Talleres 2020

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Inmunología Básica - Talleres 2020 
 
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INMUNOLOGÍA 
BÁSICA 
 
 
TALLERES 
 
 
 
 
 
 
 
 
Docentes: 
Marina Etcheverrigaray 
Carolina Veaute 
Maria Inés García 
Eduardo Mufarrege 
Adriana Soutullo 
Romina Russi 
Sonia Ricotti 
Ma. de los Milagros Bürgi 
Sofía Giorgetti 
Ivana Reidel 
Marianela Masin 
 
2020 
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas 
Universidad Nacional del Litoral 
Inmunología Básica - Talleres 2020 
 
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Índice 
 
TALLER I............................................................................................................................................. 3 
METODOS BASADOS EN LA INTERACCION ANTÍGENO-ANTICUERPO. Parte 1 .......... 3 
TALLER II………………………………………….………… .. ……………………………………6 
METODOS BASADOS EN LA INTERACCION ANTÍGENO-ANTICUERPO. Parte 2 …....6 
TALLER III ....................................................................................................................................... 13 
EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR Y CITOMETRÍA DE FLUJO ................... 13 
 
Inmunología Básica - Talleres 2020 
 
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Problema 1 
Luego de la inoculación con Fcµ humana a una rata, se purificó IgG del suero. 
a- Elija y describa una técnica de precipitación en gel para comprobar si la IgG purificada 
tiene especificidad para dicha proteína. 
b- Indique, si la proteína inoculada fuera IgM humana, si obtendría una banda de 
precipitación al enfrentarla a: 
1. IgG purificada a partir del suero de la rata inmunizada 
2. IgM humana 
3. IgG humana 
4. Fcμ humana 
 
- Expliqué qué condiciones se deben dar para que suceda este fenómeno de precipitación. 
- Puede un anticuerpo actuar como antígeno? Justifique. 
 
 
Problema 2 
Un animal de experimentación fue inmunizado con un antígeno bacteriano intracelular purificado 
(Ag B). Mediante una técnica de aglutinación se desea titular los anticuerpos específicos en una 
muestra de suero. 
a - Diseñe el protocolo indicando detalladamente los reactivos a utilizar, los pasos a 
seguir y los posibles resultados. 
b- ¿Cómo procedería si el Ag B estuviese presente en la membrana externa de la bacteria? 
 
- Antígeno e inmunógeno son sinónimos? Explique 
- Qué es un mitógeno? 
- Enumere las diferencias entre Precipitación y Aglutinación 
 
 
Problema 3 
Con el fin de evaluar la respuesta inmune frente a gp90, proteína de envoltura del Virus de la 
Anemia Infecciosa Equina, se ha inmunizado un lote de 10 ratones. A los 45 días post inoculación 
se realizó una sangría. ¿Cómo procedería, mediante aglutinación, para titular los Acs totales con 
especificidad para la proteína viral en las muestras de suero? Mediante un diagrama de flujo cite 
cada paso y describa brevemente qué sucede en cada uno de ellos. Proponga los posibles 
resultados. 
 
 
Problema 4 
A partir de un cultivo de Chlamydia pneumoniae se ha purificado una proteína citoplasmática (pi 
6,3), la cual fue inoculada a un lote de 3 conejos. Para evaluar el plan de inmunización, 
finalizado el mismo, se obtuvieron muestras de suero de los animales: 
a- Explique brevemente el protocolo de aglutinación qu e emp l ea r í a para determinar si 
los animales han respondido al inmunógeno. 
b- Describa un protocolo de aglutinación para obtener el título de Acs específicos. 
c- Del animal que mejor respondió se purificó la fracción IgG. Una alícuota de esta misma fue 
TALLER I 
 
METODOS BASADOS EN LA INTERACCION ANTÍGENO-ANTICUERPO. Parte 1 
Inmunología Básica - Talleres 2020 
 
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tratada con pepsina, los fragmentos obtenidos fueron separados por cromatografía y 
recolectados en 2 tubos con el correspondiente rótulo. Luego de conservarlos en baño de 
hielo los rótulos se borraron haciendo imposible su identificación. Empleando una 
reacción de aglutinación demuestre como podría identificar el contenido de cada tubo. 
d- Otra alícuota de la fracción IgG purificada fue tratada con papaína. Investigue cómo es 
posible determinar la presencia de fragmentos Fab específicos mediante “inhibición de 
la aglutinación”. 
 
- Describa la estructura de un Ac y explique las diferencias que distinguen a cada isotipo. 
 
 
Problema 5 
Se han inoculado tres cobayos con: DNP (hapteno), albúmina humana y albúmina humana-DNP 
(carrier-hapteno), respectivamente. 
a. Investigue como podría determinar mediante “inhibición de la precipitación” la presencia 
de DNP en la solución utilizada para inmunizar el primer cobayo. 
b. Elija una técnica que permita evaluar la presencia de anticuerpos anti hapteno en cada uno 
de los tres sueros y concluya sobre la utilidad del carrier en el desarrollo de la 
respuesta inmune. 
 
 
Problema 6 
Ud. trabaja en un laboratorio de diagnóstico y recibe un Ac anti-α humano. Antes de emplearlo 
necesita hacerle varios controles. 
a- Chequee la especificad del Ac anti-α humano mediante una técnica de precipitación en 
medio semisólido. Para ello cuenta con los siguientes reactivos de los cuales debe usar al menos dos: 
- Suero humano 
- IgA humana 
- Cadena α humano 
- IgG humana 
b- Corrobore el título del Ac anti-α humano adquirido. Diseñe el protocolo indicando 
detalladamente los reactivos a utilizar, los pasos a seguir y los controles que realiza. 
 
