EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (3)

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MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE	MACROMOLÉCULAS
Clase Teórica
PARÁMETROS HIDRODINÁMICOS
Difusión, Fricción, Radio de Stokes 2021
Parámetros hidrodinámicos
Modelos conformacionales.
Coeficiente de difusión y coeficiente de fricción. Radio de Stockes.
Coeficiente de sedimentación
Sedimentación en la ultracentrífuga Métodos de velocidad de sedimentación y equilibrio de sedimentación.
Los métodos hidrodinámicos de separación y caracterización son aquellos en los que la macromolécula se desplaza en medios fluidos, debido a distintos tipos de fuerzas, ya sea fuerzas generadas por gradientes propios o fuerzas externas aplicadas.
Ese movimiento en todos los casos va a depender de parámetros moleculares como la forma, el volumen o tamaño (y además de otros parámetros, según el método), la flexibilidad, y la hidratación.
Entre los parámetros dependientes de la forma, tamaño y flexibilidad de las macromoléculas desarrollaremos los siguientes:
Coeficiente de difusión (D) – Coeficiente de fricción (f)
Radio hidrodinámico o Radio equivalente de Stokes (RS)
Los métodos y parámetros hidrodinámicos: Difusión (D), fricción (f) y Radio de Stokes (Rs)
De estos	parámetros hidrodinámicos dependen:
El	volumen de elusión en la cromatografía de filtración por geles (Ve)
La movilidad electroforética (μel)
El coeficiente de sedimentación (s) en	centrifugación
El conocimiento de los parámetros hidrodinámicos ayuda a predecir el comportamiento de las macromoléculas en esos procesos y viceversa, el resultado de aplicar algunos de esos procesos aporta información acerca de los parámetros. Y hay otros parámetros como la viscosidad intrínseca [η] que en algunos casos se determina explícitamente con la finalidad de evaluar los cambios de forma de una macromolécula.
Folding of Elongated Proteins: Conventional or Anomalous? Tzachi Hagai, and Yaakov Levy.
J. Am. Chem. Soc., 2008.
Colágeno
Moléculas T4DNA (L aprox. 55 um), moviéndose libremente en solución , observadas con microscopía de fluorescencia
Polímeros sintéticos: random coil
Las macromoléculas adoptan distintas formas
El	conocimiento
preciso	de	la	estructura	tridimensional	lo
brinda la cristalografía de rayos X.
Dependiendo	del	tamaño,	se	puede	conocer	con	menor
precisión la forma y el	tamaño	por microscopía electrónica.
Pero más allá de que se conozca la verdadera forma y tamaño, resulta imposible, para analizar los distintos fenómenos que se producen, y que dependen de ellos, generar ecuaciones que contemplen la estructura particular de cada una.
Por eso se recurre a modelos de partículas	que se aproximen a las distintas formas reales
GLOBULARES
proteínas
ESFERA
Elipsoides de revolución
Oblato
Prolato
ELONGADAS
Barra, filamento
ADN, polisacáridos, proteínas
OVILLO ESTADÍSTICO
(RANDOM COIL)
Polímeros sintéticos, polisacáridos, proteínas y ADN desnaturalizados
MODELOS CONFORMACIONALES
El coeficiente de difusión – fricción
Las moléculas se mueven constantemente debido a la energía de agitación térmica con un movimiento azaroso (en todas las direcciones).
Si la distribución del conjunto de moléculas es homogénea, los distintos movimientos se compensan y no hay movimiento neto.
Si existe una diferencia de concentración (gradiente de potencial químico) se va a producir un movimiento neto desde la zona de mayor concentración a la zona de menor concentración.
El flujo J : número de moléculas que por unidad de área y tiempo
atraviesan el plano en la dirección x:
J = 1/A. dni/dt
Ji = civi ;	Fimp = f	vi ;	NA f= 1/ Ui ;	Ui= movilidad Fimp = -grad μ = -d μ/dx
Ji=	- ui ci d μ/dx	= - uiRT	dci/dx = -D dci/dx.
Primera ley de Fick
El coeficiente de difusión y el coeficiente de fricción:
D= Ui RT ;	D=	RT/NA f
Si solo tenemos en cuenta	la difusión térmica y en una dirección:
Ji= -D dci/dx
Coeficiente de Difusión (D):
Unidades en las que se expresa generalmente [cm2/s]
Unidades en las que se expresa generalmente
[g/s]
Coeficiente de Fricción (f):
D 	RT
NA f
RT NA D
f	
¿Cómo depende el coeficiente de fricción (f) de las dimensiones y la forma de la partícula?
Para una esfera, de acuerdo a la ley de Stokes:
f = 6 π η R
Para otras formas geométricas, también existen fórmulas que permiten el cálculo de f (elipsoides de revolución, polímeros flexibles, etc.)
Queda claro que f (o D) dependen de la forma y tamaño.
La forma que da el menor coeficiente de fricción es la que posee, para una determinada masa, la menor superficie, o sea la esfera.
¿ Se puede conocer o predecir el comportamiento hidrodinámico de una macromolécula conociendo la masa , el volumen y la hidratación?
	Conociendo la masa, el coeficiente de hidratación y el volumen específico parcial, se puede calcular el volumen de la molécula, pero no la forma y por ende solo excepcionalmente se puede predecir el comportamiento hidrodinámico.
Por lo tanto, es necesario plantear algún modelo y realizar ciertas simplificaciones.
Relación entre la masa, el volumen y la hidratación de la partícula macromolecular
Si asumimos un modelo de macromolécula compacta e hidratada
Macromolécula anhidra:
Masa de la partícula anhidra: M/NA Volumen específico: v2
Solvente asociado:
v1 : volumen específico del solvente
δ	: gramos de solvente/gramo de proteína anhidra (coeficiente de hidratación)
Masa de solvente asociado:	δ M/NA
Solvente libre
Volumen específico: v10
A
P
N
M		M	1  
0
1
2
N
 M 
A
P
v	 v	
V	
1
N
A
P	2
V		M	v	 v 
1
2
v	


