EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (7)

Vista previa del material en texto

La	célula	es	una	maquinaria	química	de	alta eficiencia.
El	funcionamiento	está	dado	por	cambios	energéticos	producidos	por distintas reacciones químicas.
¿Cuál es la base de la alta eficiencia y correlación de las distintas reacciones químicas?
Las enzimas
Arthur Kornberg: Los ácidos nucleicos son la partitura, pero las enzimas (proteínas) son las ejecutantes de la música.
Enzimas
Las	enzimas
son	catalizadores	biológicos.	Biomoléculas
(proteínas,	aunque	ribozimas)	que	aceleran	reacciones químicas. Disminuyen la energía de activación.
Las	enzimas	no	alteran	el	equilibrio	químico	de	la	reacción entre sustrato (reactivo) y producto.
Presentan cinética de saturación.
Energía de activación
La energía de activación es la energía mínima que necesita un sistema antes de poder iniciar un determinado proceso químico (reacción química).
Para que ocurra una reacción entre dos moléculas, las mismas deben colisionar
(encontrarse) en la orientación correcta.
A medida que las moléculas se aproximan, sus nubes de electrones se repelen.
Para vencer esta repulsión, se requiere energía (energía de activación). Si se vence la repulsión, las moléculas se aproximan lo suficiente para que se produzca una reordenación de los enlaces de las moléculas (reacción química).
Esta energía mínima para la activación proviene del sistema (en forma de calor), es decir de la energía traslacional, vibracional y rotacional de cada molécula.
Catálisis
¿Qué es un catalizador? Compuesto que acelera la velocidad de la reacción, interviene íntimamente en el mecanismo de reacción, permanece inalterado al final de la misma.
Acelera la velocidad de reacción (provee mecanismo más favorable), disminuyendo la energía de activación.
Afecta la velocidad, NO la constante de equilibrio: Cataliza tanto la reacción directa como la inversa (siempre y cuando la constante de equilibrio lo permita).
Se presentan diferentes tipos de mecanismos catalíticos, por ejemplo: Catálisis nucleofílica, electrofílica, ácido-base.
Existe una dependencia de la velocidad de reacción con la concentración (cantidad) de catalizador.
La ocurrencia de las enzimas hace posible la alta eficiencia de las
células	como	maquinarias	químicas,	ya	que
permiten	una coordinación	y	regulación	adecuadas	en	las	secuencias		de
reacciones (vías metabólicas) y en que no se produzcan productos colaterales en cada paso. Permiten eficiencia y especificidad.
Salvo por el ejemplo de las ribozimas (ácidos nucleicos con actividad catalítica), la mayoría de las enzimas son proteínas.
La actividad catalítica de una enzima se mide determinando el incremento en la velocidad de la reacción bajo condiciones específicas.
Las propiedades catalíticas (y globalmente la actividad biológica) dependen de la temperatura, el pH, la composición del medio y requieren de la presencia de cofactores esenciales en determinados casos.
Las enzimas poseen alta especificidad, tanto para la reacción catalizada como respecto a los sustratos.
1750-1800. Spallanzani: digestión realizada también por jugo gástrico de otros animales. Estudios in vitro con muestras del suyo propio. Controles con agua, que no digiere. El proceso depende de la temperatura, así como de la cantidad de jugo gástrico. El ingrediente activo es inestable fuera del cuerpo.
1800s.
Actividades enzimáticas en distintos organismos: peroxidasa (rábano),	amilasa (grano).
1833. Payen y Persoz encuentran en un precipitado alcohólico de la malta un factor termolábil que convertía el almidón en azúcares.
Generación espontánea derrotada por Pasteur con la esterilización e incorporación de controles.
1878.	Kühne introduce el término enzima, estudiando catálisis en extractos de levadura.
Duda sobre el vitalismo.
1897. Vitalismo derrotado por Büchner al verificar la fermentación alcohólica por un extracto de levadura (al que llamó “zymase”). Nace la bioquímica.
Duclaux propone la terminación “asa”.
1912. Emil Fischer propone el modelo de la “llave y la cerradura”, formación complejo enzima-sustrato.
Modificada por una visión menos rígida por Koshland. 1913. Henri-Michaelis-Menten. Modelo matemático de velocidad de reacción enzimática.
~1920. Willstätter purifica la peroxidasa.
~1930. Sumner cristaliza la ureasa y demuestra que las enzimas son proteínas. Ver: www.jbc.org
~1940. Se desarrollan técnicas cromatográficas.