 
Problema 7 
Usted tiene que confeccionar en su laboratorio una placa de Inmunodifusión radial para cuantificar 
IgA en muestras humanas. Cómo lo realizaría? 
 
- Relacione el concepto de “Curva de Equivalencia” con el fundamento de la IDR 
- Un Anticuerpo monoclonal, ¿es siempre monoespecífico? 
 
 
PROBLEMAS PARA RESOLVER EN EL ENTORNO VIRTUAL 
 
Problema 1 
La Influenza Aviaria Altamente Patógena es una enfermedad viral causada por algunos 
subtipos del tipo A del virus de la influenza, que afecta a la mayoría de las especies aviares; 
es extremadamente contagiosa, con una elevada tasa de mortalidad y trasmisible al hombre. 
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Con el objeto de obtener un antisuero policlonal (a fin de desarrollar un ensayo in vitro para la 
detección viral) se ha realizado una inmunización a un conejo con la nucleoproteína viral, 
presente en todos los subtipos del virus aviar tipo A. El plan de inmunización consistió en 4 
dosis del inmunógeno cada 14 días, previo a cada inoculación se obtuvo una muestra de sangre. 
Finalizado el plan el animal fue sacrificado y desangrado para obtener el suero inmune. 
a- Describa un ensayo de precipitación que permita determinar la presencia o no de Acs 
específicos. ¿Con cuál de las muestras séricas obtenidas realizaría dicho ensayo? 
b- Describa el protocolo de aglutinación que usted diseñaría para determinar el título de Acs 
específicos en el suero obtenido al momento del sacrificio del animal. 
 
 
Problema 2 
Elija la opción correcta: 
¿Cuál de las técnicas que conoce utilizaría para evaluar en forma más sencilla: 
 Acs IgA específicos para una proteína determinada? 
Inhibición de la aglutinación/ Inmunoelectroforesis/ Precipitación en medio semisólido 
 Inmunoglobulinas totales en leche anti Brucella abortus? 
Aglutinación/ Inmunoelectroforesis/ Precipitación en medio semisólido 
 La concentración total de IgM sérica humana? 
Hemoaglutinación/ Inmunoelectroforesis / Inmunodifusión radial 
 
 
Problema 3 
Conteste Verdadero o Falso y justifique: 
 Mediante aglutinación con partículas de látex es posible evaluar en un único paso fragmentos 
Fab. 
 La única manera de evaluar la presencia de haptenos en una muestra es mediante inhibición 
de la precipitación o inhibición de la aglutinación. 
 La presencia de Fab puede ser analizada utilizando hemoaglutinación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Problema 1 
Usted necesita diseñar un método de ELISA para detectar Ac específicos para una proteína del virus 
de la Hepatitis A en muestras biológicas humanas. Buscando en la heladera los reactivos necesariosencuentra soluciones de bloqueo, todos los búfferes necesarios, TMB y los siguientes conjugados: 
I. Fragmento F(ab’)2 de IgG de cabra anti-Fc humana conjugada con peroxidasa. 
II. IgG1 de ratón anti-IgM humana conjugada con peroxidasa. 
III. Fragmento F(ab’)2 de IgG de cabra anti-Fc humana conjugada con fosfatasa alcalina. 
IV. IgG de cabra anti IgG de conejo conjugada con peroxidasa. 
V. IgG2a de ratón anti-Igs totales humana conjugada con peroxidasa. 
VI. IgG de conejo anti-Igs totales humanas conjugada con peroxidasa 
Por lo que piensa, sólo le falta obtener la proteína recombinante del virus de Hepatitis A, la cual debe 
poseer regiones altamente conservadas. 
a. De la lista de conjugados: ¿sólo uno le sirve? Si hay más de uno que pueda emplearse, ¿es 
indistinto utilizar cualquiera de ellos? Justifique su respuesta considerando las estructuras de los 
anticuerpos. 
b. Además de los reactivos que encontró, ¿considera que olvidó alguno? Si es así, ¿cúal/es? 
 
 
Problema 2 
Una técnica muy utilizada para medir concentraciones de citoquinas en diferentes muestras 
biológicas es el ELISA y existen en el mercado numerosos kits para realizar estas determinaciones. 
A continuación, se muestra parte de la ficha técnica de un kit para la cuantificación de IL-1 de rata, 
describiendo el contenido del mismo. 
a. Considerando los materiales provistos por el fabricante ¿Cuál sería el fundamento de este 
ensayo? 
b. ¿Cuál es el procedimiento completo, en caso de querer cuantificar IL-1 en suero de rata? 
c. ¿Qué reactivo adicional necesitará para llevarlo a cabo? 
d. ¿Por qué considera que es importante estudiar esta citoquina? Explique. 
MATERIALS PROVIDED Cat. #R1000 
Rat IL-1 Microplate: 96 well microplate (12 strips of 8 wells) coated with monoclonal antibody 
specific for rat IL-1. 1 plate 
Rat IL-1 Conjugate: 12.5 mL/vial of a polyclonal antibody against rat IL-1 conjugated to 
horseradish peroxidase with preservatives. 1 vial 
Rat IL-1 Standard: 4 ng/vial of recombinant rat IL-1 in a buffered protein base with preservatives; 
lyophilized. 3 vials 
Rat IL-1 Control: Recombinant rat IL-1 in a buffered protein base with preservatives; lyophilized. 
The expected range of the rat IL-1 control is shown on the vial label. 3 vials 
Assay Diluent RD1-21: 12.5 mL/vial of a buffered protein solution with preservatives. 1 vial 
Calibrator Diluent RD5-3: 21 mL/vial of a buffered protein solution with preservatives. For cell 
culture supernate samples. 1 vial 
Calibrator Diluent RD5T: 21 mL/vial of a buffered protein solution with preservatives. For 
serum/plasma samples. 1 vial 
Wash Buffer Concentrate: 50 mL/vial of a 25-fold concentrated solution of a buffered surfactant 
with preservative. 1 vial 
Color Reagent A: 12.5 mL/vial of stabilized hydrogen peroxide. 1 vial 
TALLER II 
 
