EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (8)

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Purificación de proteínas.
Fines del siglo XIX, Eduard Büchner obtiene evidencias que prueban la falacia del vitalismo. Nace la bioquímica => el objetivo es aislar cada componente celular a su estado puro para conocer a nivel molecular su estructura y funcionamiento.
~1930. Sumner cristaliza la ureasa y demuestra que las enzimas son proteínas.
Luego de E. Büchner: Funciones celulares 	Estructura
Partir de extractos celulares y aislar componentes
Con la biología molecular: Estructura 	Funciones
Posibilidad de producción recombinante. Genómica. Proteómica
Importancia de purificar las macromoléculas para identificar funciones (inequívocamente)
Purificación de Enzimas: Fuente natural o recombinante
Vegetal. Algunas plantas de cultivo son excelentes fuentes de proteasas (papaína), amilasas, peroxidasa, ureasa.
Los animales y las plantas fueron las fuentes originales y siguen siendo
en muchos casos utilizadas, pero se presentan limitaciones de importancia en procesos de producción.
Microorganismos. Son una fuente importante de enzimas, habiendo una relación directa entre el amplio número de microorganismos y la diversidad de enzimas a obtener. También, enzimas similares pueden encontrarse en distintos microorganismos: Ej. 7 fuentes microbianas de glucosa oxidasa y 8 de α-amilasa.
Producción de proteínas de fuente natural Origen de la enzima
Animal. Algunos tejidos y órganos son fuentes importantes de enzimas. Ej. lipasas, esterasas, proteasas (quimotripsina, renina, tripsina), lisozima (clara de huevo), uroquinasa.
Aspergillus niger.
Lipasa, amiloglucosidasa, proteasa, α-amilasa, fosfolipasa, fitasa, glucosa oxidasa, pectinasa, pectina esterasa, celulasa, catalasa, α-galactosidasa, inulinasa, β-glucanasa, arabinasa, galactomanasa.
Bacillus spp. y Aspergillus spp. (no recombinantes) pueden
alcanzar producciones de enzimas del orden de 20 g/l. La producción puede ser intracelular o extracelular.
Hay una amplia variedad de ambientes para distintos organismos, por lo que existe un amplio potencial de obtención de enzimas con características de estabilidad en condiciones particulares y de interés para usos industriales. El desarrollo de metodologías de ADN recombinante incrementó	el interés del uso de microorganismos para la producción de enzimas.
Otras moléculas
Antígenos
Anticuerpos
Moléculas bio-activas
Enzimas
Hormonas
Factores de
 crecimiento	
-Industria farmacéutica
-Detergentes
-Alimentos
-Textil
-Papel
-Vacunas
-Equipos de diagnóstico
Insulina, Eritropoyetina humana, Interferones, factores de coagulación sanguínea, interleuquinas, factores de crecimiento, Superóxido dismutasa, Proteasas, amilasas, glucosa isomerasa, etc
Antígenos Hepatitis B, malaria, herpes, HIV.
Enzimas industriales, año 2002, U$ 1800 millones
Ingeniería genética
Biotecnología	Investigación
Producción de proteínas recombinantes
Se pueden incorporar herramientas para: aumentar la expresión y/o hacer más sencilla la purificación (etiquetas)
Purificar para demostrar la función de una estructura.
“No dilapidar pensamientos brillantes en enzimas sucias”	Efraim Racker
La purificación está basada en una estrategia clásica de dominación: “Divide y reinarás”
Poder separar la proteína de interés del resto de las proteínas (y de componentes moleculares no deseados).
Necesidad de cuantificar proteínas y la actividad enzimática
La estrategia de purificación está basada en las propiedades fisicoquímicas y funcionales derivadas de la estructura:
Masa molecular: Péptidos ~103 Da, proteínas ~104-106 Da
Forma y volumen (radio de Stokes):
Coeficiente de difusión/fricción
Coeficiente de sedimentación (S) Viscosidad intrínseca
Movilidad en gel (particulado o reticulado)
Carga:
Carga neta y distribución. Punto isoeléctrico. Movilidad electroforética
Hidrofobicidad superficial
Solubilidad
Unión a ligandos biospecíficos
La purificación de proteínas tiene como objetivos:
Eliminar tanto como sea posible aquellas proteínas que no posean la actividad funcional específica buscada, es decir, lograr pureza.