2 PTg



g
 V 
En base a ese modelo, la masa y el volumen de la partícula hidratada resultan:
Como el Vp queda en función del volumen específico del solvente asociado, y este valor no se conoce, si primero se define el volumen específico parcial de la
macromolécula
Donde g2: gramos de soluto
Se puede demostrar que es posible reemplazar la suma entre paréntesis en la expresión anterior de Vp	por otra equivalente y obtener la expresión del volumen
de	la	partícula	hidratada	en	función	del	volumen	específico	parcial	de	la macromolécula y el del solvente puro :
El coeficiente de fricción mínimo
En general, f/ fmín>1 y esto ocurre,	porque la macromolécula no es esférica, o porque está hidratada, o ambas causas.
En general, un valor aproximado para proteínas nativas es un coeficiente de hidratación
δ= 0,2 - 0,3 y el volumen específico parcial adopta un valor promedio de 0.73 cm3/g
Así sabemos	que	para partículas	esféricas,	de igual	densidad	o	volumen	específico	e hidratación, el radio crecerá con la raíz cúbica de la masa y también lo hará f.
De lo contrario, debe quedar claro que si las formas son diferentes, la relación entre el radio y la masa ya no posee una dependencia predecible.
Conociendo la masa y el volumen específico parcial (generalmente la hidratación no se conoce) solo se podrá calcular su coeficiente de fricción si asumimos que tiene una determinada forma geométrica, por ejemplo si es una esfera:
Vesfera = 4 ( π R3) /3
se puede despejar el radio y luego calcular f con la ecuación de Stokes.
Pero este radio y coeficiente solo serán los reales si la macromolécula es una esfera y no
está hidratada
De lo contrario, lo que podemos decir es que es el mínimo coeficiente de fricción fmin que podría tener, de acuerdo a su masa y volumen específico parcial.
 3Mv	1/ 3
 4NA 
fmin  6	2 
El radio equivalente
Para las formas reales que adoptan las macromoléculas en general la relación entre el radio y la masa no posee una dependencia predecible. Salvo en casos en que se pueda aproximar a otras formas geométricas definidas (ej. prolato, oblato) pero la relación es más compleja.
O sea no se puede inferir un radio, una masa o un volumen exactos a partir de un comportamiento hidrodinámico que depende de la forma y el tamaño y viceversa, debido a que se desconoce la ecuación que los relaciona y por simplicidad, lo que se hace es trabajar con el radio equivalente.
El radio equivalente para cualquier propiedad hidrodinámicaes el radio de la esfera equivalente que posee el mismo valor de una determinada propiedad en solución, que la de la macromolécula bajo consideración.
Como muchos fenómenos de interés dependen del coeficiente de fricción (o difusión), definiremos el radio equivalente en relación a esta propiedad. Pero también podría definirse el radio de la esfera equivalente en función de la viscosidad intrínseca, radio de giro, etc.
El radio de la esfera equivalente
o radio de Stokes
Se	define	como	el	radio	de	la	esfera	que	tiene	el	mismo
coeficiente de fricción que la partícula.
Si se conoce el valor del coeficiente de fricción real, el radio de Stokes se calcula despejando de la ecuación de Stokes,
En general, las otras propiedades hidrodinámicas aparecen dependiendo del radio de Stokes (la movilidad electroforética, el volumen de elusión en cromatografía de exclusión molecular, etc.)
freal	 6RStokes
Un ejemplo para comprender el concepto de Rs y Rmin (fmin)
Para la lisozima se conoce el coeficiente de fricción real, freal= 3,925 10-8 g/seg, el v2=0,688 cm3/g y la masa molecular 14.100 g/mol.
A partir de freal = 6 π η RS se puede despejar Rs= 20.8 10-8 cm = 20.8 Å
Por otro lado , el fmin lo calculamos suponiendo que la lisozima es una esfera y no está hidratada. Entonces igualando su volumen al de una esfera no hidratada, se puede obtener el valor del Rmin :
Vp= M (v2 )/NA y Vesfera= 4 (πR3)/3
Si igualamos el volumen de la partícula al volumen de la esfera se puede despejar el
Rmin= 15,68 10-8 cm = 15,68 Aº
e introduciéndolo en la ecuación de Stokes , se calcula fmin = 2,956 10 -8 g/seg
Entonces la relación f/fmin=1,32
Por lo que vemos no es una esfera, o está hidratada, o ambas cosas.
Si por otro lado, con el valor del radio de Stokes, calculamos el volumen de la esfera equivalente Vesfera eq = 3,769 10 -20 cm3, y si con este volumen calculamos la hidratación correspondiente despejando de
1
Vp = M/ NA ( v2 + δv0 ) , con los datos reales de M y de v2 ,
se calcula un δ= 0.91 (91 % de hidratación)
Valor muy alto como es lógico de esperar, ya que en realidad la proteína no es esférica, es menos simétrica y su esfera equivalente tendría que tener un radio mayor que el mínimo. Como el volumen específico y la masa molar son los reales, para lograr esa
esfera, debería tener una gran cantidad de agua asociada.
Aplicación del concepto de Rs en los métodos hidrodinámicos
La	movilidad	electroforética	depende	del	coeficiente	de fricción real, o sea de lo que llamamos el radio de Stokes:
Muchas veces utilizamos este método con la finalidad de conocer la masa. Si asumimos formas semejantes, no necesariamente esféricas, podemos establecer una relación cuantitativa experimental entre la movilidad y la masa (radio de Stokes), utilizando patrones que posean formas parecidas, o bien induciendo en todas las macromoléculas una misma forma.
S	S
ef
Qp  f KRS 
6R	 1 KR	
	