METODOS BASADOS EN LA INTERACCION ANTÍGENO-ANTICUERPO. Parte 2 
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Color Reagent B: 12.5 mL/vial of stabilized chromogen (tetramethylbenzidine). 1 vial 
Stop Solution: 23 mL/vial of a diluted hydrochloric acid solution. 1 vial 
 
 
Problema 3 
Se desea diseñar un ELISA para detectar la proteína folículo estimulante recombinante humana 
(rhFSH) en sobrenadantes de cultivos celulares. Se necesita que el ensayo sea puesto a punto. ¿Qué 
tipo de anticuerpos específicos para la proteína generaría? 
a. Justifique su elección. 
b. Explique que consideraciones debe tener en cuenta para optimizar la obtención de los 
anticuerpos. 
c. Esquematice el sistema reaccionante del ELISA. 
 
 
Problema 4 
Un grupo de ratones fue inmunizado con una proteína de origen testicular, en un protocolo que 
consistió en 4 dosis. Para caracterizar la respuesta local en tejido testicular, se propone investigar los 
niveles de la citoquina TNF-α, entre otras, en ese tejido. 
I. ¿Qué métodos podría aplicar? 
II. ¿Qué tipo de información le brinda cada uno de los métodos elegidos? 
III. Para cada uno de los métodos elegidos enumere y explique brevemente los pasos. 
IV. ¿Qué controles realizaría? ¿Qué resultados espera de cada control para validar el ensayo? 
V. Por otro lado, desea cuantificar esta citoquina en suero de los ratones. ¿Qué técnica 
emplearía? Explique que consideraciones debe tener en cuenta para poder llevarla a cabo. 
 
 
Problema 5 
Se desea evaluar aplicando Western Blot la producción de Acs específicos en cerdos infectados 
experimentalmente con un parásito. Se dispone de sueros obtenidos a los días 0, 4, 12, 32 y a los 12 
meses y antígenos purificados a partir de un cultivo de larvas parasitarias. 
a. Grafique con detalles los pasos a seguir. Justifique. 
b. Se desea detectar IgM específica para los antígenos en sueros de cerdos. Grafique el modelo 
de ELISA que diseñaría, detallando muestra a utilizar, reactivos y procedimiento. 
 
 
Problema 6 
A partir de un cultivo de Chlamydia pneumoniae se ha purificado una proteína citoplasmática (pi: 
6,3 PM: 572 kD), la que fue inoculada a un lote de 3 conejos. Para evaluar el plan de inmunización, 
finalizado el mismo, se obtuvieron muestras de suero de los animales. 
a. Antes de comenzar el plan de inoculación se desea determinar la pureza del inmunógeno, 
esquematice una técnica (más sensible que la de precipitación) para tal fin. 
b. ¿Qué técnica utilizaría para determinar si los animales han respondido al inmunógeno? 
Esquematice. 
c. ¿Qué técnica le permite determinar el título de Acs específicos? Explique. 
d. ¿Qué técnica emplearía para demostrar si los Acs específicos para el inmunógeno son del 
isotipo IgG? Esquematice. 
e. Aplicando la técnica de WB, como determinaría la presencia de Acs que puedan reconocer 
Chlamydia trachomatis. Describa el fenómeno de reacción cruzada. 
 
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Problema 7 
A) Los ensayos de 4º generación detectan simultáneamente antígenos y anticuerpos del HIV, 
permitiendo la detección temprana de la infección combinando simplicidad, sensibilidad y precisión 
en una sola prueba. A continuación se detallan los reactivos del kit de ELISA de 4º generación para 
la detección simultánea del antígeno p24 del HIV y de anticuerpos anti-HIV en suero o plasma. 
Policubeta sensibilizada: Policubeta de 96 pocillos recubiertos con proteínas recombinantes y 
péptidos sintéticos del HIV y anticuerpos monoclonales humanizados anti-p24. 
Diluyente de Muestra: Buffer Tris 0,02 M conteniendo proteínas bovinas, cloruro de sodio y agente 
tensioactivo, pH 7,2. 
Conjugado 1: Solución lista para usar conteniendo antígenos recombinantes y péptidos sintéticos 
del HIV y anticuerpos monoclonales humanizados anti-p24 biotinilados en buffer fosfato 10 mM con 
proteínas bovinas, cloruro de sodio y agente tensioactivo, pH 7,2. 
Conjugado 2 concentrado: Estreptavidina conjugada con peroxidasa. 
Diluyente de Conjugado 2: Buffer fosfato 10 mM con proteínas bovinas, cloruro de sodio y agente 
tensioactivo, pH 7,2. 
TMB: Solución de tetrametilbencidina 36 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) 100%, (100x). 
Diluyente de TMB: Buffer citrato 40 mM y peróxido de hidrógeno 1,27 mM, pH 4,3. 
Stopper: Ácido sulfúrico 1 M. 
Buffer de Lavado concentrado: Buffer fosfato 250 mM, cloruro de sodio 3,45 M y agente 
tensioactivo, (25x), pH 6,4. 
Control Positivo: Suero humano inactivado, conteniendo anticuerpos anti-HIV. 
Control Positivo p24: Solución de antígeno p24 del HIV en buffer fosfato 10 mM con proteínas 
bovinas, cloruro de sodio, y agente tensioactivo, pH 7,2. 
Control Negativo: Suero humano normal no reactivo, inactivado. 
 