1957. Kendrew deduce la primera estructura 3D por difracción de rayos-X de la mioglobina.
1948. Linus Pauling postula que la catálisis enzimática se basa en la estabilización del estado de transición.
1950-70.
Daniel Koshland propone el modelo del ajuste inducido
para la interacción sustrato-enzima. El modelo de la mano y el guante reemplazaba a la llave y la cerradura. www.nature.com Nature (2004) 432, 447.
Monod, Wyman y Changeux desarrollan la teoría de la transición alostérica.
www.jbc.org J. Biol. Chem. (2002) 277, p. E34.
1957. Sanger, primera secuencia completa de una proteína (insulina), utilizando la reacción de Edman.
1963. Primera secuencia completa de una enzima, la ribonucleasa.
1950- Dilucidación de la estructura de doble hélice del DNA por Watson y Crick.
Estudios de Arthur Kornberg sobre la DNA polimerasa y enzimas de ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos son la partitura, pero las enzimas (proteínas) son las ejecutantes de la música.
Desarrollo de la biología molecular: clonado molecular de genes y expresión de proteínas recombinantes.
Enzimas - Catálisis enzimática
Las enzimas poseen alta especificidad, tanto para la reacción que catalizan como respecto a sustratos.
estereoselectividad y regioespecificidad
Presentan una gran actividad catalítica.
La actividad catalítica de una enzima se mide determinando el incremento en la velocidad de la reacción bajo condiciones específicas.
Ejemplo de catálisis enzimática: hidratación de CO2
Esta reacción es catalizada por la anhidrasa carbónica (106 moléculas de CO2 por segundo: 107 veces más rápido que en ausencia de enzima)
Genera el ácido carbónico (parte del sistema buffer
carbonato/bicarbonato en la sangre)
Sustratos
Producto
Otros ejemplos de velocidades catalizadas por enzimas
En una reacción reversible, la enzima incrementa tanto la reacción directa como la inversa, no modificando la Keq.
Una enzima cataliza una reacción que termodinámicamente es factible.
Una enzima no hace posible una reacción.
Nomenclatura de enzimas.
Nombres triviales. Antiguos y que en general nombran la reacción.
Glc + ATP 	Glc6P + ADP	Hexoquinasa En algunos casos el nombre trivial es
contradictorio, pero igual se sigue utilizando.
PEP + ADP  Piruvato + ATP	Piruvato quinasa
Clasificación de las enzimas
En 1964, la clasificación y nomenclatura de las enzimas fué desarrollado por la Comisión Internacional de Enzimas:
Por ejemplo Nucleósido Monofosfato (NMP) quinasa = EC 2.7.4.4
2 = clase, 7 = grupo fosforilo, 4 = aceptor del fosfato, 4 = aceptor preciso (NMP)
Glc + ATP  Glc6P + ADP
Hexoquinasa.
ATP:-D-hexosa-6-fosfotransferasa, EC 2.7.1.1 Glucoquinasa.
ATP:-D-glucosa-6-fosfotransferasa, EC 2.7.1.2
L-malato + NAD+  piruvato + CO2 + NADH + H+ Enzima málica.
EC 1.1.1.38 L-malato:NAD+ oxidoreductasa
(oxaloacetado-descarboxilante)
EC 1.1.1.39 L-malato:NAD+ oxidoreductasa (descarboxilante)
EC 1.1.1.40 L-malato:NADP+ oxidoreductasa (descarboxilante)
El problema de las amilasas
α-amilasa. 4-α-D-glucano glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1
Cataliza la endohidrólisis de uniones glucosídicas α-1,4 en polisacáridos que contienen 3 o más de tales uniones.
El término α refiere a la configuración anomérica del azúcar liberado y no a la configuración de la unión hidrolizada.
β-amilasa. 4-α-D-glucano maltohidrolasa, EC 3.2.1.2 Cataliza la hidrólisis de uniones glucosídicas α-1,4 en polisacáridos removiendo sucesivamente unidades de
maltosa desde el extremo no-reductor del polímero.
El término β es arbitrario y no refiere a la configuración
anomérica del azúcar liberadoni a la de la unión hidrolizada.
Ambas son glicosidasas, EC 3.2.1, enzimas que hidrolizan uniones O- y S-glicosídicas de configuración α o β
Las enzimas tienen diferentes grados de especificidad, tanto por sustratos como por la reacción que catalizan. Hay que evaluar en detalle el significado de “grado de especificidad”
La especificidad de una enzima es debido a la interacción precisa del sustrato con la enzima. Esto se debe como resultado de la estructura tridimensional única del sitio activo de la enzima.
