BFPA_U4_EA - JESSICA VERONICA MENDOZA PRADO (17)

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Universidad Abierta y a Distancia de México
División de Ciencias de la Salud, Biológicas y Ambientales
Ingeniería en Biotecnología
Fisiología de plantas y animales 
Evidencia de aprendizaje
Unidad 4
 
1 de junio de 2022
Papaína 
Proceso fisiológico Ilustración 1Tomado de Liu et al. (2018) 
La papaína es una proteína globular de una única cadena de aminoácidos perteneciente a la superfamilia de papain like cysteine proteases (PLCP), con un peso molecular de 23406 DA que consta de 212 aminoácidos con cuatro grupos disulfuro y residuos de actividad catalítica relevante en las posiciones Gln19, Cys25, His158 e His159. Es una cisteína hidrolasa que es estable y activa en condiciones muy variables, incluso en elevadas temperaturas, lo que le ha valido para ser de interés biotecnológico, así como industrial. Las proteasas de esta familia tienen la peculiaridad de encontrarse en la mayoría de los organismos, incluidos virus, bacterias, levaduras, protozoarios, plantas e incluso animales. 
Producción fisiológica 
Se producen las proteínas de esta familia primeramente como precursores inactivos que van acompañados de un péptido señal que les sirve para para la secreción proteica, así como de un dominio auto inhibitorio para prevenir la degradación accidental de otras proteínas. Ilustración 2Estructura de la papaina
En los animales, las PLCP tienen una función importante en la degradación terminal de proteínas señalizadas con auto lisosomas a nivel liposomal. Aunque se desconoce aún a ciencia cierta su función o si tienen más funciones en las células animales. 
En el caso de las plantas, cumplen distintas funciones a nivel de germinación y desarrollo, inmunidad, senescencia y respuesta a estrés. No se han estudiado en todas las plantas las propiedades fisiológicas de esta familia, sin embargo, se reconocen algunos ejemplos de función presentados en la siguiente tabla.
	PLCP
	Especie en la que se ha encontrado 
	Función 
	EP-B
	Cebada 
	Induce la expresión en las semillas germinantes, degrada el endospermo para que las plantas tengan acceso a nitrógeno. 
	Pap-1
	Cebada 
	Se relaciona con la movilización proteica durante la germinación, retrasa procesos de senescencia. 
	Cath B 
	Arabidopsis 
	Ayuda en la respuesta al estrés abiótico y estrés del retículo endoplásmico. 
	Pap-1-6-9
	Cebada 
	Inhibición de la catepsina, incrementa la embriogénesis. 
	SAG12-H1RD21
	Arbil del hule 
	Se expresa altamente en hojas senescentes. 
	Rcr3
	Tomate 
	Provee resistencia contra Phytophthora infestans, Cladosporium fulvum y Globodera rostochiensis. 
Adaptado de Liu et al. (2018)
Extracción 
Existen actualmente diversos métodos disponibles para la extracción de la enzima del fruto de la papaya, variando entre ellos por el costo, tiempo, disponibilidad, así como nivel de pureza de la enzima. En el ámbito biotecnológico, la papaína se utiliza para la protección de plantas contra ataques de insectos, ablandamiento de la carne, exfoliante etc. Va más allá de una única industria o campo de aplicación, por lo que las técnicas disponibles han ido variando en función de las necesidades de los productores. A continuación, se describen brevemente las metodologías más representativas y populares. 
Extracción del látex del fruto de papayaIlustración 3Tomado de indiamart.com
1. Se colecta el látex realizando cortes en la fruta con un aparato de acero inoxidable, sin superar los 2 mm de profundidad para prevenir que el jugo se mezcle con el látex y disminuya su calidad. 
2. El látex es colectado dentro de los primeros 2 minutos ya que se seca muy rápidamente además de que puede ensuciarse por polvos y otros contaminantes. 