a) Enumere los pasos del ELISA para la detección del antígeno p24 y realice el esquema del 
sistema reaccionante. ¿Considera que falta algún reactivo para este sistema de ELISA? 
b) Enumere los pasos del ELISA para la detección de anticuerpos anti-p24 y realice el esquema 
del sistema reaccionante. ¿Considera que falta algún reactivo para este sistema de ELISA? 
c) ¿Porqué el sistema de detección emplea dos conjugados? ¿Existe la manera de emplear un 
solo conjugado? ¿Cuál sería? 
d) ¿Cuáles son las ventajas de emplear un kit de 4ta generación para el diagnóstico de VIH? 
 
B) Utilizando el fundamento del kit planteado en A), como diseñaría usted un ensayo de 
inmunocromatografía lateral que permita diferenciar la presencia de Ag p24 de la de presencia de 
inmunoglobulinas anti-HIV. 
 
 
Problema 8 
Las pruebas antidoping son exámenes que detectan el consumo de sustancias químicas, así sean 
drogas ilegales o medicamentos controlados. Si bien en este procedimiento se pueden emplear 
distintos tipos de muestra, el antidoping en orina es uno de los más utilizados, permitiendo medir el 
consumo reciente (3 a 5 días) de estupefacientes, excepto el cannabis que puede ser detectado hasta 
28 días después de consumirlo. Se desea diseñar un test de inmunocromatografía, capaz de detectar 
en simultáneo y diferenciar la presencia de benzodiacepinas (BZO), cocaína (COC), marihuana 
(THC), meta-anfetaminas (MET) y opiáceos (OPI). 
a) Diseñe y esquematice una tira reactiva (cassette) que permita cumplir con su objetivo. 
Indique las zonas presentes en ella. 
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b) Especifique el tipo de muestra y los reactivos que utilizará, indicando sus características y las 
zonas donde se encontrarán cada uno de ellos. Justifique su elección. (En caso de escoger el 
uso de anticuerpos señale si se tratan de monoclonales o policlonales). 
c) Grafique e indique los posibles resultados que se pueden obtener con esta prueba. 
d) Indique cuales son las posibles limitaciones de este método. 
 
 
PROBLEMAS PARA RESOLVER EN EL ENTORNO VIRTUAL 
 
Problema 1 
La sífilis es una enfermedad venérea causada por una bacteria denominada Treponema pallidum que 
invade las mucosas intactas o la piel en áreas de abrasiones. El contacto sexual es la forma más 
común de transmisión. El diagnóstico de esta enfermedad puede realizarse por métodos 
inmunoenzimáticos (ELISA) que detectan la presencia de anticuerpos específicos contra Treponema 
pallidum en muestras de pacientes que se encuentran en diferentes estadios de la enfermedad. 
Completa y ordena secuencialmente las etapas del ELISA empleado para el diagnóstico de Sífilis. Si 
es necesario, incluya los pasos que agregaría. 
• ….) La muestra diluida se incuba en los pocillos. Si los …………………………… específicos 
para………………………………… están presentes en la muestra, éstos se unen a los 
antígenos del pocillo. 
• ….) El conjugado no unido se remueve por lavado con una solución compuesta 
por………………………………………………………………………………….. 
• ….) Los pocillos de la policubeta están recubiertos con …………….…………. recombinantes 
correspondientes a las proteínas p15, p17 y p47 de …………………. 
• ….) Las muestras reactivas desarrollan color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la 
reacción con ……………………………………………………………. 
• .…) El material no unido es removido por lavado. 
• ….) Posteriormente, se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y………………. 
……………………………………………………………………………………………… 
• ….) En el paso siguiente se agrega el conjugado, que consiste en 
un…………………………..……………………………………………………………………
……………………………………………….. Este se une a los complejos antígeno-anticuerpo, 
formados previamente. 
 
