Fisiología nerviosa animal - Informe

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Fisiología nerviosa en animales
José Rojas (20181022), Rosa Custodio (20181002),
Jesús Fonseca (20180108) y Alexander Huaranga (20181012)
Experiencia 1: Transmisión nerviosa y el efecto inhibitorio del temefos sobre la
acetilcolinesterasa en larvas de mosquitos y alevines.
Metodología:
● Se colectaron los especímenes (alevines y larvas de mosquitos entre el tercer y
cuarto estadio) 24 horas antes del experimento y se dejaron en recipientes.
● Se prepararon seis vasos con una solución de temefos 1 % (0.1g de temefos en
1L de agua) y dos vasos solo con agua destilada.
● Se colocaron los alevines en cuatro vasos (3 con la solución y un control solo
con con agua), 5 alevines en cada vaso.
● Se colocaron las larvas de mosquitos en cuatro vasos (3 con la solución y un
control solo con con agua), 25 larvas en cada vaso.
● Se tapó la boca de cada vaso con una malla fina sujeta con una liga.
● Se observó la supervivencia de las larvas de mosquitos y los alevines a lo largo
de 24 horas.
Resultados:
Tabla 1: Mortalidad de alevines y larvas de mosquitos en los grupos experimentales y
el grupo control.
Grupos GE1 GE2 GE3 Control
Mortalidad de alevines (%) 0 0 20 0
Mortalidad de larvas de mosquitos (%) 100 80 80 0
Explicación:
Existen dos tipos de colinesterasas: la plasmática y eritrocitaria. La colinesterasa
plasmática se forma en el hígado y se encuentra en el plasma. No se conoce con claridad
su función, pero se presume que participa en el metabolismo de lípidos; además,
controla la concentración de colina en el plasma e impide la acumulación de
butirilcolina. La colinesterasa eritrocitaria, más conocida como acetilcolinoesterasa
(AChE) se encuentra en los eritrocitos y en las sinapsis colinérgicas situadas en
uniones neuromusculares y conexiones del sistema nervioso central, conexiones
interneuronales del sistema nervioso periférico y uniones neuroglandulares y
neuromusculares del sistema nervioso parasimpático. Su función es inactivar el
neurotransmisor acetilcolina mediante su biotransformación en colina y ácido acético, lo
cual regula la transmisión del impulso nervioso (Caro-Gamboa et al., 2020)
La acetilcolinesterasa (AChE) realiza la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina
(ACh), el cual se descompone en colina y ácido acético, en el espacio sináptico. Esta
reacción permite que la colina sea reabsorbida por la neurona colinérgica
presináptica para producir nuevamente el neurotransmisor acetilcolina, mediante la
enzima colinaacetiltransferasa, que se encarga de unir la colina con el acetato obtenido
de la acetil coenzima A (Caro-Gamboa et al., 2020).
Una vez se forma el neurotransmisor acetilcolina, se deposita en las vesículas sinápticas
de donde es expulsado por exocitosis, con el fin de unirse a receptores postsinápticos de
tipo muscarínico y nicotínico, haciendo posible la propagación del impulso
nervioso (Ferrer, 2003). La actividad de la enzima acetilcolinesterasa hace que la
neurotransmisión sea momentánea, ya que se interrumpe la interacción
neurotransmisor-receptor al descomponer el neurotransmisor. Sin embargo, el
funcionamiento de la acetilcolinesterasa puede verse alterado por la presencia de
sustancias anticolinesterásicas que bloquean la enzima e impiden la hidrólisis del
neurotransmisor, lo que origina una acumulación de acetilcolina en el espacio sináptico
y aumenta la duración del impulso nervioso, lo que ocasiona una sobreestimulación de
las neuronas postsinápticas, debido a que no pueden regresar a su estado de reposo
(Fernández et al., 2010).
El temefos es un plaguicida organofosforado no sistémico que actúa por contacto e
ingestión, conocido comúnmente por una de sus fórmulas comerciales de mayor uso en
las Américas, el Abate; de gran uso en programas de salud pública para el control de
larvas del mosquito Aedes aegypti. La penetración de este plaguicida se da
principalmente a través de los espiráculos del sistema respiratorio de las larvas (Castillo
y Ramos, 2016)
Los organofosforados realizan su acción tóxica a través del bloqueo de la
acetilcolinesterasa (AChE). La enzima se fosforila al unirse con el plaguicida
covalentemente, lo cual inhibe su función catalítica, esto ocasiona un sobreestímulo de
la vía parasimpática por medio de un exceso de acetilcolina que no es hidrolizada, lo
cual interrumpe la transmisión normal de los impulsos nerviosos (Vega, 2011), lo cual
termina ocasionando la muerte de las larvas.