Recuperar la mayor cantidad de proteína activa.
Para este fin se realizan determinaciones analíticas	y cálculos en cada etapa. Básicamente esas determinaciones son:
Determinación de la actividad biológica (medida de la cantidad de proteína funcional). Si la proteína es una enzima, la actividad biológica es la actividad enzimática.
Determinación del contenido proteico (medida de la cantidad de proteínas presentes)
Determinación del volumen y cálculo de la recuperación y la purificación de los pasos de purificación. Análisis cromatográfico, electroforético y otros de las fracciones obtenidas.
Decisiones previas
1- Material de origen (tejido, fluido, cultivo)
2- Grado de pureza final deseado.
3- Escala.
4- Método de seguimiento del proceso con identificación de componentes específicos (actividad biológica, masa molecular, reactividad inmunoquímica) y generales (contenido proteico).
Etapas
1- Obtención de la proteína soluble
2- Aplicación de diversas técnicas separativas
3- Control del proceso (tabla de purificación)
4- Control final del producto
Proceso de separación
Bases de la separación
Precipitación (fraccionamientos)
Salina Solventes Isoeléctrica
Por calentamiento
Inmunoquímica
Cromatografía
Intercambio iónico Fase reversa Hidrofóbica Exclusión molecular Afinidad
Centrifugación Ultrafiltración Electroforesis
Solubilidad Solubilidad Solubilidad, pI
Estabilidad térmica
Reconocimiento inmunoquímico (bio- específico)
Carga, distribución Hidrofobicidad Hidrofobicidad Tamaño (MM) , forma
Interacción bio-específica. MM, forma, densidad
Tamaño (MM), forma (radio Stokes) Carga, masa, tamaño y forma
Etapas
1- Obtención de la proteína soluble
Disrupción y homogeinización
Clarificación (filtración centrifugación)
Condiciones a controlar desde el principio y durante todo el proceso: depende de cada proteína
Solvente (presencia de detergentes, caotropos, sales)
Temperatura, pH, fuerza iónica
Adición de inhibidores de agentes desestabilizantes (ej. proteasas)
Estabilizantes, cofactores
Reductores (protección para evitar oxidación de grupos sulfhidrilos de cisteínas: -SH  -S-S-)
Quelantes
Procedimiento de purificación
Elección del organismo o célula. Si es posible en el estadio que contenga la mayor cantidad de enzima. “Purificación” inicial de la fuente.
Medio de recepción del material.
Ruptura. Paso clave, para obtener el material activo.
Métodos de ruptura.
Químicos.	Enzimáticos
Solventes Quelantes
Físicos.
Sonicación Presión
Agitación (abrasivos) Licuado
bead beater 
Table 1. Techniques used for the physical disruption of cells.
Lysis Method
Description	Apparatus
Mechanical
Waring Blender Polytron
Rotating blades grind and disperse cells and tissues
Liquid Homo- genization
Dounce Homogenizer Potter-Elvehjem Homogenizer French Press
Cell or tissue suspensions are sheared by forcing them through a narrow space
Sonication	Sonicator	High frequency sound waves shear cells
Freeze/ Thaw
Freezer or dry ice/ethanol
Repeated cycles of freezing and thawing disrupt cells through ice crystal formation
Manual grinding
Mortar and pestle
Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen
Técnicas de disrupción para lograr un homogenado
Primeros pasos de purificación.
Importancia de reducir volumen.
Fraccionamiento.
Extracción con solventes. Tratamientos térmicos.
Fraccionamiento por pH. Fraccionamiento salino.
Dispositivos para ultrafiltración por centrifugación o presión Uso de membranas semipermeables con distinto límite de corte (cut-off 3K, 10K, 30K y otros)
2-Procesos de separación
y acondicionamiento
Clarificación y fraccionamiento (filtrado, centrifugación, fraccionamientos por precipitación)
Cromatografías
Procesos de concentración y reacondicionamiento intermedios (filtración por geles, ultrafiltración, diálisis)
Principios de la centrifugación
Fc es proporcional al radio degiro.
Coeficiente de sedimentación. Svedberg.
Separación cromatográfica
Cromatografía de adsorción, el cromatograma típico :
Cromatografía en columna :
	Etapa	Vol.