 
Problema 4 
Mediante un ELISA sándwich indirecto se desea cuantificar TNFα humano (hTNFα) 
a. ¿cuál de los siguientes pares de anticuerpos utilizaría? Elija la respuesta correcta y justifique 
considerando las características de los anticuerpos monoclonales y policlonales. (mAb: 
anticuerpo monoclonal, pAb: anticuerpo policlonal) 
I. mAb murina anti-epitope 1 (hTNFα) / pAb murina anti- (hTNFα) 
II. mAb murina anti-epitope 2 (hTNFα) / mAb murina anti-epitope 2 (hTNFα) 
III. mAb murina anti-epitope 1 (hTNFα) / pAb conejo anti- (hTNFα) 
IV. pAb murina anti- (hTNFα) / mAb murina anti-epitope 2 (hTNFα) 
b. En base a su elección previa, determine que conjugado debería utilizar para detectar el 
complejo antígeno-anticuerpo. 
c. El anticuerpo conjugado que eligió, en el punto b, ¿podría utilizarlo para un ensayo de 
Western-Blot? ¿Qué consideraciones debería tener en cuenta? 
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Problema 6 
Con el fin de verificar el correcto diseño de un ELISA indirecto para detectar Acs anti-Trypanosoma 
cruzi, se colocó el homogenato de este parásito en 6 pocillos. Se evaluaron sueros humanos tres 
positivos y tres negativos. Al realizar la lectura, el operador no recuerda en que pocillo coloco cada 
suero, y sospecha que olvidó realizar el paso de bloqueo en uno de los pocillos y de no haber 
agregado el reactivo cromógeno en otro. 
Los resultados de DO (densidades ópticas) fueron los siguientes: 
 
 Experimento: A 
 Pocillos: 1 2 3 4 5 6 
 DO: 2,056 0,000 2,107 0,101 0,090 >3 
 
a. Indique en el experimento A, que suero se incubo en cada caso, y explique los resultados 
obtenidos. 
 
El operador repitió el experimento dos veces más, anotando en que pocillo coloco los sueros, 
obteniendo los siguientes resultados: 
 
 Experimento: B 
 Pocillos: 1 2 3 4 5 6 
 Sueros: - - - + + + 
 DO: >3 >3 >3 >3 >3 >3 
 
Experimento: C 
 Pocillos: 1 2 3 4 5 6 
 Sueros - - - + + + 
 DO: 0.02 0.02 0.01 0.05 0.01 0.01 
 
b. Indique cual/es de los siguientes errores, se pudieron haber cometido tanto para el 
experimento B como para el C. Proponga otras posibles causas para explicar los resultados 
obtenidos. 
 
I. No se sensibilizo 
II. No se bloqueo 
III. Muchos lavados y en condiciones de pH extremos 
IV. Se colocó un cromógeno distinto para el conjugado utilizado 
V. El cromógeno estaba vencido 
VI. No se realizó el ultimo lavado 
VII. Se sensibilizo con albúmina humana 
 
 
Problema 10 
La hepatitis B es una enfermedad viral caracterizada por un período prolongado de incubación (45-
160 días). El virus causante de esta patología (HBV) es una partícula compuesta por una región 
interior donde se encuentra el ADN y una envoltura exterior compuesta predominantemente con una 
proteína de superficie antigénica (HBs). La detección de anticuerpos anti-HBs es el único marcador 
serológico de infección por HBV. FUNDAMENTO DEL METODO: La muestra se pone en 
contacto con el antígeno HBs inmovilizado sobre el soporte sólido en presencia de anticuerpos anti-
HBs conjugado con peroxidasa. Si la muestra contiene anticuerpos específicos, éstos competirán con 
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el conjugado por el antígeno presente en el soporte. Luego de incubar y lavar para eliminar la 
fracción no unida, se agrega el sustrato enzimático. A mayor cantidad de anticuerpos anti-HBs 
presentes en la muestra, menor será el desarrollo de color. 
a) Considerando como se realiza la interpretación de la señal, ¿Qué tipo de ELISA se emplea para 
el diagnóstico de Hepatitis B? 
b) Complete que contiene cada reactivo provisto por el kit: 
- Policubeta sensibilizada: 
- Conjugado: 
- Revelador A: 
- Revelador B: 
- Stopper: 
- Buffer de Lavado concentrado: 
- Control Positivo: 
- Control Negativo: 
c) La reactividad de la muestra se determina relacionando la absorbancia de la muestra respecto al 
valor cut-off. 
 Cut-off = 0,4 x CN + 0,6 x CP 
 
 donde: CN: promedio de las lecturas de los Controles Negativos. 
 CP: promedio de las lecturas de los Controles Positivos. 
 
Complete: 
Muestras…………: se consideran aquellas con absorbancias menores al valor cut-off.Muestras…………: se consideran aquellas con absorbancias mayores al valor cut-off. 
 
Determine el valor del cut-off utilizando los siguientes valores de densidad óptica y en base a ese 
valor determine cuál es el resultado de cada muestra (positiva/negativa): 
 CP: 0,1 CN: 1,2 
 
Muestra 1: 0,458 …………………………….. 
Muestra 2: 0,336 …………………………….. 
Muestra 3: 0,555 …………………………….. 
Muestra 4: 1,055 ……………………………. 
 
 
Problema 11 
Si bien existen 4 especies de Plasmodium capaces de causar malaria en humanos, P. 
falciparum produce la forma más peligrosa, con los índices más altos de complicaciones 
y mortalidad. Mientras las 4 especies comparten el antígeno pan malaria p-LDH (Plasmodium lactato 
deshidrogenasa), sólo P. falciparum presenta el antígeno Pf-HRP-II (proteína rica en histidina-II 
específica de P. falciparum). Estas características han permitido desarrollar kits de 
inmunocromatografía lateral capaces de detectar de manera rápida, cualitativa y diferencial la 
presencia de estos antígenos en sangre, permitiendo hacer un diagnóstico diferencial. Considerando 
que el diseño del cassette más utilizado, en este tipo de kits, es el presentado en la imagen: 
a. Indique el nombre de cada una de las zonas señaladas en la imagen (1, 2, 3 y 4). 
b. Señale que reactivo escogería para cada zona y justifique su elección: 
 