Características de los sitios activos
El sitio activo es la región (tridimensional en la estructura de la enzima) que une al sustrato (y cofactores específicos si existen).
Los sustratos son unidos al sitio activo de la enzima mediante múltiples (y simultáneas) interacciones no covalentes:
Interacciones electrostáticas
Puentes de hidrógeno
Fuerzas de Van der Waals
Interacciones hidrofóbicas
El sitio activo es una cavidad en la estructura tridimensional formado por grupos que provienen de diferentes partes de la secuencia de aminoácidos.
La especificidad de la unión depende de la disposición definida y precisa de los átomos que forman el sitio activo.
El complejo enzima-sustrato es usualmente estabilizado por puentes de hidrógeno.
Ejemplo: Ribonucleasa (hidroliza RNA)
El sitio activo de una enzima
Las enzimas difieren ampliamente en estructura, especificidad y modo de catálisis.
El sitio activo está formado por residuos aminoácidos que directamente participan en formación/ruptura de enlaces químicos de/los sustrato/s (estos residuos se llaman residuos catalíticos).
La interacción del sustrato con el sitio activo de la enzima promueve la formación de un estado de transición estable.
De toda la molécula de enzima, el sitio activo es la región que participa directamente en la disminución de la energía libre del estado de transición (G‡) de la reacción (lo que resulta en un incremento de la velocidad de reacción).
Las enzimas emplean una gran variedad de tipos de catálisis (muchas veces en forma simultánea) .
Catálisis nucleofílica	Catálisis electrofílica	Catálisis ácido-base
Ejemplo de especificidad de sustrato de las enzimas: proteólisis
Hidrólisis enzimática de un enlace peptídico específico in vivo
Sustratos
Productos
Ejemplo (A): Tripsina, sitio de hidrólisis en Lys o Arg (enzima digestiva)
Ejemplo (B): Trombina, sitio de hidrólisis únicamente entre Arg y Gly (enzima de la cascada de coagulación)
Un caso particular, Subtilisina, hidroliza cualquier enlace peptídico
Las proteasas tienen especificidad de secuencia. Cortando, por el extermo N o C cuando en la misma aparece un determinado aminoácido.
Un ejemplo (de actualidad) de esto es el de la proteasa Mpro o 3CLpro de coronavirus. Mpro tiene especificidad de corte para la secuencia Leu-Gln↓-(Ser, Ala, Gly) (la flecha indica el sitio de hidrólisis). Esta proteasa hidroliza una proteína grande del virus en varios pedazos, generando una docena de proteínas más pequeñas no estructurales.
Particularmente tres de esas proteínas generadas tienen actividad enzimática de RNA polimerasa, de RNA transcriptasa y helicasa, que permiten la replicación viral. De esta forma, la acción catalítica de Mpro desata el proceso de multiplicación del virus en la proceso infeccioso.
A partir de esto, se diseñaron inhibidores de α-cetoamida, específicos de la proteasa (por modelado molecular del sitio activo de unión del polipéptido y catálisis) que están en etapas de prueba para ser implementados como drogas antivirales específicas de coronavirus. Como las proteasas de humanos tienen especificidad de corte distinta (no cortan después de Gln), el antiviral no las afectaría y sería de alta especificidad para las del tipo Mpro.
Para más detalle, pueden consultar los archivos pdf de publicaciones en este tema, que fueron puestos en el Entorno.
Factores físico-químicos que afectan la actividad enzimática
 Temperatura
Las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor.
temperatura	se	incrementará
actividad	enzimática	(ley
A	medida	que	aumente	la
la de
Arrhenius) hasta el momento en que comience la desnaturalización de la enzima y pérdida de la actividad.
Factores físico-químicos que afectan la actividad enzimática
pH
El pH del medio modificada la carga eléctrica de la enzima al aceptar o donar protones, lo que modificará el grado de ionización de los grupos laterales de los aminoácidos y
por	tanto
enzimática,
la	actividad así
como	la
estructura proteica.
Factores físico-químicos que afectan la actividad enzimática
Concentración y tipo de sales
– Una elevada concentración o una ausencia de sales en el medio (asociado a la fuerza iónica) pueden impedir la actividad enzimática, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentración de iones para estabilizar su carga eléctrica y su estructura.
Presencia	de	activadores	o	inhibidores enzimáticos
Algunas enzimas no precisan ningún componente adicional para poder realizar su función biológica (catálisis). Sin embargo, otras enzimas requieren la unión de moléculas no proteicas denominadas, en forma general, cofactores para poder ejercer su actividad.