El volumen de elusión en cromatografía de filtración por geles depende del radio de Stokes
Use of Fast Protein Size-Exclusion Liquid Chromatography To Study the Unfolding of Proteins Which Denature through the Molten Globule. Vladimir N. Uversky Biochemistry 1993,32, 13288-298
A medida que una proteína se desnaturaliza aumenta el radio de Stokes y disminuye el Ve en una columna de filtración por geles.
En la figura se observa cómo va decreciendo Ve para la lisozima a medida que aumenta progresivamente la concentración del agente desnaturalizante (cloruro de guanidinio) desde 0 M (1) hasta 6.2 M (7).
El radio de Stokes aumenta al desnaturalizarse una proteína
Como el Ve de elusión en una columna de filtración por geles va a depender del radio de Stokes, si utilizamos esta propiedad para conocer la masa, debemos utilizar patrones de forma semejante. En la gráfica y ecuaciones abajo descriptas se observa que la dependencia entre Rs y MM es diferente para las mismas proteínas si se encuentran nativas (Ec. 1) o desnaturalizadas (Ec.2)
	Macromolécula	Masa molecular
(g/mol)	Volumen especifico parcial v2
(cm3/g)	D (H2O)
(cm2/s)
	Catalasa	250.000	0.73	4.1 10-7
	Hemoglobina	68.000	0.749	6.9 10-7
	Albúmina	65.000	0.734	5.9 10-7
	Ovoalbúmina	45.000	0.748	7.7 10-7
	Ribonucleasa	16.683	0.728	11.9 10-7
	Tropomiosina	95.000	0.71	2.24 10-7
	Fibrinógeno	330.000	0.79	2	10-7
	Colágeno	345.000	0.69	0.69 10-7
Bibliografía sugerida
Physical chemistry of macromolecules. C. Tanford. Wiley & Sons 1961.
John
Ortega A., García de la Torre, J. Equivalent Radii and Ratios of Radii from Solution Properties as Indicators of Macromolecular Conformation, Shape, and Flexibility. Biomacromolecules	2007, 8, 2464-2475.
Bioquímica Física, Van Holde
Macromoléculas: estructura y funciones, Finn Wold
Fisicoquímica con aplicaciones a sistemas biológicos,
Raymond Chang
Continuamos con el siguiente tema …..
CLASE TEÓRICA
Tema: Electroforesis
2021
Fenómenos electrocinéticos
Ecuación	de	velocidad
y	movilidad	electroforética:
dependencia funcional
Flujo electroosmótico
Fundamentos y métodos de los distintos tipos de electroforesis: papel, acetato de celulosa, agarosa, geles de poliacrilamida
Electroforesis en condiciones nativa y desnaturalizante
Isoelectroenfoque
Electroforesis bidimensional
Inmunoblotting
Contenidos a desarrollar:
Conceptos previos:
Las proteínas como macroiones. Carga. Punto isoeléctrico. Radio de Stokes.
Estructura de proteínas.
Desnaturalización
Las macromoléculas como macroiones
Las proteínas, los ácidos nucleicos y algunos polisacáridos se pueden considerar
macroiones con forma, carga y distribución de cargas particulares para cada uno.
Las cargas en las macromoléculas:
En las proteínas, la carga se origina en los grupos R y en
los grupos amino y carboxilo terminales.
En los ácidos nucleicos los fosfatos son los portadores de las cargas.
En los polisacáridos, generalmente heteropolisacáridos, proviene de los residuos azúcar oxidados o sustituidos y pueden ser grupos ácidos (carboxilatos, sulfatos) o básicos (aminas).
El macroión, su nube iónica o doble capa eléctrica y el potencial zeta
Los iones, además de estar hidratados se rodean de una nube iónica de carga opuesta y densidad decreciente hacia el seno de la solución.
La carga origina un potencial eléctrico
También	para	las
potencial
eléctrico va a depender no solo de su carga sino de la fuerza iónica de la solución y varía exponencialmente con la distancia
a
x
macromoléculas,	el
y
Este potencial eléctrico, debido al ión central y su nube iónica, disminuye exponencialmente con la distancia r (Teoría de Debye-Hückel).
La expresión,	para iones pequeños:
z
r
Ψ= Q ( e - k(r-a)) / Dr (1+ kr)
Para un macroión
I
I
R
a
		II	III	
	El co Po	potencial eléctrico en la superfici rte	(separación, cizalla) se denom tencial zeta : ζ	e de ina
			
El potencial zeta disminuye al aumentar la fuerza iónica
Cuando la macromolécula se mueve, lo hace junto con la capa de hidratación y iones firmemente adheridos.
Para un macroión compacto, con distribución simétrica de cargas en su superficie, en la región III, la expresión del potencial eléctrico, es igual que la de Debye-Hückel.
Ψ= Q ( e - k(r-a)) / Dr (1+ kr)
El potencial eléctrico Ψ en la superficie de corte	( que separa lo que está fijo de lo que se mueve) se denomina potencial zeta, y se puede expresar como:
(ζ =Ψ , para r ≈ a ≈ R)
ζ =	Q / DR ( 1+κR)
Q = carga;	D =	constante dieléctrica, R = radio del macroión
κ = B I
cte de Debye-Hückel
I = fuerza iónica I = 1/2 ∑zi2ci
En general, la doble capa eléctrica y el potencial eléctrico aparecen en superficies sólidas cargadas en contacto con líquidos.
	Influyen en muchos fenómenos dinámicos en que participan las macromoléculas: electroforesis, interacción con otras macromoléculas, sedimentación, etc.
También el fenómeno de la doble capa eléctrica y el potencial zeta, en superficies sólido-líquido , originan la electroósmosis, que se desarrollará mas adelante .
ELECTROFORESISLa mayoría de los polímeros biológicos (biopolímeros) poseen carga eléctrica y, por lo tanto, son capaces de migrar bajo la influencia de un campo eléctrico. El transporte de partículas a través de un disolvente mediante un campo eléctrico recibe el nombre de electroforesis.
Una forma usual de caracterizar una macromolécula es la determinación de la velocidad con que se mueve al someterla a un campo eléctrico. Esta propiedad puede ser utilizada para calcular la masa molecular de una proteína, para distinguir moléculas por su carga neta o su forma, para detectar cambios de aminoácidos, de restos polares o no polares y para separar distintas especies moleculares.
Vamos a ver entonces estos procesos y sus aplicaciones.
Breve descripción de los principios de la electroforesis:
Si una partícula con carga q suspendida en un medio aislante se encuentra en una campo eléctrico E, la partícula se moverá a una velocidad constante v, determinada por el balance entre la fuerza eléctrica Eq, y la resultante del rozamiento con el medio fv, donde f es el coeficiente de
fricción, esto es,
La movilidad μ, se define como la velocidad que toma la partícula por unidad de campo,
Eq 	fv
 	v		q
E	f
La electroforesis es un método esencialmente analítico
De acuerdo a la variante técnica que se utilice permite la separación y el análisis en función de:
Carga/radio hidrodinámico: Q/Rs (libre)
Q/Rs y Rs absoluto (PAGE-nativo)
Rs → masa molecular (PAGE-SDS)
pI (isoelectroenfoque)
El medio de migración:
Electroforesis libre
Electroforesis sobre soportes:
Papel
Acetato de celulosa
Agar-agarosa.
Acrilamida (no hay flujo electroosmótico)
	Electroforesis capilar (el flujo electroosmótico es muy importante)
ELECTROFORESIS
LIBRE
1937-Tiselius (Premio Nobel-1948)
ELECTROFORESIS
EN SOPORTES
ELECTROFORESIS
CAPILAR
En la actualidad
AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD
Electroforesis	libre
La velocidad aumenta si aumentan la movilidad y el campo eléctrico aplicado.
El campo eléctrico aumenta con la intensidad (I) o densidad de corriente
(i)	y	disminuye		con	el		aumento	de	la	conductividad	X	(función	de	la concentración,	carga	y		movilidad	del		electrolito).	Conviene	que	la
conductividad no sea alta.
vef
 ef	E
I			i X S		X
E 
E  V		I R	R 		1	L	i 		I L			L		X	S		S
+
Fuerza friccional: Ff
Fuerza eléctrica: Fe
_
Polo positivo
+
La velocidad y movilidad electroforética libre
Si un ión pequeño de carga q se somete a un campo eléctrico en un medio salino diluido, se genera una fuerza eléctrica que lo desplaza hacia el polo de	carga	opuesta	y	aparece	una	fuerza	de	fricción	en	sentido	contrario proporcional a la velocidad v
Polo negativo
Cuando se igualan ambas fuerzas, el ión se desplaza con una velocidad :
Ecuación de Hückel:
Para iones pequeños en medios salinos muy diluidos
e
F	 q E
Ff	 6Rv
qE
6R
v 
q
E	6R
 	v	
ef
f (R)
6