 
https://es.wikipedia.org/wiki/Mortalidad
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- Pf-HRP-II 
- Pf-HRP-II conjugado a oro coloidal 
- p-LDH 
- p-LDH conjugado a oro coloidal 
- Muestra a analizar suero humano 
- Muestra a analizar saliva humana 
- pIgG (ratón) anti-Pf-HRP-II 
- pIgG (ratón) anti-Pf-HRP-II conjugado a oro coloidal 
- mIgG (ratón) anti-epitope 1 de Pf-HRP-II conjugado a oro coloidal 
- mIgG (rata) anti-epitope 1 de p-LDH 
- mIgG (ratón) anti-epitope 1 de p-LDH conjugado a oro coloidal 
- mIgG (ratón) anti-epitope 2 de p-LDH conjugado a oro coloidal 
- mIgG1 (conejo) anti cadena pesada γ ratón 
- pIgs (ratón) anti IgG rata 
- pIgG (conejo) anti Fab ratón 
 
c. Interprete y concluya el resultado del ensayo para cada caso: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
i ii. 
iii iv
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Problema 1 
Se han decomisado monos salvajes a cazadores furtivos. Para evaluar su estado sanitario, antes de 
colocarlos en jaulas con otros monos salvajes, se les efectúa una reacción de Mantoux, resultando 
positiva para la mayoría de los monos examinados. ¿Cómo interpretarían este resultado?, ¿Es similar 
la interpretación si la especie examinada fuera la humana?, ¿Por qué? 
 
 
Problema 2 
A partir de sangre entera de un animal inmunizado con un Ag A, se necesita obtener células 
presentadoras de antígenos (APC) y LT para efectuar los siguientes ensayos de proliferación in vitro: 
1- APC y linfocitos CD4+
 
en presencia de un Ag A. 
2- APC y linfocitos CD8+ en presencia de un Ag A. 
Realice un esquema del protocolo que realizaría para separar estos clones celulares, teniendo en 
cuenta que se dispone de los siguientes anticuerpos monoclonales y un anticuerpo policlonal anti IgG 
murino: 
Tipo celular Anticuerpos monoclonales: 
Leucocitos Anti-CD45 
LT Anti-CD3 
LT helper Anti-CD4 
LT citotóxico Anti-CD8 
NK Anti-CD16, anti-CD56 
Monocitos/macrófagos Anti-CD14 
Linfocitos B Anti-CD19, Anti- HLA-II 
Granulocitos Anti-CD16, anti-CD15 
APC, LB Anti-HLA-II 
 
 
Problema 3 
Se efectúa la siguiente experiencia: 
A) Se obtienen macrófagos (MO) de un cobayo normal y se lo cultiva con: 
 a- Linfocitos histocompatibles con el cobayo normal, proveniente de animales inmunes a 
DNP-BGG, en presencia de DNP-BGG y de BSA. 
 b- Linfocitos histocompatibles con el cobayo normal, proveniente de 
animales inmunes a BSA, en presencia de DNP-BGG y de BSA. 
 c- Linfocitos histocompatibles con el cobayo normal, proveniente de animales no 
inmunizados, en presencia de DNP-BGG y de BSA. 
 
 Referencia: DNP-BGG gammaglobulina bovina dinitrofenolada 
 BSA albúmina bovina sérica 
TALLER III 
 
EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR Y CITOMETRÍA DE FLUJO 
Inmunología Básica - Talleres 2020 
 
14 
 
B) Se infectan los cultivos anteriores (MO + linfocitos + Ag) con un parásito (intracelular que infecta 
MO) y se mide el crecimiento de éste último en los MO. 
Resultados: 
 
Analizando los resultados, ¿Qué conclusión extrae? 
 
 
Problema 4 
Se inmunizó un lote de ratones de la cepa BALB/c con antígenos de excreción-secreción de un 
parásito intracelular (Toxoplasma gondii) y se desea evaluar la respuesta obtenida en linfocitos Th. 
Para ello se realizan los siguientes protocolos: 
 
a. LTh de bazo de ratones inmunizados, cultivados in vitro durante 4 días con los antígenos de T. 
gondii, y un control sin el antígeno. 
 
b. LB de bazo de ratones inmunizados, cultivados con los antígenos de T. gondii por 4 horas, más 
un control sin antígeno. Luego de dicho tiempo se agregan LTh de bazo de ratones 
inmunizados y se cultivan durante 4 días. 
 
c. Esplenocitos de ratones inmunizados y sin inmunizar, cultivados durante 4 días con los 
antígenos de T. gondii. 
 
d. Macrófagos peritoneales de ratones Balb/c, histoidénticos con la cepa de ratones inmunizadas, 
cultivados con los antígenos de T. gondii por 4 horas, más un control sin antígeno. Luego de 
dicho tiempo se agregan LTh de bazo de ratones inmunizados y se cultivan durante 4 días. 
 
e. Macrófagos peritoneales de ratas Wistar, cultivados con los antígenos de T. gondii por 4 horas, 
más un control sin antígeno. Luego de dicho tiempo se agregan LTh de bazo de ratones 
inmunizados y se cultivan durante 4 días. 
 
f. Macrófagos peritoneales de ratones Balb/c, histoidénticos con la cepa de ratones inmunizadas, 
infectados con T. gondii. Luego de dicho tiempo se agregan LTh de bazo de ratones 
inmunizados y se cultivan durante 4 días. (Nota: T gondii inhibe la expresión de las moléculas 
CMH en macrófagos infectados). 
 