Los cofactores pueden ser compuestos inorgánicos, como los iones metálicos y los complejos ferrosulfurados, o compuestos orgánicos, como la flavina o el grupo hemo.
Los cofactores pueden ser a su vez grupos prostéticos (cuando están unidos fuertemente a la porción proteica) formando parte de la entidad catalítica completa (enzima), o coenzimas, que son liberados del sitio activo de la enzima durante la reacción.
En 1926 Sumner cristaliza la ureasa, demostrando por primera vez la naturaleza proteica de las enzimas.
Holoenzima	Apoenzima (parte proteica)
Grupo prostético (componente no proteico firmemente unido a la proteína que algunas enzimas requieren).
Todas las enzimas utilizan sustratos y algunas requieren cofactores enzimáticos (por ej. metales), coenzimas o grupos prostéticos.
Coenzima, un sustrato especial
Las	coenzimas	son	pequeñas	moléculas	orgánicas	que	transportan grupos químicos de una enzima a otra.
Algunos	de	estos	compuestos	son	vitaminas como	la	riboflavina,	la tiamina y el ácido fólico.
Los grupos químicos intercambiados incluyen, por ejemplo a:
el ión hidruro (H-) transportado por NAD+ o NADP+
el grupo fosfato transportado por el ATP
el grupo acetilo transportado por la coenzima A
los grupos formil, metenil o metil transportados por el ácido fólico
el grupo metil transportado por la S-adenosil metionina
Debido a que las coenzimas experimentan una modificación química como consecuencia de la actividad enzimática, es útil considerar a las coenzimas como una clase especial de sustratos, o como segundos sustratos, que son comunes a muchas enzimas diferentes.
Por ejemplo, se conocen alrededor de 700 enzimas que utilizan la coenzima NADH.
Ejemplos de cofactores enzimáticos
Muchas enzimas emplean el mismo tipo de cofactor.
Algunos cofactores derivan de algunas vitaminas.
Vitaminas hidrosolubles
Estructuras de algunas vitaminas hidrosolubles
Vitamina B3
Coenzima NAD(P)+/NAD(P)H
Niacina
(-PO32-)
Grupos prostéticos
HOLO PROTEÍNA
= APO PROTEÍNA + GRUPO PROSTÉTICO
Polipéptidos
(L-aminoácidos unidos covalentemente)
Parte no proteica
Estructura		orgánica	e/o	inorgánica compleja	unido	fuertemente	por
interacciones no covalentes o mediante enlaces covalentes
Estructura funcional
Ejemplos de grupos prostéticos
(grupo hemo en la peroxidasa o en la catalasa)
(piruvato deshidrogenasa)
(varias óxido-reductasas)
Isoenzimas
Proteínas distintas (difieren
en estructura primaria)
que catalizan la misma reacción. Se pueden
encontrar isoenzimas
dentro de un mismo tejido.
Mecanismos de regulación de la actividad enzimática
La regulación enzimática es un componente crítico de la funcionalidad
Algunas enzimas se sintetizan enforma inactiva (zimógenos) y luego experimentas proteólisis específica para tornarse activas. Ej. tripsina.
En algunos casos se controla el nivel de la enzima por inducción o represión de su síntesis proteica. Regulación relativamente lenta y grosera.
Modulación por metabolitos que activan o inhiben la enzima. Hay ejemplos de regulación de tipo alostérica. Mecanismo relativamente rápido y fino.
Por modificación covalente de la enzima que producen su activación o inhibición. Las respuestas de acción hormonal cursan en general por estos mecanismos. En general la regulación es de tipo todo o nada. Ej. fosforilación, oxido-reducción de –SH. En algunos casos la modificación es también señal para cambiar la estabilidad de la proteína.
Las enzimas regulatorias generalmente son las involucradas en el primer paso de una vía metabólica.
La regulación es más efectiva, en términos de economía celular, si se regula el primer paso exclusivo de la ruta metabólica.
Algunas enzimas se sintetizan en forma inactiva (zimógenos) y luego experimentan proteólisis específica para tornarse activas. Ej. quimotripsina.
Modulación por metabolitos que activan o inhiben la enzima. Hay ejemplos de regulación de tipo alostérica. Mecanismo relativamente rápido y fino. Ej. Aspartato transcarbamoilasa
Activadores reversibles
Activadores esenciales: generalmente iones (Mg2+, Mn2+, otros). Si no están, no hay reacción catalizada. La cinética es semejante a la de una reacción multisustrato.
