BMTM_U2_EA_JEMP - Jessica Mendoza (7)

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Universidad Abierta y a Distancia de México
División de Ciencias de la Salud, Biológicas y Ambientales
Ingeniería en Biotecnología
Microbiología y Taxonomía Microbiana
Evidencia de Aprendizaje 
Medios de cultivo y técnicas microbiológicas 
16 de mayo de 2021
Cuadro comparativo 
	Medio de cultivo 
	Definición
	Características 
	Ejemplo 
	Ventajas y desventajas 
	Medio basal 
	Son los usados para el cultivo de bacterias que no necesitan un medio con carteristas especiales. 
	· Una fuente de carbono como glucosa
· Agua
· Sales 
· Una fuente de aminoácidos y nitrógeno 
	· Caldo de nutrientes 
· Agar de nutrientes 
· Crecimiento de Staphylococcus y Enterobacteriacecae 
	· Ventajas: Permite el cultivo de microorganismos en general 
· Generalmente disponible
· Económico
· Desventajas: No se adapta a las necesidades especiales de crecimiento
	Medio enriquecido 
	Es un medio basal al que se le añade sangre, plasma o huevo. 
	· Es un medio con las características del basal 
· El enriquecimiento dependerá del cultivo de interés y de la duración del mismo 
	· Agar sangre para Streptococcus 
· Lowenstein-Jensen 
	· Ventajas: Permite el cultivo de los microorganismos mas exigentes y con requerimientos especiales.
· Algunos de los aditamentos o condiciones de cultivos pueden encarecer el costo 
	Medio selectivo 
	Favorece el crecimiento de alguna bacteria en particular al inhibir el crecimiento de bacterias no deseadas 
	· Se puede añadir antibiótico contra el microorganismo no deseado 
· La ausencia o presencia de aminoácidos y otros nutrientes puede detener el crecimiento bacteriano 
	· Agar MacConkey
· Lowenstein-Jensen 
· Medio tellurite 
	· Ventajas: Permite cultivar exclusivamente el microorganismo de interés además de identificar microorganismos resistentes
· Puede ser costoso 
	Medio indicador o diferencial 
	Incluye un indicador en el medio que es modificado bioquímicamente por un microorganismo en especifico
	· Puede incluir rojo neutral, rojo fenol, eosina, azul de metileno etc. 
· Ayuda en la detección de la presencia de un microorganismo 
	· Agar sangre 
· Agar MacConkey 
	· Ventajas: Permite identificar la presencia de cierto microorganismo, ayudando en el diagnostico 
· Desventajas: La interpretación de los resultados puede ser un poco mas compleja.
	Medio de transporte 
	Medio usado cuando la muestra no puede ser cultivada inmediatamente después de la toma. 
	· Mantienen la viabilidad de todos los organismos sin alterar su concentración 
· No contiene carbono, nitrógeno y factores de crecimiento organismos para detener la replicación 
· No contienen oxigeno molecular si se transporta anaerobios 
	· Cary-Blair
· Amies 
· Stuart 
	· Ventajas: Permiten que el análisis de una muestra recolectada en un punto donde no es posible la investigación sea adecuado al mantenerla en condiciones optimas
· Desventajas: Requieren condiciones especiales para el transporte de los microorganismos
	Medio de almacenamiento 
	Es usado para el almacenamiento de bacterias por un largo periodo de tiempo 
	· Contiene los nutrientes necesarios 
· Es almacenado a bajas temperaturas 
	· Medio egg saline 
· Chalk cooked meat broth 
	· Ventajas: Permite conservar los microorganismos para su análisis posterior o conservar una estirpe genética de utilidad 
· Desventajas: No siempre son muy eficientes en la conservación genotípica de los microorganismos 
Cuadro informativo 
	Método de conservación 
	Definición 
	Características 
	Conservación a largo plazo 
	Conservación por congelación 
Se congelan las células en una suspensión con crio protector y se almacena a temperaturas negativas. Es el mejor método de conservación. 
	1. Edad celular: Se prefiere usar células maduras al inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento. 
2. Velocidad de congelación: Es mejor que sea rápida
3. Almacenamiento: La temperatura debe ser lo mas baja posible, en nitrógeno liquido o en la fase gaseosa de este. Si se usa congelador este debe estar a -70°C
4. Contenedor: Crio tubos que son de plástico esterilizable, resistentes a la congelación y cierran herméticamente. 
5. Agentes crio protectores: Previenen el daño celular, como el glicerol al 15%. 
	