Al cabo de 4 días se agrega Bromo de Uridina y a las 24 horas se evalúa la incorporación de la 
misma a las moléculas de ADN mediante un ELISA, donde las lecturas de las densidades ópticas son 
proporcionales a la linfoproliferación. 
 
 Crecimiento intracelular in vitro del parásito 
 DNP-BGG BSA 
Linfocitos histocompatibles con el cobayo normal, 
proveniente de animales inmunes a DNP-BGG 
Disminuido Normal 
Linfocitos histocompatibles con el cobayo normal, 
proveniente de animales inmunes a BSA 
Normal Disminuido 
Linfocitos histocompatibles con el cobayo normal, 
proveniente de animales no inmunizados 
Normal Normal 
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1- Realice un esquema del protocolo de cultivo en cada ítem, indicando en cada caso los 
resultados esperados. Justifique. 
 
2- Si todos los ensayos anteriores dieran linfoproliferación nula, ¿A qué podría deberse? ¿Qué 
evaluaría inicialmente antes de realizar todos estos ítems? 
 
3- ¿Cómo determinaría qué población linfocitaria T se obtiene posterior a la linfoproliferación? 
 
 
Problema 5 
Usted debe corregir el siguiente examen de inmunología, enumerando lo incorrecto, señalando lo 
correcto y fundamentando su corrección. 
 
SITUACION PROBLEMÁTICA 
Se desea cuantificar simultáneamente, por inmunofluorescencia, las poblaciones celulares CD4+ y 
CD8+ en sangre periférica equina. Dispone de los siguientes reactivos: 
 
1- AcM IgG3 anti CD4 equina, sin conjugar y conjugado con FITC 
2- AcM IgG3 anti CD8 equina, sin conjugar y conjugado con FITC 
3- AcM IgG1 anti CD3 equina, sin conjugar y conjugado con FITC 
4- AcM IgG2b anti CD4 equina, sin conjugar y conjugado con PerCP 
5- AcM IgG2a anti CD8 equina, sin conjugar y conjugado con PerCP 
6- AcM IgG2a anti CD3 equina, sin conjugar y conjugado con PerCP 
7- Ac policlonal anti IgG3 murina, sin conjugar y conjugado con PerCP 
8- Ac policlonal anti IgG3 murina,sin conjugar y conjugado con FITC 
9- Ac policlonal anti IgG2a murina, sin conjugar y conjugado con PerCP 
10- Ac policlonal anti IgG2a murina, sin conjugar y conjugado con FITC 
11- Ac policlonal anti IgG murina, sin conjugar y conjugado con FITC 
12- Ac policlonal anti IgG murina, sin conjugar y conjugado con PerCP 
 
Esquematice como procedería para cuantificarlas por IFI y dibuje los gráficos de punto obtenidos por 
citometría de flujo. Interprete los resultados. 
 
RESPUESTA 
 
1- Extraigo 8 ml de sangre y separo el suero 
 
2- Diluyo la sangre al medio con agua destilada 
 
3- Coloco 3 ml de sangre dil ½ en cada tubo con Ficoll Hypaque (FH) y centrifugo 15 minutos 
punto 2. 
 
4- Separo las PBMC con pipeta Pasteur de la capa anteada y lavo con PBS, centrifugando 5 
minutos. 
 
5- Resuspendo en PBS 1X 100 ul de PBMC (1x 107 PBMC/ml), le agrego 5 ul del AcM IgG3 anti 
CD4 equina conjugada con FITC y 5 ul del AcM IgG2a anti CD8 conjugada con PerCP e incubo 
a 37°C durante 30 minutos. Luego lavo con PBS 1X y centrifugo 5 minutos. Extraigo el 
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sobrenadante y resuspendo las células en 100 ul de PBS 1X. Coloco la muestra en el citómetro de 
flujo. 
 
6- Resultados e interpretación 
 
 
Problema 6 
Se dispone de una muestra de sangre periférica humana, cuya población celular es analizada 
mediante citometría de flujo sin emplear anticuerpos específicos para marcadores celulares. Indique 
en un gráfico de puntos FSC (tamaño) vs SSC (complejidad celular) como se visualizan las 
siguientes poblaciones celulares: monocitos, granulocitos, linfocitos. 
 
 
Problema 7 
Se dispone de células mononucleares purificadas a partir de sangre periférica de un paciente que 
presenta una deficiencia de linfocitos B y de un paciente normal. Se realiza una inmunofluorescencia 
directa con el conjugado mAb anti-human CD19-FITC. 
a. Grafique un histograma de fluorescencia para FITC, mostrando cómo se visualizarán las 
muestras de ambos pacientes 
b. Indique que control debe realizarse para llevar a cabo esta citometría de flujo 
 
 
Problema 8 (conceptual) 
¿Por qué en la citometría de flujo se emplean anticuerpos monoclonales y no policlonales? 
 
 
Problema 1. Simulación del recuento, cálculo de la viabilidad del cultivo y siembra. 
 