Activadores	no	esenciales.	Si	son	componentes	metabólicos	que	regulan	la actividad de enzimas clave en vías metabólicas (generalmente son alostéricas)
Inhibidores reversibles
Distintos tipos:
competitivos
no-competitivos mixtos acompetitivos
Por modificación covalente (post-traducción) de la enzima que producen su activación o inhibición. Las respuestas de acción hormonal cursan en general por estos mecanismos. En general la regulación es de tipo todo o nada. Ej. fosforilación.
También hay regulación por interacción con proteínas específicas. Esta última puede darse en forma directa o después que la enzima ha sido modificada post- traducción. En general participan también cationes divalentes
Combinación de mecanismos. Regulación por metabolitos y modificación.
En algunos casos la modificación es también señal para cambiar la estabilidad de la proteína.
Velocidad de reacción
Cambio	en	concentración	del	sustrato	(reactante)	o	producto por unidad de tiempo. Por ejemplo, para la reacción:
A  B
Para medir actividad enzimática hay que determinar aparición de producto (o desaparición de sustrato) en función del tiempo y calcular la velocidad de la reacción en condiciones de velocidad inicial.
Ver archivo pdf ad-hoc
Figura 1
Tiempo
0
2
4
6
8
10
P
0
2
4
6
8
Figura 2
Tiempo
0
1
2
3
4
5
P
0
1
s1
s3
s2
Métodos de medida de actividad enzimática.
Continuo: pueden realizarse lecturas en forma continua de la actividad midiendo a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. Son posibles múltiples medidas por medio de ensayo.
Directos.
Indirectos (con reacciones acopladas)
Discontinuos: debe detenerse la reacción en un punto temporal para medir la concentración de los sustratos o los productos. Es posible una sola medida por medio de ensayo.
Métodos de medida de actividad enzimática.
Continuos.
Directos.
Reacciones acopladas.
Discontinuos.
Importancia de determinar velocidad inicial y en condiciones donde la enzima es limitante.
Unidad de actividad enzimática (U) = µmol/min En las condiciones especificadas
Diferencia en condiciones para cuantificar una enzima
≠ para cuantificar un sustrato o producto por un método enzimático. Ver Biochemical Education (1997) 25, 106-9.
etanol + NAD+	 acetaldehído + NADH + H+
etanol + NAD+	 acetaldehído + NADH + H+
La ADHasa podría también ensayarse, por método directo, por potenciometría, siguiendo el cambio de pH en función del tiempo.
Ensayo de la piruvato quinasa por un método continuo, acoplado.
PEP + ADP  piruvato + ATP
piruvato + NADH + H+  lactato + NAD+	*
PEP + ADP + NADH + H+  lactato + ATP + NAD+
* La LDHase debe estar en exceso
Ensayo de la ADP-glucosa pirofosforilasa
Glc1P + ATP  ADPGlc + PPi Métodos radioquímicos, discontinuos ADPGlc + [32P]PPi  Glc1P + [32P]ATP
La reacción se detiene con 5% TCA. El ATP radioactivo se separa del exceso de PPi por unión a carbón activado. El fosfato radioactivo se libera al medio acuoso por hidrólisis en medio ácido.
[14C]Glc1P + ATP  [14C] ADPGlc + PPi
La reacción se detiene por calentamiento de los tubos en baño de agua hirviente durante 30 s. Para cuantificar la ADPGlc radioactiva la mezcla se trata con fosfatasa alcalina y la ADPGlc se une a papel-DEAE.
Los métodos radioquímicos tienen alta sensibilidad. La misma puede ser ajustada convenientemente. En cambio, en los métodos espectrofotométricos la sensibilidad está condicionada por el coeficiente de extinción molar de la molécula que es medida.
Método espectrofotómétrico, continuo indirecto
ADPGlc + PPi  Glc1P + ATP Glc1P  Glc6P
Glc6P + NAD+  6P-gluconato + NADH + H+
Método colorimétrico de alta sensibilidad
Glc1P + ATP  ADPGlc + PPi
reacción hacia la derecha
PPi + H2O  2 Pi
ATP + H2O  ADP + Pi	reacción hacia la izquierda
El Pi se cuantifica colorimétricamente por formación de complejo con Verde de Malaquita, que tiene un coeficiente de extinción molar elevado
Es importante establecer la estequiometría en toda medida de actividad de una enzima. Correlacionar con la definición de U