Los resultados de esta experiencia evidencian la eficacia de temefos en las larvas de
Aedes aegypti, con una mortalidad de entre 80 a 100 %. La razón por la que la
mortalidad no es de 100 % en todos los grupos experimentales radica en los
mecanismos de resistencia a plaguicidas que han desarrollado los insectos.
Existen 4 clases de mecanismos de resistencia: Resistencia por comportamiento, por
penetración disminuida, resistencia por modificación en el sitio químico de acción y
resistencia metabólica (Castillo y Ramos, 2016). El primer mecanismo consiste en la
modificación del comportamiento del insecto, en donde se ve capacitado para evadir
los efectos letales de los insecticidas, evitando el contacto directo con el depósito del
insecticida (Vega, 2011).
La resistencia por penetración disminuida, conocido como mecanismo físico, se basa
en las modificaciones en la composición del exoesqueleto del insecto que inhibe o
impide la penetración del insecticida, las propiedades del tegumento y características
moleculares insecticidas afectan la velocidad de penetración del insecticida. En algunos
organismos, este mecanismo se puede explicar por el hecho de presentar un alto
contenido de proteínas, lípidos y un grado de esclerotización mayor que en otros
insectos susceptibles. De tal manera que la mayor cantidad de lípidos puede llegar a
ocasionar que la liberación de compuestos liposolubles sea retardado, y permite acceder
a un mayor tiempo de detoxificación de los insecticidas (Vega, 2011).
La modificación en el sitio químico de acción es el segundo mecanismo de resistencia
más común entre los insectos, ocurre cuando el insecticida no logra unirse a su sitio de
acción ya sea porque hay disminución en la sensibilidad del sitio blanco o modificación
de este. La insensibilidad de la AChE ha sido responsable del desarrollo de resistencia a
insecticidas en especies de Culex y Anopheles. Esta resistencia mediada por AChE está
relacionada con cambios cualitativos y cuantitativos en la enzima y con mutaciones
puntuales acompañadas por modificación de los parámetros cinéticos de la hidrólisis de
acetilcolina. Tales mutaciones involucran sustituciones de aminoácidos en el sitio activo
de la enzima (Vega, 2011).
Por su parte, la resistencia metabólica es el mecanismo que comprende la acción de
enzimas capaces de detoxificar los insecticidas, antes que puedan alcanzar su sitio de
acción. Se divide en tres grupos enzimáticos y son: Oxidasas de función múltiple,
Esterasas y Glutation S-Transferasas (Bisset, 2002).
Las Oxidasas de función múltiple o monooxigenasas realizan reacciones que aceleran
la eliminación del organismo de gran número de compuestos xenobióticos; se pueden
combinar con moléculas endógenas con características polares y formar productos de
conjugación que se puedan eliminar fácilmente (Bisset, 2002).
Los organofosforados presentan en su estructura química ésteres, las esterasas son las
enzimas encargadas de catalizar reacciones de hidrólisis de ésteres carboxílicos, amidas
y ésteres de fosfato. En insectos del orden Díptera, dichas enzimas se codifican como un
grupo de genes en un mismo cromosoma con la capacidad de presentar modificaciones
que brindan la resistencia (Bisset, 2002).
El grupo que corresponde las Glutation S Transferasas, presenta alta importancia
como mecanismo de desintoxicación celular. Son enzimas encargadas de conjugar el
glutatión endógeno a compuestos electrofílicos con el fin de proteger moléculas como
proteínas y ácidos nucleicos de reacciones covalentes con insecticidas que conllevan a
alta toxicidad (Vega, 2011).Las enzimas de acción metabólica son quienes constituyen el principal mecanismo de
resistencia a temefos en Aedes aegypti. Algunos estudios la han asociado con un
incremento de las monooxigenasas, pero la mayoría de las investigaciones han
demostrado que son las esterasas las enzimas responsables de la resistencia a temefos en
esta especie (Bisset et al., 2016).
La nula mortalidad de los grupos experimentales 1 y 2 de alevines puede explicarse por
la presencia del órgano detoxificador por excelencia en los vertebrados, el hígado, el
cual se encarga de degradar el plaguicida por hidrólisis hepática; este grado de hidrólisis
puede variar de un organismo a otro dependiendo de sus condiciones fisiológicas
(Morgan, 1995). Esto puede explicar por qué el grupo experimental 3 presenta una
mortalidad del 20 %, aún con su mecanismo detoxificador.