Introducción teórica: Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más 
común es el de tinción con azul de tripán, un coloide que penetra en el interior de las células muertas 
debido a que tienen alterada la permeabilidad de la membrana citoplasmática. Así, las células 
muertas se ven azules en tanto que las vivas son incoloras. 
El número de células totales puede calcularse según la siguiente fórmula: 
(∑células)/4 * Factor de dilución * 10.000 =………células/ml 
PROBLEMAS PARA RESOLVER EN EL ENTORNO VIRTUAL 
 CD4- FITC 
 
 CD8-PerCP 
CD4+ 
CD8+ 
CD4+ 
CD8- 
CD4- 
CD8- 
CD4- 
CD8+ 
Inmunología Básica - Talleres 2020 
 
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Donde el factor de dilución es la inversa de la dilución realizada para el recuento; 10.000 es el factor 
de conversión para expresar el nº de células por ml (el volumen de la cubeta es 0,1 mm3, que 
equivalen a 0,1 µl). 
La viabilidad de la suspensión celular se puede realizar calculando el porcentaje de células vivas 
respecto del total de células (vivas + muertas). 
 
Situación problemática: Se dispone de 5 ml de una suspensión de células NK. Se necesita preparar 
placas de Petri de 8 cm de diámetro (s = π x r
2
) con una densidad de 50.000 células/cm
2
. Para 
estimar la concentración de células de la suspensión inicial se han mezclado 20 μl de la 
suspensión con 20 μl de Azul de Tripán (AT). El recuento con la cámara de Neubauer fue el 
siguiente: 
 
 Cuadrícula 1 Cuadrícula 2 Cuadrícula 3 Cuadrícula 4 TOTAL /4 
VIVAS 76 73 74 77 75 
AT (+) 6 4 7 3 5 
 
En base a estos resultados: 
a) Calcular el número total de células de la suspensión inicia 
b) Calcular la viabilidad de la suspensión celular inicial 
c) Calcular el volumen de la suspensión celular inicial que debemos emplear en cada placa para 
obtener la densidad celular deseada 
 
 
Problema 2 
Se desea cuantificar, mediante inmunofluorescencia, las poblaciones celulares CD4+ y CD8+ en 
sangre periférica de equinos. Se encuentran disponibles los siguientes anticuerpos monoclonales 
conjugados: 
 
1- Anticuerpo monoclonal IgG3 anti-CD4 equina, conjugado con FITC 
2- Anticuerpo monoclonal IgG2a anti-CD2 equina, conjugado con FITC 
3- Anticuerpo monoclonal IgG1 anti-CD3 equina, conjugado con FITC 
4- Anticuerpo monoclonal IgG2b anti-CD4 equina, conjugado con Rodamina T 
5- Anticuerpo monoclonal IgG2a anti-CD8 equina, conjugado con Rodamina T 
6- Anticuerpo monoclonal IgG1 anti-CD3 equina, conjugado con Rodamina T 
 
Seleccione el par de AcM adecuados y seleccione el gráfico de tipo dot plot que represente cómo se 
visualizarían las poblaciones celulares correspondientes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Problema 3 
Se pretende analizar el porcentaje de monocitos en una muestra purificada de sangre periférica 
humana. Indique cuál de los siguientes anticuerpos (hechos en ratón) conjugados a FITC utilizaría. 
 
o mAb- IgG1 anti human CD14 
o mAb- IgG1 anti human CD4 
o mAb- IgG1 anti human CD16 
o mAb- IgG2 anti mouse CD14 
o mAb- IgG2 anti mouse CD4 
o mAb- IgG2 anti mouse CD16 
 
a. Con el objetivo de determinar la población positiva, para llevar a cabo la citometría de flujo 
se deben realizar los controles negativo y de isotipo adecuados. Seleccione la opción correcta, 
en base a la definición de los mimos: 
1- Control negativo: realizado con una muestra de cualquier población celular marcada con 
el anticuerpo seleccionado. 
2- Control negativo: realizado con la muestra que contiene la población celular a estudiar, 
sin marcar con el anticuerpo. 
3- Control negativo: realizado con una dilución apropiada del anticuerpo seleccionado, sin 
células. 
4- Control de isotipo: control de reactividad inespecífica, llevado a cabo con IgG1 murina 
conjugada con FITC, no dirigida contra ningún antígeno específico de monocitos. 
Fluorescencia 
N
° 
d
e 
cé
lu
la
s 
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5- Control de isotipo: control de reactividad inespecífica, llevado a cabo con IgG2 humana 
conjugada con FITC, no dirigida contra ningún antígeno específico de monocitos. 
6- Control de isotipo: control de reactividad inespecífica, llevado a cabo con la población 
celular en estudio (monocitos) sin marcar con el anticuerpo. 
 
 
Problema 4 
Indique cuál de los siguientes anticuerpos conjugados a fluoróforos utilizaría para estudiar las 
poblaciones celulares en una muestra de sangre periférica purificada: 
 
a. Población de LT helper 
b. Población de LT citotóxicos 
c. Población de LT totales 
d. Población de LB 
e. Población de NK 
f. Población de Monocitos 
g. Población de Neutrófilos 
 
Conjugados disponibles: 
 mAb-anti human CD45-PE 
 mAb-anti human CD2-PE 
 mAb-anti human CD3-PE 
 mAb-anti human CD4-PE 
 mAb-anti human CD8-PE 
 mAb-anti human CD14-PE 
 mAb-anti human CD15-PE 
 mAb-anti human CD19-PE 
 mAb-anti human CD56-PE 
 mAb-anti human CD45-FITC 
 mAb-anti human CD2-FITC 
 mAb-anti human CD3-FITC 
 mAb-anti human CD4-FITC 
 mAb-anti human CD8-FITC 
 mAb-anti human CD14-FITC 
 mAb-anti human CD15-FITC 
 mAb-anti human CD19-FITC 
 mAb-anti human CD56-FITC