 D
La movilidad electroforética libre de una macromolécula
Para iones macromoleculares y en medios salinos no tan diluidos de acuerdo a Henry:
Qp es la carga del macroión (Qp = Zp.e)
(Zp es la valencia neta promedio	y e es la carga	elemental)
 es la viscosidad del medio
f(κR) es el factor de Henry. Depende del tamaño del macroión y de la fuerza iónica
R es el radio del macroión. En la práctica se considera el radio de Stokes (RS)
κ es la constante de Debye-Hückel, que depende de la fuerza iónica ζ es el potencial zeta del macroión.
Qp
DR(1   R)
	
Ecuación de Henry
(para macromoléculas en medios salinos no muy diluidos)
La movilidad electroforética libre depende de:
Relación Qp/Rs (Q → pH)
Partículas con igual relación Q/Rs no se pueden separar por electroforesis libre
I (fuerza iónica) a través de
 (viscosidad del medio)
Reemplazando ζ en la expresión de la movilidad:
Qp	f (R)
ef
6 R (1   R)

  B	I
-1
0
2
3
1
log KR
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
f(KR)
f(κR)	varía entre 1 y 1,5 con κR
Si κR	es pequeño, menor que 1, la ecuación de movilidad
se simplifica a la ecuación de Hückel
Si κR es mucho mayor que 1 , corresponde a la ecuación
de Smoluchowsky (igual a la expresión de la velocidad electroosmótica).
f(κR) es función del radio de Stokes y de la fuerza iónica
Sobre soporte aparecen otros fenómenos adicionales
Adsorción
Tortuosidad
Evaporación del solvente
Electroósmosis
Efecto de tamiz
Los más importantes
Electroósmosis
La electroforesis puede definirse como la migración de un sólido respecto del líquido por la acción de un campo eléctrico.
La electroósmosis implica la migración del líquido respecto del sólido por la acción de un campo eléctrico.
En ambos fenómenos interviene la doble capa eléctrica y el potencial zeta.
Electroósmosis
Si un sólido se pone en contacto con un líquido y el sólido adquiere cargas fijas, se genera un potencial eléctrico sólido-líquido y se forma la doble capa eléctrica.
Al aplicar un campo eléctrico el líquido se desplaza con una velocidad que depende del potencial zeta del sólido.
Este fenómeno puede estar presente cuando se realiza una electroforesis sobre soporte, e influir en la magnitud y sentido de la migración de las moléculas a separar.
Depende de las características del soporte y es importante solo en alguno de ellos.
De acuerdo a la característica
del sólido, el flujo electroosmótico depende del pH
El líquido se desplaza cuando se aplica un campo eléctrico
La velocidad y movilidad electroosmótica
D	
  4 1

4
eosm
	D
ς = Potencial zeta del sólido (soporte)
D: constante dieléctrica η: viscosidad del medio σ = Q/superficie
κ: constante de Debye-Hückel
El flujo elecroosmótico depende del pH y la fuerza iónica
μ = v / E
Electroósmosis
	Es relativamente importante en soportes de acetato de celulosa y agarosa.
●
No	se	produce	en	geles	de
poliacrilamida.
●
Es	muy	importante	en
electroforesis capilar, en capilares
de sílica no revestidos. A pH neutro o alcalino, el soporte posee cargas fijas negativas: el flujo electroosmótico se dirige hacia el cátodo (polo negativo) y arrastra tanto a los compuestos neutros como a los cargados positiva o negativamente.
neta
Vel	= vel ef + vel eos
+	-	+	-
Dirección de la Velocidad electroosmótica (soporte con cargas fijas negativas)
Desarrollo del flujo electroosmótico: (a) Superficie del capilar de sílice fundida cargada negativamente ( SiO- ). (b) Cationes hidratados acumulados cerca de la superficie. (c) Flujo de líquido en dirección al polo negativo al aplicar un campo eléctrico (Heiger, 1992).
Migración diferencial de los solutos superpuesta al flujo electroosmótico en la electroforesis capilar por zona. (Heiger, 1992).
Electroforesis sobre soporte
La función del medio soporte es, principalmente, evitar las perturbaciones mecánicas y las corrientes de convección que pueden producirse por cambios de temperatura o por la elevada densidad de las disoluciones que contienen la muestra.
De todos modos, el medio soporte algunas veces adsorbe varias de las especies moleculares o actúa como un tamiz molecular que puede contribuir en cierto grado a la separación.
La electroforesis en papel a bajo voltaje (20 V/cm) ha sido utilizada para el análisis de mezclas proteicas. Hoy en día ha sido superada por la electroforesis en gel.
La electroforesis a bajo voltaje es ineficaz para moléculas pequeñas (aminoácidos y nucleótidos) porque poseen una carga demasiado reducida para proporcionar una movilidad suficiente (la separación es muy lenta) y, por otra parte, su pequeño tamaño les confiere una considerable difusión.
En la electroforesis de alto voltaje (200 V/cm) la velocidad de separación aumenta, pero se produce una intensidad de corriente alta por lo que es necesario sistemas de refrigeración.
La electroforesis de alto voltaje en papel fue de gran valor para la separación de
aminoácidos y péptidos.
Electroforesis en tiras de acetato de celulosa: la utilización de membranas de acetato de celulosa en vez del clásico papel evita elefecto de adsorción, puesto que la mayor parte de los grupos hidroxilos de la celulosa están esterificados con residuos de acetato, que no adsorben, por lo general, las muestras a tratar.
La resolución es mayor y la separación a bajo voltaje se realiza de modo más rápido.
Asimismo se reduce la tinción del fondo por lo que aumenta la sensibilidad del método.
Aplicación clínica: proteinograma del suero
Imagen electroforética normal
Gammapatía monoclonal a IgG
Electroferograma de electroforesis capilar que muestra el doble pico de albúmina
de	la	fracción
característico	de	la	condición	de	aloalbuminemia	y	ausencia
gamaglobulina.
La letra AU en la ordenada indica absorbancia mientras que el tiempo de migración se reporta en minutos en la abscisa.
Imagen de la separación de las proteínas del suero en acetato de celulosa en la que no se evidencia la condición de aloalbuminemia que se observa en el electroferograma de la electroforesis capilar.
Electroforesis en geles de poliacrilamida
(PAGE)
Efecto de tamiz molecular
Las moléculas migran a través de los poros del medio que ejercen un efecto de tamiz. Si bien este efecto está presente en todos los medios gelosados, para proteínas es muy importante en geles de poliacrilamida, cuya porosidad está controlada.
A medida que aumenta la concentración de acrilamida disminuye el tamaño del poro y aumenta el efecto de tamiz molecular.