Referencias bibliográficas:
● Bisset, J. (2002) Uso correcto de insecticidas: control de la resistencia. Revista
Cubana de Medicina Trópical, 54(3), 202-219
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Medicina Tropical, 68(1) Recuperado en 02 de marzo de 2022, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-076020160001000
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● Caro-Gamboa, L., Forero-Castro, M., Dallos-Báez, A. (2020) Inhibición de la
colinesterasa como biomarcador para la vigilancia de población
ocupacionalmente expuesta a plaguicidas organofosforados. Ciencia y
Tecnología Agropecuaria, 21(3), e1562.
https://doi.org/10.21930/rcta.vol21_num3_art:1562.
● Castillo, J. y Ramos, J. (2016) Evaluación de la eficacia de Temefos (Abate®)
en condiciones de laboratorio y su utilidad en el control de larvas de Aedes
aegypti, vector del Dengue y Chikungunya en el barrio “Bóer”, Managua en el
período Febrero-Marzo. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
NICARAGUA. En: https://repositorio.unan.edu.ni/7383/1/97438.pdf
● Fernández, D., Mancipe, L., y Fernández, D. (2010). Intoxicación por
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● Ferrer, A. (2003). Intoxicación por plaguicidas. ANALES Sistema Sanitario de
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● Morgan, D. (1995) Diagnóstico Y Tratamiento De Los Envenenamientos Por
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https://nepis.epa.gov/Exe/ZyPDF.cgi/2000U9C1.PDF?Dockey=2000U9C1.PDF
● Vega, G. (2011). Determinación de los Grados de Resistencia al Insecticida
Temefos en Poblaciones de Aedes aegypti LINNAEUS, 1762 (Diptera,
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de Cauca, La Guajira, Cundinamarca y el Atlántico. Colombia: bdigital. De:
http://www.bdigital.unal.edu.co/5347/1/gabrielareyvega.2011.pdf
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https://doi.org/10.18359/rmed.1295
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https://nepis.epa.gov/Exe/ZyPDF.cgi/2000U9C1.PDF?Dockey=2000U9C1.PDF
http://www.bdigital.unal.edu.co/5347/1/gabrielareyvega.2011.pdf
Experiencia 2: Reacción de Galli Mainini - Test de la rana
Metodología:
● Se introdujo un gotero por la cloaca de un macho joven de la especie Rhinella
arenarum extrayendo un poco de su orina.
● Se colocó una gota de la orina extraída y se comprobó al microscopio la
ausencia de espermatozoides.
● Luego, se inyectó 10 ml de orina de una gestante de entre 2 y 3 meses de
embarazo en el anfibio, específicamente en el saco linfático dorsal.
● Después de dos horas, se introdujo nuevamente el gotero por la cloaca del
macho extrayendo un poco de su orina.
● Se colocó una gota de la orina extraída y se comprobó al microscopio la
presencia de espermatozoides.
Resultados:
Figura 1. Visualización de espermatozoides de Rhinella arenarum
(Reacción positiva del test Galli Mainini)
Explicación:
La espermatogénesis se produce dentro de los túbulos seminíferos testiculares de forma
escalonada, lo que requiere estímulos autocrinos, paracrinos y endocrinos que están
controlados por las acciones de la hormona estimulante del folículo (FSH) y la hormona
luteinizante (LH). A través de la interacción con su receptor (FSHR), la FSH actúa
sobre su único objetivo en las células masculinas, las células de Sertoli, ubicadas en la
base de los túbulos seminíferos de los testículos. Estas células crean un nicho en el que
las espermatogonias proliferan y maduran. En las células de Leydig, la LH estimula la
producción de testosterona a través de la interacción con su receptor específico, el
LHCGR (Santi et al, 2020).
La hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) es una proteína sintetizada
principalmente por los tejidos embrionarios; cumple la función de mantener la actividad
del cuerpo lúteo, y con ello el desarrollo del endometrio, a través de la secreción de
progesterona (Moore et al., 2016). En el embarazo normal incrementa sus valores en las
primeras semanas de una manera casi constante, elevándose exponencialmente, lo
mismo para sus concentraciones en orina y sangre, las cuales se correlacionan muy bien
con la cantidad de trofoblasto activo (Lenton et al, 1982) Sin embargo, después de las
primeras semanas estos valores decaen, de ahí la importancia de que la reacción de Galli
Mainini se realice en gestantes de 2 a 3 meses.