3. Antes del almacenado del látex, 0.3M NaOH se añade para prevenir la oxidación. 
Extracción de la cáscara de papaya 
La enzima es extraída principalmente del látex de la cascara de la fruta inmadura, pues se encuentra ahí con una concentración mayor. Además, al ser un producto de desecho, representa un ingreso extra. 
1. La cáscara se corta en piezas pequeñas para ser secadas a 55°C hasta disminuir el peso agua al 10%. 
2. Las cáscaras deshidratadas son molidas para ser remojadas en agua destilada. 
3. Se centrifuga y filtra para eliminar otros compuestos. 
Purificación de la papaína por precipitación 
1. Con el extracto anterior, se añade sulfato de amonio que interactúa con el agua y otros solutos manteniéndolos en precipitados. 
2. Puede usarse también cloruro de sodio, solución alcoholada, e incluso etanol, que ha demostrado al 70% obtener una pureza del 82.31% de la papaína. 
Partición de triple fase 
Es un método sencillo que ha incrementado por mucho la pureza de la proteína al final del proceso de purificación además de conservar de forma considerable la actividad catalítica de la enzima. 
1. Se almacenan a -20° C los extractos de látex de la papaya inmadura 
2. Se descongelan hasta los 4°C y se diluyen en agua destilada en razón 1:.5
3. Se centrifuga la solución a 2500 rpm por 10 minutos a 4°C
4. Se precipitan los sobrenadantes con una solución al 20% de (NH4)2SO4 y se vuelve a centrifugar por 10 minutos a 2500 rpm
5. Se precipitan nuevamente los sobrenadantes con una solución al 60% de (NH4)2SO4 y se centrifugan por 10 minutos a 2500 rpm 
6. Se realiza diálisis del precipitado a 4°C con ayuda de un buffer de fosfato de sodio 30Mm, con pH de 6.5 y que contenga L-cisteína 2Mm
7. Se añade nuevamente (NH4) SO4 al 40% y se mezcla con ayuda de un agitador vortex 
8. Se añade butanol en razón 1:.75 y se incuba por 45 min a 25°C para después centrifugar a 4000 rpm por 10 min a 20°C
9. Se realiza la separación de las 3 fases: se remueve la parte superior que consiste en butanol, se remueve la parte intermedia que consiste en papaína con menor actividad y finalmente se extra la papaína en su fase de sal acuosa
10. Finalmente, se dializa por una noche con un buffer de sodio fosfato 30mM, pH 6.5 que contenga L-cisteína. 
Escualeno 
El escualeno es una biomolécula lipofílica que pertenece a la clase química de los triterpenos. Se compone de seis unidades de isopreno, siendo un compuesto isoprenoide de 30 carbonos con seis dobles enlaces (C30H50). Ilustración 4 Síntesis de esteroles. Tomado de Harker (2003)
En su forma macroscópica es un aceite inoloro, incoloro y líquido. Se le dio el nombre de escualeno por ser aislado por primera vez del aceite de hígado del tiburón Tsujimoto (Squalus milsukurii), con investigaciones más recientes demostrando la existencia del compuesto también en el reino vegetal. 
Proceso fisiológico 
En las células eucariotas es un metabolito intermedio en la ruta metabólica de biosíntesis de esteroles, siendo catalizada la formación por la enzima Escualeno Sintasa, misma que se encuentra asociada con la membrana del retículo endoplásmico. La síntesis se da en una reacción de dos pasos que comienza con dos unidades de farnesil difosfato que son convertidos en 2,3-epoxiescualeno, que es el precursor tanto animal como vegetal. 
Los mecanismos fisiológicos que impulsan su síntesis son muy variados, ya que juega un papel crucial en el desarrollo de los organismos vegetales y animales, resaltando entre ellos su papel antioxidante y su alta capacidad de erradicación de radicales libres. 
	Reino 
Animal. 
	Función 
	Descripción 
	