Las moléculas sufren un retraso adicional, que depende de su radio de Stokes y del tamaño del poro (% de acrilamida).
Kr depende del radio de Stokes (aumenta al aumentar RS) A mayor RS , mayor pendiente
Loggel
[gel] %
Log libre
Tangente = -Kr
Log gel	= Log libre	– Kr	[gel]
Log gel = Log libre – Kr [gel]
METODOLOGÍA GENERAL
1- Gelificación del medio (si no está disponible)
2- Conexión a cubas
3- Siembra y separación por aplicación de diferencia de potencial con fuente de poder
4- Revelado
Revelado por tinción
Revelado funcional
Transferencia y revelado inmunoquímico
Electroelusión
Si se debe gelificar el gel, los componentes son:
Monómero: acrilamida
Entrecruzante: bis-acrilamida
Catalizadores : TEMED (tetraetiletilendiamina), e iniciador de radicales libres, persulfato de amonio
Se debe polimerizar en ausencia de Oxígeno
Aumentando el % de acrilamida disminuye el tamaño del poro
En general se mantiene constante la relación monómero / dímero
Esquema de PAGE
Acrilamida
Sin bis-acrilamida Polímero lineal
Acrilamida
+	bisacrilamida
Polímero entrecruzado
	% bis(acrilamida)	1%	5%	15%	25%
	% total de acrilamida	Radio (Å)			
	6.5	24	19	28	--
	8.0	23	16	24	36
	10.0	19	14	20	30
	12.0	17	9	-	-
	15.0	14	7	-	-
El radio corresponde a moléculas para las cuales es accesible el 50 % del gel.
(Terrance Cooper. The Tools of the Biochemistry)
Efecto	del	%	de	acrilamida	y	bis-acrilamida	en	el tamaño del poro del gel
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
Variantes técnicas (cada una posee una particularidad en relación al principio de separación
PAGE-nativo (continua-discontinua)
PAGE desnaturalizante (SDS, urea) (continua-discontinua ; en medio reductor o no reductor)
Isoelectroenfoque
Electroforesis Bidimensional
Combinadas	con	reacciones	específicas:	inmunoquímicas (western blotting), o revelado funcional.
Discontinua
El medio posee dos geles: el gel apilamiento y el gel de separación; la relación de movilidades de las
especies aniónicas, que en las distintas zonas conducen la corriente y los cambios de pH producen el efecto de apilamiento y luego permiten la separación con mayor resolución.
Electroforesis discontinua: el gel de apilamiento y el aumento de resolución por concentración
Hay una discontinuidad del pH y composición de especies iónicas entre las distintas zonas: los reservorios (1), el gel de apilamiento (2) y el gel de separación (3):
El catión es común en las tres zonas : Tris
El anión A1 es el glicinato, cuya carga depende del pH
El anión A2 es la (las) proteína El anión A3 es el Cl-
El pH en el gel de apilamiento es menor que en el gel de separación
La relación de movilidades es A1<A2<A3 y mientras se mantenga, los componentes no se mezclan.
Se forma un frente iónico
I es la misma en todas las zonas
I = XE	;	X= F∑ci mi zi
En el gel de apilamiento, el campo eléctrico es diferente en ambas
capas y las proteínas quedan atrapadas entre la Gly y el Cl
En el gel de separación, al aumentar el pH, la movilidad de la glicina pasa a ser mayor que la de las proteínas. El frente se mueve delante de las proteínas, estas se mueven en un medio de conductividad constante y se separan en función de su movilidad.
Separación en base a la relación Q/Rs y Rs absoluto
Dos	proteínas	que	tengan	igual	relación	Q/Rs,	si	poseen distinto Rs se pueden separar por PAGE-nativo.
(Recordar que: en electroforesis libre dos proteínas con igual relación Q/Rs no se pueden separar)
PAGE NATIVO
PAGE SDS
Si posee estructura cuaternaria el SDS disocia las subunidades y les confiere una relación Q/M cte. y una forma semejante. Por lo tanto, a diferencia de lo que ocurre en condiciones nativas, todas poseen una relación Q/Rs semejante. De este modo, la movilidad será en función del Rs absoluto. Y como la forma es similar, se puede decir que será función de la masa molecular. O sea se puede en este caso asumir que la separación depende fundamentalmente de la masa. Esto ocurre, si no tiene puentes disulfuro, o si se usa además reductor.
Si es un oligómero el SDS lo disocia en subunidades
En este ejemplo la molécula es un homodímero
Si las subunidades son iguales, en PAGE-SDS se visualiza una única banda que corresponde a la masa molecular de la subunidad.
PAGE-SDS en condiciones reductoras o no reductoras
Si no existen puentes disulfuro intra e intercatenarios, en general la adición de reductores (beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, etc) no cambia el resultado.
Pero si existen puentes disulfuro, con la adición de compuestos reductores se rompen estos enlaces, y el resultado puede ser distinto en cada caso.
El cambio es más dramático cuando los puentes son intercatenarios ya que dan lugar a la formación de multímeros (dímeros, trímeros, etc.)
Con patrones de masa molecular adecuados se puede determinar la masa molecular de la banda correspondiente a la subunidad de la proteína.
Si es monomérica será su masa molecular.
Pero si es oligomérica lo que se determina es la masa molecular de cada subunidad.
PAGE-SDS
También se puede graficar Log de la masa molecular de proteínas patrones versus Rf
distancia migrada por el frente
 distancia migrada por la proteína
f
R
Equipo necesario para PAGE
Imagen PAGE-SDS
PAGE desnaturalizante con urea
Si la proteína se desnaturaliza con urea, su carga no cambia sustancialmente.
