC son:
o UV/Vis
o Arreglo de diodos
o Índice de refracción
o Fluorescencia
o Conductividad
o Dispersión de luz
o Espectrometría de masa
179
Comparación de los detectores.
180
Detector UV-Vis
• Es el más utilizado.
• Ideal para compuestos que absorben en la región UV-
Vis
• Utiliza lámparas de deuterio, xenón o wolframio
• Trabajan desde 190 a 900 nm
181
Detector UV-Vis
λ de corte de disolventes usados en HPLC
182
Detector de arreglo de diodos
• Permite registrar la absorbancia simultánea en todo el intervalo
UV/VIS.
• La muestra es atravesada por luz blanca (todas las λ)
• El policromador dispersa la luz en las diversas λ que la
componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos.
• En cada diodo incide una λ diferente, que manda la información
al sistema de análisis de datos.
183
Detector de arreglo de diodos
Posibilidades de un detector de arreglo de diodos.
184
Detector de índice de refracción
• Se miden variaciones en el índice de refracción del
eluyente con respecto al de la fase móvil.
• Sólo se pueden usar en elución isocrática.
• Responden casi todos los solutos pero con baja
sensibilidad.
• Son muy sensibles a las variaciones de temperatura.
• Deben estar con temperatura controlada.
185
Detector de índice de refracción
186
Detector de Fluorescencia
• Detector selectivo.
• Es para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados
• fluorescentes.
• Se seleccionará la λ de excitación y la λ de emisión.
• Son de alta sensibilidad.
• La fase móvil no interfiere en la detección, por lo que se
puede hacer gradiente de elución.
187
Detector de Conductividad
• Son detectores basados en una respuesta diferencial y no
absoluta.
• Empleados fundamentalmente en cromatografía de
• intercambio iónico.
Desventajas:
• Baja sensibilidad
• Sensibles a impurezas de la fase móvil.
188
Detector de dispersión de luz
• Método destructivo.
• El eluyente se evapora bajo una corriente de N2 dejando
una nube de finas partículas sólidas que entran en la zona
de detección.
• Las partículas se detectan por la luz que procede de un
diodo láser y llega al fotodetector por dispersión.
• En la FM no puede haber sales.
• Para controlar el pH sólo se pueden usar tampones
volátiles en la fase móvil.
• Empleados fundamentalmente en cromatografía de
intercambio iónico.
189
Detector de dispersión de luz
Restricción:
• Sólo se aplica a solutos mucho menos volátiles que la FM.
190
Detector Electroquímico
• Detector sensible.
• Detector selectivo.
• Se basa en una respuesta amperomética del analito que
permanece normalmente a potencial constante.
• Muy utilizado en la detección de iones o moléculas que
puedan oxidarse o reducirse en el intervalo de
potenciales de trabajo del detector.
• Se deben usar sales en la fase móvil para obtener la
fuerza iónica adecuada.
• La fase móvil debe ser acuosa fundamentalmente.
191
Detector Electroquímico
192
Sistema de registro
Registrador:
• Costoso
• Lento y con pobre calidad de resultados.
Integrador:
• Basado en los primeros microprocesadores
Sistema computarizado:
• Permite optimizar la calidad de los resultados y
reprocesar cuando se necesite.
• El Software también permite el control del instrumento
por medio de la computadora.
• No es necesario imprimir los resultados para poder
analizarlos.
193
Sistemas acoplados
HPLC-FTIR
• El sistema de espectroscopía infrarroja cercana se acopla
al efluente del sistema cromatográfico.
• Se puede utilizar como detector selectivo en el intervalo
de longitudes de onda del infrarrojo.
• O puede ser detector selectivo a una longitud de onda
específica.
• Su aplicación no es muy extendida ya que se deben
utilizar disolventes que no absorban la longitud de onda
deseada.
194
Sistemas acoplados
HPLC-MS
• El espectrómetro de masas se acopla al sistema
cromatográfico.
• Los modos más comunes de introducción de muestra es:
o Electrospray (ESI)
o Ionización química a presión atmosférica (APCI)
195
Espectrometría de masas por electrospray (ESI)
• Desarrollada a mediados de los años 80
• La muestra líquida se introduce a través de un
capilar al que se aplica un elevado potencial (± 3-5
kV).
• Se produce un spray de microgotas cargadas.
• Las repulsiones electrostáticas generadas dividen a
las microgotas provocando desolvatación y
evaporación de los iones.