La hCG está constituida por 2 cadenas de aminoácidos denominadas alfa (α) y beta (β),
unidas no covalentemente por un puente sulfidrilo, que si se separan pierden su
actividad biológica; es decir, que ninguna tiene actividad por sí misma, pero la
recuperan cuando se recombinan. La subunidad α es común a otras hormonas como la
hormona luteinizante (LH), la estimulante del folículo (FSH), la tirotrofina hipofisaria
(TSH); mientras que la β es diferente a cada otra hormona y es quien le confiere la
especificidad (Velázquez, 2014)
Es precisamente esta similaridad en estructuras lo que le permite a la hCG actuar sobre
el mismo receptor de membrana para la LH, lo cual estimula la producción de
testosterona. A su vez, actúa sobre las células de Sertoli a través del receptor nuclear de
andrógenos (Santi et al, 2020), en resumen, la hCG estimula la espermatogénesis. Por
ello, la orina de una mujer embarazada de dos a tres meses, bastante cargada de hCG, al
ser inyectada en un anfibio joven, da lugar una rápida producción y liberación de
espermatozoides.
Los espermatozoides se liberan en los tubos seminíferos del sapo macho, de donde
pasan a los conductos eferentes que se comunican con el riñón; de esta forma, es posible
encontrarlos en la orina de la cloaca a las dos o tres horas de realizada la inoculación.
(Roe, 1951)
Referencias bibliográficas:
● Lenton E., Neal L. y Sulaiman R. (1982) Plasma concentrations of human
chorionic gonadotropin from the time of implantation until the second week of
pregnancy. Fertil Steril. 37:773-778.
● Moore, K., Persaud, T. y Torchia, M. (2016) Embriología Clínica. 10a ed.
Barcelona, Elsevier.
● Roe, C. (1951). Estandarización de la Unidad Sapo en el dosaje de
Gonadotrofinas Coriónicas. Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud
Pública, 8(1-4), 172-193. Recuperado en 02 de marzo de 2022, de
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-4634195100
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● Santi, D., Crépieux, P., Reiter, E., Spaggiari, G., Brigante, J. Casarini, L.,
Rochira, V. y Simoni, M. (2020) Acción de la hormona estimulante del folículo
(FSH) sobre la espermatogénesis: un enfoque en los roles fisiológicos y
terapéuticos. J. Clin. Med. 9(4), 1014; https://doi.org/10.3390/jcm9041014
● Velázquez, N. (2014). La hormona gonadotrofina coriónica humana: Una
molécula ubicua y versátil. Parte I. Revista de Obstetricia y Ginecología de
Venezuela, 74(2), 122-133. Recuperado en 02 de marzo de 2022, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0048-77322014000200006&lng=es&tlng=es.
Experiencia 3: Tasa metabólica basal en mamíferos pequeños.
Metodología:
● Se ubicó una rata en una jaula cilíndrica pequeña.
● Se cubrió la jaula con una tela negra.
● Se colocó cal sodada dentro de un frasco grande.
● Se ubicó la jaula dentro del frasco grande de tapa hermética unido a una pipeta
que comunica el interior del frasco con el exterior.
● Se creó una burbuja en la boca de la pipeta con una solución de agua y jabón.
● Se contabilizó el tiempo y la distancia recorrida por la burbuja en la pipeta para
determinar los mL de oxígeno consumidos por el roedor.
Consideraciones para la experiencia:
● El ensayo debe realizarse en la mañana, para evitar un ayuno prolongado.
● La jaula debe ser lo suficientemente pequeña para impedir cualquier movimiento
del roedor.
● La tela oscura se coloca con el fin de evitar el estrés del animal, debido a que
son individuos acostumbrados a ambientes con poca luz. Además, mantener el
ambiente lo más silencioso posible también ayuda, ya que no soportan ruidos
fuertes.
● La pipeta debe ser lubricada en agua o una sustancia jabonosa para que la
burbuja pueda desplazarse y no reventar al poco tiempo de iniciar su recorrido.
● La pipeta debe ser introducida en el frasco por un agujero y ser ajustada con un
jebe, para impedir el paso del aire.
● El roedor, al respirar, consumirá oxígeno y liberará CO2, por ello la importancia
de colocar cal sodada en la superficie del frasco, la cual actuará como agente
absorbente de CO2 y permitirá resultados reales.
● La temperatura del ambiente influye en la tasa metabólica basal, por lo que debe
ser medida.
● Conocer la altitud del lugar servirá también para el análisis de los resultados,
debido a la relación de la altura con la presión parcial de oxígeno y por ende,
con la frecuencia respiratoria.
● Los procesos metabólicos se ralentizan a mayor edad del roedor, por lo que es
una variable a tomar en cuenta.
● El peso del animal condiciona también su tasa metabólica basal, animales de
mayor peso poseen menor gasto energético en reposo que animales de menor
peso.
● El sexo de las ratas influye en su tasa metabólica. Los machos, por lo general,
presentan un metabolismo más alto.
● Considerar el estado de salud del individuo y su estado anímico, los cuales
pueden disminuir su TMB.
Figura 2. Diseño para determinar la tasa metabólica basal de un roedor en función a los
mL de oxígeno consumidos.