	Conservación por liofilización 
No se da crecimiento celular, consiste en la remoción de agua que logra la estabilidad genética. Se congela el agua libre celular y se elimina mediante el vacío. Se utilizan liofilizadores. El producto puede almacenarse a temperatura ambiente. 
	1. Tipo de microorganismo: Los que contienen mas agua como hongos filamentosos no pueden ser almacenados con esta técnica 
2. Concentración celular: Se obtienen mejores resultados con concentraciones de 109 célula/ml
3. Temperatura: Durante la sublimación del agua debe ser -50°C
4. Grado de deshidratación: Debe ser lo mas baja posible 
5. Atmosfera del tubo: Las células se almacenan en tubos al vacío para evitar contaminación e hidratación 
6. Almacenamiento: Temperatura entre 0 y 18°C en la oscuridad 
	Métodos alternativos 
	Conservación por transferencia periódica
Se almacena el microorganismo en forma de cultivo activo. Se transfieren a un nuevo medio según sea necesario. Es un método malo para la estabilidad genética. Se recomienda disminuir la cantidad de inoculo, rebajar la proporción nutricia y almacenar a 4°C. La cultivación se puede dar muy fácilmente. 
	1. Puede almacenarse a temperaturas bajas, en aceite mineral o agua
2. Es el peor método para la estabilidad genética 
3. El riesgo de contaminación y cambio genético se incrementa con cada transferencia 
4. Se requiere espacio grande ara el almacenamiento 
5. Se puede mantener la viabilidad por muchos años 
6. La recuperación de los cultivos es fácil 
	
	Conservación por suspensión en agua destilada 
Se puede usar en hongos filamentosos, levaduras y algunas bacterias. 
	1. Altos porcentajes de viabilidad 
2. Se pueden usar crio tubos 
3. La concentración celular no debe ser superior a 105
4. La estabilidad de caracteres morfo y fisiológicos es buena 
	Métodos restringidos 
	Desecación en papel filtro
Se utiliza papel absorbente como Whatmann 3 que es impregnado con una solución densa en contenido celular y se seca en condiciones estériles 
	1. Método sencillo 
	
	Desecación en suelo, arena y silicagel 
Las células son añadidas a estos sustratos y son desecadas. Se conservan bastante bien los microrganismos que esporulan 
	2. Se conservan bien los microorganismos productores de esporas 
	