(ml)	[Proteína]
(mg/ml)	Proteína
Total (mg)	Actividad
Enzimática (U/ml)	Act. Enz.
Total (U)	Act. Enz.
Específica (U/mg)	Rend.
(%)	Purif.
(veces)
	Extracto crudo							100	1
	Sulfato amonio 40-60%								
	DEAE-celulosa								
	Cromatografía de afinidad								
Seguimiento del proceso: La tabla de purificación
Aunque parezca algo menor, es importante analizar y comprender qué significa cada columna en una tabla de purificación. Herramienta para evaluar la eficacia del procedimiento empleado.
Tabla de Purificación
Paso	Volumen (ml)
Proteína:	Total (mg)	Concentración (mg/ml)
Actividad: Concentración (U/ml)	Total (U)
Específica (U/mg) U= µmol/min
Purificación= Act. Esp. Paso n / Act. Esp. Paso 1 Purificación Parcial= Act. Esp. Paso n /Act. Esp. Paso n-1 Rendimiento= Act. Total paso n / Act. Total paso 1 Rend. Parcial= Act. Total paso n / Act. Total paso n-1
Objetivo: Alcanzar la máxima purificación con el mayor rendimiento.
¿Cuál protocolo recomendaría, siguiendo los requerimientos establecidos?
Ud. es contratado por una empresa de biotecnología para que decida y haga el escalamiento respecto a la producción de…
El protocolo más recomendable es el II. Podría ser el III, dependiendo del requerimiento de pureza. El procedimiento de obtención de la enzima en forma recombinante produce niveles de expresión un orden de magnitud superior a la fuente natural. Los protocolos I y II permitirían obtener la enzima con similar grado de pureza, pero una tabla de purificación no da certeza respecto a la pureza. Esta última hay que establecerla de otra forma, empleando otros procedimientos.
La actividad específica (U/mg) refleja el grado de pureza alcanzado, antes que la purificación (que depende del grado de impurezas presentes en el extracto crudo). Ensayada en idénticas condiciones, la actividad específica de una enzima pura debe dar el mismo valor, característico de la misma.
Pero, no necesariamente se conoce cuál es la actividad específica de la enzima pura y, de nuevo, una tabla de purificación no da certeza respecto a la pureza. Las veces de purificación es relativa a la pureza relativa en el paso inicial. La pureza hay que establecerla de otra forma, empleando otros procedimientos.
Diferentes pasos cromatográficos.	¿Hasta cuándo purificar?
Criterios de pureza.	Criterio: Regla para conocer la verdad.
Hay que utilizar un método de análisis que resuelva (separe) proteínas para identificar sus presencias en la muestra individualmente. Cuanta mayor resolución tenga el método, más certero (confiable) es el resultado (la estimación de la pureza).
Más adecuados
Única banda proteica
Métodos de alta resolución de proteínas que dan alto
grado de confianza
Electroforesis
Almidón (geles de)
PAGE: en gel de poliacrilamida
(2-D)
Ultracentrifugación
Ultracentrífugas analíticas y preparativas
En principio se usa PAGE y no SDS-PAGE, porque no necesariamente se conoce la estructura cuaternaria homo o hetero de la proteína en estudio. Puede hacerse tinción de proteínas acompañada de identificación con anticuerpos específicos.
Lo que muestran las figuras indica: 1. La proteína está pura y está compuesta por dos subunidades de distinto tamaño. 2. La banda proteica observada en PAGE corresponde a dos proteínas de igual relación carga a masa pero distinto tamaño.
El uso de electroforesis bidimensional fortalece el criterio, porque se usan dos métodos separativos (con diferente principio de resolución).
1. La proteína está pura y está compuesta por dos subunidades de distinto tamaño.
Aquí, la pregunta a responder era si, en la figura de la izquierda, las muestras Sy y An (la misma enzima que Sp, pero de distintas fuentes) estaban purificadas a homogeneidad y compuestas por una única subunidad.
La figura de la derecha indica que
la respuesta es Sí. Al menos indica que si Sy o An tuvieran
estructura heterooligomérca, las distintas subunidades tendrían
igual punto isoeléctrico y tamaño.
El revelado por el uso de anticuerpos y/o de medida de actividad enzimática en el gel son de gran ayuda para establecer la identidad y la purificación de la enzima.
Zimograma