Si es oligomérica, se disocia en subunidades, se despliega, y la banda observada corresponde a cada subunidad.
Al desplegarse aumenta su Rs
Si la proteína es monomérica, se observa una disminución de la movilidad de la proteína desnaturalizada respecto de la proteína nativa.
En gradiente de urea
La banda superior en el gel contiene una forma mutante de lisozima (con Ala 160 sustituida por Thr), y la banda inferior discontinua corresponde a la proteína wild-type. La proteína	wild-type se aplicó al gel primero, y migró durante 10 min, y luego se aplicó la proteína mutante y continúo la electroforesis por 20 min más. El gel se coloreo con Coomassie blue.
El gel revela dos importantes diferencias en el proceso de desnaturalización de la proteína mutante y la wild-type:
La proteína mutante desnaturaliza a menor concentración de urea que la
proteína wild-type.
La interconversión entre las formas nativa y desnaturalizada de la proteína wild- type es relativamente lento (comparado con el tiempo de la electroforesis), dando lugar a la discontinuidad, mientras que para la proteína mutante es más rápido, produciendo una banda uniforme.
Electroforesis Capilar
ElectroforesisCapilar
Electroferograma experimental (absorbancia versus tiempo) de una mezcla artificial de teofilina, ácido benzoico y ácido salicílico, a pH=10 y fuerza iónica 88.2 mM.
Electroforesis Capilar
Electroferograma experimental (absorbancia versus tiempo) de una mezcla de Phe y Tyr (patrones) en suero. Buffer borato 25 mM, pH =11, el voltaje aplicado es 15 KV y la temperatura 20 ºC.
ISOELECTROENFOQUE
Las proteínas son anfolitos, es decir contienen grupos cargados positiva y negativamente. Todos los anfolitos presentan la propiedad de que su carga neta depende del pH. Existe un valor de pH al cual presentan carga neta nula y se denomina punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico el anfolito no se moverá si se lo somete a un campo eléctrico.
Si se coloca una proteína en un gradiente de pH, las moléculas se moverán hasta llegar a un punto en el gradiente en el que presenten carga neta nula, entonces cesará su movimiento.
En una mezcla de proteínas cada una de ellas se situará en aquel punto del gradiente donde el pH sea igual a su punto isoeléctrico.
	El método empleado para producir un gradiente estable de pH consiste en distribuir polianfolitos sintéticos de bajo peso molecular (300-600) que cubran un amplio margen de puntos isoeléctricos. Estos polianfolitos son usualmente mezclas de polímeros de ácidos carboxílicos y aminas alifáticas.
	El método de isoelectroenfoque tiene dos grandes ventajas: (1) se pueden separar mezclas que por otros métodos resultaría imposible y (2) las proteínas quedan significativamente concentradas.
ISOELECTROENFOQUE
La separación es función del punto isoeléctrico (pI)
Es un método de equilibrio, en el que las proteínas migran en un medio de pH variable y quedan enfocadas (detenidas) en la zona en la cual el pH=pI
Isoelectroenfoque (IEF)
Electroforesis en dos dimensiones:
permite separar por dos principios distintos
Lo más común es separar primero por Punto Isoeléctrico (pI) y luego por masa. De este modo, componentes que poseen el mismo pI y aparecen en la misma banda en la primera dimensión, en la segunda dimensión se separan en función de sus masas.
Electroforesis Bidimensional
Las proteínas se separan en la primera dimensión por diferencias en punto isoeléctrico.
A continuación el gel se gira en otra dimensión y se añade SDS al buffer. Las proteínas se separan en la segunda dimensión por diferencias de masa molecular.
Finalmente se tiñe el gel y se mide la intensidad de cada una de los millares de manchas de proteína.
Determinar la identidad de cada una de las manchas de proteínas de un gel bidimensional no es tarea fácil. El patrón del gel 2-D, si se realiza en condiciones estándar, puede compararse con los patrones obtenidos por laboratorios de referencia que hayan determinado la identidad de la mayoría de los componentes del patrón de 2-D de un determinado tipo celular.
Para la identificación experimental se pueden extraer las manchas del gel e hidrolizar la proteína para obtener pequeños péptidos por digestión enzimática proteolítica (por ejemplo con tripsina o quimotripsina) que pueden ser analizados por espectrometría de masas.
Electroforesis Bidimensional
Electroforesis bidimensional
Combinada con otras reacciones
Transferencia y reacción inmunoquímica
(Inmunoblotting)
Etapas:
Separación electroforética
Transferencia a medio adsorbente (nitrocelulosa 3- Bloqueo
4- Reacción inmunoquímica (Anticuerpo primario marcado o Anticuerpo secundario marcado)
Luego de la separación electroforética, las bandas son transferidas a membranas de nitrocelulosa por electroforesis
La membrana con las bandas proteicas transferidas, se somete a la reacción inmunoquímica, previo bloqueo de sitios residuales
La reacción inmunoquímica se desarrolla utilizando uno o más anticuerpos , de los cuales uno debe estar marcado (enzima, fluorófobo, etc)
Comparison of IgG antibody profiles by immunoblotting in patients with acute and previous Toxoplasma gondii infection.J. Clin Pathol 1991;44:569-572.
Tanto los ácidos nucleicos (AN) como los polisacáridos se pueden separar por electroforesis
Los principios son los mismos que para proteínas, pero dada la estructura molecular , presentan particularidades en la separación y tinción.