• La fuente ESI trabaja a flujos entre 0.5 y hasta 400
µL/min
• Es una técnica de ionización suave (poca
fragmentación).
196
HPLC-MS
ESI
197
HPLC-MS
ESI
198
HPLC-MS
ESI
• Ventajas
o Proporcionan información del peso molecular.
o Adecuado para analitos volátiles y no volátiles
o Es la opción para analitos polares y iónicos
o Buena sensibilidad
o Puede utilizarse con especies de peso molecular alto
(iones con carga múltiple.
• Desventajas
o No proporciona información de la fragmentación.
199
HPLC-MS
ESI
200
HPLC-MS
Electrospray vs Electroionización
Electrospray Electroionización
Analitos no volátiles Analitos volátiles
Ideal para analitos polares Para analitos ligeramente o 
iónicos polares o no polares
Iones producidos Iones producidos en fase
Directamente de la vapor
disolución
Poca fragmentación Mucha fragmentación
Excelente para LC-MS Excelente para GC-MS
201
HPLC-MS
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
• Desarrolladas a mediados de los años 70 .
• La fase móvil se introduce a través de una cámara de
vaporización cilíndrica que se encuentra a
temperatura elevada, vaporizando el efluente
cromatográfico.
• El analito debe ser lo suficientemente volátil para
estar en fase vapor.
• La ionización se induce aplicando un elevado voltaje
(± 3-5 kV) a un electrodo en forma de aguja, lo que
produce una corriente de hasta 10 μA.
202
HPLC-MS
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
• Se origina un plasma de iones de la fase móvil que
provoca un proceso de ionización química.
• La ionización química a presión atmosférica es una
técnica de ionización suave,
• En algunos casos además de los iones
correspondientes a la molécula protonada o
desprotonada pueden aparecer fragmentos en el
espectro.
203
HPLC-MS
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
204
HPLC-MS
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
205
HPLC-MS
HPLC-MS (APCI)
• Ventajas
o Información del peso molecular
o Menor fragmentación (en comparación con ESI).
o Bueno para analitos moderadamente volátiles y 
poco polares (en comparación con ESI).
o Permite flujos de 1 mL/min o más.
• Desventajas
o Puede haber problemas derivados de la 
degradación térmica del analito
o Requiere el uso de buffers volátiles.
206
HPLC-MS
(APCI)
207
Ejercicio
Se desea cuantificar el THC de una muestra de 
cannabinoides
¿qué método utilizarías?
208CUANTIFICACIÓN
• El área bajo la curva debe ser directamente proporcional 
a la concentración del analito.
Límite de detección
• Cantidad o concentración mínima de analito que puede 
ser detectada por un método analítico determinado. La 
señal obtenida por el analito debe diferenciarse del 
ruido de fondo
• A partir de una curva de calibración se puede tomar 
como tres veces la desviación estándar.
• Generalmente se toma como tres veces la señal el ruido 
de fondo
209
CUANTIFICACIÓN
Límite de cuantificación
• Es la cantidad mínima de analito que se puede 
cuantificar con fiabilidad. 
• A partir de una curva de calibración se puede tomar 
como 5 ó 10 la desviación estándar
• También se puede tomar como 10 veces la relación señal 
ruido
210
CUANTIFICACIÓN
211
CUANTIFICACIÓN
Características del método analítico
• Exactitud (Veracidad). Estadísticamente, el valor 
medido es el valor real
• Precisión. Todas las mediciones dan el mismo valor 
estadístico
• Repetibilidad. Diferentes mediciones realizadas en 
las mismas condiciones dan el mismo valor 
estadístico
• Reproducibilidad. Diferentes mediciones realizadas 
en diferentes condiciones dan el mismo valor 
estadístico
212
CUANTIFICACIÓN
Método R & R
• Este método estudian la dispersión producida por el 
propio sistema de medición (repetibilidad) y la 
dispersión producida en diferentes condiciones de 
operación (reproducibilidad).
ROBUSTEZ
213
CUANTIFICACIÓN
Factor de respuesta
• Se inyecta una disolución estándar de concentración conocida 
(CE). Con el área (AE) obtenida del cromatograma, se obtiene el 
factor de respuesta.
• Se analiza en las mismas condiciones la muestra problema
• Se obtiene el área bajo la curva de la muestra problema (Am).
• Con el área y el factor de respuesta anteriormente calculado, se 
calcula la concentración de analito en la muestra problema 
(Cm).