	Desecación en sal gorda 
Se mezclan las células con sal y se dejan secar. No se desecan completamente, pero se detiene la multiplicación. 
	3. Técnica sencilla de bajo costo
4. Poca contaminación de subcultivos
5. Limitada al número de microorganismos 
6. No debe ser usado como único método de conservación 
Ensayo
Técnicas de cuantificación celular 
Durante el trabajo en laboratorio, en el caso particular del laboratorio de microbiología, es necesario en ocasiones conocer la cantidad de microorganismos presentes ya sea en la muestra fresca o en el cultivo realizado a partir de una muestra. El conteo de organismos tan pequeños como son los parásitos, bacterias y hongos se vuelve necesario en diversos contextos, desde la realización de una investigación sobre la eficacia de un nuevo tratamiento antimicrobiano, como para el diagnostico de una enfermedad y la toma de decisiones terapéuticas sobre la misma. 
Actualmente, se disponen de diversas tecnologías que felicitan la realización de la tarea, de las cuales se selecciona la mas adecuada de acuerdo a diversos factores como la habilidad del técnico, el microrganismo en particular y el propósito de la cuantificación. 
Recuento en preparaciones teñidas 
Es una de las técnicas mas comunes y sencillas disponibles, además de contar con la ventaja que el costo de su realización es bajo. Consiste en la tinción de la preparación microbiológica, por ejemplo, Ziehl Nielsen para la tinción de bacilos acido alcohol resistente, donde la muestra de esputo se deposita sobre la laminilla y se realizala tinción. Los materiales requeridos cambian en función del microorganismo a teñir, pero de manera general se requiere el colorante, la laminilla, microscopio y aceite de inmersión. Siguiendo el caso de Ziehl Nielsen, esta se realiza para el diagnóstico de tuberculosis, por ejemplo, donde se buscan los bacilos de Mycobacterium tuberculosis en la preparación y se realiza el conteo de los mismos por campo, dando una clasificación clínica según el resultado del conteo. 
Contadores electrónicos de partículas 
Tiene base en el principio Coulter, donde el campo eléctrico es usado para el conteo y determinación de la dimensión de las partículas que se encuentran en el liquido conductor. Permite conocer el recuento y concentración de las células o partículas de la muestra. Es una técnica exacta, reproducible, veloz y empleable para diversos microorganismos. Las partículas son colocadas en una suspensión de Isoton II, se colocan dos electrodos, uno al interior del vaso con la solución y otro en el tubo donde se coloca el vaso y se aplica una diferencia de potencial. Con esto se determina la impedancia entre los dos electrodos. Es una técnica mas compleja y costosa, pues requiere la compra del contador de partículas. Son necesarias la muestra, el contador y equipo especializado para su realización. 
Determinación del peso húmedo 
Es una técnica sencilla, donde a partir de una muestra de suspensión se puede calcular el número celular. La suspensión con células es pesada cuando se retira por medios físicos como la centrifugación o filtración el contenido celular. Es necesario en ocasiones realizar un ajuste, pues cierta cantidad de liquido puede quedar detenida en el espacio intercelular, siendo esta su principal desventaja. También es posible hacer uso de líquidos especiales como soluciones de polímeros no iónicos, que por su naturaleza no atraviesan la pared bacteriana y por tanto no queda atrapado en el espacio intercelular. Para la realización de este procedimiento son necesarias la muestra, el líquido para la suspensión, una centrifuga o filtro y la báscula.
Determinación del peso seco 
Es también un método sencillo y económico, donde se determina la cantidad de biomasa con el peso seco por gramo o ml de muestra. Suele utilizarse con cultivos puros. La muestra pura es disecada en estufa y el peso es comparado antes y después de la remoción del líquido, determinando así la cantidad de biomasa. Son necesarias la muestra, un contenedor, la estufa y una báscula. 
Método de extensión en placa
Es un método considerablemente rápido, donde se realizan soluciones seriadas de las que son extendidas 100 microlitros en placas que son incubadas hasta que las colonias son apreciables para ser contadas. Son necesarias la muestra, las placas y las necesidades de cultivo propias del microorganismo. 
Técnica de vaciado en placa
En esta técnica se inocula 1 ml de la solución celular en cada caja de Petri, puede usarse una pipeta estéril. A la solución se le añaden 20 ml del medio de fundido y se homogenizan las dos soluciones para ser incubadas. Se hace uso de un testigo de esterilidad y se incuban las cajas. Se seleccionan las que sean representativas, es decir que contengan entre 25 y 250 UFC.
Turbidez 
De acuerdo con la ISO la turbidez es la reducción de transparencia en un liquido por partículas no disueltas distintas al líquido. Esta es medida haciendo uso de técnicas ópticas, a través de la dispersión y absorción de energía lumínica. Según la ley de Lambert Ver, esta es proporcional a la concentración de partículas. Es una técnica que permite conocer el crecimiento bacteriano. Los avances en las técnicas ópticas han permitido que esta sea una medición cada vez más precisa que además permite conocer el crecimiento bacteriano. Para su realización, son necesarias la solución y un espectrofotómetro, que, al ser un equipo costoso, hace que la técnica misma sea costosa. 
Número más probable
Esta técnica hace uso de la estimación estadística, donde se estima la densidad de la población microbiológica. Se basa en la ausencia o presencia en replicas de diluciones consecutivas de algún atributo particular de la población, que se compara con una tabla probabilística. Se colectan las muestras, se extraen los microorganismos, se colocan en 9 ml de solución salina y se diluyen en serie, pasando 1 ml a 9 ml de NaCl al .85%, repitiendo la disolución hasta alcanzar lograr una disolución de 10-7. Se pasa a una caja Petri 5 microlitros de disolución de distinta concentración a cierta área de la caja, se deja cultivar. Los resultados se comparan con la tabla probabilística y se obtiene el numero mas probable de microorganismos. Son necesarias la muestra, los medios de cultivo y los materiales de disolución. Es una técnica practica y económica. 
Medida de consumo de nutrientes 
Es un método indirecto donde se realiza la medición del consumo nutricio conocido en el medio de cultivo o de la producción de algún metabolito, como son el consumo de oxígeno y de carbono y la producción de ácidos en el medio. En el caso de los gases, se hace uso del respiro metro de Wartburg. Es un método del que no se encontró mucha información disponible, y del que, dependiendo del metabolito o nutriente medido, será el material necesario en particular. 
La diversidad de métodos para estimar o conocer la cantidad de microorganismos presentes en la muestra permiten que el ideal sea usado según el caso particular y las necesidades de la investigación. Existen aquellos que son relativamente sencillos y que he realizado con anterioridad, así como existen también los que hacen uso de equipo sofisticado, cuyo precio me lleva a pensar que este tipo de métodos no están disponibles en regiones marginadas, dificultando el proceso de investigación y diagnostico de enfermedades causadas por microorganismos y truncando la realización de investigación en estas áreas. 
Referencias
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