Los AN poseen una relación q/pb semejante. Los ADN doble hebra de gran tamaño pueden considerarse como ovillos cuya carga es proporcional a la longitud y a su vez al coeficiente friccional. Por lo tanto, en electroforesis libre presentan una movilidad que es independiente de su longitud (poseen relación q/Rs semejante) y no se separan.
En medios gelosados, la movilidad depende no solo de la relación q/Rs sino también, debido al efecto tamiz de la masa (pb) y la forma (Rs). Si se asume que la forma es semejante para todos, y se usan patrones adecuados, se puede determinar la masa molecular (o el número de pb). En caso de poseer diferente forma, si se desnaturaliza, la movilidad depende esencialmente de la masa y se puede utilizar este método para calcularla.
Para el ADN se emplean geles de agarosa (200-
50.000 pb) o acrilamida (menos de 500 pb), siendo estos últimos de mayor resolución
La cubas de agarosa son en general horizontales y el gel se encuentra sumergido en el buffer de corrida.
Para que exista una relación lineal entre el log. de la masa (o pb) y la movilidad, el ADN debe estar linealizado o mejor aún desnaturalizado.
Plásmido
cerrrado
Plásmido linalizado
marcadores
GARY K. MCMASTER AND GORDON G. CARMICHAEL. Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange. Proc. Natl. Acad. 1977 : 74pp. 4835-38, Biochemistry
Linea 1: marcadores
Linea 2: Circular no enrollado (corte en una sola hebra) migra menos que circular super enrollado
Linea 3: Lineal . Migra más que circular no
enrollado y menos que circular super enrollado.
La visualización de realiza en trans- iluminador a partir de la	unión a colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio
Se han desarrollado múltiples estrategias para analizar y visualizar polisacáridos cargados o aún neutros por electroforesis.
Alcian blue fixation allows silver staining of the isolated polysaccharide component of bacterial lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Electrophoresis [1991, 12(6): 439-441] Corzo J, Pérez-Galdona R, León- Barrios M, Gutiérrez-Navarro AM
Polysaccharide Analysis Using Carbohydrate Gel Electrophoresis: A Method to Study Plant Cell Wall Polysaccharides and Polysaccharide Hydrolases. Florence Goubet, Peter Jackson, Michael J. Deery, and Paul Dupree. Analytical Biochemistry 300, 53–68 (2002)
Bibliografía sugerida:
Donald Voet y Judith Voet. Bioquímica. Buenos Aires: Ed. Médica Panamericana. 3ra. Ed. 2006.
Lubert Stryer. Bioquímica. Tomos 1 y 2. Cuarta edición.1995. Editorial
Reverté, S.A. España.
Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principios de Bioquímica. 3era. Ed. 2001. Ed. Omega.
Robert Scopes. Protein Purification. Principles and practice. 1982. Springer-Verlag New York Inc.
	Hames BD and Rickwood D. Gel electrophoresis of proteins . A practical Approach. Primera impresión:1990. Reimpreso en 1994. IRL Press. Oxford. Inglaterra.
Protein purification. Principles and high resolution methods. Edited by Jan-Christer Janson Lars Rydén. Second edition.1998. Wiley & Sons Inc. publication NY. USA.
Willard HH, Merrit LL Jr, Dean JA, Settle FA Jr. Métodos
instrumentales de análisis1991. Grupo Editorial Iberoamericana.
David Freifelder. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. 1979 Ed. Reverté S.A
Páginas a consultar:
https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCI wYo
Esta direccion corresponde a un vídeo tutorial que muestra con detalle como se realiza la electroforesis en gel de polialcrilamida en el laboratorio.
Por favor, no dejen de verlo !!!
Y para terminar vamos a ver ….
Métodos de separación y caracterización
Sedimentación por centrifugación 2021
Método analíticoy preparativo Aplicaciones
Analítico (solo la ultracentrífuga analítica):
Determinar la (MM) de una proteína en estado nativo; establecer el estado oligomérico (monómero, dímero, etc).
Verificar si una muestra es homogénea en masa y conformación.
Detectar agregados en muestras de proteínas y cuantificar la extensión
de los mismos.
Detectar cambios conformacionales (por desnaturalización, mutación, etc).
Estudiar la formación y estequiometria de complejos fuertes entre
macromoléculas(receptor–ligando, antígeno anticuerpo)
Determinar el coeficiente de difusión-fricción.
Preparativo:
Separación de fracciones celulares y subcelulares.
La fuerza centrífuga y la fuerza gravitatoria
La utilización de la fuerza centrífuga permite aumentar hasta cinco órdenes de magnitud la fuerza de gravedad para sedimentar partículas y macromoléculas.
Fc = m ω2r
ω= velocidad angular
r = distancia al eje de giro
ω=2π RPM/60
La fuerza centrífuga relativa : FCR =	g FCR = Fc/Fg = ω2r /g = ω2r /980 cm/seg2
FCR = ω2r /980 cm/seg2
La fuerza depende de las RPM y del radio del rotor
Equipamiento
Centrífugas comunes: hasta aprox . 10.000 g (10.000 -15.000 RPM)
Supercentrífugas: hasta 50.000 g
Ultracentrífugas: hasta 100.000-800.000 g (100.000 RPM)
PREPARATIVAS
EQUIPAMIENTO
ANALÍTICAS
Some examples of different AUC centerpieces: A two mono-sector centerpieces (12 and 3mm) made from aluminum, used for velocity runs applying Schlieren or turbidity optics; B two double-sector centerpieces (12 and 3 mm) made from aluminum, used for velocity and equilibrium runs applying interference, absorption or Schlieren optics;
Análisis de la concentración en función del radio : formas de medirla