R
m
m
F
A
C =
𝐹𝑅 =
𝐴𝐸
𝐶𝐸
214
CUANTIFICACIÓN
Factor de respuesta
• Ventajas
o Se asume un comportamiento lineal de la concentración 
de analito y su respuesta. 
o La ordenada al origen se considera 0.
o Método rápido.
o No se necesita mucha cantidad de estándar.
• Desventajas
o Válido a concentraciones de analito cercanas a la del 
estándar.
o Proporciona concentración aproximada.
215
CUANTIFICACIÓN
Ejemplo
Se desea cuantificar metilpalmetoleato y meltilpalmitato
presentes en una mezcla de ácidos grasos. 
Para ello se formó el derivado metilsililado utilizando 
MSTFA (N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide).
Se inyectó una disolución estándar conteniendo una 
mezcla de metilpalmetoleato y metilpalmitato, ambos a 50 
µg/ml
La muestra problema se inyectó en las mismas 
condiciones. Los resultados se dan a continuación:
¿cuál es la concentración de cada analito?
216
Disolución estándar
to = 0.1 min
217
*
218
219
CUANTIFICACIÓN
Factor de respuesta relativa.
• Se tiene el mismo principio de factor de respuesta
• Se utiliza un estándar interno (EI)
• Analito que no se encuentra en la muestra 
problema
• Es de naturaleza similar a los analitos de la 
muestra problema
• Su separación cromatográfica de otros 
componentes de la muestra está bien definido.
220
CUANTIFICACIÓN
Factor de respuesta relativa.
• La cuantificación se hace utilizando la relación de
áreas y la relación de concentraciones.
𝐹𝑅 =
ൗ
𝐴𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜
𝐴𝐸𝐼
ൗ
𝐶𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜
𝐶𝐸𝐼
𝐶𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
ൗ
𝐴𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝐸𝐼
𝐹𝑅
∗ 𝐶𝐸𝐼
221
CUANTIFICACIÓN
Factor de respuesta relativo
• Ventajas
o Se disminuyen errores por tratamiento de muestra
o Método rápido.
o No se necesita mucha cantidad de estándar.
• Desventajas
o Válido a concentraciones de analito cercanas a la del 
estándar.
o Proporciona concentración aproximada.
222
CUANTIFICACIÓN
Mismo ejemplo
Estándar interno: Metillaurato, 
C = 50 µg/mL
tR = 14.002 min
A = 33 584
¿cuál es la concentración de cada analito?
223
CUANTIFICACIÓN
*
224
CUANTIFICACIÓN
225
CUANTIFICACIÓN
Curva de calibración.
• Se analiza el estándar de analito a cinco 
concentraciones diferentes. 
• Se calcula la regresión lineal entre la respuesta del 
detector y su concentración.
• La concentración del analito en la muestra problema 
se calcula por interpolación.
bxay +=
226
Curva de calibración.
C (ng/mL) Área
10 5,000 
50 24,800 
100 53,200 
150 74,100 
200 110,110 
227
Curva de calibración con estándar interno.
• Se selecciona un estándar con características
similares al analito a cuantificar (EI).
• Este EI se debe separar cromatográficamente del
analito de la muestra problema.
• A los niveles de la curva de calibración y a la
muestra problema se les añade la misma cantidad de
estándar interno.
• Se procesan las muestras y se analizan
cromatográficamente.
• Se traza la recta de calibración y se calcula la
concentración por interpolación.
228
Curva de calibración con estándar interno.
C (ng/mL) Área C EI (ng/mL) Área EI
10 6,000 100 5,000 
50 23,200 100 4,900 
100 53,200 100 5,300 
150 74,100 100 4,900 
200 112,000 100 5,500 
Rel C/CEI Rel A/AEI
0.1 1.2 
0.5 4.7 
1.0 10.0 
1.5 15.1 
2.0 20.4 
229
CUANTIFICACIÓN
Curva de calibración por adiciones patrón.
• Se preparan cinco alícuotas de muestra problema.
• A todas se les agrega el estándar de calibración.
• Se procesan las muestras y se analizan 
cromatográficamente.
o La ordenada al origen se considera la concentración 
del analito en la muestra.
o Método más preciso.
• Desventajas
o Se necesita gran cantidad de muestra.
o Por cada muestra, se necesita una curva de 
calibración
230
Curva de calibración por adiciones patrón.
C (ng/mL) Área
10 23,200 
50 53,200 
100 74,100 
150 108,000 
200 130,000 
ng/mL 3.37
84.557
20800
==C
231
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