	Lipoproteínas 
Transporte de triglicéridos 
	El escualeno se presenta en el plasma embebido en las lipoproteínas, particularmente en las de muy baja densidad, siendo su cantidad correlacionada con la abundancia de triglicéridos. 
	
	Membrana celular 
Protección 
	Constituye aproximadamente el 12% de los lípidos de superficie, sobre todo en la piel, probablemente debido a la falta de cabello en el humano y la necesitad de contrarrestar los efectos oxidantes de los rayos UV. 
	
	Esteroides 
	Como precursor, tiene un papel importante en el resto de los esteroides que cumplen distintas funciones en los organismos, en membrana para estructura, como hormonas, como precursores para síntesis de ácidos biliares.
	Vegetal 
	Organización de membrana 
	Junto conlípidos no saturados, el escualeno regula las propiedades físicas, difusión y organización dinámica de la membrana. Actúa como inhibidor del derrame de electrones en membranas alcalinas y tiene influencia en la síntesis de ATP. 
	
	Almacén para biosíntesis 
	El escualeno almacena se usa como precursor de moléculas importantes como el B-sitosterol, campesterol y estigmasterol, que son precursores de hormonas de crecimiento y de adaptación de estrés biótico. 
Extracción Ilustración 5 Presencia del escualeno en la membrana eucariota. Tomado de Micera (2020)
La fuente más importante de escualeno es el hígado de tiburón de profundidades, en los que figuran varias especies. La concentración de escualeno varía, pero en el mejor de los casos, hasta el 60% del peso del hígado es escualeno. La metodología más común para la extracción de este escualeno es el uso de dióxido de carbono supercrítico. Dado que ya no es promovido el uso de escualeno proveniente de hígado de tiburón por sus implicaciones ambientales y que puede ser extraído también de plantas, encontrar bibliografía que redacte como realizar la extracción del escualeno del aceite fue una tarea compleja, pues se trató de bibliografía vieja o de origen asiático, que por traducciones incompletas resulta imposible de comprender. Describo la más citada a continuación.
Ilustración 6 Laboratorio para la extracción de escualeno del aceite de hígado. Tomado de Catchpole et al. (1997)
En un laboratorio que procesa 5mL/min de aceite se cuenta con un sistema que cuenta de un compresor de alta presión que recircula el dióxido de carbono, una columna aislada consistente de tres secciones con un diámetro interno de 56 mm y una altura de 2.5m y tres secciones de temperatura controlada, un pistón de alta presión para la circulación del aceite y dos vasos de separación para la recuperación del aceite y de los aromas a pescado. 
1.Se pasa dióxido de carbono supercrítico a través de la columna aislada con tres diferentes estaciones de control de temperatura, a una presión de .5 bar. 
2. Una vez estabilizado el flujo del gas, presión y temperatura, el aceite de hígado de tiburón fue introducido en la primera parte de la columna (H1) a un flujo volumétrico controlado. 
3. El líquido de reflejo fue bombeado a la parte superior de la columna a un ritmo conocido. 
4. El refinado es recolectado a intervalos de tiempo regulares, drenando el reservorio líquido. 
5. En la primera etapa de separación, se recupera el escualeno. Esto es a una presión de 90 bar y 313 K. 
6. En el segundo, se eliminan los olores de pescado. Esto es a una presión de 60 bar y 313K.
7. El dióxido de carbono es reciclado hacia la columna. 
Referencias 
Catchpole, O. J., von Kamp, J.-C., & Grey, J. B. (1997). Extraction of Squalene from Shark Liver Oil in a Packed Column Using Supercritical Carbon Dioxide. Industrial & Engineering Chemistry Research, 36(10), 4318–4324. doi:10.1021/ie9702237 
Harker, M. (2003) Enhancement of seed phytosterol levels by expresión o fan N-terminal truncated Hevea brasiliensis (rubber tree). Recuperado de https://www.researchgate.net/figure/Schematic-representation-of-the-sterol-biosynthesis-pathway-in-plants-Solid-lines_fig4_6650929
Jain, J. (2020) Review on isolation and purification of papain enzyme from papaya fruit. International Journal of Engineering Applied Sciences and Techonology, vol 6 (6) 
Kahina Hafid, James John, Taha Mansour Sayah, Rubén Domínguez, Samira Becila, Melisa Lamri, Amira Leila Dib, José M. Lorenzo, Mohammed Gagaoua, (2020) One-step recovery of latex papain from Carica papaya using three phase partitioning and its use as milk-clotting and meat-tenderizing agent, International Journal of Biological Macromolecules, Volume 146, Pages 798-810,ISSN 0141-8130
Liu, H., Hu, M., Wang, Q., Cheng, L., & Zhang, Z. (2018). Role of Papain-Like Cysteine Proteases in Plant Development. Frontiers in plant science, 9, 1717. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.01717
Lozano-Grande, A. (2018) Plant sources, extraction methods and uses of squalene. International Journal of Agronomy. Recuperado de https://www.hindawi.com/journals/ija/2018/1829160/
Nitsawang, S., Hatti-Kaul, R., & Kanasawud, P. (2006). Purification of papain from Carica papaya latex: Aqueous two-phase extraction versus two-step salt precipitation. Enzyme and Microbial technology, 39(5), 1103-1107.
Micera, M. (2020) Squalene: More than a step toward Sterols. Antioxidants 9 (68)
Popa, O. (2015) Methods for obtaining and determination of squalene of natural sources. Biomed Res Int Recuperado de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4324104/