Fb
Fd
Fc
r
r = a; meniscus
r = b; bottom
Las fuerzas que intervienen:
Fc = m ω2r (m=masa partícula, ω=aceleración angular; r=distancia al eje de giro) Fflot(Fb) = ω2rVpsolv (Vp= volumen de partícula; solv = densidad del solvente)
Ffricc(Fd) = f v (f= coeficiente de fricción de la partícula; v= velocidad angular )
La velocidad y el coeficiente de sedimentación
S: coeficiente de sedimentación,
depende de la masa y forma (f)
S se mide en Svedverg = 10 -13 s
	
v 		
Na f
		 
2
	rM	1 v2
N	f
a
	

		
S 

 
v
2r
M	1 v2
Que sedimente o flote dependerá de la densidad (o su inversa, el volumen específico) de la partícula en relación a la del solvente
Clasificación de los métodos
1-Velocidad de sedimentación
De frente (preparativo, analítico)
De zona (preparativo)
2- Equilibrio de sedimentación
Sin gradiente de densidad	(analítico)
Con gradiente de densidad o isopícnico (preparativo).
Velocidad de sedimentación de frente
desplazamiento	en		el	tiempo,	en	la	figura esquematiza	cómo	varía
la	concentración	desde
Se parte de una solución homogénea y los componentes
se desplazan como un frente hacia el fondo .
Si	se	efectúa	en	forma	analítica,	y	se	observa	el
se el
menisco (Xm) al fondo del tubo. A	t=0, la línea de
puntos indica que la concentración es constante e igual
desde el menisco al fondo. Si hay dos componentes con distintos S, al tiempo t se observarán dos frentes, como lo indica la línea de trazo grueso. A la distancia X1 aparece el frente del componente de menor S. A la distancia X2 aparece el segundo componente y la concentración se mantiene aproximadamente igual a la inicial en un tramo , donde ambos componentes están mezclados ; en el fondo se acumulan ambos, con mayor concentración del componente de mayor S. La figura es un esquema en el que los frentes aparecen idealmente como escalones.
Xm X1	X2
d
t=0
C
t=0
t
Velocidad de sedimentación de frente analítico
Si hay un solo componente
En la figura se observa cómo varía la
concentración en función del radio para un solo componente	a distintos tiempos de
centrifugación.
Se observa que el frente no es recto sino sigmoidal.
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Combined absorbance (FFT smoothed) and derivative plot for one concentration profile. The boundary can be
identified from the maximum of the derivative. This is not strictly correct, but close enough for us.
Absorbance (FFT Smoothed)
r/cm
0
2
dA/dr
5.5
6.0
7.0
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
real data from Igor & Bricker
Meniscus
50,000 RPM T=20.2oC
Times in s, in order: 1409, 2663, 3908, 5197,
6473, 7757, 9104, 10538
6.5
r/cm
Absorbance
En la figura superior se observa nuevamente el desplazamiento del frente hacia el fondo a medida que aumenta el tiempo de centrifugación. En la figura inferior se muestra la variación de la absorbancia y su derivada
7(.5concentración), en función de la
distancia, para un dado tiempo.
En el punto en el que Abs pasa por un punto de inflexión, su derivada (dAbs/dr) pasa por el máximo y ese punto corresponde al radio del frente.
El conocimiento de la posición del frente a distintos tiempos permite calcular
el coeficiente de sedimentación
v =	dr/dt	v =	ω2r S
∫ dr/r = ω2	S ∫dt
lnr
ln r =	lnrm	+ ω2S t
t
Recíprocamente, si se conoce S, se puede estimar el tiempo necesario para sedimentar la partícula a una determinada velocidad, etc.
Tg = ω2S
Se debe corregir por temperatura y viscosidad
2 T ,solvent
So
T , solvent
2
20,water
20, water
v~
v~
T , solvent
T , solvent 20, water	1  
20, water
1  
 So
Actualmente se utilizan programas computacionales para el análisis, determinación de los frentes a distintos tiempos, cálculo de S y representación de datos de la distribución de valores de S, semejante a un cromatograma
Velocidad de sedimentación de frente diferencial: separación de fracciones subcelulares
Para fines preparativos, la velocidad de sedimentación diferencial	de frente permite el fraccionamiento subcelular:
Los componentes se separan por sus coeficientes de sedimentación, pero solo se obtienen fracciones enriquecidas
Velocidad de sedimentación	zonal : Preparativo
Las partículas o moléculas se separan de acuerdo a
su coeficiente de sedimentación. La densidad del gradiente no supera a	la de la macromolécula o partícula
Equilibrio	de sedimentación
en gradiente de densidad (isopícnica)
La densidad del gradiente supera a la de la macromolécula en algún punto hacia el fondo del tubo.
La separación es en función de la densidad.
Se utiliza más para células y fracciones subcelulares.
Organelle
diameter (µm)
Density (g/cm3)
	Nuclei	5-10	1.4
	Mitochondria	1-2	1.1
	Ribosomes	0.02	1.6
	Lysosomes	1-2	1.1
Algunas sales que se utilizan: CsCl, Cs2SO4, NaBr.
Velocidades: en el orden de 30.000
rpm tiempos largos (días).
RT	dc	dc
Na f	dr	dr
Na f
2
2
 	rcS  D
M (1  v~	)
J  	rc	2	
~
(1  v2 )
1 dc   2rM c dr	RT
ln[c(r)]  ln[c(a)] 	2	
 2 M (1  v~	)(r 2  a 2 )
2RT
Si se evalúa la concentración a diferentes radios, una vez alcanzado el equilibrio, de la pendiente de la gráfica de ln c versus r2, se calcula la Masa Molecular (M) sin necesidad de conocer D.
Equilibrio de sedimentación (analítico): cálculo de Masa Molecular
Se establece un equilibrio	entre la difusión y la sedimentación
En el equilibrio:
Integrando:
40
50
0
2
Igor-Bricker sample T=20.0oC
24,000 RPM v2=0.73 mL/g
1
45
r2/cm2
Absorbance
c(r)  c(a) exp(	2	)
 2M (1 v~	)(r 2  a2 )
2RT
En el equilibrio la concentración de la macromolécula presenta una distribución exponencial con el radio cuadrado.
	Método	Aplicaciones	Velocidad
Angular	Tiempo de
medición
	Equilibrio de sedimentación sin gradiente	Analítica. Cálculo de la MM.	Relativamente baja	Varios días
	Equilibrio de sedimentación en gradiente de densidad	Preparativa. .Separación de fracciones subcelulares de distinta densidad	Alta	
	Velocidad de sedimentación de frente	Analítica.Determinación del coeficiente de Sedimentación y Cálculo de MM conociendo el coeficiente de Difusión
Preparativa.Separación de fracciones subcelulares con distintos S.	Alta
Media-alta	Varias horas
Resumen de lascaracterísticas y aplicaciones
de los distintos métodos